SU1315472A1 - Штамм гриба @ @ ВКПМ @ -326 - продуцент лимонной кислоты - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма гриба, используемого дл  производства лимонной кислоты в услови х глубинного культивировани  . Селекционированный штамм As- pergillus niger ВКПМ F-326 обладает высокой активностью образовани  лимонной кислоты при глубинном культивировании на разбавленных и концентрированных мелассных средах, образу  до 9,9 кг/м в 1 сут лимонной кислоты . При этом выход от редуцирующих веществ составл ет 88,2%. 4 табл. g (Л

Description

11

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма гриба вида Aspergillus niger, продуцирующего лимонную кислоту в услови х глубинного культивировани  .

Целью изобретени   вл етс  получение нового штамма, обладающего высокой продуцирующей активностью по образованию лимонной кислоты при ферментации на мелассных растворах.

Новый штамм получен в результате селекции с использованием метода генной инженерии: гибридизации путем сли ни  протопластов, полученных из мицели  двух штаммов Aspergillus niger штамма Л-106, культивируемого в производстве лимонной кислоты поверхностным способом, и штамма Л-4. В результате гибридизации выделен реком- бинатный штамм 91-2 с новыми свойствами , объедин ющий в себе генотипы двух промышленных штаммов, дающих потомство, совмещающее свойства родительских штаммов.

Протопласты получают из 17-часового мицели , выращенного на минимальной синтетической среде, содержащей , г/л:

Глюкоза 3,0 Дигидроорто- фосфат кали  0,5 Сульфат магни , .гидрат0,5

Сульфат аммони 0 ,5 Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)0,5 Пептон2,5 Вода Остальное

В качестве литического фермента примен ют смесь дрожжелитина Г10Х и лиофилизированного пищеварительного сока виноградной, улитки (ПСУ) в 0 мМ фосфат-цитратном буфере. Стабилизатором протопластов служит 0,6 М КС1. Сли ние- протопластов осуществл ют в 30%-ном растворе полиэтиленгли- кол , содержащем 0,01 М регенерацию слившихс  протопластов - на плотной гипертонической минимальной среде. Из 100 отобранных рекомбинатон один - 91-2 синтезирует наибольшее количество лимонной кислоты с высоким выходом от сахара. Дл  закреплени  новых свойств конидии выделенного ре- комбината обрабатьгоают 0.,01%-ным вод

22

ным раствором 1 ,,4-бис-диазоацетилбу- тана (ДАВ) в течение суток при +4°С. Из 100 полученных мутантов после изучени  их кислотообразующей способнос- ти отбирают мутант 91-2-79 - штамм Л-5 (Ленинградский-5), имеющий номер ВКПМ F-326.

Новый штамм обильно образует конидии золотисто-желтого цв ета,  вл ющиес  посевным материалом в производстве лимонной кислоты. В 7%-ном по сахару сусле конидии начинают прорастать через 6ч.

Штамм  вл етс  более устойчивым

к бактериальной флоре (Е. coli, B.me- sentericus. С, tropicalis и др.), сопутствующей производству лимонной кислоты, по сравнению с производственными штаммами Л-1 и Л-4.

Штамм ВКПМ F-326  вл етс  активным продуцентом лимонной кислоты при глубинном культивировании как в услови х технологии разбавленных, так и по техйологии концентрированных сред.

При культивировании в глубинных ; услови х на разбавленных меласных средах штамм образует на 8,6% больше лимонной кислоты с 1 М в сутки. Одновременно снижаетс  удельный расход мелассы на 11,5% по сравнению с производственным штаммом Л-1.

Морфолого-культурапьные признаки. Диаметр колонии, конидиальных головок , длина конидиеносцев, диаметр

конидий у нового штамма приближаютс  к размерам тех же величин родительского штамма Л-106. Длина стеригм I и II пор дков у штамма близка к другому родительскому штамму - Л-4.

Новый штамм имеет мелкие пузырьки на конидиеносцах.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-326 на суслоагаре образует крупную колонию , достигающую на 5-е сутки в диаметре в среднем 8,1 см. Окраска колонии золотисто-желта . Воздушный мицелий хорошо развит, конидиеношение обильное, В центре конидиальные головки расположены плотно, несколько

возвьш1аютс  над остальными. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,4 см светла  аконидиальна  зона. Обратна  сторона колонии гладка 

бела .

На 5-е сутки на среде Чапезса вырастает колони  диаметром 5,7 см. Окраска колонии золотисто-желта .

313

в центре колонии конидиальные головки крупные, расположены несколько плотнее, чем по остальному газону роста. К краю колонии величина кони- диальных голавок уменьшаетс , нарастающий край в радиусе 0,4 ем покрывают незрелые мелкие конидиальные головки. Обратна  сторона колонии гладка , бела .

Признаки нового шт.амма представлены в табл. I . .

Морфологические свойства у п ти- суточных культур, выращенных при на суслоагаре, следующие: конидиальные головки круглой формы, диаметр их сечени  74-169 мкм, средний диаметр головок 119 мкм. Вздутие ко- нидиеносца (пузырь) шаровидной формы диаметром от 22x20 до 62x80 мкм, средний диаметр 36x34 мкм. Стеригмы двуслойные , длина стеригм первого пор дка 5,3-25,3 мкм, в среднем 14,8. Стеригмы второго пор дка длиной 4,Ох х9,3 мкм, в среднем 6,0 мкм. Конидии круглые с толстой желтой оболочкой. Средний диаметр конидий 3,75 мкм. Конидиеносды пр мые, бесцветные,длина конидиеносцев 400-2000 мкм, ширина 8-25 мкм.

Образование лимонной кислоты у нового штамма изучено при различных режимах ведени  процесса:

в лабораторных опытах в глубинных услови х выращивани  на мелассных средах с содержанием сахара 30 г/л (табл. 2);

в лабораторных опытах в глубинных услови х на мелассных средах с содержанием сахара 130 г/л (табл. 3);

в производственных циклах в цехе глубинной ферментации по производству лимонной кислоты на мелассных средах с исходной концентрацией сахара 30 г/л по технологии ферментации отъемно-доливным способом (табл. 4).

Результаты испытаний предлагаемого штамма по сравнению с известными 1-1 и Л-4 предста влены в табл. 2-4.

Из таблиц следует, что штамм Л-5  вл етс  более активным кислотообра- зователем при всех испытанных режимах по сравнению с производственными штаммами.

Пример 1. Процесс ферментации осуществл ют в глубинных услови х на качалке типа АВУ-50 р с числом

5

54724

качаний 160 в мин в колбах емкостью 700 см при .

Опыты провод т на образце мелассы , имеющей следующую характеристику: 5 сахароза 46%, СаО 1,31%, рН 6,3.

Дл  подращивани  мицели  готов т мелассньй раствор, содержащий 30 г/л сахара. Состав среды дл  подращивани  , г /л: 0 Меласса 65,1

Карбонат натри  0,087

Гексацианоферроат кали , гидрат 0,261

Оксалат аммони , гидрат (дл  полного осаждени 

СаО)2,16

Дигидроортофосфат кали  0,16 0 Сульфат магни ,

гидрат0,25

Сульфа;т цинка,

гидрат0,005

рН6,8-7,2

ВодаДо 1 л

Дл  ферментации готов т мелассную среду, содержащую 30 г/л сахара (указанна  среда дл  подращивани  мицели ), но без добавлени  сульфата маг- ни . Состав среды дл  подлива следующий , г/л:

Меласса 543,4

Гексацианоферроат кали , 5 гидрат2,355

ВодаДо 1 л

Дл  приготовлени  споровой суспензии 0,1 г спор Aspergillus nlger замачивают в 10 мл мелассного раствора, 0 приготовленного дл  подращивани  мицели , в течение 1 ч при . Приготовленный дл  ферментации мелассный раствор разливают в колбы по 50 мл и засевают 10 мл споровой суспензии. В этой среде споры подращивают 24 ч. Подрощениый мицелий посевньм материалом дл  засева ферментируемой среды.

0 Среду, приготовленную дл  ферментации , разливают в колбы по 50 мл и внос т в них по 10 мл подрощенного мицели .

В процессе ферментации провод т

5 подливы мелассного раствора, содержащего 250 г/л сахара, по следующей схеме: первый подлив через 24 ч ферментации в количестве 10 мл, второй подлив через 30 ч ферментации в количестве 9 мл, а затем по А мл чере 5, 6 и 7-е сутки ферментации. Проце ведут 9 сут.

В качестве контрол  используют производственные штаммы Л-4 и Л-1. Результаты испытаний, представленны в табл. 2, показывают, что у селекционированного штамма возрастает массова  дол  лимонной кислоть в составе синтезируемых кислот.

Съем лимонной кислоты у нового штамма возрастает на 11,8% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,3% по сравнению со штаммом Л-4.

У нового штамма соответственно увеличиваетс  выход лимонной кислот от сахара на 11,9% по сравнению со штаммом Л-1 и на 6,4% по сравнению со штаммом Л-4.

Пример 2. Услови  проведени  те же, что и в примере 1. Подращивание мицели  провод т иа мелас сных средах, содержащих 50 г/л сахара; на ферментацию используют мелас сные среды с содержанием сахара 130 г/л.

Дл  подращивани  используют мела сную среду, содержащую, г/л:

Меласса 109

Карбонат натри 0 ,145

Гексацианоферроат кали , гидрат 0,436

Оксалат аммони ,

гидрат (дл  полного осаждени 

СаО)3,63

Сульфат магни ,

гидрат0,25

Дигидроортофосфат кали  0,16

Сульфат цинка,

гидрат 0,005

рН6,8

ВодаДо 1 л

Дл  ферментации используют мелас сную среду, содержащую, г/л: Меласса 283 Карбонат натри  0,38 Гексацианоферро- ат кали , гидрат 1,128 Оксалат аммони , гидрат (дл  выведени  1/2 солей кальци  в пересчете на СаО)4,7

Дигидроортофосфат кали 0,16

5

0

5

Сульфат цинка, гидрат0,005

рН6,0

ВодаДо 1 л

Дл  приготовлени  споровой суспензии 0,1 г спор Aspergillus niger замачивают в 10 мл мелассного раствора , содержащего 50 г/л сахара и приготовленного по прописи дл  подращивани  мицели , в течение 1 ч при 32 С. Приготовленный мелассный раствор дл  подращивани , содержащий 50 г/л сахара, разливают в колбы по 50 мл и засевают 10 мл споровой суспензии . В зтой среде споры выращивают 24 ч. Подрощенный мицелий служит посевным материалом дл  засева ферментационной среды.

Ферментационную среду с содержанием сахара 130 г/л разливают в колбы по 50 мл и внос т в них по 10 мл подрощенного мицели . Весь процесс ферментации протекает на исходном растворе без дополнительных дробных доливов питательной среды и заканчиваетс  через 5 сут (табл. 3).

Контролем служат варианты опытов, в которых процесс ферментации осуще0 ;ствл ют в тех же услови х, но возбудител ми процесса  вл ютс  производ- ственные штаммы Л-1 и Л-4 (табл. 3).

Испытани  показали, что на концентрированных мелассных средах с содержанием -сахара 130 г/л полученный щтамм увеличивает съем лимонной кислоты на 12,% по сравнению со штаммом Л-1 и на 7,9% по сравнению со штаммом Л-4. Кроме того, селекциони0 рованный штамм увеличивает выход лимонной кислоты от сахара на 12,1% по сравнению со штаммом Л-1 и на 7,7% по сравнению со штаммом Л-4, культивируемыми в тех же услови х.

Пример 3. Выращивание кислотообразующего мицели  нового штамма и синтез лимонной кислоты осуществл ют глубинным способом на разбавленной по сахару мелассной среде в

0 производственных услови х.

На замачивание конидий, подращивание посевного материала, ферментацию и доливы используют мелассный раствор, приготовленный из одной и

5 той же мелассы с отработанным дл  нее режимом приготовлени  сред.

При ведении процесса t использованием штамма ВКПМ F-326 на разбавленной среде подращивание осуществл 5

5

меласют в 5 м -ферментаторах с 3 м сной среды с содержанием сахара 30 г/л. Через 24 ч подрощенный мицелий в объеме 3м перевод т в ферментатор , содержащий 27 м мелассного раствора с концентрацией сахара 30 г/л. Через 24 ч ферментации начинают подлив мелассного раствора, содержащего 180 г/л сахара, по I м через каждые 1,5 ч.

На 5-е сутки ферментации провод т отъем ферментированного раствора в количестве 5 м . После отъема в ферментатор ввод т 5 м мелассного раст вора, содержащего 180 г/л сахара .

Процесс ферментации заканчиваетс  через 7 сут, в контрольном опыте - 8 сут. В качестве продуцента в контрольном цикле, проведенном по тому же режиму ферментации, используют производственный штамм Л-1.При таком ведении процесса у нового штамма массова  дол  лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот в среднем из четьфех опытрв составл ет 86,73%. Съем лимонной кислоты с 1 м в сутки

Втакм

Окраска коккдий

Л- (из- Бежева 87132 50x50 330-1320 П-20 10,4 6,3 4,1

.вестиый)

Л-5 Зблотнс-57119 33x35 400-2000 12,4 14,8 6,0 3,75

(ВКПМ F-326) то-желта 

9,55

, 9.55

9,55

9,0 6,13 93,4 б.б О

9,0 5,53 92,7 7,34 О 9,0 5,85 92,2 7,8 О

8

0

5

0

9,9 кг, удельный расход 46%-ной мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2466 кг, выход лимонной кислоты от сахара - 88,16% (табл. 3). У производственного штамма Л-1 массова  до- л  лимонной кислоты в составе синтезируемых кислот составл ет 86,14%, съем лимонной кислоты с 1 м в сутки - 8,64 кг, удельный расход 46%- ной мелассы на 1 т лимонной кислоты - 2697 кг, выход лимонной кислоты от сахара - 80,6% (табл. 3).

Таким образом, новый штамм в услови х производства образует на 11,5% больше лимонной кислоты с 1 м в сутки и дает экономию мелассы на 8,6% по сравнению с производственным штаммом Л-. Кроме того, штамм за менее продолжительный (7 сут) цикл быстрее, чем штамм Л-1 накапливает то же количество лимонной кислоты.

Claims (1)

1. Формула изо.бретени 

   Штамм гриба Aspergillus niger

   ВКПМ F-326 - продуцент лимонной кислоты .

   Таблица I

   5.72 10,6 И1,в 6й И1,9 I06,i

   5,12 9,48 100 53,6 100 - 5,39 10,0 105,5 56,4 - 100

   7.0

   7,0

   7,0

   5,0 4,27 93.0 7,0 О 5,03,84 92,0 8,0 О

   5,04,05 91,0 О

   Л-1

   Л-5

   -(ВКПМ Г-326)

   7,98 86,14 3,12 10,74 3700 8,64 100,0 2697 100 80,6 7 86,73 7,23 6,04 3717 9,9 1И,5 2466 91,4 38,2

   Составитель 3. ФаЛуиина Редактор Н. Егорова Техред А.КравчукКорректор т. Колб

   Заказ 2316/26 .Тираж 499Подписное

   ВНИШШ Государственного комитета СССР

   по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

   т а б л и ц а 3

   3,972 13,24 112,5 56,7 112,1 107,7 3,53 11,77 100,0 50,4 100,0

   3,69 12,30 104,6 52,7 -100,0

   Таблица 4