SU707923A1

SU707923A1 - Способ получени иммобилизованных холинэстераз

Info

Publication number: SU707923A1
Application number: SU772526977A
Authority: SU
Inventors: Мати Эвальдович Хага; Антс Энделевич Ляэне; Эрленд Вячеславович Пеэнема; Ааво Артурович Аавиксаар
Original assignee: Институт Кибернетики Ан Эстонской Сср
Priority date: 1977-09-27
Filing date: 1977-09-27
Publication date: 1980-01-05

Description

1

Насто щее изобретение относитс к области биотехнологии и в частности , к способу получени иммобили зованных холинэстераз, который может быть применен дл изготовлени высокчувствительных анализаторов дл определени отравл ющих веществ антихолиэстеразного действи . Такие анализаторы могут быть применены в сельском хоз йстве дл определени инсектицидов .

В литературе описан р д способов получени иммобилизированных на неорганических материалах ферментов, в том числе холинэстераз, включающих обработку неорганического материала

.У -аминопропилтриэтоксисиланом с последующим переводом аминогрупп в такие функциональные группы, которые способны реагировать с функциональными группами молекул ферментов 1, 2.

Недостатком этих способов иммобилизации ферментов вл етс многостадийность процесса получени активных реакционноспособных групп на поверхности неорганического материала.

Известен также -способ получени иммобилизованных холинэстераз на не-i органическом носителе, включающий

активирование неорганического носител и последующее ковалентное св зывание с ним фермента 3. Согласно известному способу, пористое стекло обрабатывают раствором -аминопропитриэтоксисилана в толуоле. Далее аминопроизводное стекла св зывают с п-нитробензойной кислотой, полученный нитробензамид восстанавливают и диазотируют. Привод т св зывание ацетнлхолинэстеразы с полученным aктивиpoвaнны носителем. При этом выход по активности составл ет 0,5%, Полученные препараты иммобилизованно холинэстеразы вл ютс нестабильными и в течение 10 дней активность иммобилизованного фермента уменьшаетс в 3 раза. Таким образом, недостатками известного способа иммобилизации холинэкстераз вл ютс многостадийность активировани носител , малый выход ферментативной активности при иммобилизации и нестабильность полу .ченных препаратов.

Целью описываемого способа вл етс устранение недостатков известного способа, а именно, упрощение способа иммобилизации, увеличение выхода ферментативной активности и по вышение стабильности иммобилизованных холинэстераз. Указанна цель достигаетс за счет того, что неорганический материал активируют раствором хлористого цианура в органическом растворителе и, после св зывани фермента препараты обрабаты вают водным раствором гидроксиламин§

Согласно изобретению описываетс упрощенный способ получени иммобилизованных холинэстераз на неорганических носител х, включаквдий активирование неорганического материала и ковалёнтное св зывание фермента, с высоким выходом ферментативной активности и повышенной стабильностью иммобилизованных холинэстераз ,- заключающийс в том, что неорганичес1 ий носитель активируют раствор хлористого цианура в органическом . растворителе и, после св зывани фермента , препараты стабилизируют водным раствором гидроксиламина.

Предпочтительно процесс проводить следующим образом.

Активирование неорганического материала (силикагель, пористое стекло окись алюмини ) провод т путем обработки названных материалов 1-5% раствором хлористого цианура в диоксане , ацетоне, хлороформе, или диэтиловом эфире в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Количество прореагировавшего с неорганическим материалом хлористого цианура не зависит существенно от растворител . Обработанный хлористым циануром материал промывают ацетоном, 10-30% раствором уксусной кислоты и водой. Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе.

Св зывание холинэстераз провод т из раствора фермента в буфере. В случае силикатных носителей (силикагель , пористое стекло) максимальный выход ферментативной активности наблюдаетс при рН св зывани 4,5-6,5, а в случае окиси алюмини - при рН 8,0-8,5. Продолжительность стадии

св зывани при комнатной температуре составл ет 6-48 ч.

Полученные препараты дважды промывают буфером св зывани и обрабатывают 0,2 М раствором гидроксиламина при рИ 8,0-9,0 в течение 2-6 ч. Благдар этой обработке удал ют непрореагировавшие атомы хлора и существенно повышаетс стабильность полученных иммобилизованных холинэстераз

Полученные препараты многократно промывают 1,0 М раствором хлористого натри и хран т в холодильнике во влажном состо нии.

Пример. Навеску окиси алюмини (5,0 г) суспендируют в 20 мл 5% раствора хлористого цианура в диоксан . Через 3 ч избыток раствора дикантируют, препарат промывают дваж диоксаном, дважды 20% раствором уксусной кислоты, многократно водой и три раза ацетоном. Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе .

Количество прореагировавшего хлористого цианура определ ли спектрофотометрически . С 1 граммом окиси алюмини прореагировало 3 мкмол хлористого цианура.

Пример 2. Навески активированной , как описано в примере 1, окиси алюмини (0,5 г сухого препарата ) суспендируют в 6-миллилитровых порци х буферных растворов (рН 7,2-9,0), содержащих по 9 мг бутирилхолйнэстеразы. Через 24 ч препараты промывают дважды буфером св зывани и обрабатывают в течение 3 ч 0,2 М раствором гидроксиламина при рН В,6. После многократного промывани 1,0 М раствором хлористого натри определ ли активность препаратов по скорости гидролиза бромистого бутирилхолина в 0, растворе NaCI в присутствии 4-10м трис-(оксиметил) аминометана. Полученные результаты приведены в табл.1.

рН раствора

7,2 7,6 8,1 8,3 8,6 9,0 св зывани 5,4 10,6 10,9 9,0 6,4

ПрИмерЗ. Силикагель марки Силохром-2, активированный по приviepy 1, содержит 2,8 мкмол хлористого цианура на 1 г носител . Св зыТаблица 1

вание бутирилхолйнэстеразы и определение ее ферментативной активности . провод т аналогично примеру 2. Результаты представлены в табл.2.

Claims

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных холинэстераз на неорганических носителях, включающий активирование неорганического носителя и ковалентное связывание фермента, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения выхода ферментативной активности и повышение стабильности иммобилизованных холинэстераз, неорганический носитель активируют раствором хлористого цианура в органическом растворителе и после связывания фермента препараты стабилизируют водным раствором гидроксиламина .
2. Способ по π.1, о т л и чающийся тем, что, в качестве органического растворителя применяют диокт сан, ацетон, хлороформ или диэтиловый эфир, а в качестве носителя - пористое стекло, силикагель или окись алюминия.
3. Способ πόπ,π. 1,2, отлича ю щ и й с я тем, что связывание холинэстераз на активированных порис,том стекле и силикагеле проводят' при pH 4,5-6,5, а на активированной окиси алюминия при pH 8,0-8,5.
4. Способ по п.п.1-3, отличающийся тем, что применяют 0,2 М водный раствор.гидроксиламина и стабилизацию осуществляют при pH 8,0-9,0 в течение 3-6 часов при комнатной температуре.