KR900003744B1 - 세라티오 펩티다제(Serratiopeptidase)를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세라티오펩티다제의 생산방법 - Google Patents

세라티오 펩티다제(Serratiopeptidase)를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세라티오펩티다제의 생산방법 Download PDF

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Description

세라티오 펩티다제(Serratiopeptidase)를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 세라티오펩티다제의 생산방법
본 발명은 세라티오 펩티다제를 생산하는 미생물 자체와 이를 이용하여 세라티오펩티다제를 생산하는 방법에 관한것으로, 좀더 구체적으로는 세라티아 마르세렌스(ATCC 25419)의 변이주로써 프로디오지신(prodigiosin)색소를 성산하지 않으며 탄소원 및 질소원으로 포도당을 사용하여도 세라티오펩티다제를 고역가로 생산하는 변이주와 이를 이용하여 세라티오펩티다제를 생산하는 방법에 관한 것이다.
세라티오 펩티다제는 세라티아(Serratia)속의 미생물을 적당한 배양배지에 배양하여 얻을수 있는 효소로써 우수한 소염작용을 가지며 현재 소염재로써 널리 사용되고 있다.
종래의 세라티아 속 균주를 이용한 세라티오펩티다제 생산 방법에 있어서의 세라티아속 미생물의 배양액중에는 주생산물인 세라티오 펩티다제 이외에 540μm의 파장에서 최대흡수를 나타내는 프로디지오신이 부산물로 다량 존재하고 또한 이 색소는 정제공정을 복잡하게 할뿐만 아니라, 색소 제거공정중 회수율이 떨어져 제조원가를 가중시킬 뿐만 아니라 제품의 품질또한 저하시키는 등의 문제점이 있었다.
또한 배양배지로 사용되는 카제인(Casein), 스킴밀크(Skim milnk)등은 주생산물인 세라티오 펩티다제의 생산뿐만 아니라, 부산물인 색소를 생산하는테 사용됨으로써 생산성 감소의 요인이 되며 탄소 및 질소원으로 밀크카제인(Milk casein)이나 스킴밀크(Skim milk)등을 사용하는 일반적인 배지는 제조원가를 지나치게 가중시키는 문제점을 대두 시키는 결점이 있었다.
종래에 밀크카제인이나 스킴밀크를 사용하는 것은, 포도당만을 사용하면 균주 고유의 유전적 특성에 의해 균주만이 생육되고 세라티오펩티다제의 생산은 저하되기 때문이다.
이런 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 세라티오 마르세센스(ATCC 25419)를 변이시켜 프로디지오신은 생산하지 않고 탄소원으로 사용될수 있는 포도당이 과량으로 존재하는 배양 배지에서도 세라티오펩티다제를 고역가로 생산할수 있는 변이주를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명 변이주의 분리방법은 세라티아 마르세센스(ATCC 25419)를 친주로하여 자외선 조사 또는 화학변이 유기제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아닌을 통상적인 방법에 따라 처리하여 2-데옥시 클루코오스(2-deoxyglucose)를 첨가하고 밀크카제인을 질소원 및 탄소원으로 하는 배지(주2)에서 1일간 배양한다음, 복합배지(주1)에 도말하여 배양시켜 투명환(Clear Zone)이 큰 균주를 선별하므로서 포도당의 존재하에서도 고역가의 세라티오펩티다제를 생산할수 있는 특성을 가진 균주를 얻어 CS 5521이라 명명하고, 이를 모주로하여 상술한 방법으로 다시 변이주분리를 행하였다. 즉 CS 5521을(주3)배지에서 배양하면서 콜로니의 색깔이 엷은 황색 또는 무색인것을 선별한 다음,(주2),(주4),(주5) 배지에서 배양하여 포도당을 탄소원으로 사용하며 프로디지오신을 생산하지 않는 세라티오 펩티다제의 생산성이 우수한 균주를 선별하여 CS-5897이라 명명하고 1988.6.3.(한국종균협회)에 기탁하였다(KFCC-10618). (주2)배지는 세라티오펩티다제의 생산저해제인 2-데옥시 글루코오스(2-deoxyglucose)를 첨가한 배지이며 이배지에 변이 처리시킨 세라티아속 균주를 배양하면 2-데옥시글루코오스의 존재하에서도 세라티오펩티다제를 생산하므로써 밀크카제인을 분해하여 이용할수있는 변이주만 성장하게 된다.
본 발명자들이 분리한 변이주(KFCC-10618)의 특성은 세라티아속의 변이주로서 일반적으로 세라티아속의 미생물이 부산물로서 생산하는 프로디지오신을 생산하지 않고, 포도당이나 2-데옥시글루코오스의 존재하에서도 세라티오펩티다제의 생산성이 우수한 본절적인(constitutive mutant)성질을 가짐으로써 탄소 및 질소원으로 밀크카제인 또는 스킴밀크를 사용하던 것을 포도당을 탄소원으로 사용하고 질소원은 무기 암모니아염을 사용하여 세라티오펩티다제를 생산할 수 있는 변이주이다. 물론, 종래의 방법과 같이 스킴밀크, 밀크카제인을 사용할 경우에는 더욱 우수한 생산성을 나타내며 포도당과 카제인을 혼합하여 사용할수도 있다.
본 발명에서 사용한 효소의 역가는 37°에서 매분당 티로신(Tyrosine)lug을 생산하는 효소량을 1유니트(unit)라고 정의하였으며 역가 측정방법은 코우치 미야타등의 방법(Kouichi MIYATA 등, Agr. Biol.Chem, Vol.34, No2, P.310-318 1970)을 사용했다.
(주1) 복합배지 ; 스킴밀크 5g/1, 포도당 1g/1, 효모액기스 5g/1, K2HPO41g/1, 한천 20g/1, pH 7.0
(주2) 2-데옥시 글루코오스 첨가배지 : 밀크카제인 5g/1, Na2HPO46g/1, KH2PO43g/1, NH4Cl3g/1, NaC1 0.5g/1, MgSO4·7H2O 2g/1, CaCl20.lg/1, 치아민염산염 350mg/1, 2-데옥시글루코오스 0.5-1g/1, pH 7.0
(주3) 배지 : (주2)배지에 한천 20g/1를 첨가한 고체배지
(주4) 배지 : (주2)배지에서 밀크카제인 대신 포도당 20g/1를 첨가하고 2-데옥시글루코오스를 제외한 배지
(주5) 배지 : 밀크카제인 10g/1, KH2PO412.5g/1, CaCl2·2H2O 0.2g/1, MgSO4·7H2O 0.2g/1, KC1 0.5g/1, 탈지대두박*10g/1, pH7.0
*탈지테두박은 10g을 400ml의 물에 넣고 30℃에서 1시간동안 추출한후 여액을 사용함.
(주6) 배지 : 주5배지에 밀크카제인 대신 포도당 20g/1를 첨가한 배지.
본 발명의 변이주 CS5897(KFCC-10618)의 생리적 특성을 종래의 균주와 비교하여 표1에 기재하였다.
[표 1]
Figure kpo00001
본 발명 변이주(KFCC-10618)를 이용하여 세라티오렙티다제를 생산하는 방법을 실시예에 따라 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
[실시예 1]
사용균주 ; 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens, ATCC 25419) 및 본 발명변이주(KFCC-10618)
종배지 : 펩톤 10g/1, 효모액기스 10g/1, 포도당 2g/1, K2HPO42g/1, pH 7.0
발효배지 : (주4)배지
발효방법 ; 종배지 20ml를 100ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압멸균한후 균주를 접종한후 10-15시간 배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지(주4) 2000ml를 51시험 발효조에 넣고 상법에 따라 가압멸균후(121℃, 20분)종배양액 20m1를 접종한 다음, 교반속도를 매분당 200-300회, 온도를 25℃-30℃, pH를 6.8로 조절하고 공기 유량을 분당 0.51-21를 공급하면서 배양하고, 배양중 포도당 농도를 측정하여 0.5%정도가 될때 추가당을 첨가하여 1.5%의 포도당 농도가 되게 하였으며, 총발효시간을 24-30시간 배양하였다.
발효완료액의 프로테아제 역가(Protease activity)를 측정한 결과, 세라티아 마르세센스(ATCC 25419)는 50-300u/ml이고 프로디지오신 색소를 다량생산한 반면, 본발명 변이주(KFCC-10618)는 3000-5000u/ml이었으며 배양액은 백색 또는 아주 엷은 황색을 띄었다.
역가가 4600u/ml인 본 발명 변이주의 배양액 21를 암모늄설페이트[(NH4)2SO4] 또는 저급알콜(에탄올, 이소프로판올, 아세톤등)을 사용하여 분획하고 한외여과, DEAE 셀룰로오즈, 세파덱스 G-75 (Sephadex G-75) 등으로 정제하여 동결건조한 결과, 역가가 9000u/mg인 세라티오 펩티다제 510mg을 얻을수 있었다.
[실시예 2]
사용균주 : 실시예 1와 동일
종배지 : 실시예 1과 동일
발효배지 : (주5),(주6)배지
발호방법 ; 배양중(주5)배지는 밀크카제인이 소모된 시점에서(배양시간 : 15-20시간)배양액 총액량대비로 1.0%가 되게 밀크카제인을 1회 첨가하였으며, (주6)배지는 포도당 농도가 0%정도일때 밀크카제인 또는 스킴밀크를 1%가 되게 1회 첨가한 것을 제외하고는 실시예1과 같다.
배양완료액의 프로테아제 역가는세라티아 마르세센스는(주5)배지에서 2000-4000u/ml, (주6)배지에서는 500-1000u/ml이고 프로디지오신 색소가 다량생산된 반면, 본 발명 변이주는 (주5)배지에서 9000-12000u/ml(주6)배지에서는 7000-9000u/m1였으며 배양액의 색깔은 백색 또는 엷은 황색이였다.
상술한 바와같이 본 발명은 세라티오펩티다제 생산능이 있는 균주를 프로디지오신 색소를 생산하지 않고 포도당을 탄소원으로 사용하여도 고수율로 효소를 생산할수 있도록 변이시킨 변이주(KFCC-10618)에 관한것으로, 본 발명 변이주를 이용함으로써 종래 균주보다 고수율로 세라티오 펩티다제를 생산할수있는 것이 확인되었다.

Claims (2)

  1. 세라티아속에 속하고 프로디지오신(prodigiosin)색소를 부산물로 생성하지 않거나 극히 소량 생산하며 배양배지의 탄소원으로 포도당, 질소원으로 무기암모니아염을 사용할수 있는것을 특징으로 하는 세라티오펩티다제 생산능이 있는 미생물(KFCC-10618).
  2. 탄소원으로서 포도당을 사용하는 배지에 세라티아속 미생물(KFCC-10618)을 배양함을 특징으로 하는세라티오펩티다제의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108148781A (zh) * 2018-01-25 2018-06-12 浙江工业大学 一株不产灵菌红素的粘质沙雷氏菌及其制备舍雷肽酶的应用

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