SU1304748A3

SU1304748A3 - Способ получени производных тетрагидроизохинолина

Info

Publication number: SU1304748A3
Application number: SU813282548A
Authority: SU
Inventors: Т.Сах Джон; Е.Вильямс Бруц; В.Скайлз Джерри
Original assignee: Юсв Фармасьютикаи Корпорейшн (Фирма)
Priority date: 1980-05-12
Filing date: 1981-05-11
Publication date: 1987-04-15
Also published as: ATE21511T1; FI811424L; JPS577470A; ES502064A0; KR830006210A; NO811599L; ES8203368A1; YU120481A; IL62782A0; KR850001088B1; AU546218B2; DE3175150D1; DK206881A; IN152326B; EP0039804B1; NZ197048A; EP0039804A1; AU7045081A; ZA812941B; US5200416A

Abstract

Изобретение касаетс производных азотогетероциклических соединений , в частности соединений общей формулы I СЮЮУ СН-Ш-С-f-CH -CHi СН-СН- сCHi-N-CtObCRiRj-CRjpik-S-Rs , где Y - низший алкил; R, 4 за- висимо друг от друга Н или С,-Cg-алкил; Ry-H, С -С -алконоил, которые как про вл ющие противогипертензив- ную активность могут быть использованы в медицине. Дл вы влени активно сти у соединений указанного класса бьши получены новые соединени Т, Реакцию ведут из тетрагидроизохинолина и алкилирующей кислоты в присутствии дициклокарбодиимида с последующим гидролизом и выделением целевого со- .единени I с выходом до 91%. Соединени I вл ютс активными ингибиторами ангиотензинпревращени энзима; токсичность LDj.Q 84 мг/кг живой массы. с S (У) 00 о 4 4 00

Description

Изобретение относитс к способу получени новых производных тетрагид- роизохинолина, обладающих ценными фармакологическими свойствами, позвол ющими их примен ть в медицине.

Цель изобретени - синтез новых соединений, обладающих противогипер- тензивной активностью и активностью

Н-бензилкарбетокси-Ь-1,2,3, рагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (46,5 Г;, 0,150 моль) раствор ют в метиленхлориде (1000 мл) и добавл ют концентрированную серную кислоту (7 мл), Получающуюс смесь охлажингибирующей Превращение ангиотензин-- дают в бане с сухим льдом и ацетоном превращающего энзима.

до -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хран т в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавл по кап л м 10%-ный раствор водного карбоната кали . Органическую фазу отдел ют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магни . После фильтровани и выпаривани раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.

Пример 1. L-1,2,3,4-тетра- гидроизохинолин-3 карбонова кислота.

Суспензию L-фенилаланина о(75 г, 15 0,455 моль) в концентрированной сол ной кислоте (488 мл) и 37%-ньш формалин (165 мл) медленно нагревают с обратным холодильником при интенсивном перемещивании в течение 30 мин. По 20 проществии этого времени добавл ют другую порцию 37%-ного формалина (75 мл) и концентрированной сол ной кислоты (165 мл). Перемешивание и нагревание продолжают в течение 4ч, Реакционную смесь охлаждают до.крм- натной температуры и Образовавшийс твердый осадок отфильтровывают и про- мьшают небольшим количеством метанола; при этом получают гидрохлорид в 30 виде бесцветного твердого вещества (68,9 г, 71%), т.пл. 291-294°С,

2. L-бензилкарбедо -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хран т в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавл по капл м 10%-ный раствор водного карбоната кали . Органическую фазу отдел ют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магни . После фильтровани и выпаривани раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.

Пример 4, трет-Бутил N-(1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат .

трет-Бутил N-бeнзилкapбeтoкcи-L- -(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3- -карбоксилат (45 г, 0,123 моль) раствор ют в абсолютном этаноле (600 мл)

Пример

токси-L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин- 35 й добавл ют Го% р1/с () Получаю-3-карбонова кислота,

щуюс смесь гидрогенизируют в мешалГидрохлорид L-1,2,3,4-тетрагидро- изохинолин-3-карбоновой кислоты (58,8 г, 0,275 моль) раствор ют в 1 N гидроокиси натри (600 мл) и получающийс раствор охлаждают в лед ной бане. Добавл ют по капл м бензил хлороформат (39,0 мл, 0,263 моль). После этого добавл ют бензил-хлоро- формат (30 мин) при перемешивании в течение часа при комнатной температуре , а затем добавл ют другую порцию 1 N гидроокиси натри (100 мл). Перемешивание продолжают в течение последующих 2-2,5 ч. Реакционную смесь подкисл ют до рП 4 концентрированной сол ной кислотой и продукт экстрагируют хлороформом. Органическую фазу дважды промывают водой и суиат над сульфатом магни , йосле фильтровани и испарени растворител получают бесцветное масло (86,3 г, 91,5%), которое можно использовать без дальнейшей очистки.

40

ке Парра низкого давлени под давлением 50 футов на KB, дюйм в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель вьтаривают с получением неочищенного продукта в виде бледно- голубого масла (24,8 г, 86,4%), кото рый используют без дальнейшей очистки .

5 Пример 5о трет-Бутил N-(3 ацетилтио-2 -метилпропаноил)-L-(1,2, 3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат , I

5Q К раствору трет-бутила ,-(1,2,3,

4-тетрагидроизохинолина)-3-карбокси- лата (8,1 г, 0,0349 моль) и 3-ацетил тио-2--мётилпропионовой кислоты (5,6 г 0,036 моль) в метиленхлориде (250мл) охлажденному в лед ной бане, добавл ют дициклогексилкарбодиимид (7,2 г 0,0350 моль). Получающуюс смесь перемешивают со внешним охлаждением в течение 30 мин, а затем примерно 3 ч

Пример 3, трет-Бутил М-бен- зилкарбетокси-L-(1,2,3,4-тетрагидро- изохинблин)-3-карбоксилат.

Н-бензилкарбетокси-Ь-1,2,3, рагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (46,5 Г;, 0,150 моль) раствор ют в метиленхлориде (1000 мл) и добавл ют концентрированную серную кислоту (7 мл), Получающуюс смесь охлаждают в бане с сухим льдом и ацетоном

до -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хран т в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавл по капл м 10%-ный раствор водного карбоната кали . Органическую фазу отдел ют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магни . После фильтровани и выпаривани раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.

й добавл ют Го% р1/с () Получаю

ке Парра низкого давлени под давлением 50 футов на KB, дюйм в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель вьтаривают с получением неочищенного продукта в виде бледно- голубого масла (24,8 г, 86,4%), который используют без дальнейшей очистки .

Пример 5о трет-Бутил N-(3 ацетилтио-2 -метилпропаноил)-L-(1,2, 3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат ,

К раствору трет-бутила ,-(1,2,3,

4-тетрагидроизохинолина)-3-карбокси- лата (8,1 г, 0,0349 моль) и 3-ацетил- тио-2--мётилпропионовой кислоты (5,6 г, 0,036 моль) в метиленхлориде (250мл), охлажденному в лед ной бане, добавл ют дициклогексилкарбодиимид (7,2 г, 0,0350 моль). Получающуюс смесь перемешивают со внешним охлаждением в течение 30 мин, а затем примерно 3 ч

313

при комнатной температуре. Осажденную дициклогексилмочевину отфильтровывают .и промьшают небольшим количеством метиленхлорида. При концентрировании фильтрата получают неочищенный продукт в виде бледно-желтого масла, который используют без дальнейшей очистки.

Пример 6. N-(3 -Ацетилтио

-2 -метилпропанил)-Ь-(1,2,3,4-тетра- гидроизохинолин),-3-карбонова кислота ,

Неочитенный трет-бутил N-(3 -ацетил тио-2 -метилпропанрил)-L-(1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3-карбокси- лат (14 г, 0,371 моль) раствор ют в смеси анизола (25 мл) и трифторуксус - ной кислоты (75 мл), Получающийс раствор перемешивают при комнатной температуре примерно -в течение часа, Трифторуксусную кислоту удал ют под вакуумом и остаток распредел ют между этилацетатом и насыщенным бикарбонатом натри , Водную бикарбонатную фазу отдел ют и дважды промывают этилацетатом, а затем осторожно подкисл ют до рН 2-А с помощью концентрированной сол ной кислоты, Осажден- ый продукт несколько раз экстрагируют хлороформом и объединенный орга- нический экстракт дважды промывают водой и высушивают над сульфатом магни , фильтруют и вьтаривают с получением бледно-желтого масла (7,3 г). Этот грубый продукт очищают с помощью жидкостной хроматографии высокого давлени с использованием смеси п-гексана : этилацетата : уксусной кислоты (30:60:1) в качестве злюанта дл получени чистого продукта в виде бесцветного масла (5,9 г). Продукт был описан в виде его диц,иклогексил- аминовой соли (ДЦГА), которую получали в эфире таллов,

Пример 7, N-(3 -MepKanTO- -2 -метилпропаноил)-L-(,2,3,4-тетра- гидроизохинолин)-3-карбонова кислота ,

Безводный аммиак пробулькивают в течение 15 мин через метанол (100 мл) и получающийс насьщенный раствор добавл ют к N-(3 -ацетилтио-2 -мев виде бесцветных крис- т,пл, 161-163°С.

тилпропаноил)-Ь-(1 ,2,3,4,-тетрагидро- „ Реакционную смесь помещают в атмосизохинолин-3-карбоновой кислоте (2,0 г, 0,00623 моль) и помещают в атмосферу азота. Реакционную смесь перемешивают при комнатной темпераферу азота продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение часа. Метанол испар ют и остаток нанос т на катион-обменную колонку . (fs

O

5

5 0 0

4

туре в течение часа. Растворитель удал ют в вакууме и остаток нанос т на колонку АС-50 W - Х2 катионобмен- ной смолы и элюируют метанолом. Метанол выпаривают и остаток раствор ют в хлороформе, Хлороформ вымывают водой один раз и высушивают над сульфатом магни . После фильтровани и вьтаривани растворител получают бесцветное масло (1,7 г, 98%), Свободную кислоту перевод т в ДЦГА соль в простом эфире с получением бесцветных кристаллов, т.пл, 146-147 С, Продукт -описывают в виде его ДЦГА соли.

Пример 8, 2-(3 -Ацетилтио- -2 -метилпропанолил)-1-фенил-3-кар- бометокси-1 ,2,3,4-тетрагидро-(0-кар- болин,

1-Фенил-3-карбометокси-1,2,3,4- -тетрагидро- -карболин (10 г, 0,04 моль) и триэтиламин (4,1 г, 0,04 моль) раствор ют в ацетонитри- ле (250 мл) и получающуюс смесь охлаждают в лед ной бане, З-Ацетшттио- -2 метилпропионилхлорид (6,5 г, 0,036 моль) добавл ют небольшими порци ми . После этого добавл ют кисльш хлорид и убирают лед ную баню; смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 2,5 ч. Растворитель выпаривают и остаток раствор ют в хлороформе. Хлороформ промывают водой, 5%-ным водным раствором NaOH, 5%-ным водным раствором НСЕ и водой. Выпаривают хлороформ высушиванием над сульфатом магни , фильтруют и испар ют с получением неочищенного продукта в виде слегка окрашенного масла. Продукт подвергают дальнейшей очистке хроматографией на силикагеле () с получением чистого продукта в виде бесцветного масла (9,6 г, 65%),

Пример 9, 2-(з -Меркапто- -2 -метилпропаноил)-1-фенил-3-карбо- метокси-1,2,3,4-тетрагидро-/3-карбо- лин,

2-(З -Ацетилтио-2 -метилпропаноил )- 1- фенил-3-карбометокси-1 ,2,3, 4-тетрагидро-й-карболин (2 г, 0,0045 моль) раствор ют в метаноле (75 мл) и через раствор пробулькивают безводный аммиак в течение 15 мин.

феру азота продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение часа. Метанол испар ют и остаток нанос т на катион-обменную колонку . (fs10

f5

танол), Метанол испар ют и остаток раствор ют в хлороформе, промывают водой, высушивают над сульфатом магни , фильтруют и выпаривают с получением продукта в виде бесцветного масла (1,6 г, 88%).

Пример 10. N-(З -Ацетил- тис- 2 метилпропаноил)-Ь-1 ,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3-карбонова кислота.

К перемешанной суспензии L-1,2,3, 4-тетрагидроиЗохинолин-З-карбоновой кислоты 40,0 г, 187,2 моль) примерно в литре р-диоксана и воды (200 мл)

добавл ют триэтиламин (78 Йл, 560,8 моль), а затем по капл м добавл ют З-ацетилтио-2-метилпропионил- хлорид (33,8 г, 187,2 моль). По мере прохождени реакции смесь становитс в основном гомогенной. По протест-20 ВИИ примерно 3 ч отфильтровывают небольшое количество растворимого материала и фильтрат концентрируют на вращающемс испарителе. Получающийс раствор разбавл ют водой и подкисл - ют до рН 2 концентрированной НСВ, после чего экстрагируют в этилацетат. Раствор этилацетата дважды промывают водой, один раз сол ным раствором, высушивают над сульфатом магни , фильтруют и испар ют с получением примерно .55 г масла. Неочищенньй продукт отдел ют методом препаративной хроматографии с элюированием 2%-ной уксусной кислоты, 40%-ным этилацета- том и 60%-ным гексаном с выходом

30,2 г (50,2%) чистого вещества, 1

Испытание in vitro на ингибирова- ние ангиотензин-превращаюр его энзима (АСЕ).

Испытание на ингибирование ангио- тензин-превращающего энзима.

Введение. Этот тест обеспечивает метод идентификации ингибировани ан- гнотензин-превращающего энзима (АСЕ). Активность энзима испытывают в присутствии и отсутствии испытуемого соединени и определ ют процентное ингибирование активности энзима.

Превращающий энзим катализирует гидролиз трипептида, гиппурил-гисти- дил-лейцина (HHL), Продуктами этой реакции вл ютс гиппурова и гистидил-лейцин.

Активность энзима может быть определена путем измерени количества гиппуроБой кислоты, образуемой за данное врем . Дп этой цели превраща45

30

35

40

50

кислота о

5

0

ющий энзим инкубируют с HHL в течение 10 мин при 37 С, Реакцию энзима останавливают с помощью добавлени сол ной кислоты. Затем гиппуровую кислоту отдел ют с помощью экстракции реакционной смеси этилацетатом. После выпаривани растворител остаток „ содержащий гиппуровую кислоту, раствор ют в воде. Концентрацию гип- пуровой кислоты определ ют спектро- фотометрически путем сравнени поглощени раствора при 228 нм с поглощением раствора известной концентрации чистого соединени , Удельную активность энзима выражают в наномол х образуемой гиппуровой кислоты мин/мг протеина. Тестуемые соединени оценивают по их способности уменьшать удельную активность АСЕ.

Препарат сырого ангиотензин-прев- ращающего энзима.

Экстракци ацетонового порощка из легкого кролика. Влили 80 мл холодного раствора 0,05 М , доведенного до рН 8,3 с помощью гидроокиси кали , в мини-контейнер из нержавеющей стали (емкость 100 мл), предварительно охлажденный льдом. Добавили 5,0 г ацетонового порошка из легкого кролика и гомогенизировали смесь в течение одной минуты с использованием смесител Waring Blender (установка 4). Контейнер охладили и продержали во льду в течение 2 мин. Повторили гомогенизацию и охлаждающую процедуру более двух раз.

Перенесли гомогенат в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом. Промыли мини-контейнер.20 мл холодного фосфатного буфера, рН 8,3, и объединили промывочную жидкос гь с гомогенатом. Перенесли гомогенат в поликарбонатные центрифугационные 5 пробирки (27x103 мм), охлаждаемые льдом. Центрифугировали в течение 40 мин при 40000 g (21500 об/мин) в роторной N 30, предварительно охлажденной до 4° С центрифуге Beckmon L 3-50. Перенесли верхний слой жидт кости в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом.

0

5

0

Влили 80 мл охлажденного раствора 0,05 М при рН 8,3 в мини-контейнер из нержавеющей стали, охлаждаемый льдом. Перенесли щарики из центрифугационных пробирок в мини- контейнер и повторили процедуру гомогенизации три раза, как это описано вьпче. Центрифугировали гомогенат, как это .описано выше, и объединили поверхностные слои с поверхностным ело ем, полученным после первого центри- фугировани . Хранили препарат при 4°С.

После сто ни в течение нескольких недель при 4 С раствор энзима может становитьс мутным и может иметь место седиментаци в колбе. Раствор энзима может быть очищен путем центрифугировани при без какого-либо существенного изменени его удель- ной активности.

Диализ сырого экстракта. Превращающий энзим, которьм должен был использоватьс дл целей скрининга, диализовали дл удалени низкомоле кул рных ингибиторов. Дл этой цели около 30-40 мл сырого.экстракта поместили в диализирующую трубку Spect- rapor № 1 (отсекаемые молекул рные веса: 6000-8000), которую предварительно промыли 0,05 М буферным раствором фосфата кали с рН 8,3. Энзим диализовали в течение ночи (около 18 ч) против такого же буфера при

энзим хранили

4 С, Диализованный при 4 С; он. сохран л полную активность в течение трех недель.

I

Определение концентрации протеина Концентрацию протеина энзимного

препарата определ ли согласно методу

Lowry (2). -;

Вода

BSA, 1 мг/мл

0,05 М , рН 8,3

Энзим в 0,05 М , рН 8,3

0,20 0,18 0,160,140,120,100,200,20

0,02 0,040,060,080,10

0,05 0,05 0,050,050,050,050,030,01

----0,020,04

Щелочной сульфат меди

1,0 1,0 1,0 1.0 1.0 1,0 1,0 1,0 Инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре

Фенольный реагент 0,1 0,1

.

O 5

0

5

0

5

Требуемые растворы получены в стекле с применением дистиллированной воды.

1.2%-ный , Растворили 5,0 г в воде и добавили достаточное количество воды дл получени 250 мл раствора.

2.4%-ный натрий калий тартрат. Растворили 10,0 г натрий калий тарт- рата в воде и разбавили водой до 250 мл.

3.2%-ный карбонат натри в О,1 М гидроокиси натри . Растворили 20,0 г карбоната натри и 4,0 г едкого натра в воде и разбавили раствор до 1000 мл водой.

4.Щелочной раствор сульфата меди. В день определени протеина смешали 0,1 мл 2%-ного раствора сульфата меди , 0,1 мл натрий калий тартратного раствора и 20 мл 2%-ного раствора карбоната натри и 0,1 М раствора гидроокиси натри в 25 мл;мерной мензурке .

5.Фенольный реагент. Разбавили 1 мл реагента (Sigma Chemical Со)

1 мл в день определени протеина.

6.Альбумин бычьего серума (BSA), Растворили 25 мг BSA (Sigma Chemical Со) в воде и разбавили до 25 мл водой. Хранение раствора при 4 С.

Методика, Концентраци протеина растворов энзима определ етс с помощью стандартной кривой, полученной с BSA.

Растворы добавл ли к испытуемьм пробиркам 13x10 мм в пор дке, перечисленном в табл.1.

Таблица 1

.Oil

о,:

0,1

.Oil

9 .130А748

Проводили смешивание сразу же после добавлени фенольного реагента и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

5 в

Прослеживали поглощение ( ) каждого образца относительно воды,

Образец 1 был контрольным. Образцы 2 - 6 были стандартными, используемыми дл получени стандартной кривой в диапазоне 20-100 мкг BSA,

Образцы 7 и 8 были неизвестными,

Расчеты, Провели вычитание дл образца 1 из неизвестного образца. Дл этого из стандартной кривой нашли количество протеина в мкг с огласно формулы: мг/мл протеина

1 OQtO мкг протеина х

мл, использование дл испытани X фактор разбавлени .

Определение активности ангиотен- зин-превращающего энзима и действие ингибиторов,

Дл определени коэффициента экс- тинкции гиппуровой кислоты приготовили п ть образцов (аналогичных),, содержащих 0,98, 0,96, 0,94, 0,92- и 0,90 мл..воды добавили 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 и 0,1 мл водного раствора гиппуровой кислоты до 1 мл в такой же последовательности. Это привело к получению образцов, содержащих 20, 40, 60, 80 и 100 мкМ гиппуровой кислоты соответственно, зарегистрировали поглощение каждого образца относительно водного контрол при; 228 нм на ультрафиолетовом спектрометре . Использовали 1 мл кварцевую чейку. Отложили зависимость поглощени каждого образца от соответствующей концентрации гиппуровой кислоты . График имел вид пр мой линии, проход щей через нуль. Наклон пр мой

Требуемые растворы бьши получены 5 в стекл нной посуде с использованием дистиллированной воды,

1,ЗМ NaCl, Растворили 175 г хлористого натри в 800 мл воды. Перенесли раствор в мерный цилиндр и доtO вели объем до 1000 мл,

2,0,3 М КН, 1,5 М NaCl, рН 8,3. Растворили 12,2 г фосфата кали в 120 мл воды в лабораторном стакане Добавили 150 мл ЗМ хлористого натри

f5 Перемешали раствор магнитной мешалкой и добавили разбавленную гидроокись кали дл доведени рН раствора до 8,3, Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем до 300 мл ,20 водой,

3,0,05 М ,, рН 8,3, Раство- рили 1,701 г фосфата кали в 220 мл воды. Довели рН раствора до рН 8,3 с помощью добавлени разбавленной гид роокиси кали . Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до.250 мл,

4,0,001 М гиппуровой кислоты - 0,05 М рН 8,3, Растворили

30

1,701 г КК,РО в 200 мл воды. Доба-.

вили 0,0448 г гиппуровой кислоты. Раствор перемешивали магнитной мешалкой и добавили разбавленной гидроокиси кали , чтобы довести рН раст- 35 вора до рН 8,3,-Перенесли раствор в мерньш цилиндр и довели объем раствора до 250 мл водой,

5.0,001 М гиппуровой кислоты. Растворили 0,0448 г гиппуровой кис40 лоты в 200 мл воды. Довели объем раствора до 250 мл водой,

6,0,025 М гиппурил-гистидил-лей- цина (HHL) - 0,04 М KHjP04, рН 8,3, Растворили 0,170 г в 20 мл

линии равен микромол рному коэффици- 1воды, Добавили 0,2685 г KHL и пере- енту экстинкции и Имел величину мешивали раствор магнитной мешалкой, 0,0103+5%, .Эта величина используетс Добавили разбавленной гидроокиси каЛИЯ дл доведени рН раствора до рН 8,3,

дл , расчета концентраций гиппуровой кислоты в эксперименте с превращающим энзимом,

Методика измерени активности ан- гиотензин-превращающего энзима в присутствии и отсутствии потенциальных ингибиторов,

Реагенты дл испытани . Неорганические реагенты и этилацетат были марки ХЧ, Гиппурова кислота была получена от Sigma Chemical Со, Гиппу

8

10

риллистиднн-лейцин вл лс продуктом, поставл емым Reseoreh Plus, Inc.

1,ЗМ NaCl, Растворили 175 г хлористого натри в 800 мл воды. Перенесли раствор в мерный цилиндр и доO вели объем до 1000 мл,

2,0,3 М КН, 1,5 М NaCl, рН 8,3. Растворили 12,2 г фосфата кали в 120 мл воды в лабораторном стакане, Добавили 150 мл ЗМ хлористого натри ,

f5 Перемешали раствор магнитной мешалкой и добавили разбавленную гидроокись кали дл доведени рН раствора до 8,3, Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем до 300 мл 0 водой,

3,0,05 М ,, рН 8,3, Раство- . рили 1,701 г фосфата кали в 220 мл воды. Довели рН раствора до рН 8,3 с помощью добавлени разбавленной гид роокиси кали . Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до.250 мл,

30

1,701 г КК,РО в 200 мл воды. Доба-.

1воды, Добавили 0,2685 г KHL и пере- мешивали раствор магнитной мешалкой, Добавили разбавленной гидроокиси каводы , Добавили 0,2685 г KHL и пере- мешивали раствор магнитной мешалкой, Добавили разбавленной гидроокиси ка

ЛИЯ дл доведени рН раствора до рН 8,3,

7,1 М НСЕ, Добавили 83 мл 37%-ной сол ной кислоты к 500 мл воды в мерном цилиндре. Раствор сметали и дог вели объем раствора до 1000 мл водой.

8,0,00 М SQ 20,881, Растворили 3,0 мг SQ 20,881 в 2,72 мл воды,

9,4 мкМ SQ 20,881, Разбавили 0,01 мл раствора 8 2.49 мл 0,05 М KHjPO,, рН 8,3,

1304748 2

Растворы 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 9 хра- - ,КОН, рИ 8,3 н хранили во

нили при 4 С,льду. Растворы внесли пипеткой в исМетод . Разбавили диализированную пытуемые пробирки 13x100 мм в пор дАСЕ до 2 мг/мл раствором 0,05 М - ке, указанном в табл.2.

Таблица 2

0,05 М - 1-,5 М NaCI, рН 8,3

0,05 М рН 8,3

1 м1-1 гиппурова кислота - 0,05 М , рН 8,3

0,025 К НН1 - 0,05 М KH,, рН 8,3

4микромол SQ 20,881 0,05 М , рН 8,3

5мМ ингибитор (в 95%-ном этаноле)

95%-ньй этанол

.0,050,050,050,050,050,050,05

0,0450,0950,070,0950,0950,0950,07

0,05- .-0 ,020,020,020,020,020,020,02

0,025 0 ,025

- - - 0,005 . - 0,005 0,005 0,005 0,005 - 0,005 0,005

Опыт с каждьи образцом дублировалс .

Образец 1 использовали дл определени извлечени гиппуровой кислоты , Образец 2 - контроль активности АСЕ, Образец 3 - активность АСЕ в присутствии стандартного ингибитора. Образец 4 - активность АСЕ в присутствии спирторастворимого ингибитора.

НС, 1 М

Диализованный АСЕ, 2 мг/мл

НСЕ, 1 М

0,25

0,25 0,25 0,25

0,08 0,08 0,08 -0,08 0,08 0,08 0,08 0,25 0,25. 0,25 Образцы 1, 5, 6 и 7 удал ли из вод ной бани после добавлени энзима . Образцы 2, 3 и 4 инкубировали при 37°С в течение 10 мин перед добавлением НСЕ.

0,025 0 ,025

Образцы 5, 6 и 7 эталоны сравнени в начальный момент времени дл образцов 1 и 2, 3 и 4 соответственно,

Вышеуказанные образцы и разбавленные растворы энзима инкубировали (2 мг/мл) при 37 С в вод ной бане в течение 5 мин перед добавлением растворов , приведенных в табл.З.

Таблица 3

0,25 0,25 0,25

Конечна концентраци компонентов смеси составл ла фосфат, 0,01 М, гиппуровой кислоты, 50 мкМ хлористого натри , 300 мкМ и НН1 2 мМ. Концентраци стандартного ингибитора

SQ 20,881 составл ла 0,4 мкМ, Удельна активность препарата АСЕ, использованного в этой методике составила 48 нм/мин/мг.

После добавлени ко всем образцам НС 8 к каждому образцу добавили 1,5 мл .этилацетата и смешали в вихревом смесителе (установка 6) в течение 15 с, Центрифугировали образцы в течение 5 мин на верхнем столе, центрифугировали дл отделени двух слоев жидкости. Отделили 1,0 мл из этилацетатного сло каждого образца и перенесли в испытуемые пробирки 13x100 мл. Поместили испытуемые пробирки в аналитический испаритель (Organomation Associates, Inc.) с температурой воды 65°С. Выпарили образцы досуха в потоке азота чистоДол поглощение при 228 нм извлечени микромол рный коэффициент

экстинкции

Активность энзима. Вычитают погло-25 дорастворимый ингибитор и о.бразце.

щение образцов 5, 6 и 7 из поглощени образцов 2, 3 и 4 соответственно, Это приводит к величине чистого поглощени за счет гиппуровой кислоты в контрольном образце, содержащем во30

содержащем спирторастворимьй ингиби тор.

2. Расчет образуемой гиппуровой кислоты, нМ, провод т следующим образом:

Гиппурова чистое поглощение при 228 нм

кислота, мм

микромол рный коэффициент экстинкции

Активность превращающего энзима35 активность выражаетс в наномо- выражаетс в наномал образуемой л х гиппуровой .кислоты/мин/мг про- гиппуровой кислоты/мин. Удельна теина.

Удельна активность активностьх ...- . . . . .-.... ... ...................

мг протеина в образце (0,16) .

% ингибировани рассчитываетс следующим образом:

удельна активность - удельна активность .,,,,

% ингибировани - ............ . ./сГ..... . .....,..,. .,„,....,.., х 100.

удельна активность контрол

Концентраци испытуемого соедине- контрольный образец, извлекаемый об- ни Дл целей скрининга все соедине- разец и образец в начальный момент

времени должны содержать одинаковое количество органического растворител . Не обнаружено существенного вли ни на активность АСЕ 5%-ного этанола или 2%-ного диметилсульфоксида. дартного ингибитора на актив ность АСЕ определ ют каждый раз при испытании неизвестного соединени .

При растворении испытуемых соедини были испытаны при концентрации . 100 мкМ.

В качестве стандартного ингибитора активности АСЕ использовали нона- пептид SQ 20,881. Воздействие стано

50

2 Повышение концентрации этих растворителей привод т к ингибированию активности энзима.

Вли ние испытуемого соединени на

нений в органических растворител х,

той 99,94% (10 мин). Удалили образ- цы из испарител . Добавили 1 мл воды к к1аждой испытуемой пробирке и мешали в течение 20 с на вихревом

смесителе (установка 6).дл растворени осадка. Зарегистрировали поглощение при 228 нм .() относительно воды. Использовали 1 мл кварцевую кювету.

Расчеты.

Извлечение гиппуровой кислоты. Вычитают величину поглощени образца 5 из величины поглощени образца 1. Чистое поглощение при 228 нм,

обусловленное 50 нМ гиппурой кислоты , добавл ют к образцу 1. Долю гиппуровой кислоты, извлекаемую из образца 1 рассчитывают следующим образом;

X 1 ,5 X

50

дорастворимый ингибитор и о.бразце.

содержащем спирторастворимьй ингибитор .

X 1,5 X

1

извлеченна

дол

времени должны содержать одинаковое количество органического растворител . Не обнаружено существенного вли ни на активность АСЕ 5%-ного этанола или 2%-ного диметилсульфоксида.

Вли ние испытуемого соединени на

рН реакционной смеси определ ют разбавлением 0,02 мл 5 мМ раствора испытуемого соединени 0,2 мл 0,05 М КНдР04- 1,5 М NaCl, рН 8,ЗиО,78 мл 0,05 М КН2Р04,рН 8,3. Концентрации испытуемого соединени , буферного раствора, органического растворител и хлористого натри в этом разбавленном растворе равны концентраци м этих компонентов в реакционной смеси. Если рН разбавленного раствора находитс между 8,2 и 8,5, то5мМ раствор испытуемого соединени в органическом растворителе используетс дл испытани на воздействие на активность АСЕ. Если рН разбавленного раствора меньше 8,2 или больше 8,5, то алик- воту 5 мМ раствора разбавл ют в 0,05М KHjP04 и рН довод т до 8,3.

Соединени , которые вл ютс активными ингибиторами АСЕ, испытываютс при нескольких .различных концентраци х ингибитора дл того, чтобы определить 1 fo или константу ин- гибировани , . .

Вновь суспендировали шарики в 10 мл охлажденного 0,03 М 1-0-н-ок- тил-р-В-глюкопиранозид - 0,05 М ,, рН 8,3 в дробилке и повтори ли методику, описанную выше дл гомогенизации и центрифугировани . Об единенные поверхностные слои жидкос ти, как было найдено, содержали око ло 70% активности, присущей первона

Активные соединени . Соединени , которые содержат активные группы и потенциально воздействуют как активные целенаправленные необратимые ин- ЗО гибиторы АСЕ, испытьгоаютс на их способность к необратимому ингибирова- нию АСЕ, Такие соединени , предварительно инкубируют с АСЕ в 0,05 М

, рН 8,3 при 37°С. В различные чальному гомогенату. Энзим диализо- моменты времени отдел ют аликвоты и

вали перед использованием.

испытьгеают на активность превращающего энзима, как это описано вьше. Параллельно провод т опыт с контрольной предварительно инкубированной смесью без испытуемого соединени .

Заключени об активности - Менее 20% ингибировани АСЕ, Соединени , вызывающие менее 20% ингибировани АСЕ активности рассматриваютс как неактивные и далее не испытываютс .

Соединени , вызывающие 20-50%-ное ингибирование активности АСЕ, рассматриваютс как соединени средней активности. Такие соединени вновь испытываютс дл подтверждени процента ингибировани .

Соединени , которые имеют воспроизводимое ингибирование активности АСЕ более 50% при концентрации 100 мкМ, рассматриваютс как активные . Такие соединени испытываютс при различных концентраци х дл того чтобы определить Igo или К.

Соединени , которые необратимо ин- гибируют АСЕ, испытываютс далее дл определени минимальной концентрации ингибитора, необходимой дл инактивации АСЕ и скорости инактивации.

Активность соединени при О,1 мМ. Неактивное L 20% ингибировани .

Получение сырого ангиотензин-прев- ращающего энзима. (Pel - Freer) в 20 мл 0,03 М 1-0-н-октил-Р-1 -глюкопи-- ранозид - 0,05 М , рН 8,3 в 30 мл измельчителе ткани Potbr Elve- hjem, охлаждаемом льдом. Гомогенизо- вали., суспензию с применением мрхани- ческого тефлонового пестика (%) 3 прохода.

Гомогенат перенесли в охлажденную поликарбонатную пробирку (50 мл) дл центрифугировани и центрифугировали в течение 25 мин при скорости

20000 об/мин (36900 х) в центрифуге SS-34 с использованием Sorval RC 5Е при 4°С. Перенесли верхний слой жидкости в лабораторный стакан 50 мл, охлаждаемый льдом.

Вновь суспендировали шарики в 10 мл охлажденного 0,03 М 1-0-н-ок- тил-р-В-глюкопиранозид - 0,05 М ,, рН 8,3 в дробилке и повторили методику, описанную выше дл гомогенизации и центрифугировани . Объединенные поверхностные слои жидкости , как было найдено, содержали около 70% активности, присущей первона

чальному гомогенату. Энзим диализо-

вали перед использованием.

Следующие соединени были испытаны in vitro на ингибирование ангио- тензин-превращающего энзима, прила- гаемому здесь. Ингибирование пред- ставлено в виде величин Ij СоединениеI,

50

СООСНо,

NC-CHCH-iSCCHs II I II

о сн о соосн

NC-CHCH2.SH II I

о ш

19 мМ

245 мМ

to

N-(3 -Меркаптопропаноил)- -L-(1,2,3,4-тетрагидро- нзохинолин)-3-кар6онова кислота3,8

N-(3 -Ацетилтио-2 -метил- пропаноил)-L- (1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3- -карбонова кислота 0,04

4 С.

N-(3 -Меркапто-2 -метил- пропаноил)-L-(1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)- -3-карбонова кислота 0,045

М-(3-Меркапто-2 метилпр паноил)- J5 -L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3- -карбоноиа кислота;

N-(3 -Ацетилтио-2 -метилпропано- ил)-Ь(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)- -3-карбонова кислота,20

Это испытание дает предваритель - ные данные, указывающие на присутствие активности, направленной на центральную нервную систему и автономной активности, а также косвенно указы- 25 вающие на циркул торную активность соединени . В этом испытании получают также предварительные данные по смертности, в результате-чего можно выбрать нелетальные дозы дл использовани в каких-либо дальнейших нужных фармакологических испытани х,

Дл каждой дозы используют . группу из 4 мы1ией, которым внутрибрюшинно инъекцией ввод т соединение в количестве 60 мг/кг. Животных наблюдают дл определени сильных вных симптомов в течение 1,5 ч после введени лекарства. Симптомы фиксируют и эти данные анализируют дл проведени определени в том случае, если соединение имеет какую-либо пригодную , активность по отноп:ению к ЦНС и/или автономную активность. Определ ют максимальную нелетальную дозу 45 и, если это возможно, приблизительные значени LDjo и EDjo t

В приложении А представлены результаты , полученные с использованием N-(3 меркапто-2 -метилпропано- 50 ил-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)- -3-карбоновой кислоты (соединени № 3371), В приложении В представле1304748 8

дл лакримации, расширени зрачков и птоза, и на активность по отношению к центральной нервной системе, тремор, конвульсии, моторную актив- 5 ность, атаксию и потерю рефлекса выпр млени . Наблюдали также одьтку и цианоз. Там, где эт.о возможно, указаны также ЕВзоИ LD.

Приложение А, Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз.

Испытывали соединение (-) К 3371 (1 ч).

Автономна

Усиление лакри- мацин-22 Расширение зрач- ка-23

Обща

понижение ректальной темпера туры-3 О

EDso тела

715

640

мг/кг веса

НД

НД-ЕВ о не достигаетс

30 LDg 640 мг/кг веса тела

Код №: SKI-D 59-B

35 Источник: специалист/виварий

Проект: алкано- иламинокислоты

Цвет желтый

форма: жидкий раст- Носитель Tween

вор80

40 Основной фактор: 1,0

Вид: кры.са, вьздер- жанна без пищи 18ч.рН 3,0

Пол: самцы

Использованные дозы: Комнатна темпе- 640-10 мг/кг ратура: 22,4°С . ,Доведение рН: -.

перорально

Способ введени : перорально

соон UH

Количество живот- ных.на 1-ю дозу: 6

Структура:

ны результаты, полученные с использованием N-(3 -ацетилтио-2 -метил- пропаноил-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин ) -3-карбоновой кислоты (соединение № 3370), Соединение № 3371 испытано на автономную активность

EDso тела

мг/кг веса

Автономна

Усиление лакри- мацин-22 Расширение зрач ка-23

Обща

понижение ректальной темпера туры-3 О

5

30 LDg 640 мг/кг веса тела

5

45

Код №: SKI-D 59-B

35 Источник: специалист/виварий

форма: жидкий раст- Носитель Tween

45

50

вор

40 Основной фактор: 1,0

Вид: кры.са, вьздер- жанна без пищи 18ч.

Использованные доз 640-10 мг/кг . ,

Количество живот- ных.на 1-ю дозу:

Структура:

55

О

HS

N

Ш

1913,04748. 20

Первичный фармакологический отбор. Центральна нерв- Испытание 100 особей на сильную ре- на система акцию в интервале доз. Испытывали соединение № 3371 (1/2 ч)

снижение моторной 5 активности

ЕП,о. тела

мг/кг веса

Автономна

усиление лакрима- ции 22НД

расширение зрачка 23

640 мг/кг веса тела

од №: SKI-D-59-B

НД

НД-ЕВуд не достигаетс

Обща

15

еиижение темпе туры пищевода

LDyg приблизитель равна 320 мг/кг веса тела

Проект: алкано- 20 LD равна прибли- иламинокислоты

зительно 160 мг/к веса тела

Цвет желтый

специа

Носитель: Tween 80

Форма: жидкий растворрН 3,0

Основной фактор: 1,0

Вид: крыса, выдержанна без пищи 18 ч

Использованные дозы:

640-10 кг/кг веса тела

Количество животных на 2-ю дозу: 6

Пол: самць

Температура 22,3°С Доведение рН 30 Форма: жидкий раст- Носитель: 15% вор

Основной фактор: .1,0

Носитель: Tween 80

рН: 3,5

, Вид: мышь, не выдержанна без пищи

Пол: самцы

Температура 2,8°С

Способ введени : 40 Использованные до- Доведение рН: перорально

зы:

320-20 мг/кг

Способ введени : внутрибрюшинно

тральна нерв- система

снижение моторной 5 активности

Автономна птоз 20

расширение зрачка 23

Обща

120

НД

еиижение температуры пищевода 32 160

LDyg приблизительно не дос- равна 320 мг/кг веса тела

тигаетс s-o 7 LDjo

LD равна прибли-

зительно 160 мг/кг веса тела

Код №: SKI-D-59-B

Проект: алкано- иламинокислоты

Источник: специалист/ виварий

Форма: жидкий раст- Носитель: 15% вор

Основной фактор: .1,0

Цвет: желтый

Носитель: Tween 80

рН: 3,5

Вид: мышь, не выдержанна без пищи

Пол: самцы

Температура 2,8°С

зы:

320-20 мг/кг

Способ введени : внутрибрюшинно

Структура:

О

HS

соон

сн,

Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную секцию в интервале Доз. Испытьгоали сое- динение N 337 1 .

EIVo . тела

мг/кг веса

Количество животных на 1-ю дозу: 4

Структура: .

О соон

СНо,

Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз, Испытьюали соединение № 3371 (3,5 и 24 ч).

211304748

томы

еса не достигаетс

59-В Проект: алканоил- аминокислоты

Ко

Ис ли ви

Источник: специалист/ виварий

Цвет желтый

Носитель:Tween 80

рН 3,0 Пол: самцы

Комнатна температура: 21,7°С

Доведение рН: Количество животных на 1-ю дозу: 6 Способ введени ;

перорально

О

соон

HS

ш,Ч

Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз. Испытывали соединение № 3371 (1ч).

EDjj EDyo /1Л),0 ЬП„/ ЕВ„ , мг/кг веса тела

Автономна

усиление лакрима- ции 22 320

715 0,9

зрач

0,9 0,4

320 640 1 0,5

1

НД нд нд нд

нд 50 не достигаетс

22

640 мг/кг веса тела

Проект: алканоил- аминокислоты

Цвет: желтый

Форма: жидкий рас- Носитель: Tween

80

рН 3,0

Пол: самцы

Температура 22,4 С

Доведение рН: Способ введени : перорально

твор

Основной фактор: 1,0

Вид: крыса, выдержанна без пищи 18 ч

Использованные

дозы:

640-10 мг/кг

Количество животных на 1 дозу: 6

Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную pev акцию в интервале доз. Испытывали со единение № 3371.

EDo EDso /ЬП„ /LD

ED,j ED,oo, МГ/КГ веса тела

35 Центральна нервна

система

снижение моторной активности - 5

Автономна птоз 20

39 113 2,83 1,42 0,48

39 120 2,67 1,33 0,44

расширение зрачка 23

нд нд

нд нд нд

5Q Обща

5

снижение температуры пищевода 32

равна приблизительно 320 мг/кг веса тела

80 160 0,5

2 1

не достигаетс

23

Проект: алканоил аминокислоты

1304748

Обща

24

5

снижение температуры пищево- да 32

42 .

,о не достигаетс

130474826

ED о ED so ЬП-го EDjp EDjjj ED,gQ МГ/КГ веса тела

8 40. 2,1 1,05 0,22 34 108 0,78 0,39 0,12

40 57 0,74 0,53

20 40 2,1 1,05 0,53

42 84 1 0,5 0,25

(

21 42 2 1 0,5

не достигаетс

ьно равна 84 мг/кг веса тела ьно равна 42 мг/кг веса тела Проект: алканоиламинокислоты

т

Цвет белый

Носитель г вода

рЦ 6

Пол самцы

130474828

Температура 22,5 С

Доведение рН Способ введени : внутрибрюптьтитт

шинно

птьтитт

шинно

(Количество животных на 1-ю дозу: 4

Claims

( Формула изобретени

Способ получени производных тет- рагидроизохинолина общей формулы

где R,-R - независимо друг от друга водород или низший алкил с 1-6 атомами, углерода;

RP - водород или низший алканоил с 1-ft атомами углерода, отличающийс тем, что тетрагидроизохинолин общей формулы

COOY

.где Y - низший алкил,. подвергают ацилированию формулы

кислотой

Нз RI ОН II / R5-8-C-C-C I I li Нг О

где R4-R4 имеют указанные значени , в присутствии дициклогексилкарбодии- мида с последующим гидролизом и выделением целевого продукта.