SU1678838A1

SU1678838A1 - Способ вы влени нуклеотидных последовательностей

Info

Publication number: SU1678838A1
Application number: SU894686597A
Authority: SU
Inventors: Александр Львович Мельников; Игорь Валерианович Домарадский; Андрей Валентинович Дроздов
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения
Priority date: 1989-05-03
Filing date: 1989-05-03
Publication date: 1991-09-23

Abstract

Изобретение относитс к молекул рной биологии и может быть использовано дл диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов , а также в научных исследовани х. Цель изобретени - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижени веро тности неспецифических реакций. Предварительно на поверхность носител нанос т один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку ввод т непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей .

Description

Изобретение относитс к молекул рной биологии и может быть использовано дл диагностики возбудителей инфекционных болезней, идентификации микроорганизмов , а также в научных исследовани х.

Цель изобретени - ускорение способа и повышение достоверности его результатов за счет снижени веро тности неспецифических реакций.

При вы влении нуклеотидных последовательностей , комплементарных нуклеотид- ным последовательност м эталонного образца, предварительно на поверхность носител нанос т один или несколько эталонных образцов, а специфическую метку ввод т непосредственно в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей .

Способ осуществл ют следующим образом .

Эталонные образцы предварительно нанос т на поверхность носител , фиксируют их тепловой обработкой и предгибридизуют . Маркированию, например сульфированию , подвергают исследуемый материал без очистки его нуклеотидных последовательностей непосредственно в процессе лизиса бактериальных клеток или тканей, инфицированных вирусами, Общее врем обработки и маркировки исследуемого материала до его взаимодействи с фиксированными на носителе эталонными образцами занимает 3 ч. Носитель с эталонными образцами подвергают взаимодействию с маркированным исследуемым материалом и отмывают избыток материала . Факт комплементарного взаимодействи нуклеотидных последовательностей эталонного образца и исследуемого материала устанавливают иммуноферментным методом .

Пример 1. Бактериальную культуру штамма E.coli TG I с плазмидой pTZ 18R выращивают с аэрацией при 37°С в L-буль- оне, содержащем 30 мкг/мл ампициллина, до концентрации 2х108 кл /мл. Бактериальсл С

о xj

00 00

oj

00

ную культуру лизогеиного по фагу /1 штамма E.coli CSH 45 ( Я С 1857S7) выращивают аналогичным образом в L-бульоне без антибиотика . Бактериальную культуру штамма B.subtills 168 выращивают в L-бульоне до насыщени (до концентрации 2x10 кл/мл). Клетки из 1 мл каждой бактериальной культуры осаждают центрифугированием при 20QOg в течение 5 мин и суспендируют в 0,2 мл ТЭН-буфера, содержащего 0,05 М трис- HCI, 0.001 М ЭДТА, 0.025М натри хлористого , рН 8,0. Такие суспензии клеток используют в качестве исследуемого материала . Все дальнейшие операции, кроме специально указанных, провод т при комнатной температуре.

Дл обработки и маркировки исследуемого материала предлагаемым способом к суспензии клеток прибавл ют 0,05 мл раствора лизоцима в ТЭН-буфере с концентрацией 4 мг/мл. Через 10 мин добавл ют 1,35 мл лизирующего раствора, содержащего 6,0 М гуанидинхлорида, 0,1 М ЭДТА, 0,05 М трис-HCI, рН 8,0, и перемешивают в течение 5 мин до полного лизиса клеток. Прогревают лизат при G5°C в течение 10 мин, затем п ть раз пропускают лизат через иглу с помощью шприца на 5 мл. К лизату добавл ют 2 мл раствора 1,0 М метилгидроксиламина, рН 6,0 и 8 мл раствора 2,0 М метабисульфита натри , рН 6,0. Через 1,5 ч прибавл ют 11,6 мл изопропилового спирта и выдерживают в течение 15 мин. Затем осаждают сульфированные нуклеотидные последовательности центрифугированием при SOOOg в течение 15 мин, Осадок дважды промывают 70%-ным этиловым спиртом, высушивают на воздухе в течение 15 мин и раствор ют сульфированные нуклеотидные последовательности в 0,05 мл ТЭН-буфера. Общее врем подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействи с эталонными образцами составл ет 3 ч,

Дл сравнени исследуемый материал обрабатывают на носителе - нитроцеллю- лозном фильтре в соответствии с известным способом. Суспензию клеток нанос т на поверхность нитроцеллюлозного фильтра, ли- зируют раствором 0,5 М гидроокиси натри в течение 10 мин, нейтрализуют раствором 1,5 М натри хлористого, 1,0 М трис-HCI, рН 7,0 в течение 13 мин, затем фиксируют тепловой обработкой при 65°С в течение 2-12 ч,

Предгибридизацию провод т путем инкубации фильтра при 37°С в течение 3 ч в 10 мл гмбридизационного раствора, содержащего 50% формамида, 5хССР (1хССР соответствуе раствору 0,15 М натри хлористого , 0,015 М натри лимоннокислого), 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% овальбумина, 0,1% додецилсульфата

натри , 75 мкг/мл денатурированной прогреванием при 100°С и фрагментированной ультразвуком ДНК тимуса теленка. Общее врем подготовки исследуемого материала на носителе составл ет 5,5-15,5 ч. .

0 По 0,2 мл растворов овальбумина с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере и ДНК тимуса теленка с концентрацией 1 мг/мл в ТЭН-буфере подвергают такой же физико- химической обработке предлагаемым спо5 собом, как и бактериальные клетки. Полученные препараты используют в качестве контрольных.

На нитроцаллюлозный фильтр нанос т в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов

0 сульфированных нуклеотидных последовательностей из бактериальных клеток и контрольных препаратов ДНК тимуса теленка и овальбумина. Фильтр высушивают на воздухе в течение 30 мин.

5Дл вы влени маркированного исследуемого материала и контрольных препаратов используют иммуноферментный метод. Фильтр помещают а 10 мл раствора дл блокировки, содержащего буфер ФСБ сле0 дующего.состава: 0,007 М натри фосфорнокислого двузамещенного, 0,003 М натри фосфорнокислого однозамещенного, 0,12 М натри хлористого. 0,02% глицина, 0,3% Твин-20, рН 7,4, с добавлением овальбуми5 на до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Через 30 мин фильтр перенос т в 10 мл буферу ФСБ, содержащего конъюгат имму- ноглубул(лнов кролика против сульфированной ДНК с перексидазой хрена в

0 разведении 1:200 и выдерживают в течение 1 ч. Фильтр отмывают три раза по 10 мин, каждую поомывку провод т в 20 мл буфера ФСБ. Затем фильтр погружают в 5 мл раствора хромогенного субстрата, содержаще5 го 0,2% бензидина, 0,4 М аммони хлористого, 3% перекиси водорода, 0,02 М ЭДТА, рН 6,0, Выдерживают 20 с, затем фильтр промывают водой и высушивают на воздухе в течение 15 мин. Оценку результа0 тов провод т визуально, счита за положительный по вление сине-голубой окраски.

Из результатов следует, что иммунофер- ментным методом вы вл ютс нуклеотидные последовательности исследуемого

5 материала и контрольной ДНК, но не вы вл етс препарат контрольного белка.

Представленные данные свидетельствуют , что предлагаемый способ позвол ет вводить специфическую метку в исследуемый материал без очистки его нуклеотидных

последовательностей. При этом маркирование белка, составл ющего основную часть примесей, не происходит. Общее врем подготовки исследуемого материала к реакции комплементарного взаимодействи с эталонными образцами предлагаемым способом по сравнению с известным сокращаетс по меньшей мере на 2,5 ч.

Пример 2. В качестве эталонных образцов (зондов) используют ДНК плазми- ды pTZ 18R и фага Я. Дл денатурации ДНК растворы зондов с концентрацией 0,2 мг/мл в ТЭН-буфере прогревают при 100°С в течение 10 мин. На три нитроцеллюлозных фильтра нанос т в виде отдельных точек по 0,01 мл растворов зондов. Фиксацию зондов на фильтрах и предгибридизацию провод т в соответствии с известным способом. В качестве исследуемого материала используют суспензии бактериальных клеток штаммов E.coli TG I (pTZ 18R), E.coli CSH 45 ( A Cl 857S7) и Bac.subtilis 168, обработанные и маркированные по методике, описанной в примере 1. Фильтры с фиксированными эталонными образцами помещают в полиэтиленовые пакеты и внос т в каждый по 1 мл гибридизационной смеси, содержащей 0,95 мл гибридизационного раствора и 0,05 мл одного из препаратов маркированного исследуемого материала. Пакеты запаивают и инкубируют при 37°С в течение 24 ч. Удал ют из пакетов гибриди- зационные смеси. Фильтры отмывают в течение 45 мин, инкубиру их при 65°С в 200 мл раствора 5хССР, 0,1% додецилсульфата натри , затем 5 мин в растворе 2хССР при комнатной температуре. Фильтры высушивают на воздухе в течение 30 мин.

Инкубацию фильтров в растворе дл блокировки и в растворе коньюгата иммуноглобулинов кролика против сульфированной ДНК с пероксидазой хрена, отмывку фильтров и окрашивание комплементарных нуклеотидных последовательностей в растворе хромогенного субстрата провод т, как описано в примере 1.

Как следует из полученных данных, окраска по вл етс лишь в точках фиксации эталонных образцов, комплементарных нуклеотидных последовательност м маркированного исследуемого материала. Некомплементарные нуклеотидные последовательности предлагаемым способом не вы вл ютс .

Таким образом, предлагаемый способ действительно позвол ет вы вл ть в иссле- 5 дуемом материале нуклеотидные последовательности , комплементарные эталонным образцам, и применим дл идентификации как бактерий, так и вирусов. По сравнению с известным способом, предлагаемый спо- 0 соб за счет снижени веро тности неспецифических реакций не дает ложно положительных результатов и они имеют однозначную интерпретацию.

Преимущества предлагаемого способа 5 перед известным - ускорение анализа и повышение достоверности его результатов путем снижени веро тности неспецифических реакций - достигаютс за счет других отличительных признаков - маркировки ис0 следуемого материала (сульфирование) без очистки его нуклеотидных последовательностей и гибридизации маркированного материала с предварительно фиксированными на носителе эталонными образцами.

5Использованный метод детркции результатов гибридизации вл етс качественным и не позвол ет определ ть количество гибридных нуклеотидных последовательностей . Однако этот метод ис0 пользован лишь дл иллюстрации принципиальной осуществимости предлагаемого способа и не вл етс единственно возможным .

Claims

Формула изобретени

5Способ вы влени нуклеотидных последовательностей , включающий подготовку носител , исследуемого материала, эталонного образца, введение метки, проведение реакции комплементарного взаимодейст0 ви на поверхности носител нуклеотидных последовательностей исследуемого материала и эталонного образца с последующей регистрацией результатов по наличию метки в продукте взаимодействи , отличаю5 щ и и с тем, что, с целью ускорени способа и повышени достоверности его результатов за счет снижени веро тности неспецифических реакций, в качестве исследуемого материала используют лизат кле0 ток, метку ввод т непосредственно в полученный лизат, а дл проведени реакции на носитель нанос т эталонный образец , а затем меченый исследуемый материал.