CS276695B6 - Způsob výroby antibiotika cortalceronu enzymovou transformaci D-glukózy nebo D-glukosonu - Google Patents

Abstract

Způsob výroby antibaktsriálniho antibiotika cortalceronu účinného zejména proti grampozitivnimzbakteriím enzymovou transformaci D-glukozy nebo D-glukosonu pomoci enzymů produkovaných kulturami některých basidiomycetů, výhodně druhem Phanerochaete chrysosporium. Transformaci lze provést promytým intaktnim nebo psrmeabiiizovaným myceliern ze submersnich kultur P.chrysosporium a/nebo volnými enzymy pyranosa- -2-oxidasou a pyranosondehydratasou izolovanými z téhož zdroje do různého stupně čistoty. Transformaci lzs rovněž provést imobilizovaným dezintegrovaným buněčným preparátem a/nebo imobilizovaným ve vodě nerozpustným enzymovým preparátem na bázi zesitěných enzymů pyranosa-2-oxidasy a pyranosondehydratasy izolovaných z P. chrysosporium. Stabilitu těchto přípravků lze zvýšit koimobilizaci enzymu katalázy. Součásti řešeni je rovněž i způsob izolace antibiotika cortalceronu spočívající v chromatografii na měniči iontů v Ca2+ cyklu, přičemž pro eluci je užita voda.

Description

Vynález se týká způsobu výroby antibiotika cortalceronu enzymovou transformaci □-glukózy nebo D-glukosonu intaktnimi nebo imobilizovanými disintegrovanými buňkami vyšších hub či koimobilizovanými enzymy a způsobu izolace tohoto antibiotika.

Názvem cortalceron je označováno antibakteriální antibiotikum houbového, původu, účinné zejména proti gram-pozitivním baktériím izolované z fermentační tekutiny kultury basidiomycetu Corticium caeruleum, vystavené vlivu stressových faktorů (zvýšení teploty na 42 °C,' expozice par toxických rozpouštědel jako jsou chloroform, ether, aceton, octan ethylnatý nebo kontaktem mycelia se směsi voda-toluen při pokojové teplotě (Baute a kol.. Phytochemistry 15, 1753-55 (1976/). Chemické složení cortalceronu CgHgOg odpovídá hydroxypyronovému derivátu, 2-hydroxy-6H-3-pyron-2-karboxaldehyd hydrátu, jehož struktura je znázorněna na obr. 1, vzorce I.

Baute a kol. rovněž zjistil přímý biogenetický vztah cortalceronu k D-glukóze, popř. k intermediárnímu D-glukosonu (D-arabino-2-hexosulóze) (Baute a kol.,‘ Phytochemistry 16, 1895-97 /1977/). Navrhli rovněž schéma tvorby tohoto antibiotika, zahrnující oxidaci D-glukózy na D-glukoson enzymem pyranosa 2-oxidasa (E.C. 1.1.3.10) a následující dvojnásobnou enzymovou dehydrataci D-glukosonu na meziprodukt, jehož spontánní cyklizací vzniká cortalceron (Baute a kol.. Phytochemistry 25; 1395-97 /1987/). Z tohoto schématu vycházejí rovněž američtí autoři (US patentový spis č. 4,569,910) při optimalizaci postupu přípravy čistých preparátů pyranosa-2-oxidasy a jejich využití pro výrobu pyranoeonů. Přitom v kulturách některých basidiomycetů zjistili přítomnost enzymu pyranoson dehydratázy,' katalyzujícího shora uvedenou dvojnásobnou dehydrataci D-glukosonu na cortalceron. Tento enzym přečistili a částečně charakterizovali.

Dosavadní informace o antibiotické aktivitě cortalceronu se omezují na konstatováni, že je účinný proti gram-pozitivním bakteriím, včetně některých pathogenních druhů,<jako Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus pyogenes (Bérdy a kol., CRC Handbook of antibiotic compounds, vol. V, p. 395 /1981/). Podrobnější údaje dosud chybí. Vzhledem k jeho strukturní podobnosti s microthecinem, obr. 1, vzorec II (Japonsko, patentový spis č. 79,122,796), lze usuzovat na možnou aplikační perspektivu cortalceronu. Ovšem této možnosti však dosud bránila nízká úroveň produkce tohoto antibiotika zdlouhavou stacionární kultivací basidiomycetu Corticium caeruleum (Baute a kol.,’ Phytochemistry 25, 1472-73 /1986/) nebo některých příbuzných makromycetů. Inkubace mycelia S roztokem D-glukózy a plasmolytických agens (např. 1% toluen) indukuje produkci D-glukosonu a jeho následnou konverzi na cortalceron. Použité kultivační doby se pohybuji mezi 15 až 20 dny a výtěžnost antibiotika se pohybuje okolo 200 mg na 1 litr submersni houbové kultury. Postup izolace cortalceronu z fermentační tekutiny popsaný Bautem a kol. (Phytochemistry 15, 1753-55 /1976/) zahrnuje extrakci produktu směsi chloroform-methanol 93:7 a několikrát opakovanou chromatografii na silikagelové koloně. Fermentační tekutina obsahuje řadu balastních látek; které je třeba před vlastní extrakcí srážet methanolem a propanolem.

Uvedené nevýhody dosavadního postupu zdlouhavé a málo výtěžné přípravy cortalceronu odstraňuje předmětný způsob, založený na principu enzymové transformace D-glukozy nebo alternativně D-glukosonu. Využívá - ve vhodném sledu nebo kombinaci - hrubých nebo částečně přečištěných enzymových preparátů houbového původu, obsahujících volné nebo imobilizované enzymy podílející se na tvorbě cortalceronu (tj. pyranosa-2-oxidasu a pyranoson dehydratasu). Výhodou navrženého postupu je rychlost,' vysoká výtěžnost a usnadněná izolace produktu (bez použití organických rozpouštědel).

Podstatou způsobu výroby antibakteriálního antibiotika cortalceronu enzymovou transformaci D-glukozy nebo D-glukosonu je, že transformace se provádí pomoci enzymů produkováných myceliálními kulturami některých basidiomycetů. Pro tuto transformaci je výhodné použít určitých druhů basidiomycetů, zejména druhu Phanerochaete chrysosporium. S výhodou se předmětný způsob transformace D-glukozy nebo D-glukosonu na antibiotikum cortalceron provádí pomocí intaktního mycelia ze submersních kultur basidiomycetu Phanerochaete

CS 276 695 B6 2 chrysosporium. Transformaci D-glukózy nebo D-glukosonu na antibiotikum cortalceron lze též podle předmětného způsobu provést pomoci desintegrovaného nebo desintegrovaného a zmobilizovaného mycelia tohoto druhu basidiomycetů, popřípadě koimobilizovanými enzymy izolovanými do různého Stupně Čistoty z mycelia tohoto, popřípadě jiných druhů basidiomycetů obsahujících příslušné enzymy,' popřípadě koimobilizaci katalazy, což umožňuje vícenásobné použiti zmobilizovaných preparátů pro přípravu tohoto antibiotika z uvedených substrátů. Izolace antibiotika cortalceronu z reakční směsi se podle předmětného způsobu provádí pomocí chromatografie na iontoměniči v Ca cyklu s vodou jako eluentem.

D-glukoson se připravuje oxidací D-glukózy (např. podle čs. autorského osvědčení č. 175897). K biotransformaci lze použít pouze D-formu glukózy nebo glukosonu; L-glukoza ani L-glukoson nereagují.

V případě G-glukózy (1 až 10 % hmota/objem) jako substrátu lze jako enzymově aktivní preparát použít promyté mycelium ze submersní kultury houby Phanerochaete chrysosporium, obsahující jak enzym pyranosa-2-oxidasu,' oxidující D-glukózu na D-glukoson, tak i pyranoson dehydratasu, katalyzující následnou dvojnásobnou dehydrataci D-glukosonu za tvorby dosud přesně neidentifikovaného meziproduktu (Patrně 4-deoxy-aldehydo-D-glycero-2,3-hexodiulosy a jejich tautomsrů). Účinnost biotransformačniho procesu je možno zvýšit přídavkem katalazy, rozkládající peroxid vodíku; uvolněný v reakční směsi při oxidaci D-glukózy. Dinak dochází ke hromadění peroxidu vodíku, který denaturuje oba zúčastněné enzymy.

3e samozřejmé, že místo enzymově aktivního mycelia Phanerochaste chrysosporium je možné použít i částečně přečištěný preparát obsahující volnou pyranosa-2-oxidasu a pyranoson dehyďratázu, připravenu např. postupem dle Erikssona a kol. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 23; 257-262 /1986/). Zvláště výhodné je užití biokatalyzátoru s oběma enzymy koimobilizovanými spolu s katalázou na buněčných fragmentech desintegrovaného mycelia produkční houby, Enzymově aktivní myceliální biomasu lze získat 10 až lldenní submersní kultivaci příslušné houby v baňkách na třepačce nebo ve fermentoru při 28 °C n_a živném médiu o složeni D-glukóza 20 g, kukuřičný extrakt 15 g, MgS0₄.7H₂0 1,5 g v 1 litru roztoku s pH upraveným na 5,5 přídavkem 6M NaOH. Pro ukončení fermentace je přitom rozhodující pH fermentační tekutiny: maximální obsah obou enzymů podílejících se na biosyntéze cortalceronu byl zjištěn v myceliu sklizeném při pH 6,3 až 6,8, což je dokumentováno v následujících příkladech provedení.

V případě D-glukoeonu jako substrátu (připraveného např. postupem podle čs. autorského osvědčení č. 175897) lze jako zdroj pyranoson dehydratázy, v tomto případě jediného potřebného enzymu, rovněž alternativně použít promyté mycelium Phanerochaete chrysosporium nebo z něj připravený zmíněný částečně přečištěný enzymatický preparát, popř. biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu. Příprava tohoto antibiotika za použití D-glukozy jako substrátu je pochopitelně jednodušší a podstatně ekonomičtější.

Pro imobilizaci desintegrovaného mycelia produkčních buněk basidiomycetů obsahujících příslušné enzymy, popřípadě pro koimobilizaci enzymu katalázy a/nebo koimobilizaci těchto enzymů izolovaných do různé čistoty lze výhodně použít princip imobilizace podle čs. autorských osvědčení č. 231458 a/nebo č. 231656, které spočívají na vzájemné reakci glutaraldehydu, polyethyleniminu a Celých buněk nebo disintegrovaných buněčných směsí obsahujících různé enzymy u různých druhů mikroorganismů včetně basidiomycetů a/nebo různých surových nebo do různého stupně čistoty izolovaných enzymů z různých mikrobních, rostlinných^' nebo živočišných zdrojů za tvorby navzájem chemicky vázaných buněčných nebo enzymových agregátů nerozpustných ve vodě a využívaných pro diskontinuálni nebo kontinuální enzymové biotransformace.

Izolace cortalceronu z reakční směsi podle předmětného způsobu spočívá v chromatografickém oddělení cortalceronu od cukerných intermediátů a od 2-furylglyoxalu, identifikovaného jako spontánní degradačni produkt cortalceronu. To lze podle předmětného vynálezu

CS 276 695 B6 provést na koloně plněné lontoměničsm v Ca cyklu. Výhodou tohoto postupu oproti purifikaci používané Bautem a kol. (Phytochemistry 15,' 1753-55 /1976/) js, že látku není třeba v průběhu izolace převádět do organického rozpouštědla; k- izolaci je potřeba pouze destilovaná voda a eluát získaný z kolony je možno přímo lyofilizovat, což je rovněž doloženo v následujících příkladech provedení předmětného vynálezu, aniž by se jimi tento omezoval.

Dále jsou uvedeny příklady provedení způsobu výroby antibiotika cortalceronu podle vynálezu.

Příklad 1

Mycelium basidiomycetu Phanerochaete chrysosporium bylo kultivováno na reciprokém třepacím stroji (150 rpm) v 500 ml baňkách obsahujících 80 ml tekutého média o složení: D-glukóza 20 g,’ kukuřičný extrakt 15 g, MgSO^.THgO 1,5 g v 1 litru vodovodní vody. V průběhu kultivace bylo sledováno pH, produkce biomasy a aktivity pyranosa-2-oxidasy a pyranoson dehydratázy. Příslušné hodnoty byly získány měřením průměrných vzorků ze tří spojených paralelních baněk odebíraných v 2denních intervalech. (Jedna jednotka (U) aktivity pyranosa-2-oxidasy (P-2-0) odpovídá oxidaci 1 /Umolu D-glukózy za 1 min. při 25 °C v užitém reakčním systému (Eriksson a kol.,^r Appl. Microbiol. Biotechnol., 23, 257-262 /1986/); jedna jednotka aktivity (U) pyranoson dehydratázy (PO) je definována jako množství enzymu způsobující v užitém uzavřeném systému absorbance při 265 nm o jednotku (△Aggg = 1) za 1 minutu při 25 °C.

Na obr. 2 uvedeném v příloze předmětného vynálezu je graficky znázorněna produkce enzymů pyranosa-2-oxidasy (P-2-0),' pyranoson dehydratázy (PD), pH a biomasy v průběhu submersní kultivace basidiomycetu Phanerochaete chrysosporium. Na ose x jsou uvedeny dny kultivace (d). Průběh produkce P-2-0 je znázorněn plnými kroužky (jednotky jsou U/g sušiny mycelia,^: hodnoty jsou na ose y vlevo), produkce PD je znázorněna prázdnými kroužky (jednotky jsou U/g sušiny mycelia, hodnoty jsou na ose y vlevo). Čtverečky jsou znázorněny hodnoty pH (osa y vpravo), trojúhelníčky jsou znázorněny hodnoty produkce biomasy (jednotky jsou mg sušiny/ml kultury, hodnoty jsou na ose y vpravo). Z uvedených průběhů vyplývá, že optimální doba kultivace pro produkci aktivního mycelia (vzhledem k transformaci D-glukózy na cortalceron) je 10 až 11 dní. Dobu vhodnou ke sklizni kultur signalizuje vzrůst pH nad hodnotu pH 6,'3. Při hodnotách pH fermentačni tekutiny nad 6,8 dochází k výraznému poklesu obou enzymových aktivit. Aktivní mycelium sklizené ve vhodnou dobu se oddělí filtrací na filtrační tkanině, promyje se vodou a bu3 bezprostředně nebo po uchovávání ve zmraženém stavu (-20 °C) se použije k transformaci, jak následuje.

Do dvou 250 ml baněk bylo odváženo po 10 g vlhkého enzymově aktivního mycelia Phanerochaete chrysosporium a přidáno po 50 ml 2% roztoku D-glukosonu. Směs byla inkubována při 20 °C na reciprokém třepacím stroji (150 rpm). Po 24 hod. bylo aktivní mycelium odfiltrováno, promyto a ve vodné suspenzi uchováno pro další použití. Roztok cortalcero2+ nu byl zahuštěn na rotační vakuové odparce a přečištěn na sloupci Dowsxu 50 v Ca cyklu. Spojené frakce obsahující čistý cortalceron byly zmraženy a lyofilizovány. Výtěžek postupu byl 0,654 g cortalceronu (tj. 41 % vzhledem k použité koncentraci substrátu).

Příklad 2 g vlhkého mycelia Phanerochaete chrysosporium obsahujícího enzymy pyranosa-2-oxidasu a pyranoson dehydratázu, připraveného podle příkladu 1 se po promytí vodou suspenduje ve 120 ml destilované vody a za chlazení ledem se 5krát 0,5 minuty homogenizuje při maximálních otáčkách homogenizátoru Ultra-Turrax. Ibomolizace desintegrovaného mycelia a koimobilizace katalázy se provádí podle čs. autorského osvědčení č. 231458 vhodně modifikovaného pro biokatalyzátor sloužící k přípravě antibiotika cortalceronu takto:

. k uvedenému množství desintegrovaného mycelia se za intenzivního míchání přidá 0,6 g technického větveného polyethyleniminu (Sedipur CL-930, BASF, SRN) a poté 10 ml suspenze ko

CS 276 695 B6 merčního enzymu katalázy (Reanal, Maňarsko) a za intenzivního chlazení se upraví pH reakčni směsi na hodnotu 7,8 vodným O,'5 M roztokem NaOH. Pak se za stálého míchání přidává po kapkách celkem 4,'8 ml 25% roztoku glutaraldehydu. Suspenze se po dalších 5 minutách intenzivního míchání rozlije v tenké vrstvě do fotomisky a uloží se do mrazícího boxu při teplotě -15 °C. Po 24 hodinách se rozmrazí přelitím destilovanou vodou. Imobilizovaný preparát se zfiltruje a promývá destilovanou vodou tak dlouho, až filtrát neobsahuje zbytky použitých činidel (kontrola např. snímáním UV spekter). Takto připravený enzymový preparát je možné uchovávat jako suspenzi v destilované vodě v chladu po dobu asi 4 měsíců bez výrazné ztráty aktivity. Celkem bylo z 75 g vlhkého mycelia (obsah sušiny 6 %) získáno 60 g vlhké hmoty směsného imobilizovaného buněčného a enzymového preparátu ve formě agregátů o celkovém obsahu suché hmoty 22 %.

Přiklad 3

Do dvou 250 ml baněk bylo odváženo po 10 g vlhkého enzymově aktivního mycelia basidiomycetu Phanerochaete chrysosporium připraveného podle přikladu 1 a přidáno po 50 ml 2% roztoku D-glukózy. Směs byla inkubována na reciprokém třepacím stroji (150 rpm) při 20 °C. V různých časových intervalech byly odebírány vzorky tekutiny (0,1 ml), ve kterých byl zjištován obsah cortalceronu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na NH₂ koloně Separon SGX. Mobilní fázi tvořil 70% vodný acetonitril o pH 5,0 (H₃P0₄), detekce UV detektorem při 225 nm.

Na obr. 3 v příloze předmětného vynálezu je znázorněn časový průběh biotransformace D-glukozy na antibiotikum cortalceron aktivním myceliem basidiomycetu Phanerochaete chrysosporium.

Na ose x je uveden čas inkubace v hodinách, na ose y obsah cortalceronu v g/1 reakční směsi. Z obrázku vyplývá, že maximální konverze bylo dosaženo v 26. hodině inkubace. Po ukončeni transformace bylo aktivni mycelium odfiltrováno,’ promyto a ve vodné suspenzi uchováno pro další transformace. Roztok cortalceronu byl zahuštěn na rotační vakuové odparce, přečištěn na sloupci Dowexu 50 v Ca cyklu a spojené frakce obsahující čistý cortalceron byly zmraženy a lyofilizovány. Výtěžek postupu byl O,'567 g cortalceronu (tj. 32 % vzhledem k použité koncentraci substrátu - D-glukóza).

Přiklad 4

Do pěti 250 ml baněk bylo odváženo po 7 g imolizovaného směsného enzymového preparátu připraveného jak je uvedeno v přikladu 2 a přidáno po 50 ml 2% roztoku D-glukózy. Baňky byly inkubovány na reciprokém třepacím stroji (150 rpm) při 20 °C. V různých časových intervalech byly odebírány vzorky tekutiny (0,1 ml),' ve kterých byl zjišťován obsah cortalceronu pomoci vysokoúčinné kapalinové chromatografie na NH₂ koloně Separon SGX. Mobilní fázi tvořil 70% vodný acetonitril o pH 5^0 (H₃P0₄), detekce UV detektorem při 225 nm.

Na obr. 4,' který je uveden v příloze předmětného vynálezu, je znázorněn přírůstek cortalceronu v závislosti na době transformace. Na ose x ja uveden čas transformace D-glukozy na antibiotikum cortalceron v hodinách, na ose y obsah cortalceronu v g/1 reakční směsi. Z hodnot uvedených na tomto obrázku vyplývá, že maximální konverze bylo dosaženo v 22. hodině enzymové transformace. Po ukončení transformace byl imobilizovaný enzymový preparát odfiltrován, promyt a’uchován pro další opakované použiti. Roztok cortalceronu byl po zahuštěni a přečištění jak je uvedeno v následujícím příkladě lyofilizován. Výtěžek postupu byl 3,73 g cortalceronu (tj. 84 % vzhledem k použité koncentraci substrátu D-glukóze)j^J tedy přibližně třikrát vyšši než za použití intaktniho mycelia v příkladu 3.

Příklad 5

Roztok cortalceronu získaný jak je uvedeno v příkladu 4 byl po odfiltrování imobilizovaného enzymového preparátu zahuštěn na rotační vakuové odparce při teplotě nepřevyšuji5 CS 276 695 B6 ci 40 °C na objem 50 ml. Na kolonu (30 cm x 4 cm) iontoměniče Dowex 50 v Ca²⁺ cyklu bylo dávkováno po 2,5 ml zahuštěného roztoku cortalceronu. Oako mobilní fáze byla použita destilovaná voda a jímaly se frakce o objemu 10 ml. V každé frakci byla měřena absorbance při 225 nm.

Na obr. 5j uvedeném v příloze předmětného vynálezu, je znázorněn eluční profil cortalceronu na Dowexu 50 v Ca cyklu. Na ose x je uveden objem eluátu v ml (V/ml), na ose y hodnoty absorbance při 225 nm. Z obrázku vyplývá, že pík cortalceronu (1) odpovídá elučnimu objemu zhruba 180 ml, pík 2-furylglyoxalu (2) elučnímu objemu zhruba 430 ml. Píky cukerných intermediátů (3; 4) následuji. Frakce obsahující cortalceron byly spojeny a lyofilizovány. lontoměniěová kolona byla důkladně promyta destilovanou vodou a tak připravena pro další použití. Při dávkování 63,4 mg surového cortalceronu v 2,^J5 ml vzorku bylo po průchodu kolonou nalezeno 54,4 mg čistého cortalceronu v 50 ml; výtěžnost popsaného izolačního a purifikačního postupu dosahuje tedy 86 %.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby antibiotika cortalceronu enzymovou transformaci D-glukozy nebo D-glukosonu, vyznačený tim, že tato transformace se provádí pomoci myceliálních kultur basidiomycetů, výhodně druhem Phanerochaete chrysosporium.
2. 2. Způsob výroby podle bodu 1, vyznačený tim, že enzymová transformace D-glukozy nebo D-glukosonu na antibiotikum cortalceron se provádí pomocí promytého intaktniho nebo permeabilizovaného mycelia ze submersních kultur Phanerochaete chrysosporium a/nebo volnými enzymy pyrariosa-2-oxidasou a pyranosondehydratázou izolovanými ze stejného zdroje.
3. 3. Způsob výroby podle bodu 1, vyznačený tím, že enzymové transformace se provádí imobilizovaným desintegrovaným buněčným preparátem na bázi agregátů zesitěných buněčných fragmentů a rozpustných komponentů enzymově aktivního mycelia basidiomycetu Phanerochaete chrysosporium a/nebo imobilizovaným, ve vodě nerozpustným enzymovým preparátem na bázi zesitěných enzymů pyranosa-2-oxidasy a pyranosondehydratázy izolovaných z P.chrysosporium.
4. 4. Způsob výroby podle bodů 1 a 3, vyznačený tím, že imobilizovaný desintegrovaný buněčný preparát a/nebo imobilizovaný enzymový preparát obsahují s výhodou koimobilizovaný enzym katalázu.
5. 5. Způsob výroby podle bodů 1, 2, 3 a 4, vyznačený tím, že izolace antibiotika cortalce2+ ronu ze zahuštěné reakční směsi se provádí chromatografii na iontoměniči v Ca cyklu s vodou jako eluentem.