SK72298A3 - Vectors and methods for gene transfer to cells - Google Patents

Description

Opisuje sa chimerický adenovírusový obalový proteín, ktorý sa líši od obalového proteínu divokého typu zavedením neprirodzenej aminokyselinovej sekvencie. Uvedený chimerický adenovírusový obalový proteín je schopný riadiť vstup vektora, ktorý obsahuje obalový proteín, do buniek. Vstup vektora do buniek je účinnejší, ak vektor obsahuje chimerický adenovírusový obalový proteín ako adenovírusový proteín divokého typu. Uprednostňuje sa chimerický obalový proteín, ktorým je vláknitý proteín, hexónový alebo pentónový proteín. Ďalej sa opisuje adenovírusový vektor, ktorý obsahuje chimerický adenovírusový obalový proteín, jeho konštrukcia a použitie.

yi/

Vektory a spôsoby pre génový prenos do buniek

Oblasť techniky

Vynález opisuje chimérický adenovírusový obalový proteín, ktorý je schopný riadiť vstup vektora, ktorý obsahuje tento obalový proteín, do bunky. Tento vektor je účinnejší než podobný vektor, ktorý má obalový proteín adenovírusu divokého typu. Uvedený chimérický obalový proteín je vláknitý, hexónový alebo pentónový proteín. Vynález tiež opisuje rekombinantný vektor, ktorý obsahuje uvedený chimérický adenovírusový obalový proteín a spôsoby konštrukcie a použitia tohto vektora.

Doterajší stav techniky

Adenovírusy patria k čeľadi Adenoviridae, ktorá sa delí na rody Mastadenovirus a Aviadenovirus. Adenovírusy nemajú vírusový obal, tvoria pravidelné ikozaédre s približnou veľkosťou 65 až 80 nanometrov v priemere (Horne et al., J. Mol. Biol., 1, 84-86 (1959)). Adenovírusový kapsid je tvorený 252 kapsomérmi, z ktorých 240 sú hexóny a 12 sú pentóny (Ginsberg et al., Virology, 28, 782-783 (1966)). Hexóny a pentóny vznikli z troch rôznych vírusových polypeptidov (Maizel et al., Virology, 36, 115-125 (1968); Weber et al., Virology, 76, 709-724 (1977)). Hexón obsahuje tri identické polypeptidy, kde každý zahrnuje 967 aminokyselín, menovite polypeptid II (Roberts et al., Science, 232, 1148-1151 (1986)). Pentón obsahuje pentónovú bázu, ktorá je naviazaná na kapsid, a vlákno, ktoré sa nekovalentne viaže na pentónovú bázu a vyčnieva z nej. Vláknitý proteín obsahuje tri identické polypeptidy, kde každý zahrnuje 582 aminokyselín, menovite polypeptid IV. Proteín s pentónovou bázou adenovírusového sérotypu 2 (Ad2) je kruhový komplex, ktorý sa skladá z piatich identických proteínových podjednotiek, kedy každý zahrnuje 571 aminokyselín, menovite polypeptid III (Boudin et al., Virology, 92, 125138 (1979)). Proteíny IX, VI a Hla sa tiež nachádzajú v adenovírusovom obale a uvažuje sa, že stabilizujú vírusový kapsid (Stewart et al., Celí, 67, 145-154 (1991); Stewart et al., EMBO J., 12(7), 2589-2599 (1993)).

Potom, čo sa adenovírus prichytí na bunke, dochádza k internalizácii, ktorá je sprostred, kovaná receptorom, do klatrinom obalených endocytických váčkov bunky (Svensson et al, J.

\ '•-s ' x

Virol., 51, 687-694 (1984); Chardonnet et al, Virology, 40, 462-477 (1970)). Virióny, ktoré vstupujú do bunky, sa postupne rozkladajú, pretože rad štrukturálnych vírusových proteínov sa rozpadá (Greber et al., Celí, 75, 477-486 (1993)). Počas procesu rozbaľovania vírusové partikuly spôsobujú poškodenie bunkového endozómu mechanizmom závislým na pH (Fitzgerald et al., Celí, 32, 607-617 (1983)), ktorý nie je stále celkom objasnený. Vírusové partikuly sa potom prenášajú do komplexu jadrového póru bunky (Dales et al., Virology, 56, 465-483 (1973)), kde sa vírusový genóm dostáva do jadra a tak iniciuje infekciu.

Adenovírusy využívajú pre účinné zachytenie a infekciu bunky dva oddelené bunkové receptory, pričom musia byť oba prítomné (Wickham et al., Celí, 73, 309-319 (1993)). Po prvé, vláknitý proteín Ad2 sa naviaže na ešte neidentifikovaný receptor, čírn zachytí vírus na bunke. Potom sa pentónová báza naviaže na a_v integríny, ktoré patria do rodiny heterodimérických bunkových povrchových receptorov, ktoré sprostredkovávajú bunkovú adhéziu na extracelulárnych matricových molekulách, rovnako ako aj na iných molekulách (Hynes, Celí, 69, 11-25 (1992)).

Vláknitý proteín je trimér (Devaux et al., J. Molec. Biol., 215, 567-588 (1990)), ktorý pozostáva z oblastí chvosta, strednej časti a uzla (tail, shaft, knob). Vláknitá oblasť “shaft” sa skladá z 15 opakovaných aminokyselinových motívov. Verí sa, že tieto motívy tvoria dva alternujúce β-reťazec a β-oblúk (Green et al., EMBO J., 2, 1357-1365 (1983)). Celá dĺžka strednej časti vlákna a počet 15 aminokyselinových repetícií sa líši u jednotlivých adenovírusových sérotypov. Napríklad stredná časť vlákna Ad2 je dlhá 37 nanometrov a obsahuje 22 repetícií, zatiaľ čo vlákno u sérotypu Ad3 je dlhé 11 nanometrov a obsahuje 6 repetícií. Väzobná oblasť receptora vláknitého proteinu sa nachádza v oblasti “knob”, ktorá je kódovaná poslednými 200 aminokyselinami proteínu (Henry et al., J. Virology, 68(8), 5239-5246 (1994)). Oblasti nevyhnutné pre trimerizáciu sa tiež nachádzajú v oblasti “knob” proteínu (Henry et al., J. Virology, 68(8), 52395246 (1994)). Delečný mutant, kde chýba posledných 40 aminokyselín, netrimerizuje a tiež sa neviaže na pentónovú bázu (Novelli et al., Virology, 185, 365-376 (1991)). Trimerizácia vláknitého proteínu je nevyhnutná pre naviazanie pentónovej bázy. Jadrové lokalizačné signály, ktoré smerujú proteín do jadra, aby došlo k tvorbe vírusových partikúl, čo nasleduje po syntéze proteínu v cytoplazme, sa nachádzajú v oblasti N-konca proteínu (Novelli et al., Virology, 185, 365376 (1991)). Vlákno dohromady s hexónom sú hlavné antigénne determinanty vírusu a tiež určujú sérotypovú špecifítu vírusu (Watson et al., J. Gen. Virol., 69, 525-535 (1988)).

Rekombinantné adenovírusové vektory sa používajú pri prenose jedného alebo viac rekombinantných génov do nemocných buniek alebo tkanív, ktoré potrebujú liečbu. Také vektory sa charakterizujú tým, že nevyžadujú pre expresiu adenovírusových proteínov proliferáciu hostiteľských buniek (Horwitz et al.. In Virology, Raven Press, New York, vol. 2, pp. 1679-1721 (1990); Berkner, BioTechniques, 6, 616, (1988)). Avšak v prípade, že cieľové tkanivo pre somatickú génovú terapiu sú pľúca, tieto vektory sú výhodné, pretože sú normálne trofické pre respiračný epitel (Straus, In Adenoviruses, Plénum Press, New York, pp. 451-496 (1984)).

Ďalšie výhody adenovírusov ako potencionálnych vektorov vhodných pre ľudskú génovú terapiu: (I) pri použití takých vektorov zriedkavo dochádza k rekombinácii; (II) nie je známe žiadne spojenie s tvorbou ľudských maligných nádorov a adenovírusových infekcií aj keď ľudské adenovírusové infekcie sú bežné; (III) adenovírusový genóm (ktorým je lineárna, dvojreťazcová DNA) sa môže manipulovať, tak aby sa do neho vniesli cudzorodé gény, ktoré zodpovedajú veľkosťou; (IV) pri použití adenovírusového vektora nedochádza k začleneniu jeho DNA do chromozómu bunky, čo znamená, že jeho účinok je prechodný a interferuje s bunkovými normálnymi funkciami; (V) adenovírus môže infikovať bunky, ktoré sa nedelia, alebo terminálne diferenciované bunky, ako sú bunky v mozgu a v pľúcach; a (VI) živé adenovirusy, ktorých hlavnou charakteristikou je schopnosť sa replikovať, sa používajú ako ľudská vakcína (Horwitz et al., In Virology, Raven Press, New York, vol. 2, pp. 1679-1721 (1990); Berkner et al., BioTechniques, 6, 616, (1988); Straus et al., In Adenoviruses, Plénum Press, New York, pp. 451496 (1984); Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966); Haj-Ahmad et al., J. Virol., 57, 267, (1986); a Ballay et al., EMBO, 4, 3861 (1985)); patentová prihláška PCT WO 94/17832).

Nevýhodou génovej terapie sprostredkovanej adenovírusmi je, že po dvoch týždňoch od aplikácie vektora sa pozorovalo podstatné zníženie expresie génu. Pri terapeutickej aplikácii strata expresie vyžaduje novú aplikáciu vírusového vektora. Avšak pri nasledujúcej opakovanej aplikácii vznikajú proti obom vláknitým a hexónovým proteínom vírusového vektora neutralizujúce protilátky (Wohlfart, J. Virology, 62, 2321-2328 (1988); Wohlfart et al., J. Virology, 56, 896-903 (1985)). Táto protilátková odozva proti vírusu môže zabrániť efektívnej opakovanej aplikácii vírusového vektora.

Inou nevýhodou pri použití rekombinantného adenovírusu v génovej terapii je, že isté bunky nie sú schopné prijať gén zavedený prostredníctvom adenovírusov. Napríklad lymfocyty, ktorým chýbajú adenovírusové receptory pre a_v integrín, nie sú schopné prijať adenovirusy (Silver et al., Virology, 165, 377-387 (1988); Horvath et al., J. Virology, 62(1), 341-345 (1988)). Neschopnosť infikovať všetky bunky vedie k hľadaniu novej cesty zavedenia adenovírusov do buniek, ktoré nemôžu byť infikované adenovírusmi, napríklad z dôvodu neprítomnosti adenovírusových receptorov. Vírus sa môže spájať v DNA-polylyzínový komplex, ktorý obsahuje ligand (napríklad transferín) vhodný pre cicavčie bunky (napr. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992); patentová prihláška PCT WO 95/26412). Podobne adenovírusový vláknitý proteín môže byť stéricky blokovaný protilátkami a tkanivovo špecifické protilátky sa môžu chemicky viazať na vírusové partikuly (Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6094-6098 (1992)).

Tieto prístupy sú nevýhodné tým, že vyžadujú ďalšie kroky, ktoré umožnia kovalentne naviazať veľké molekuly, ako je polylyzín, receptorové ligandy a protilátky na vírus (Cotten (1992), citácia uvedená vyššie; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992)), čo zväčšuje veľkosť výsledného vektora a zvyšuje náklady na produkciu. Cieľové časticové komplexy nemajú homogénnu štruktúru a ich účinnosť je citlivá na relatívny pomer vírusových partikúl, viazanie molekúl a používaných cieľových molekúl. Tento prístup ku zväčšeniu zastúpenia buniek, ktoré sú prístupné adenovírusmi sprostredkovanej génovej terapii je menej ako optimálny.

Účinnosť transferu génu sprostredkovaného adenovírusmi in vivo dokonca aj do tých buniek, do ktorých vektor vstupuje s vysokou účinnosťou, je stále otázkou (Grubb et al., Náture, 371, 802-806 (1994); Dupuit et al., Human Gene Therapy, 6, 185-1193 (1995)). Receptor vlákna, prostredníctvom ktorého adenovírus na začiatku kontaktuje bunky, nebol identifikovaný a jeho zastúpenie v rôznych tkanivách sa nezisťovalo. Všeobecne sa prijíma, že epiteliálne bunky v pľúcach a v črevách produkujú podstatné množstvo receptora vlákna, čo umožňuje ich optimálnu transdukciu. Žiadna štúdia však doposiaľ nepotvrdila tento bod. V skutočnosti štúdie naznačujú, že zavedenie génu sprostredkované adenovírusmi do diferenciovaných epiteliálnych buniek pľúc je menej účinné, než zavedenie do proliferujúcich alebo nediferenciovaných buniek (Grubb et al.. Náture, 371, 802-806 (1994); Dupuit et al., Human Gene Therapy, 6, 185-1193 (1995)).

Podobne sa ukázalo, že adenovírusy transdukujú veľké množstvo tkanív, medzi ktoré patria pľúcne epiteliálne bunky (Rosenfeld et al., Celí, 68, 143-155 (1992)), svalové bunky (Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 2581-2584 (1992)), endoteliálne bunky (Lemarchand et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6482-6486 (1992), fibroblasty (Anton et al., J. Virol., 69,

4600-4606 (1995) a neurónové bunky (LaSalle et al., Science, 259, 988-990 (1993)). V mnohých týchto štúdiách sa za účelom dosiahnutia transdukcie používala veľmi vysoká hladina vírusových partikúl, často prekračujúca 100 jednotiek tvoriacich plaky na bunku, čo zodpovedá multiplicite infekcie (MOI) 100. Požiadavkou na dosiahnutie transdukcie je vysoké MOI, čo je nevýhodou rovnako ako ľubovoľná imúnna odozva spojená s adenovírusovou infekciou, ktorá je aktivovaná použitím vysokých dávok.

Stále však existuje nutnosť vytvorenia vektorov, ako sú adenovírusové vektory, ktoré sú schopné infikovať bunky s vysokou účinnosťou, zvlášť pri nízkých MOI a ktoré sú schopné infikovať väčšie rozmedzie buniek. Vynález sa snaží obísť prinajmenej niektoré opísané problémy rekombinantnej adenovírusovej génovej terapie. Predmetom vynálezu je zvlášť vektor (taký ako je adenovírusový vektor), ktorý má široké rozmedzie hostiteľov a schopnosť vstupovať do buniek s vysokou účinnosťou, dokonca ak je nízke MOI, pričom sa redukuje množstvo aplikovaného rekombinantného adenovírusového vektora a ľubovoľné vedľajšie účinky/komplikácie vyplývajúce z takej aplikácie. Ďalej vynález opisuje spôsob génovej terapie, ktorý zahrnuje použitie homogénneho adenovírusu, pričom vírusové partikuly sa modifikujú na úrovni adenovírusového genómu, bez nutnosti ďalších chemických modifikácií vírusových partikúl. Tieto a iné výhody vynálezu rovnako ako ďalšie inventívne rysy sú zrejmé z detailnejšieho opisu.

Podstata vynálezu

Vynález opisuje chimérický adenovírusový obalový proteín (napríklad vláknitý, hexónový alebo pentónový proteín), ktorý sa líši od vláknitého proteínu divokého typu (prirodzeného) zavedením umelej aminokyselinovej sekvencie prednostne do alebo blízko karboxylového konca. Výsledný chimérický adenovírusový obalový proteín je schopný riadiť vstup vektora do buniek. Uvedený vektor obsahujúci obalový proteín vstupuje do buniek s väčšou účinnosťou než vektor, ktorý je identický až na skutočnosť, že obsahuje adenovírusový obalový proteín divokého typu. Priamy výsledok tejto zvýšenej účinnosti je, že chimérický adenovírusový obalový proteín umožňuje adenovírusu viazať sa a vstupovať do radu typov buniek, do ktorých nemôže vstúpiť adenovírus, ktorý obsahuje obalový proteín divokého typu, alebo do ktorých vstupuje iba s nízkou účinnosťou. Vynález opisuje adenovírusový vektor, ktorý obsahuje chimérický adenovírusový obalový proteín a spôsoby konštrukcie a použitia takého vektora.

Vynález opisuje okrem iného rekombinantný adenovírus, ktorý obsahuje chimérický obalový proteín, taký ako je chimérický vláknitý, pentónový a/alebo hexónový proteín. Chimérický obalový proteín obsahuje umelú aminokyselinová sekvenciu, ktorá je buď priradená alebo nahradzuje natívnu aminokyselinová sekvenciu. Táto neprirodzená aminokyselinová sekvencia umožňuje chimérickému vláknu (alebo vektoru, ktorý obsahuje chimérické vlákno) účinnejšie sa viazať na bunky a vstupovať do nich.

Vynález opisuje chimérický adenovírusový obalový proteín, ktorý obsahuje neprirodzenú aminokyselinová sekvenciu, pričom obalový proteín je schopný riadiť vstup vektora obsahujúceho obalový proteín do buniek. Vstup uvedeného vektora do buniek je účinnejší než vstup vektora do buniek, ktorý je identický okrem toho, že obsahuje adenovírusový obalový proteín divokého typu, skôr než chimérický adenovírusový obalový proteín (to je pri absencii chimérického adenovírusového obalového proteínu a v prítomnosti adenovírusového obalového proteínu divokého typu).

Chimérický obalový proteín “Obalový proteín” podľa vynálezu prednostne obsahuje vláknitý proteín (zvlášť adenovírusový vláknitý proteín), pentónový proteín (zvlášť adenovírusový pentónový proteín) a hexónový proteín (zvlášť adenovírusový hexónový proteín). Obalový proteín zvlášť obsahuje adenovírusový vláknitý, pentónový alebo hexónový proteín. Ľubovoľný zo sérotypov ľudského alebo neľudského adenovírusu sa môže použiť ako zdroj génu obalového proteínu, optimálnym sa však javí adenovírus Ad2 alebo Ad5.

Obalový proteín je “chimérický,” ak obsahuje aminokyselinové zvyšky, ktoré nie sú typické pre proteín, ktorý sa izoloval z adenovírusu divokého typu (to je obsahujúceho natívny proteín alebo proteín divokého typu). Obalový proteín potom obsahuje “neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu”. “Neprirodzená aminokyselinová sekvencia” je ľubovoľná aminokyselinová sekvencia, ktorá sa nenachádza v prirodzenom vlákne daného sérotypu adenovírusu a ktorá sa prednostne zavádza do vláknitého proteínu na úrovni expresie génu (to je zavedením “sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje neprirodzenú aminokyselinová sekvenciu”).

Taká neprirodzená aminokyselinová sekvencia obsahuje aminokyselinovú sekvenciu (to znamená, že má jednotlivé zvyšky v určitom poradí), ktorá prepožičiava výslednému chimérickému proteinu schopnosť viazať sa na bunku alebo do nej vstupovať na základe nových bunkových povrchových väzobných miest (to znamená “UTV” alebo “Univerzálna sekvencia transferového vektora”) a/alebo obsahuje inkorporovanú sekvenciu za účelom tvorby alebo udržovania istej konfigurácie výsledného chimérického proteinu (to je “intergénová sekvencia”) medzi natívnou/neprirodzenou, neprirodzenou/neprirodzenou alebo natívnou/natívnou sekvenciou. Pretože neprirodzená aminokyselinová sekvencia je začlenená do aminokyselinovej sekvencie alebo ju nahradzuje a k manipulácii aminokyselinovej sekvencie chimérického obalového proteinu prednostne dochádza na úrovni nukleovej kyseliny, aminokyselinová sekvencia chimérického obalového proteinu, ktorá sa tak líši od sekvencie proteinu divokého typu (to je sekvencia UTV a intergénová sekvencia), môže prednostne obsahovať celú neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu alebo zmes natívnej a neprirodzenej aminokyseliny.

“Bunkové povrchové väzobné miesto” znamená receptor (ktorým je prednostne proteín, sacharid, glykoproteín alebo proteoglykan) rovnako ako to môže byť ľubovoľná opačne nabitá molekula (opačne nabitá vzhľadom k chimérickému obalovému proteinu, ktorý prednostne obsahuje neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je pozitívne nabitá, ako sa opisuje ďalej) alebo iný typ molekuly, s ktorou môže chimérický obalový proteín interagovať, aby sa naviazal na bunku a tak podporovať vstup do bunky. Príklady potenciálnych bunkových povrchových väzobných miest zahrnujú, ale nie sú obmedzené na negatívne nabitý heparín, sulfát heparanu, hyalurónovú kyselinu, sulfát dermatanu a časti sulfátu chondroitínu, ktoré sa napríklad nachádzajú na glykozaminoglykáne a ktoré ďalej obsahujú sulfát a/alebo fosfát sialovej kyseliny; časti sialovej kyseliny, ktoré sa nachádzajú na mucíne, glykoproteínoch a gangliosidoch; hlavný histokompatibilný komplex 1 (MHC I), glykoproteíny; bežné komponenty sacharidov, ktoré sa nachádzajú v membránových glykoproteínoch, medzi ktoré patrí manóza, N-acetyl-galaktózamín, Nacetyl-glukózamín, fukóza, galaktóza a podobne; a fosfátové časti, napríklad na nukleových kyselinách. Chimérický obalový proteín podľa vynálezu a spôsoby jeho použitia nie sú obmedzené na určitý mechanizmus bunkovej interakcie (to je interakcie s určitým bunkovým povrchovým väzobným miestom) a nie je tak spojovaný.

Ďalej také bunkové povrchové väzobné miesto je “nové”, pretože ide o to miesto, ktoré predtým nebolo prístupné pre interakciu s adenovírusovým obalovým proteínom (to znamená adenovírusový obalový proteín divokého typu, ako je vláknitý proteín) alebo bolo prístupné na veľmi nízkej úrovni, čo sa odráža na zníženej účinnosti vstupu vektora, ktorý obsahuje adenovírusový obalový proteín divokého typu, v porovnaní s vektorom obsahujúcim chimérický adenovírusový obalový proteín, taký ako je vláknitý proteín podľa vynálezu. Väzobné miesto je nové v bunkách, ak je prítomná jeho hlavná časť, ak nie celé, bez ohľadu na jeho pôvod. Tým sa líši od bunkového väzobného miesta, s ktorým, ako sa predpokladá, adenovírusový vláknitý proteín divokého typu interaguje, ktoré sa údajne nachádza iba na niektorých bunkách alebo je iba prístupné na niektorých bunkách, čo má za následok redukovanú účinnosť vstupu vektora, ktorý obsahuje adenovírusové vlákno divokého typu.

“Účinnosť vstupu” sa môže kvantifikovať niekoľkými spôsobmi. Účinnosť vstupu sa môže zvlášť kvantifikovať zavedením chimérického obalového proteínu do vektora, prednostne vírusového vektora, a monitorovaním vstupu do bunky (napr. zavedením génu, ako je reportný gén, do bunky sprostredkovanej vektorom) ako funkcia multiplicity infekcie (MOI). V tomto prípade redukovaná hodnota MOI, ktorá je nutná pre vstup vektora obsahujúceho chimérický adenovírusový obalový proteín do bunky, čo sa porovnáva s vektorom, ktorý je identický, okrem toho, že obsahuje skôr adenovírusový obalový proteín divokého typu než uvedený chimérický adenovírusový obalový proteín, indikuje “účinnejší” vstup.

Podobne účinnosť vstupu sa môže kvantifikovať na základe schopnosti vektorov, ktoré obsahujú chimérický obalový proteín alebo obalový proteín divokého typu alebo samotný rozpustný chimérický obalový proteín alebo obalový proteín divokého typu, viazať sa na bunky. V tomto prípade zvýšená schopnosť viazať sa, vykazuje u vektora, ktorý obsahuje chimérický adenovírusový obalový proteín alebo samotný chimérický obalový proteín, v porovnaní s vektorom, ktorý je identický okrem toho, že obsahuje obalový proteín divokého typu alebo samotný obalový proteín divokého typu, zvýšenú účinnosť vstupu alebo “účinnejší vstup”.

Neprirodzená aminokyselinová sekvencia podľa vynálezu je prednostne začlenená do vnútornej sekvencie obalového proteínu alebo túto sekvenciu nahradzuje. V inom prípade neprirodzená aminokyselinová sekvencia podľa vynálezu sa nachádza na karboxylovom konci proteínu alebo blízko pri tomto konci. Zvlášť, ak je obalový proteín podľa vynálezu vláknitý proteín, potom je vhodné, aby sa neprirodzená aminokyselinová sekvencia nachádzala na karboxylovom konci proteínu alebo blízko pri tomto konci. V prípade, že obalový proteín podľa vynálezu je pentónový alebo hexónový proteín, potom sa uprednostňuje, aby neprirodzená aminokyselinová sekvencia bola v exponovanej slučke proteínu, napríklad ako sa opisuje v nasledujúcich príkladoch, zvlášť v hypervariabilnej oblasti slučky 1 a/alebo slučky 2 adenovírusového hexónového proteínu (Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70, 1836-1844 (1996)). Potom je vhodné, aby neprirodzená aminokyselinová sekvencia bola v oblasti obalového proteínu, ktorý je schopný interagovať s bunkou a viazať sa na ňu.

Spôsob podľa vynálezu sa môže použiť na vytvorenie adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV v predĺženej štruktúre, zvlášť v hexónovom a/alebo pentónovom proteíne, takom, ktorého výsledkom je predĺžený proteín s hexónovou a/alebo pentónovou bázou, kde aminokyselinová inzercia pôsobí smerem von z kapsidu viriónu, v ktorom je proteín. Zvlášť také vyčnievajúce obalové proteíny sa môžu začleňovať do rekombinantného adenovírusu spolu s “krátko stočeným vláknom” (“short-shafted fíber”) (ďalej sa tu opisuje), kde stredná časť vlákna je skrátená a oblasť “knob” vláknitého proteínu je nahradená oblasťou “knob” (zahrnujúcou trimerizačnú oblasť) adenovírusového vektora iného sérotypu, z ktorého sa odvodil zvyšok vláknitého proteínu.

Vláknitý proteín s krátkou strednou časťou môže byť prednostne začlenený do adenovirusu, ktorý nesie chimérický proteín s pentónovou bázou, ktorý obsahuje UTV alebo sekvenciu podobnú UTV. Vláknitý proteín s krátkou strednou časťou sa môže začleniť do adenovírusu, ktorý nesie chimérický hexónový proteín, ktorý obsahuje UTV alebo sekvenciu podobnú UTV alebo nesie vyčnievajúci chimérický hexónový proteín, ktorý sa môže naviac začleniť UTV alebo sekvenciou podobnou UTV.

Neprirodzená aminokyselinová sekvencia je spojená s proteínom inou neprirodzenou aminokyselinovou sekvenciou, to je intervenujúcou intergénovou sekvenciou. Intergénová sekvencia je sekvencia, ktorá sa nachádza medzi sekvenciou prirodzeného proteínu a neprirodzenou sekvenciou, medzi neprirodzenou sekvenciou a inou neprirodzenou sekvenciou alebo medzi prirodzenou sekvenciou a inou natívnou sekvenciou. Intergénová sekvencia je prednostne začlenená do proteínu, aby sa zaručilo, že neprirodzená sekvencia, ktorá obsahuje bunkové povrchové väzobné miesto vyčnieva z trojdimenzionálnej štruktúry chimérického proteínu (trojdimenzionálna štruktúra chimérického proteínu, ako existuje v prírode, to je ako časť kapsidu) takým spôsobom, že je schopná interagovať s bunkou alebo sa na ňu viazať. V prípade, že intergénová sekvencia je začlenená do vnútornej sekvencie obalového proteínu alebo ju nahra10 dzuje, potom v chimérickom obalovom proteíne sa môže nachádzať jedna alebo viac intergénových sekvencií.

Uprostred ležiaca intergénová sekvencia môže mať ľubovoľnú dĺžku, u pridanej intergénovej sekvencie, z ktorej vzniká “vyčnievajúci” obalový proteín, sa uprednostňuje dĺžka okolo 3 až 400 aminokyselín (ako sa ďalej opisuje v nasledujúcich príkladoch). Pre iné tu opísané aplikácie sa uprednostňuje dĺžka od 3 do 30 aminokyselín. Intergénová sekvencia môže obsahovať ľubovoľné aminokyseliny. V optimálnom prípade intergénová sekvencia všeobecne neinterferuje s funkciami obalového proteínu a zvlášť s funkciami inej neprirodzenej aminokyselinovej sekvencie (to je UTV alebo sekvencie podobnej UTV).

Neprirodzená aminokyselinová sekvencia, ktorá nie je intergénovou sekvenciou, to je sekvencia UTV, tiež môže byť ľubovoľne vhodne dlhá. Uprednostňuje sa dĺžka okolo 3 až 30 aminokyselín (hoci ako u intergénovej sekvencie, sekvencia UTV môže byť dlhšia, napríklad až 400 aminokyselín). Tieto aminokyseliny tvoria ľubovoľné pozitívne nabité zvyšky, ktoré sú schopné viazať sa na negatívne nabité časti, ktoré sú prítomné na povrchu eukaryontnej bunky a v optimálnom prípade sú schopné sa viazať na negatívne nabité časti, ktoré sa nachádzajú na povrchu väčšiny (ak nie na všetkých) eukaryontných buniek. Taká negatívne nabitá časť prítomná na povrchu eukaryontnej bunky, na ktorú sa viaže sekvencia UTV, zahrnuje predtým uvedené “bunkové povrchové väzobné miesto”.

Neprirodzená aminokyselinová sekvencia obsahuje aminokyseliny, ktoré sú vybrané zo skupiny obsahujúcej lyzin, arginín a histidín. V inom prípade tieto kyseliny môžu byť negatívne nabité zvyšky, ktoré sú schopné sa viazať na pozitívne nabité bunkové povrchové väzobné miesta, napríklad neprirodzená aminokyselinová sekvencia obsahuje aminokyseliny vybrané zo skupiny zahrnujúcej aspartát a glutamát.

Neprirodzená aminokyselinová sekvencia obalového proteínu prednostne obsahuje sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO:1 (to je Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys), SEQ ID NO: 2 (to je Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ) a SEQ ID NO: 3 (to je Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa, kde “Xaa” obsahuje Lys alebo Arg) a kde 1, 2, 3, 4 alebo 5 zvyškov sa môže na C-konci sekvencie odstrániť. V prípade, že obalový proteín je vláknitý proteín, uprednostňuje sa, aby proteín obsahoval sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 (to je Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys

Lys Lys Lys Lys Lys) a SEQ ID N0:5 (to je Ala Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys) a kde 1, 2, 3, 4 alebo 5 zvyškov C-konca sekvencie sa môžu odstrániť.

Sekvencia, ktorá sa viaže na heparín sa môže zúčastniť na naviazaní na receptor podobný heparínu (Sawitzky et al., Med. Microbial. Immunol., 182, 285-92 (1993)). Podobne tzv. “heparín viažúce sekvencie” môžu sprostredkovať interakciu peptidu alebo proteínu, v ktorom sú obsiahnuté spolu s inými bunkovými povrchovými väzobnými miestami, ako je bunkový povrchový sulfát heparanu proteoglykánu (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541-9 (1994)). Neprirodzená aminokyselinová sekvencia (to je UTV sekvencia) prednostne obsahuje tieto sekvencie, rovnako ako prídavné sekvencie, ktoré sú schopné rozoznávať negatívne nabité časti, ktoré sú široko zastúpené na povrchu eukaryontných buniek.

Zvlášť sa uprednostňuje neprirodzená aminokyselinová sekvencia, ktorá obsahuje dve základné aminokyseliny (často Arg) lokalizované okolo 20A stranou, obaľujúcou v opačnom smere alfa skrutkovicu (Margalit et al., J. Biol. Chem., 268, 19228-31 (1993); Na et al., J. Lipid Res., 35, 2049-2059 (1994)). Iné základné aminokyseliny sú rozptýlené medzi týmito dvoma zvyškami obaľujúcimi jednu stranu, zatiaľ čo nepoláme zvyšky obaľujú druhú stranu, pričom tvoria amfipatickú štruktúru, ktorá v optimálnom prípade obsahuje motív XBBXBX (SEQ ID NO:49) alebo XBBBXXBX (SEQ ID NO: 50), kde B je základná aminokyselina (napr. Lys, Arg atď.) a X je ľubovoľná ďalšia aminokyselina.

UTV neprirodzená aminokyselinová sekvencia prednostne obsahuje: sekvenciu LIGRKK.T (SEQ ID NO: 51), LIGRK (SEQ ID NO: 53), ktoré sú bežné heparín viažúce motívy prítomné vo fibronektíne a v proteínoch teplotného šoku (Hansen et al., Biochim. Biophys. Acta, 1252, 135-45 (1995); inzerciu 7 zvyškov buď Lys alebo Arg alebo zmesi Lys a Arg (Fromm et al., Árch. Biochem. Biophys., 323, 279-87 (1995)); bežnú základnú oblasť C-konca IGFBP-3 a IGFBP-5 približne 18 aminokyselín, ktorá obsahuje heparín viažúcu sekvenciu (Booth et al., Growth Regúl., 5, 1-17 (1995)); buď jeden alebo obidva hyaluronanové (HA) väzobné motívy, ktoré sa nachádzajú v oblasti 35 aminokyselín C-konca HA receptora RHAMM (Yang et al., J. Celí. Biochem., 56, 455-68 (1994)); syntetický peptid (Ala347-Arg361) modelovaný po heparín viažúcej forme vitronektínu zo Staphylococcus aureus, ktorý obsahuje heparín viažúce sekvencie (Liang et al., J. Biochem., 116, 457-63 (1994)); ľubovoľné jedno alebo viac z piatich heparín viažúcich miest medzi aminokyselinou 129 a 310 glykoproteínu glll bovinného herpesvirusu 1 alebo ľubovoľného jedného zo štyroch heparín viažúcich miest medzi aminokyselinami 90 a 275 glykoproteínu glll vírusu besnoty (Liang et al., Virol., 194, 233-43 (1993)); aminokyseliny 134 až 141 glykoproteínu glll vírusu besnoty (Sawitzky et al., Med. Microbiol. Immunol., 182, 28592 (1993); heparín viažúce oblasti zodpovedajúce nabitým zvyškom v pozíciách 279 až 282 a 292 až 304 ľudskej lipoproteínovej lipázy (Ma et al., citácia uvedená vyššie); syntetický peptid obsahujúci 22 zvyškov, N22W so sekvenciou NVSPPRRARVTDATETTITISW (SEQ ID NO: 54) alebo zvyšky TETTITIS (SEQ ĽD NO:55) tohto syntetického peptidu modelovaného po fibronektíne, tento peptid vykazuje vlastnosti viazania heparínu (Ingham et al., Árch. Biochem. Biophys., 314, 242-246 (1994)); motív GVEFVCCP (SEQ ĽD NO: 56), ktorý sa nachádza v ektooblasti zinok viažúceho miesta prekurzora Alzheimerovho beta-amyloidového proteínu (APP), rovnako ako rôzne iné proteíny podobné APP, ktoré modulujú heparínovú afinitu (Bush et al., J. Biol. Chem., 229, 26618-21 (1994)); peptid obsahujúci 8 aminokyselín odvodený z krížovej oblasti reťazca laminínu A (Tashiro et al., Biochem. J., 302, 73-9 (1994)); syntetické peptidy založené na heparín viažúcich oblastiach antitrombínu III, čo je inhibítor serínovej proteázy, zahrnujúci peptidy F123-G148 a K121-A134 (Tyler-Cross et al., Protein Sci., 3, 620-7 (1994)); 14 K veľký fragment N-konca APP a oblasť blízku N-koncu (to je zvyšky 96 až 110), ktoré sa uvádzajú ako heparín viažúce oblasti (Small et al., J. Neurosci., 14, 2117-27 (1994)); pás 21 aminokyselín rastového faktora podobného heparín viažúcemu epidermálnemu rastovému faktoru (HB-EGF), ktorý je charakterizovaný vysokým obsahom zvyškov lyzínu a arginínu (Thompson et al., J. Biol. Chem., 269, 2541-9 (1994)); oblasť tvorená 17 aminokyselinami obsahujúca heparín viažúcu oblasť trombospondinu a zodpovedajúca syntetickému peptidu hep 1 (Murphy-Ulrich et al., J. Biol. Chem., 268, 26784-9 (1993)); sekvencia 23 aminokyselín (Y565-A587) ľudského faktoru von Willebranda, ktorá viaže heparín (Tyler-Cross et al., Árch. Biochem. Biophys., 306, 528-33 (1993)); peptid PRARI odvodený od fibronektínu (SEQ ID NO:57) (a väčšie peptidy obsahujúce tento motív, ako je WQPPRARI (SEQ ID NO: 58)), ktorý viaže heparín (Woods et al., Mol. Biol. Celí., 4, 605-613 (1993); oblasť viažúca heparín faktora krvných doštičiek 4 (Sato et al., Jpn. J. Cancer Res., 84, 485-8 (1993); a sekvencia K18K v transmembránovom glykoproteine receptora fibroblastového rastového faktora pre tyrozínovú kinázu (Kan et al., Science, 259, 1918-21 (1993)).

Avšak UTV sekvencia môže obsahovať iné sekvencie, ktoré sa opisujú v nasledujúcich príkladoch. UTV sekvencia sa prednostne vyberá zo skupiny obsahujúcej (SEQ DD NO:1), (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:20), (SEQ ID

NO:22), (SEQ ID NO:24), (SEQ ID NO:26), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:30), (SEQID

NO:32), (SEQ ID NO:34), (SEQ ID NO:36), (SEQ ID NO:38), (SEQ ID NO:40), (SEQID

NO.42), (SEQ ID NO:46), (SEQ ID NO:48), (SEQ ID NO:49), (SEQ ID NO:50), (SEQID

N0:51), (SEQ ID NO:52), (SEQ ID NO:53), (SEQ ID NO:54), (SEQ ID NO:55), (SEQID

NO:56), (SEQ ID NO:57), (SEQ ID NO:58), (SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:74), (SEQID

NO:76), (SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:90) a (SEQ ID NO:93). Tieto sekvencie sa tiež môžu použiť v prípade, že zvyšky 1, 2 alebo 3 z N- alebo C-konca sú odstránené. Pretože intergénová sekvencia môže byť ľubovoľnou sekvenciou aminokyselín, ktoré neinterferujú s funkciou proteínu podľa vynálezu, ľubovoľná predtým spomínaná UTV sekvencia tiež môže obsahovať intergénové sekvencie.

Tiež sa preferuje, aby neprirodzená aminokyselinová sekvencia obsahovala aminokyselinové sekvencie, ktoré sú ekvivalenty ľubovoľných predtým uvedených sekvencii (to je “sekvencii podobných UTV”). Ekvivalentná môže byť sekvencia, ktorá má rovnaké funkcie (možno sa minoritne odlišuje v účinnosti) a ešte sa môže trochu líšiť vo svojej aminokyselinovej sekvencii alebo v iných štrukturálnych rysoch. Ekvivalentná sekvencia je zvlášť tá sekvencia, ktorá obsahuje jednu alebo viac konzervatívnych aminokyselinových substitúcií. “Konzervatívna aminokyselinová substitúcia” je aminokyselina substituovaná alternatívnou aminokyselinou s podobnou hustotou náboja, hydrofilicitou/hydrofóbicitou, veľkosťou a/alebo konfiguráciou (napr. zámena Val za íle). “Nekonzervatívna aminokyselinová substitúcia” je aminokyselina substituovaná alternatívnou aminokyselinou, ktorá sa líši hustotou náboja, hydrofilicitou/hydrofóbicitou, veľkosťou a/alebo konfiguráciou (napr. zámena Val za íle).

Nukleová kyselina kódujúca chimérický obalový proteín

Ako sa uvádza predtým, neprirodzená aminokyselinová sekvencia je prednostne zavedená na úrovni DNA. Vynález ďalej opisuje izolovanú a čistenú nukleovú kyselinu, ktorá kóduje obalový proteín podľa vynálezu, kde sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu obsahuje sekvenciu SEQ ID NO: 6 (to je GGA TCC AA), ktorá sa nachádza pred polyadenylačným miestom. Podobne vynález prednostne opisuje izolovanú a čistenú nukleovú kyselinu obsahujúcu sekvenciu vybranú zo skupiny obsahujúcej SEQ ID NO: 7 (to je GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT) a SEQ ID NO: 8 (to je GCC

GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA), (SEQ ID NO: 19), (SEQID

NO: 21), (SEQ ED NO: 23), (SEQ ID NO: 25), (SEQ ID NO: 27), (SEQ ID NO: 29), (SEQID

NO: 31), (SEQ ID NO: 33), (SEQ ID NO: 35), (SEQ ID NO: 37), (SEQ ID NO: 39), (SEQID

NO: 41), (SEQ ID NO: 45), (SEQ ID NO: 47), (SEQ ID NO: 72), (SEQ ID NO: 75), (SEQID

NO: 77) a (SEQ ID NO: 89). Vynález ďalej opisuje konzervatívne modifikované varianty týchto nukleových kyselín.

“Konzervatívne modifikovaný variant” je variácia sekvencie nukleovej kyseliny, ktorej výsledkom je konzervatívna amínokyselinová substitúcia. Pre porovnanie “nekonzervatívne modifikovaný variant” je variácia sekvencie nukleovej kyseliny, ktorej výsledkom je nekonzervatívna amínokyselinová substitúcia. Spôsoby uskutočnení takých modifikácií sú v odbore dobre známe a opisujú sa v nasledujúcich príkladoch a tiež sa môžu uskutočniť s použitím komerčne dostupných súprav a vektorov (napr. New England Biolabs, Inc., Beverly, MA; Clontech, Palo Alto, CA). Spôsoby uskutočnenia takých substitúcií (napr. v zmysle ovplyvnenia schopnosti viazať sa na bunky a vstupovať do nich) sa opisujú v uvedených príkladoch.

Spôsoby prípravy takého chimérického obalového proteinu, zvlášť potom spôsoby zavedenia sekvencie na úrovni DNA, sú v odbore dobre známe a sú zobrazené pre reprezentatívny chimérický proteín na obrázku č. 2 a opisujú sa v nasledujúcich príkladoch. Spôsob zahrnuje zavedenie sekvencie (prednostne sekvencie SEQ ID NO:6 alebo jej konzervatívne modifikovaného variantu) do sekvencie obalového proteinu. V jednom preferovanom uskutočnení opísanom v nasledujúcich príkladoch sa sekvencia zavedie pred ľubovoľný stop kodón alebo polyadenylačný signál tak, aby sa indukovala mutácia výsledného proteinu posunom rámca, pričom do chimérického proteinu sa inkorporujú prídavné aminokyseliny.

Všeobecne sa to môže dosiahnuť klonovaním sekvencie vlákna do plazmidu alebo niektorého iného vektora za účelom zjednodušenia manipulácie sekvencie. Potom sa určia reštrikčné miesta, ktoré lemujú sekvenciu a do ktorých sa zavedie mutácia posunom rámca. Dvojreťazcový syntetický oligonukleotid sa vytvorí z presahujúcich syntetických jednoreťazcových sense a antisense oligonukleotidov (napr. zo sense a antisense oligonukleotidov, respektíve TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C (SEQ ľD NO: 9) a AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA C AT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA (SEQ ID NO: 10), ako sa opisuje na obrázku č.4)) tak, že dvojreťazcový nukleotid sa začlení do reštrikčných miest presahujúcich cieľovú sekvenciu.

Plazmid alebo iný vektor sa štiepi reštrikčnými enzýmami a oligonukleotidová sekvencia, ktorá má kompatibilné kohezívne konce, sa liguje do plazmidu alebo do vektora, aby nahradila DNA divokého typu. Môžu sa tiež uskutočniť iné spôsoby in vitro miestne riadenej mutagenézy, ktoré sú známe v odbore (zvlášť použitím PCR), napr. komerčne dostupné kity sa môžu použiť na zavedenie mutovanej sekvencie do sekvencie kódujúcej obalový proteín.

Potom, čo sa sekvencia zavedie do chimérického obalového proteínu, môže sa izolovať fragment nukleovej kyseliny kódujúcej sekvencie, napr. pomocou PCR amplifikácie s použitím 5 a 3' primérov. Napríklad vzhľadom na chimérický vláknitý proteín sa môže fragment izolovať PCR s použitím priméru TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA (SEQ ID NO: 11) a priméru CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA (SEQ CD NO: 12), ako sa ilustruje na obrázku č. 4. Použitie týchto primérov uvedeným spôsobom vedie ku vzniku fragmentu, ktorý obsahuje amplifikované chimérické vlákno, ktoré lemujú reštrikčné miesta (to je v tomto prípade reštrikčné miesta Ndel a BamHI), ktoré sa môžu používať pri konvenčnom subklonovaní fragmentu. Môžu sa tiež použiť iné spôsoby, pri ktorých vzniká chimérický obalový proteín.

Mutácia posunom rámca sa môže zaviesť do ľubovoľnej časti sekvencie kódujúcej obalový proteín. Vzhľadom na sekvenciu SEQ ID NO: 6 táto sekvencia sa napríklad môže umiestniť do oblasti génu obalového proteínu, ktorý kóduje C-koniec proteínu (to znamená, že sa môže pridať bezprostredne pred TAA stop kodón) alebo sa môže umiestniť na začiatok kódujúcej sekvencie tak, aby ležala medzi kodónmi kódujúcimi Ala (to je A) a Gin (to je Q) a produkovala predtým uvedenú kódujúcu sekvenciu SEQ ID NO:8, ktorá kóduje chimérický proteín obsahujúci sekvenciu SEQ ĽD NO: 5. Podobne sa môže použiť tento prístup na zavedenie mutácie posunom rámca na začiatok kódujúcej sekvencie, napr. buď zaviesť do vnútornej sekvencie (to je natívneho) obalového proteínu alebo túto sekvenciu nahradiť.

Avšak dvojreťazcový nukleotid môže tiež obsahovať ďalšie reštrikčné miesto, ktoré sa tiež môže použiť na manipuláciu sekvencie. Napríklad sekvencia SEQ ID NO: 6 sa môže zaviesť do vektora, ktorý obsahuje modifikované miesto BamHI, to znamená, že miesto je “modifikované” pridaním nukleotidov do palindromickej rozpoznanej sekvencie. Táto sekvencia sa tiež môže syntetizovať tak, aby obsahovala ľubovoľné iné reštrikčné miesto vhodné pre manipulácie DNA. Ak sa uvedená sekvencia zavedie do sekvencie obalového proteínu nedôjde iba ku vzniku mutácie posunom rámca, ale môže sa použiť na zavedenie iných kódujúcich sekvencií do génu obalového proteínu. Najmä, kódujúce sekvencie zavedené týmto spôsobom, môžu obsahovať kodóny pre lyzín, arginin a histidín alebo kodóny pre aspartát a glutamát, buď samotné alebo v ľubovoľnej kombinácii. Ďalej nový translačný stop kodón môže nasledovať po týchto kodónoch aminokyselín, čo umožňuje, aby vznikol chimérický proteín, ktorý iba zahrnuje daný počet prídavných aminokyselín v neprirodzenej aminokyselinovej sekvencií. Kodóny pre aminokyseliny a translačný stop kodón sa môžu zaviesť do nového reštrikčného miesta indukovaného mutáciou posunom rámca inkorporovaného do obalového proteínu pomocou syntetizujúcich oligonukleotidov, ktoré obsahujú tieto sekvencie, ktoré sú lemované, ako sa opisuje v predchádzajúcom texte, reštrikčným miestom (napr. obsahujú 5' a 3' BamHI miesta) alebo iným spôsobom, ktorý je známy v odbore.

Veľkosť DNA používanej na zámenu sekvencie viažúcej natívny receptor môže byť vynútená napríklad bránením zabalenia vlákna alebo nesprávnym zostavením komplexu pentónovej bázy/vlákna. DNA kódujúca predtým uvedené aminokyselinové sekvencie (napr. lyzín, arginin, histidín, aspartát, glutamát a podobne) sa preferuje pri inzercii do génovej sekvencie vlákna, kde sa odstránila sekvencia viažúca natívny receptor alebo došlo k mutácii tejto sekvencie iným spôsobom. Avšak iné sekvencie DNA, také ako sú tie, ktoré kódujú aminokyseliny slúžiace na inkorporáciu do intergénových sekvencií, sa prednostne používajú na zámenu sekvencie kódujúcej natívny obalový proteín.

Vektor obsahujúci chimérický obalový proteín “Vektor” podľa vynálezu je nástroj slúžiaci na prenos génu. Tak tomuto termínu rozumie odborník. Podľa vynálezu sú štyri typy vektorov plazmidy, fágy, vírusy a lipozómy. Plazmidy, fágy a vírusy sa prenášajú do bunky vo forme nukleovej kyseliny a lipozómy sa môžu použiť na prenos nukleových kyselín. Vektory, ktoré sa používajú na transfer génov sa tu nazývajú “prenosové vektory”.

Prednostne vektor podľa vynálezu je vírus, špeciálne vybraný zo skupiny, ktorá zahrnuje vírusy bez obalu, to je RNA alebo DNA vírusy bez obalu. Vírus sa môže tiež vybrať zo skupiny, ktorá zahrnuje vírusy s obalom, to je obalené RNA alebo DNA vírusy. Také vírusy prednostne obsahujú obalový proteín. Vírusový obalový proteín vyčnieva z kapsidu tak, že je schopný inter akcie s bunkami. V prípade obalených RNA alebo DNA vírusov sa uprednostňuje, aby obalový proteín bol lipidový obalový glykoproteín (tzv. spike alebo peplomer).

Zvlášť uprednostňovaný vektor je neobalený vírus (to znamená buď RNA alebo DNA vírus) z čeľade Hepadnaviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae alebo Picornaviridae. Preferovaný neobalený vírus podľa vynálezu je vírus z čeľade Hepadnaviridae, zvlášť rod Hepadnavirus. Vírus z čeľade Parvoviridae je rodu Parvovirus (napr. cicavčie a vtáčie parvovírusy) alebo Dependovirus (napr. adenoasociované vírusy (AAV)). Vírus z čeľade Papovaviridae je prednostne z podčeľade Papillomavirinae (napr. papilomavírusy, ktoré napríklad zahrnujú ľudské papilomavírusy (HPV) 1-48) alebo z podrodiny Polyomavirinae (napr. polyomavírusy zahrnujúce JC, SV40 a vírus BK). Vírus čeľade Adenoviridae je rodu Mastadenovirus (napr. cicavčie adenovírusy) alebo Aviadenovirus (napr. vtáčie adenovírusy). Vírus z čeľade Picornaviridae je prednostne vírus hepapatitídy A (HAV), vírus hepapatitídy B (HBV) alebo vírus hepatitídy ani A ani B,

Podobne vektorom môže byť obalený vírus čeľade Herpesviridae alebo Retroviridae alebo to môže byť Sindbis vírus. Preferovaným obaleným vírusom podľa vynálezu je vírus čeľade Herpesviridae, zvlášť podčeľade alebo rodu Alphaherpesvirinae (napr. vírus podobný vírusu herpes simplex), Simplexvirus (napr. vírus podobný vírusu herpes simplex), Varicellavirus (napr. varicella a vírus podobný vírusu besnoty), Betaherpesvirinae (napr. cytomegalovírusy), Cytomegalovirus (napr. ľudské cytomegalovírusy), Gammaherpesvirinae (napr. lymfocytmi-asociované vírusy) a Lymphocryptovirus (napr. vírus podobný EB vírusu).

Iným preferovaným obalovým vírusom je RNA vírus čeľade Retroviridae (to je prednostne retrovírus), zvlášť vírus rodu alebo podčeľade Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae a Lentivirus. RNA vírus podčeľade Oncovirinae je ľudský T-lymfotropný vírus typu 1 alebo 2 (to je HTLV-1 alebo HTLV-2) alebo bovinný vírus leukémie (BLV), vtáčí vírus leukosarkómu (napr. Rous sarkoma vírus (RSV)), vtáčí vírus myeloblastózy (AMV), vtáčí vírus erytroblastózy (AEV), Rous-asociovaný vírus (RAV)-l až 50, RAV-0), cicavčí vírus typ C (napr. Moloneyov vírus myšej leukémie (MuLV), Harveov vírus myšieho sarkómu (HaMSV), Abelsonov vírus myšej leukémie (A-MuLV), AKR-MuLV, mačací vírus leukémie (FeLV), opičí vírus sarkómu, vírus retikuloendoteliózy (REV), vírus nekrózy sleziny (SNV)), vírus typu B ( napr. myší vírus nádoru prsnej žľazy (MMTV)) alebo vírus typu D (napr. Mason-Pfizerov opičí vírus (MPMV)), vírusy “SAIDS”). RNA vírus podčeľade Lentivirus je vírus ľudskej imunonedosta točnosti typ 1 alebo 2 (to je HIV-1 alebo HIV 2, kde HIV-1 bol predtým nazývaný lymfadenopatia-asociovaný vírus 3 (HTLV-III) a vírus získaného syndrómu imunitnej nedostatočnosti (AIDS) (ARV)) alebo iný určený vírus príbuzný s HIV-1 alebo HIV-2, ktorý je spojovaný s AIDS alebo s ochoreniami, ktoré sú podobné AIDS. Skratka “HIV” alebo termíny “vírus AIDS” alebo “vírus ľudskej imunonedostatočnosti” tu označujú všeobecne vírusy HIV, vírusy príbuzné HIV a HlV-asociované vírusy. Avšak vírus RNA podčeľade Lentivirus je prednostne vírus Visna/maedi (napr. taký, ktorý infikuje ovce), mačací vírus imunonedostatočnosti (FIV), bovinný lentivirus, opičí vírus imunonedostatočnosti (SIV), konský vírus infekčnej anémie (EIAV) alebo kozí artritídový-encefalitídový vírus (CAEV).

Zvlášť preferovaným vektorom podľa vynálezu je adenovírusový vektor (to je vírusový vektor čeľade Adenoviridae v optimálnom prípade rodu Mastadenovirus). Takým vektorom je vektor Ad2 alebo Ad5, pričom sa môžu použiť aj adenovírusové vektory iných sérotypov. Adenovírusový vektor používaný na prenos génu môže byť vektor divokého typu (to je kompetentný na replikáciu). V inom prípade adenovírusový vektor obsahuje genetický materiál s najmenej jednou modifikáciou, ktorá spôsobuje, že vírus sa nereplikuje. Modifikácia adenovírusového genómu môže zahrnovať, ale nie je obmedzená na, pridanie segmentu DNA nové usporiadanie segmentu DNA, deléciu segmentu DNA, nahradenie segmentu DNA alebo zavedenie lezie DNA. Veľkosť segmentu DNA sa môže pohybovať od 1 nukleotidu do 36 kbp (to je približne veľkosť adenovírusového genómu) alebo v inom prípade sa môže rovnať maximálnemu množstvu nukleotidov, ktoré možno zabaliť do adenovírusového viriónu (to je okolo 38 kb). Preferované modifikácie adenovírusového genómu zahrnujú modifikácie oblastí El, E2, E3 alebo E4. Podobne adenovírusový vektor sa môže kointegrovať, to znamená ligáciu adenovírusových sekvencií, s inými sekvenciami, ako sú iné vírusové alebo plazmidové sekvencie.

Vírusový vektor (to je zvlášť replikačne deficitný adenovírusový vektor) môže obsahovať buď plné kapsidy (to znamená, že zahrnuje vírusový genóm, ako je adenovírusový genóm) alebo prázdné kapsidy (to znamená, že neobsahuje vírusový genóm alebo vírusový genóm je degradovaný, napr. fyzikálnym alebo chemickým spôsobom). Vzhľadom k tomu, že existujú spôsoby prenosu vírusov, plazmidov a fágov vo forme sekvencií nukleových kyselín (to je RNA alebo DNA), vektor (to je prenosový vektor) podobne môže obsahovať RNA alebo DNA v neprítomnosti ľubovoľného asociovaného proteinu, ako je kapsidový proteín a v neprítomnosti ľubovoľného obalového lipidu. Podobne, vzhľadom k tomu, že lipozómy ovplyvňujú vstup do bunky fuzovaním s bunkovou membránou, transferový vektor môže obsahovať lipozómy (napr. tie, ktoré sú bežne dostupné, Life Technologies, Bethesda, MD) s konštitutívnymi nukleovými kyselinami, ktoré kódujú obalový proteín. Potom podľa vynálezu, zatiaľ čo vektor “obsahuje” chimérický adenovírusový obalový proteín, transferový vektor “kóduje” chimérický adenovírusový obalový proteín; lipozómové transferové vektory zvlášť “kódujú” v zmysle, že obsahujú nukleovú kyselinu, ktorá v skutočnosti kóduje proteín.

Vektor podľa vynálezu môže obsahovať prídavné sekvencie a mutácie, napr. niektoré v samotnom obalovom proteíne. Vektor podľa vynálezu ďalej prednostne obsahuje nukleovú kyselinu obsahujúcu cudzorodý gén.

“Nukleová kyselina” je polynukleotid (DNA alebo RNA). “Gén” je ľubovoľná sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín alebo nascentnú molekulu RNA. “Cudzorodý gén” je ľubovoľný gén, ktorý sa podľa vynálezu typicky nenachádza vo vektore a nie je do neho ani subklonovaný (napr. transferový vektor) a ktorý je pri zavedení do hostiteľskej bunky doprevádzaný zistiteľnou zmenou intracelulárneho prostredia (napr. zvýšeným množstvom DNA, RNA, peptidu alebo proteínu, alebo zmenenou rýchlosťou produkcie alebo degradácie týchto látok). “Génový produkt” je buď ešte nepreložená molekula RNA prepísaná z daného génu alebo kódujúca sekvencia (napr. mRNA alebo antisense RNA) alebo polypeptidový reťazec (to je proteín alebo polypeptid) preložený z molekuly mRNA prepísanej z daného génu alebo kódujúcej sekvencie. Zatiaľ čo gén obsahuje kódujúce sekvencie a zároveň ľubovoľné nekódujúce sekvencie, “kódujúca sekvencia” nezahrnuje žiadnu nekódujúcu (napr. regulačnú) DNA. Gén alebo kódujúca sekvencia je “rekombinantný”, ak báza po celej dĺžke molekuly sa líši od sekvencie, kde sa typicky gén alebo kódujúca sekvencia nachádzajú v prírode alebo ak sa sekvencia báz typicky v prírode nenachádza. Podľa vynálezu gén alebo kódujúca sekvencia sa môže pripraviť celkom alebo čiastočne synteticky, môže obsahovať genómové alebo komplementárne sekvencie DNA (cDNA) a môže sa vyskytovať buď vo forme DNA alebo RNA.

Nekódujúce sekvencie alebo regulačné sekvencie zahrnujú promótorové sekvencie. “Promótor” je sekvencia DNA, ktorá riadi naviazanie RNA polymerázy a tým podporuje syntézu RNA. “Zosilňovače” sú czs-pôsobiace elementy DNA, ktoré stimulujú alebo inhibujú transkripciu priľahlých génov. Zosilňovač, ktorý inhibuje transkripciu sa tiež nazýva “tlmič”. Zosilňovače sa líšia od DNA viažúcich miest určených pre sekvenčne špecifické DNA viažúce proteíny, ktoré sa nachádzajú iba v promótore (ktoré sa tiež nazývajú “promótorové elementy”), v ktorých zo20 silňovače môžu fungovať v ľubovoľnej orientácii a na vzdialenosť až niekoľko párov kilobáz dokonca z pozície downstream prepisovanej oblasti. Podľa vynálezu kódujúca sekvencia je “operabilne spojená” s promótorom (napr. keď kódujúca sekvencia aj promótor tvoria cudzorodý gén), keď promótor je schopný riadiť transkripciu uvedenej kódujúcej sekvencie.

“Cudzorodý gén” je ľubovoľný gén a ide buď o terapeutický gén alebo o reportný gén. Preferuje sa, aby cudzorodý gén bol výhodne schopný expresie v bunke, do ktorej sa vektor internalizoval. Napríklad cudzorodý gén môže obsahovať reportný gén alebo sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá kóduje proteín, ktorý sa môže v bunke určitým spôsobom detegovať. Cudzorodý gén môže tiež zahrnovať terapeutický gén, ktorý napr. ovplyvňuje množstvo RNA alebo proteínu. Napríklad proteín kódovaný preneseným terapeutickým génom sa môže použiť pri liečbe dedičných chorôb, ako je napr. transmembránová konduktancia regulačnej cDNA u cystickej fíbrózy pri liečbe cystickej fibrózy. Proteín kódovaný terapeutickým génom môže spôsobiť aj odumretie bunky. Napríklad samotná expresia génu môže viesť k usmrteniu bunky, ako napr. expresia génu diftériového toxínu A, alebo expresia génu môže prepožičať bunkám selektívnu senzitivitu k fatálnemu pôsobeniu istých liekov, napr. expresia génu HSV tymidínovej kinázy umožňuje bunkám byť citlivými na antivírusovú látku, ktorá zahrnuje acyklovírus, gancyklovírus a FIAU (l-(2-deoxy-2-fluóro-p-D-arabinofuranozyl)-5-jódouracil).

Terapeutický gén môže pôsobiť na množstvo RNA, napr. kódovaním antisense message alebo ribozómu, proteínu, ktorý spôsobuje zostrih alebo spracovanie 3' konca (napr. polyadenylácia) alebo môže kódovať proteín, ktorý pôsobí na silu expresie iného génu v bunke (kde sa uvažuje, že expresia génu zahrnuje všetky kroky od iniciácie transkripcie cez produkciu spracovaného proteínu), možno medzi ďalšími môže sprostredkovať zmenu rýchlosti akumulácie mRNA, zmenu transportu mRNA a/alebo zmenu v post-transkripčnej regulácii. Použitie termínu “terapeutický gén” zdôrazňuje tieto a ďalšie uskutočnenia, ktoré sa bežnejšie nazývajú génovou terapiou a sú dobre známe v odbore. Podobne rekombinantný adenovírus sa môže použiť v prípade génovej terapie alebo ku štúdiu účinkov expresie génu v danej bunke alebo v tkanive in vitro alebo in vivo.

Rekombinantný adenovírus obsahujúci chimérický obalový proteín a rekombinantný adenovírus, ktorý ďalej obsahuje cudzorodý gén alebo gény, ktoré sú schopné sa exprimovať v určitej bunke, sa pripravujú použitím transferového vektora, uprednostňuje sa vírusový alebo transferový vektor v súlade s vynálezom. Taký transferový vektor prednostne obsahuje sekven21 ciu génu chimérického adenovírusového obalového proteínu, ako sa opisuje vyššie. Sekvencia génu chimérického obalového proteínu obsahuje neprirodzenú sekvenciu v mieste natívnej sekvencie, ktorá sa odstránila alebo vedľa uvedenej natívnej sekvencie.

Rekombinantná sekvencia génu chimérického obalového proteínu (ako je sekvencia génu vlákna) sa môže za účelom expresie a zhodnotenia receptorovej a proteínovej špecifíty a avidity, trimerizačného potenciálu, viazania pentónovej bázy a iných biochemických charakteristík, preniesť z adenovírusového transferového vektora do bakulovírusu alebo vhodného prokaryontného alebo eukaryontného expresívneho vektora.

Vynález tiež opisuje rekombinantné bakulovírusové a prokaryontné a eukaryontné expresívne vektory, ktoré obsahujú sekvenciu génu chimérického adenovírusového obalového proteínu (uprednostňuje sa sekvencia génu vlákna). Tieto vektory tiež sú “transferové vektory” podľa vyššie uvedenej definície. Sekvencia génu chimérického obalového proteínu (napr. sekvencia génu vlákna) zahrnuje neprirodzenú sekvenciu vedľa natívnej aminokyselinovej sekvencie alebo na mieste uvedenej sekvencie, ktorá je schopná sa naviazať na výsledný chimérický obalový proteín (napr. vláknitý proteín) na inom väzobnom mieste ako je tomu u natívnej sekvencie. Prenosom chimérického génu z adenovírusového vektora do bakulovírusu alebo prokaryontného alebo eukaryontného expresívneho vektora, je možné dosiahnuť vysokú expresiu proteínu (približne 5 až 50% celkového proteínu je chimérický proteín).

Vektor podľa vynálezu ďalej môže obsahovať ďalšie sekvencie, ktoré ovplyvňujú schopnosť obalového proteínu, ako je trimerizácia vláknitého proteínu, alebo ktoré obsahujú proteázovú rozoznávajúcu sekvenciu, na mieste alebo mimo kódujúcej sekvencie obalového proteínu. Sekvencia, ktorá ovplyvňuje schopnosť trimerizácie je jedna alebo viac sekvencií, ktoré umožňujú trimerizáciu chimérického obalového proteínu, ktorým je vláknitý proteín. Sekvencia, ktorá obsahuje proteázovú rozpoznávaciu sekvenciu je sekvencia, ktorá sa môže štiepiť proteázou, pričom spôsobuje odstránenie chimérického obalového proteínu (alebo jeho časti) a zachytenie rekombinantného adenovírusu na bunku prostredníctvom iného obalového proteínu. V prípade, že sa používa obalový proteín, ktorým je vláknitý proteín, proteázové rozpoznávacie miesto s výhodou neovplyvňuje trimerizáciu vlákna alebo receptorovú špecifitu vláknitého proteínu. Napríklad v jednom uskutočnení vynálezu je výhodne vláknitý proteín alebo jeho časť odstránená prostredníctvom proteázovej rozpoznávacej sekvencie a potom sa nové väzobné miesto na po vrchu bunky inkorporovalo buď do pentónovej bázy alebo do hexónového obalového proteinu, pričom sa uprednostňuje použitie intergénovej sekvencie, ako sa opisuje predtým v texte.

Čo sa týka prípravy vektorov a transferových vektorov podľa vynálezu konštruujú sa s použitím štandardných molekulových a genetických metód, ktoré sú známe v odbore. Vektory (napr. virióny alebo vírusové partikuly) sa pripravujú s použitím vírusových vektorov. Napríklad vírusový vektor obsahujúci chimérický obalový proteín podľa vynálezu sa môže skonštruovať tak, že do bunky, ktorá neobsahuje kompletné E4 sekvencie, sa zavedie (1) lineárny vektor obsahujúci chimérické vlákno a gén E4 divokého typu a (2) lineárny vektor, ktorý neobsahuje E4, ako je zobrazené na Obr. 3. Nasledujúce príklady ukazujú, že táto metodológia vedie k rekombinácii medzi sekvenciami, ktoré generujú vektor obsahujúci časť počiatočného vektora bez E4 a Časť vektora E4⁺, zvlášť oblasť obsahujúcu sekvencie chimérického vlákna.

Podobne partikuly obsahujúce vláknitú chiméru vznikajú v štandardných bunkových líniách, napr. v tých, ktoré sa používajú v prípade adenovírusových vektorov. Potom nasleduje produkcia a izolácia. Partikuly, v ktorých má byť vlákno odstránené, sa stávajú bezvláknové prostredníctvom štiepenia partikúl so sekvenčne špecifickou proteázou, ktorá štiepi vláknité proteíny a uvoľňuje ich z vírusových partikúl, čím vznikajú bezvláknové partikuly. Napríklad trombín rozoznáva a štiepi známe aminokyselinové sekvencie, ktoré sa môžu inkorporovať do vektora (Stenŕlo et al., J. Biol. Chem., 257, 12280-12290 (1982)). Podobne sa pri konštrukcii vektora môžu použiť delečné mutanty, ktorým chýba gén vlákna. Sú to napríklad H2dl802, H2dl807 a H2dll021 (Falgout et al., J. Virol., 62, 622-625 (1988)). Tieto bezvláknité partikuly vykazujú stabilitu a schopnosť viazať sa na bunky a infikovať ich (Falgout et al., J. Virol., 62, 622-625 (1988)). Tieto výsledné partikuly sa potom smerujú do špecifických tkanív prostredníctvom pentónovej bázy alebo iného obalového proteinu, uprednostňuje sa tiež iný obalový proteín, ktorý obsahuje jednu alebo viac neprirodzených aminokyselinových sekvencii podľa vynálezu.

V inom prípade môže odstránením natívnej oblasti “knob”, ktorá obsahuje oblasť trimerizácie a oblasť naviazania receptora vláknitého proteinu, a jej nahradením neprirodzenou oblasťou trimerizácie a neprirodzenou aminokyselinovou sekvenciou, vzniknúť rekombinantný adenovirus obsahujúci chimérický vláknitý proteín, ktorý má ďalšie modifikácie (Peteranderl et al., Biochemistry, 31, 12272-12276 (1992)) podľa vynálezu. Rekombinantný adenovírus obsahujúci chimérický vláknitý proteín môže tiež vznikať bodovou mutáciou v oblasti “knob” a izoláciou klonov, ktoré sú schopné trimerizácie. V každom prípade a tiež vzhľadom na odstránenie a nahradenie natívneho receptora - špecifickej väzobnej sekvencie, ako sa opisuje vyššie, k C-koncu vláknitého proteínu alebo do exponovaných slučiek vláknitého proteínu možno pridať väzobné domény nového proteínu zavedením jednej alebo viacerých kópií sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá kóduje neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu, do vhodnej polohy. Taký vláknitý proteín má výhodne schopnosť trimerizácie tak, že je schopný viazať protein na báze pentónu.

Vyššie opísaný spôsob tvorenia chimérického vláknitého proteínu sa môže použiť na prípravu ďalších chimérických obalových proteínov, napríklad chimérického hexónového alebo pentónového proteínu.

Názorné použitia

Vynález opisuje chimérický protein, ktorý je schopný sa viazať na bunky a sprostredkovať s vysokou účinnosťou vstup do týchto buniek, rovnako ako vektory a transferové vektory. Samotný chimérický obalový protein má niekoľko použití, napríklad môže byť nástrojom in vitro štúdií naviazania adenovírusu na bunky (napr. Scatchardovou analýzou, ako predtým v texte opísal Wickham et al. Celí, 73, 309-319 (1993)) za účelom zablokovania naviazania adenovírusu na receptory in vitro (napr. použitím protilátok, peptidov a enzýmov, ako sa opisuje v príkladoch) a ochrany proti adenovírusovej infekci in vivo, pričom dochádza k súťaženiu pri naviazaní na väzobné miesta, ktorými adenovírus vstupuje do bunky.

Vektor obsahujúci chimérický obalový protein sa tiež môže použiť pri tvorbe kmeňa a pri príprave nových vektorov. Napríklad neprirodzená aminokyselinová sekvencia sa môže viazať na nukleové kyseliny a môže sa intracelulárne zaviesť v zmysle tvorenia nových vektorov prostredníctvom rekombinácie. Podobne sa vektor môže použiť pri génovej terapii. Napríklad vektor podľa vynálezu sa môže použiť pri liečbe radu chorôb zavedením opravnej DNA do cieľových buniek. To znamená, že ide o DNA, ktorá kóduje funkciu, ktorá sa buď v bunke nevyskytuje alebo je poškodená, alebo kóduje jednotlivé činidlá usmrcujúce bunky, napríklad DNA kódujúca cytotoxín, ktorá je aktívna iba vnútri bunky. Medzi choroby, ktoré je možné liečiť uvedeným spôsobom patrí napríklad rakovina, napr. melanóm, glióm alebo rakovina pľúc; genetické poruchy, napr. cystická fibróza, hemofília alebo svalová dystrofia; patogénne infekcie, napr. HIV, tuberkulóza alebo hepatitída; ochorenia srdca, napr. prevencia restenózy nasledujúcej angioplas24 tiu alebo podpora angiogenézy reperfuziou nekrotického tkaniva; a poruchy autoimunity, napr.

Crohnova nemoc, kolitída alebo reumatická artritída.

Génová terapia zvlášť prebieha pri liečbe chorôb, porúch alebo stavov, ktoré sú spojené s poruchami rôznych tkanív, ktorým chýba vysoké množstvo receptorov, na ktoré sa viaže vláknitý proteín adenovírusu divokého typu a pre ktoré súčasné prístupy ku génovej terapii, ktorá je sprostredkovaná adenovírusmi, nie sú optimálne (napr. v prípade zavedenia do monocytu/makrofágov, fibroblastov, neurónov, buniek hladkého svalstva a epiteliálnych buniek). Tkanivá obsahujúce tieto bunky (a ochorenia, poruchy alebo stavy s nimi spojené) zahrnujú, ale nie sú obmedzené na endotelium (napr. angiogenézu, restenózu, zápal a nádory); neurónové tkanivo (napr. nádory a Alzheimerova nemoc); epitelium (napr. poruchy kože, sietnice, čriev a pľúc); hematopoietické bunky (napr. HIV-1, HIV-2, rakovina a anémia); hladké svalstvo (napr. restenóza) a fibroblasty (napr. zápal).

Avšak namiesto prenášania terapeutického génu sa s použitím vektorov (zvlášť adenovírusových vektorov) môže preniesť reportný gén alebo niektorý typ značiaceho génu. Značiace a reportné gény sa môžu použiť napríklad pri diferenciácii buniek a pri štúdiách odumierania buniek, rovnako ako na účely diagnostiky. Štandardný reportný gén, ako je β-galaktozidáza, čo je gén, ktorý kóduje zelený fluorescenčný proteín (GFP) alebo gén β-glukuronidázy sa môže použiť in vivo, napríklad pri teste živého hostiteľa alebo pri odstraňovaní cieľových buniek (napr. Minden et al., Biotechniques, 20, 122-129 (1996); Youvan, Science, 268, 264 (1995); US Patent 5,432,081; Deonarain et al., Br. J. Cancer, 70, 786-794 (1994)).

Podobne môže byť vhodné na prenesenie génu použiť hostiteľa v podstate ako prostriedok in vivo produkcie určitého proteínu. Za týmto účelom sa používajú transgénne zvieratá, napríklad pre produkciu rekombinantných polypeptidov v mlieku transgenného bovinného druhu (napr. medzinárodná prihláška PCT WO 93/25567). Ďalej sa gény môžu prenášať za účelom iným než sú terapeutické dôvody, ako je štúdium ľudských onemocnení s použitím zvieracieho modelu (napr. použitie transgénnych myší a iných transgénnych zvierat, ktorých gén nádorového supresora je vyradený z funkcie, pre účely tumorogénnych štúdií, použitie transgenného modelu pri poruche tolerancie na glukózu a v prípade Alzheimerových amyloidových prekurzorových proteínových modelov pri štúdiách metabolizmu glukózy a patogenézy Alzheimerovej choroby atď.

Tieto názorné použitia uvedené vyššie v texte nie sú zďaleka vyčerpávajúce a je zrejmé, že vynález zdôrazňuje tiež ďalšie použitia, ktoré vychádzajú z opisu vynálezu. Podobne tu existuje rad výhod, ktoré sú spojené s rôznymi aspektami vynálezu.

Použitie univerzálneho cieleného vektora podľa vynálezu je výhodné z týchto dôvodov: (1) vektor sa môže potencionálne používať pre všetky bunky a tkanivá; (2) vo všetkých bunkových líniách je možné použiť iba jeden vektor, nemusí sa uskutočňovať kotransfekcia nezávislým vektorom; (3) vektor je schopný umožniť zavedenie génu s vyššou účinnosťou, než sa pozoruje u vektorov, ktoré obsahujú vláknitý proteín divokého typu; (4) vektor, na rozdiel od predchádzajúcich vektorov, nie je špecifický k určitým bunkám, ale namiesto toho zvyšuje transdukčnú účinnosť, čím je globálnym; (5) v prípade, že sa vektor používa v redukovanej dávke, dávka sa porovnáva s vektorom obsahujúcim vláknitý proteín divokého typu (to je multiplicita infekcie (MOI)), je schopný sprostredkovať transfer génu a tak pravdepodobne redukovať s dávkou spojený nedostatok, ktorý doprevádza súčasne dostupné adenovírusové vektory; a (6) vektor sa môže pomnožiť a udržovať s použitím súčasne dostupných bunkových línií.

Schopnosť univerzálneho cieleného vektora, ako je univerzálny cielený adenovírusový vektor, potencionálne sa viazať na všetky alebo na väčšinu tkanív a vstupovať do nich má niekoľko výhod. Medzi tieto výhody patrí zvýšená účinnosť zavedenia génu do mnohých tkanív, schopnosť jednotlivého vektora zaviesť gény do všetkých tkanív a zjednodušenie produkcie komponentov nevyhnutných pre zavedenie génu. Taký univerzálny cielený vektor obsahuje potenciál pre zavedenie exogénnej DNA do buniek spôsobom “piggy backing”, kedy DNA sa pripojí k vektoru na základe interakcie proteín/DNA.

Ďalšie potencionálne výhody takého univerzálneho cieleného vektora zahrnujú podstatne zvýšenú účinnosť zavádzania (napr. zvýšenie 10 až 100 krát) do buniek, ktoré exprimujú nízke množstvo receptora vlákna, na ktorý sa viaže vláknitý proteín divokého typu, rovnako ako zvýšenú účinnosť expresie receptora vlákna buniek alebo tkanív, ktoré exprimujú receptor vlákna, na ktoré sa viaže vlákno divokého typu. Ak sa vektory používajú v redukovanej dávke povedie to ku zníženiu výskytu zápalov, ktoré sú spojené s adenovírusmi; ku zníženiu výskytu humorálnej odozvy na adenovírusy a cytotoxickej odozvy T-lymfocytov na adenovirus.

Ďalej vektor je výhodný v tom, že sa môže izolovať a čistiť bežným spôsobom. Vzhľadom k tomu, že zmeny vo vektore sa uskutočňujú na úrovni genómu, nevyžadujú sa nevhodné a nákladné post-produkčné modifikácie, ktoré sú spojené s inými vektormi (napr. Cotten et al., (1992), citácia uvedená vyššie; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6099-6103 (1992). Podobne nie sú nutné špeciálne línie buniek exprimujúce receptor. UTV vektor sa môže pomnožiť na rovnaký titer, ktorý dosahuje vektor divokého typu, ktorý nemá vláknité modifikácie.

Spôsoby aplikácie

Vektory a transferové vektory podľa vynálezu sa môžu použiť ku kontaktu buniek buď in vitro alebo in vivo. Termín “kontaktovanie” podľa vynálezu znamená ľubovoľný spôsob, ktorým je vektor zavedený intraceluláme; spôsob nezávisí od akéhokoľvek určitého spôsobu zavedenia a nie je tak vykladaný. Spôsoby zavedenia sú v odbore dobre známe a sú tiež tu uvedené.

Zavedenie môže byť uskutočnené buď in vitro (napr. spôsobom génovej terapie typu ex vivo alebo pri štúdiu tkanivových kultúr) alebo in vivo elektroporáciou, transformáciou, transdukciou, konjugáciou alebo triparentálnym matovaním, (ko-)transformáciou, (ko)infekciou, membránovou fuziou s katiónovými lipidmi, bombardovaním projektilmi obalenými DNA pri veľkých rýchlostiach, inkubáciou so zrazeninami fosforečnan vápenatý-DNA, priamou mikroinjektážou do jednotlivých buniek a podobne. Vektory sa môžu podobne zaviesť pomocou katiónových lipidov, napr. lipozómov. Také lipozómy sú bežne dostupné (napr. Lipofectin®, Lipofectamine™ a podobne, tieto produkty dodáva firma Life technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Podľa vynálezu možno použiť lipozómy, ktoré majú zvýšenú kapacitu prenosu a/alebo redukovanú toxicitu in vivo (napr. patentová prihláška PCT WO 95/21259). Existujú aj iné dostupné metódy, ktoré sú dobre známe v odbore.

Termín “hostiteľ” podľa vynálezu (a potom “bunka” hostiteľa) znamená ľubovoľného hostiteľa, do ktorého sa môže zaviesť vektor podľa vynálezu, čo môže byť napr. zviera, ako obojživelník, vták, ryba, hmyz, plaz alebo cicavec napr. hlodavec , primáti (ako sú šimpanz, opica, bezchvostá opica, gorila, orangutan alebo gibon), mačkovité šelmy, psovité šelmy, kopytníky (ako sú prežúvavce alebo prasatá) a najmä človek.

Keďže univerzálny cieľový vektor zjavne vstupuje do všetkých buniek, potom bunka môže byť ľubovoľná bunka, do ktorej taký vektor môže vstúpiť. Univerzálny cieľový vektor sa môže zvlášť použiť pri transfere génu do bunky, ktorá exprimuje nízke alebo nedetegovateľné množstvo receptora vlákna. Medzi tieto bunky patria napr. endoteliálne, neurónové, hematopoietické alebo fibroblastové bunky alebo bunky hladkého svalstva.

Vhodné metódy aplikácie vektora (zvlášť adenovírusového vektora) podľa vynálezu na zviera pre účely génovej terapie (napr. Rosenfeld et al., Science, 252, 431-434 (1991); Jaffe et ak, Clin. Res. 39 (2), 302A (1991); Rosenfeld et ak, Clin Res., 39(2), 311A (1991); Berkner, BioTechniques, 6, 616-629 (1988)), chemoterapie a vakcinácie sú dostupné, a hoci sa môže použiť viac ako jedna cesta aplikácie, určitý spôsob aplikácie môže umožniť okamžitú alebo účinnejšiu reakciu v porovnaní s iným spôsobom. Farmaceutický prijateľné ekcipienty sú tiež v odbore dobre známe a sú dostupné. Voľba excipientu sa stanoví čiastočne v závislosti od spôsobu aplikácie rekombinantného vektora. Existuje rad vhodných formulácií, ktoré sa používajú v súlade s vynálezom. Nasledujúce metódy a excipienti sú iba príkladmi a nie sú limitujúce.

Formulácie vhodné pre prípad orálnej aplikácie môžu zahrnovať (a) kvapalné roztoky, ako je účinné množstvo látky rozpustenej v rozpúšťadle, ktorým je voda, fyziologický roztok alebo pomarančový džús; (b) kapsuly, vrecúška alebo tablety, kde každá obsahuje prevládajúce množstvo aktívnej látky, ako sú pevné látky alebo granuly; (c) suspenzie vo vhodnom roztoku; a (d) vhodné emulzie. Tabletové formy môžu zahrnovať jednu alebo viac látok, ktorými sú laktóza, manitol, kukuričný škrob, zemiakový škrob, mikrokryštalickú celulózu, arabskú gumu, želatínu, koloidový silikónový dioxid, karmelózu sodíka, talk, stearát magnézia, stérická kyselina a iné excipienty, farbivá, rozpúšťadlá, pufrujúce činidlá, zvlhčovacie činidlá, konzervačné činidlá, aromatizačné prísady a farmaceutický kompatibilné excipienty. Lozengové formy môžu obsahovať aktívne dochucujúce látky, obvykle cukrózu a arabskú gumu alebo tragakant, rovnako ako pastilky obsahujúce aktívne ingredience v inertnej báze, ako je želatína a glycerín alebo sacharóza a arabská guma, emulzie, gély a podobne, ktoré obsahujú naviac aktívne látky, ako sú excipienty dobre známe v odbore.

Samotný vektor alebo transferový vektor podľa vynálezu alebo v kombinácii s inými vhodnými komponentami sa môže pripraviť ako aerosólové formulácie, ktoré sa aplikujú inhaláciou. Tieto aerosólové formulácie sa plnia spolu s tlakovanými prijateľnými hnacími látkami, ako sú dichlórodifluórometán, propán, dusík a podobne. Môžu sa tiež pripravovať ako liečivá vo forme natlakovaných prípravkov, ako sú zhmľovače alebo atomizéry.

Formulácie vhodné pre parenterálnu aplikáciu zahrnujú vodné a nevodné, izotonické, sterilné injekčné roztoky, ktoré môžu obsahovať antioxidanty, pufre, bakteriostatiká a rozpustené látky, ktoré tvoria prípravok izotonický s krvou zamýšľaného recipienta a vodné a nevodné sterilné suspenzie, ktoré môžu zahrnovať suspendujúce činidlá, rozpúšťadlá, stabilizátory, zahusťovadlá a konzervačné činidlá. Prípravky sa môžu baliť do vzduchotesne uzavretých kontajnerov v jednotkovej dávke alebo v multi-dávkach, ako sú ampuly a fľaštičky a môžu sa skladovať v lyofilizovanom stave, čo vyžaduje pre aplikáciu injekciou púhe pridanie sterilného kvapalného excipienta, napríklad vody, tesne pred použitím. Injekčné roztoky a suspenzie podľa receptu sa môžu pripraviť zo sterilných práškov, granúl a tabliet, ktoré sú opísané predtým v texte.

Naviac vektor alebo transferový vektor podľa vynálezu sa môže pripraviť vo forme čapíkov tak, že sa zmieša s rôznymi bázami, ako sú emulgačné bázy alebo vo vode rozpustiteľné bázyFormulácie vhodné pre vaginálnu aplikáciu sa môžu pripraviť ako pesary, tampóny, krémy, gély, pasty, peny alebo sprayové prípravky obsahujúce okrem aktívnej látky tiež nosiče, o ktorých je známe, že sú vhodné.

Dávka aplikovaná zvieraťu, zvlášť potom človeku v súlade s vynálezom kolíše v závislosti od použitého génu, použitej kompozície, od spôsobu aplikácie a určitého miesta a organizmu, ktorý sa lieči. Dávka môže byť dostatočná na vyvolanie terapeutickej odozvy.

Ako sa uvádza v predchádzajúcom texte, vektor alebo transferový vektor podľa vynálezu sa tiež využíva in vitro. Taký vektor sa používa ako prostriedok výskumu pri štúdiu zachytenia adenovírusu na bunkách a ich infekcie a pri metóde testovania interakcie väzobné miesto-ligand. Podobne rekombinantný obalový proteín, ktorý obsahuje neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu priradenú alebo na mieste natívnej sekvencie viažúcu receptor, sa môže použiť v testoch receptor-ligand a ako adhezívne proteíny in vitro alebo in vivo. Nasledujúce príklady ďalej ilustrujú tento vynález.

Prehľad obrázkov na výkrese

Na obrázku č. 1 je stĺpcový graf zobrazujúci viazanie adenovírusu divokého typu (ako percento vstupu) na bunky získané z rôznych tkanív.

Na obrázkoch č. 2A až B je znázornené pripojenie sekvencie nukleovej kyseliny na koniec génu vlákna adenovírusového divokého typu (Obr. 2A), pričom vzniká chimérický adenovírusový vláknitý proteín (Obr. 2B), ktorý obsahuje neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu na karboxylovom konci. Ako je znázornené, dĺžka polyA chvosta a následne počet lyzínov vo výslednom proteíne môže kolísať.

Obrázok č. 3 ukazuje schematický diagram znázorňujúci konštrukciu adenovírusového transferového vektora, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín pAd BS 59-100 UTV, spôsobom intermediámych transferových vektorov. Zvlášť pAd NS 83-100 (tiež známy ako pl93NS 83-100 alebo pNS 83-100) sa používal pre vznik pAd NS 83-100 bez vlákna (“F’“) (tiež známy ako pl93NS (AF) alebo pNS (AF)) (cesta A), pAd NS 83 100 (F') sa použil ku vzniku pAd NS 83-100 UTV (tiež známy ako pl93NS (F5*), pl93 (F5*) alebo (pNS (F5*)) (spôsob B) a pAd NS 83-100 UTV sa použil pre vznik pAd BS 59-100 UTV (spôsob C).

Obrázky č. 4A až D znázorňujú oligonukleotidy, ktoré sa používajú pri konštrukcii GV10 UTV, to je priméry so sekvenciou SEQ ID No: 9 (Obr. č. 4A), SEQ ID NO: 10 (Obr. 4B), SEQ ID NO: 11 (Obr. č. 4C) a SEQ ID NO: 12 (Obr. č. 4D).

Obrázok č. 5 znázorňuje analýzu westernovým prenosom, ktorá ukazuje nárast veľkosti chimérického adenovírusového vláknitého proteínu (UTV), ktorá sa porovnáva s vláknitým proteínom divokého typu (WT).

Obrázky č. 6A až B znázorňujú grafy vykazujúce porovnanie naviazania adenovírusového vektora, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV10, prázdny trojuholník), a adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín (to je GV UTV, plný kruh) na bunky s receptorom (A549, Obr. č. 6A) a bez receptora (HS 68, Obr. 6B).

Obrázok č. 7 je graf viazaného UTV (počet za minútu (CPM)) oproti množstvu kompetítora (pg/ml) inhibície naviazania chimérického adenovírusového vláknitého proteínu na bunky bez receptora (to je HS 68 fibroblasty) pomocou rozpustných faktorov sulfát chondrotínu (prázdny kruh); heparínu (plný kruh); mucínu (plný trojuholník) a DNA spermy lososa (prázdny trojuholník).

Obrázok č. 8 je graf viazaného UTV (CPM) proti riedeniu enzýmu, ktorý inhibuje naviazanie chimérického adenovírusového vláknitého proteínu na bunky bez receptora (to je HS 68 fíbroblasty) pomocou enzýmov chondroitinázy (prázdny kruh, bodkovaná dráha); heparinázy (otvorený kruh, plná čiara) a sialidázy (trojuholník, plná čiara).

Obrázok č. 9 je stĺpcový graf znázorňujúci porovnanie transferu reportného génu lacZ pomocou vektora, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV10), a adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín (to je GV10 UTV), ako sa stanovilo pomocou expresie výsledného reportného génu (to je relatívnej jednotky svetla (RLU)) v rôznych bunkách s receptorom alebo bez receptora.

Obrázok č. 10 je stĺpcový graf znázorňujúci porovnanie transferu reportného génu lacZ pomocou adenovírusového vektora, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV10), a adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín (to je GV 10 UTV), ako sa stanovilo pomocou expresie výsledného reportného génu (to je relatívnej jednotky svetla (RLU)) v myších pľúcach.

Obrázok č. 11 je stĺpcový graf znázorňujúci transfer reportného génu (to je obsiahnutého v pGUS) pomocou adenovírusového vektora, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV 10, plné stĺpce), a pomocou adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérické vlákno (to je prázdne stĺpce) potencionálne viazané cez proteín/DNA interakciu na bunky 293, A549 a H700 T.

Obrázok č. 12 je diagram, ktorý ďalej znázorňuje plazmid pl93(F5*) (opísaný ako pAd NS 83-100 UTV na Obr. č. 3 a tiež známy ako pl93 (F5*) alebo pNS (F5*)), ktorý sa používa na konštrukciu adenovírusových vláknitých chimér, a sekvenciu C-konca mutovaného vláknitého proteínu, ktorý je prítomný v plazmide (polyadenylačné miesto).

Obrázok č. 13 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pl93NS(F5*) pGS(K7) (tiež známeho ako pl93 (F5*) pGS(K7) alebo pNS (F5*)pK7), ktorý sa používa na konštrukciu adenovírusových vláknitých chimér.

Obrázok č. 14 je diagram, ktorý zobrazuje plazmid pBSS 75-100 pGS(null) (tiež známy ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(null)).

Obrázok č. 15 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pBSS 75-100 pGS(RK32) (tiež známy ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₂ alebo pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK2)).

Obrázok č. 16 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pBSS 75-100 pGS(RK33) (tiež známy ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₃ alebo pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK3)).

Obrázok č. 17 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pl93NS F5F2K (tiež známy ako p 193 F5F2K).

Obrázok č. 18 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₂ (tiež známy ako pl93NS F5F2K(RKKK2), pl93NS F5F2K(RK32) alebo p 193 F5F2K(RKKK2)).

Obrázok č. 19 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₃ (tiež známy ako pl93NS F5F2K(RKKK3), pl93NS F5F2K(RKKK3) alebo pl93 F5FK(RK33)).

Obrázok č. 20 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pACT (RKKK)₃ (tiež známy ako pACT(RKKK3) alebo pACT (RK33)).

Obrázok č. 21 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pACT (RKKK)₂ (tiež známy ako pACT (RKKK2) alebo pACT (RK32)).

Obrázok č. 22 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pACT HU.

Obrázok č. 23 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pACT H11(RKKK)₂ (tiež známy ako pACT H11(RKKK2) alebo pACT H11(RK32)).

Obrázok č. 24 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pl93 F5F9sK (tiež známy ako pl93 F5F9K-Short).

Obrázok č. 25 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pSdelta.

Obrázok č. 26 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pSP2alfa. “j” označuje poškodené miesta PpulOI v plazmide.

Obrázok č. 27 je diagram, ktorý znázorňuje plazmid pSP2alfa2. “j” označuje poškodené miesta PpulOI v plazmide.

Obrázok č. 28 je graf, ktorý znázorňuje dni po infekcii oproti FFU/bunku pre bunky 293 infikované Ad5 (prázdny kruh). AdZ.F(RGD) (plné štvorce) alebo A.dZ.F(pK7) (prázdny trojuholník).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1:

Tento príklad uskutočnenia vynálezu opisuje výskum množstva adenovírusového receptora v rôznych bunkách, čo určuje schopnosť adenovírusu divokého typu viazať sa na bunky. Pre účely týchto experimentov sa stanovila schopnosť adenovírusu obsahujúceho vlákno divokého typu viazať sa na bunky odvodené z rôznych tkanív. Adenovírusové partikuly sa značili [ ³H ] tymidínom, ako sa opisuje predtým v texte (napr. Wickham et al., Celí, 73, 309-319 (1993)). Subsaturačné množstvo adenovírusu, ktorý je značený tymidínom, sa pridalo do 200 μΐ buniek v množstve 10⁶, ktoré sa preinkubovali za prítomnosti 20 μβ/ιηΐ rozpustného vláknitého proteínu alebo bez jeho prítomnosti počas doby 30 až 60 minút. Bunky sa inkubovali s vírusom počas doby jednej hodiny pri teplote 4°C a potom sa 3 krát premyli chladeným fosfátovým pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS). Počet spojených buniek sa meral v scintilačnom počítadle. Špecifické naviazanie sa určilo z odčítaného počtu spojených buniek (to je počet za minútu (cpm) za prítomnosti vlákna a z počtu spojených buniek v prípade, kedy vlákno nebolo prítomné. Naviazanie v prípadoch prítomnosti vlákna nebolo nikdy vyššie ako 2% celkového vstupu rádioaktívnych vírusových partikúl. Výsledky sa získali ako priemer troch meraní.

Ako je zobrazené na obr. 1 podstatné množstvo buniek odvodených z rôznych tkanív exprimovalo malé množstvo alebo žiadny receptor vlákna, čo sa prejavilo relatívnou neschopnosťou adenovírusu divokého typu viazať sa na tieto bunky. Bunky epiteliálneho pôvodu (to sú bunky obsahujúce receptor, medzi ktoré patria Changove bunky, bunky HeLa a bunky A549) viazali veľké množstvo adenovírusu. Pre porovnanie bunky, ktoré nie sú epiteliálne (to je bunky, ktoré neobsahujú receptor, ako sú monocyty/makrofágy, fibroblasty, neurónové bunky, bunky hladkého svalstva a epiteliálne bunky) vykazovali okolo desaťnásobnú alebo vyššiu redukciu pri viazaní vírusu v porovnaní s bunkami, ktoré sú podobné epiteliálnym bunkám.

Tieto výsledky potvrdzujú predtým nerozpoznanú relatívnu neschopnosť adenovírusu viazať sa na bunky, ktoré nie sú epiteliálne a neobsahujú receptor, a vstupovať do nich v porovnaní s epiteliálnymi bunkami, ktoré obsahujú receptor. Predpokladá sa. že táto schopnosť je spôsobená nízkym zastúpením receptorov pre adenovírusový vláknitý proteín divokého typu na týchto bunkách.

Príklad 2:

Tento príklad opisuje konštrukciu adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérický obalový proteín, zvlášť chimérický adenovírusový vláknitý proteín.

Za účelom prekonania obmedzenia transdukcie spôsobenej prítomnosťou iba limitovaného počtu receptorov vlákna na klinicky relevantných tkanivách, ako sú iné tkanivá než epiteliálne, sa skonštruoval modifikovaný adenovírusový vektor, ktorý je zobrazený na obr. č. 2A a 2B. Účelom konštrukcie je odvodiť vektor, ktorý sa tu nazýva “univerzálnym transferovým vektorom” alebo UTV. V géne, ktorý kóduje adenovírusový obalový proteín, v tomto prípade ide o gén vlákna, sa uskutočnila mutácia posunom rámca. Nemodifikovaný gén vlákna u adenovírusu divokého typu obsahuje zahniezdený stop signál translácie (TAA) a transkripčný polyadenylačný signál (AATAAA). Polyadenylačný signál riadi adíciu polyA chvosta na 3'koniec transkriptu. PolyA chvost typicky kdekoľvek obsahuje približne od 20 do okolo 200 nukleotidov. Nasleduje transkripcia a výstup z jadier. Stop signál TAA riadi ukončenie translácie na ribozóme.

Modifikovaný gén vlákna u UTV vektora neobsahuje v rámci translačný stop signál. Nasleduje normálna transkripcia a adícia polyA na mRNA bez prítomnosti stop kodónu, ribozóm pokračuje v translácii transkriptu do oblasti polyA. Vzhľadom k tomu, že kodón AAA kóduje aminokyselinu lyzín, výsledný translačný produkt chimérického génu vlákna produkovaný pomocou UTV zahrnuje adíciu radu polylyzínových zvyškov na C-koniec, to je Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (SEQ ID NO: 1). Je možné, že bunkový proces spôsobuje limitáciu dĺžky polylyzínového radu, vzhľadom na to, že polylyžínové zvyšky typicky obsahujú v chimérickom vláknitom proteíne od približne 3 do 30 zvyškov. V každom prípade však polylyžínové proteínové modifikácie rovnako ako ďalšie tu opísané modifikácie umožňujú UTV, účinne sa viazať na bunky, ktorým chýba veľké množstvo receptora pre adenovírusový vláknitý proteín divokého typu (to sú bunky bez receptora).

Čo sa tyká konštrukcie vektora a charakterizácie, štandardných molekulových a genetických metód, ako sú tvorenie kmeňov, plazmidov a vírusov, gélová elektroforéza, manipulácia DNA, ktorá zahrnuje izoláciu plazmidov, klonovanie DNA a sekvenovanie, testovanie westernovým prenosom a podobne, uskutočnili sa spôsobom, ktorý je dobre známy v odbore a detailne sa opisuje v štandardných laboratórnych manuáloch (napr. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1992); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (1987)). Reštrikčné enzýmy a iné enzýmy používané na molekulové manipulácie sa získali z komerčných zdrojov (napr. Boehringer Mannheim, Inc., Indinapolis, Indiana; New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland) a použili sa v súlade s doporučeniami výrobcu. Bunky, ktoré sa používajú v experimentoch (napr. bunky transformovanej bunkovej línie 293, čo sú bunky obličiek ľudského embrya (CRL 1573) a iné bunky, ktoré poskytla Američan Type Culture Collection) sa kultivovali a udržovali s použitím štandardných sterilných kultivačných činidiel, médií a metód, ktoré sú už opísané (Erzerum et al., Nucleic Acids Research, 21, 1607-1612 (1993)).

Zavedením modifikovaného reštrikčného miesta BamHI (to je GGAT CCAA (SEQ ID NO: 6)) do adenovírusového transferového vektora došlo k mutácii posunom rámca stop kodónu vlákna. Táto manipulácia sa uskutočnila ako ilustruje obr. 3. Na začiatku je plazmid pAd NS 83-100 (ktorý je známy tiež ako pl93NS 83-100 alebo pNS 83-100). Plazmid pAd NS 83-100 sa skonštruoval klonovaním Ad5 Ndel do Sali fragmentu, ktorý zaberá 83 až 100 mapové jednotkové oblasti genómu Ad5, ktorý obsahuje gén vlákna, do plazmidu pNEB193 (New England Biolabs, Beverly, MA).

Fragment Ndel-MunI pAd NS 83-100 sa zamenil za syntetický oligonukleotid, ktorý obsahuje reštrikčné miesto BamHI, ktoré bolo lemované 5'Ndel miestom a 3 'MunI miestom, ktoré sú vhodné pre klonovanie. Dvojreťazcový syntetický oligonukleotidový fragment sa vytvoril z presahujúcich syntetických jednoreťazcových sense a antisense oligonukleotidov. Sense primér je TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C (SEQ ID NO:9) a antisense primér AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA (SEQ ID NO: 10), ako je zobrazené na obrázku č. 4A a 4B. Konce presahujúcich oligomérov sa pripravili tak, aby mali prečnievajúce konce kompatibilné za účelom priameho klonovania do Ndel a Munl miest.

Výsledný transferový plazmid pAd NS 83-100 (F) (ktorý je tiež známy ako pl93NS (AF) alebo pNS (AF)) nemá 50 prvých párov báz kódujúcej sekvencie génu vlákna (to znamená, že nemá vlákno). Vektor ďalej obsahuje celú kódujúcu sekvenciu adenovírusu E4. Plazmid obsahuje polyadenylačný signál AATAAA, ktorý sa nachádza v syntetickom polynukleotide Ndel/MunI a tiež zahrnuje nové reštrikčné miesto BamHI.

Mutovaný gén vlákna sa začlenil do plazmidu pAd NS 83-100, ktorý nemá vlákno, s použitím syntetických sense a antisense oligonukleotidových primérov za účelom amplifikácie génu vlákna polymerázovou reťazovou reakciou (PCR), pričom sa inkorporovalo modifikované reštrikčné miesto BamHI, ktoré nasleduje po poslednom kodóne génu vlákna, vznikol tak mutovaný gén vlákna. Toto modifikované reštrikčné miesto BamHI tiež kóduje aminokyseliny glycín a serín, čo vedie ku vzniku sekvencie chimérickej nukleovej kyseliny GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT (SEQ ID NO:7). Modifikovaný gén vlákna potom kóduje predĺženie výsledného chimérického vláknitého proteínu Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys (SEQ ID NO:4), kde dĺžka polylyzínového radu sa môže meniť. Syntetické oligonukleotidy, ktoré sa používajú pri amplifikácii vlákna sú priméry so sekvenciami TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA (SEQ ID NO:11) a CGT GTA TCC AT A TGA CAC AGA (SEQ ID NO: 12, ako je zobrazené na obr. 4C a 4D.

Amplifikovaný produkt génu sa potom štiepil reštrikčnými enzýmami Ndel a BamHI a klonoval sa do reštrikčných miest Ndel/BamHI plazmidu pAd NS 83-100, ktorý neobsahuje vlákno, za účelom vytvorenia transferového vektora pAd NS 83-100 UTV (ktorý je tiež známy ako pl93NS (F5*), pl93 (F5*) alebo pNS (F5*)). Celá adenovírusová sekvencia pAd NS 83100 UTV od Ndel do Sali sa klonovala do plazmidu pAd BS 59-100, ktorý neobsahuje vlákno, za účelom vzniku pAd BS 59-100 UTV (ktorý je tiež známy ako pl93NS (F5*), pl93 (F5*) alebo pNS (F5*).

Adenovírusový vektor UTV vznikol pomocou homológnej rekombinácie v bunkách 293. Menovite E4 pAd B S 59-100 UTV transferový vektor sa linearizoval reštrikčným enzýmom Sali a transfektoval sa do buniek 293, ktoré sa pred tým infikovali adenovírusovým vektorom A2F. Vektor A2F sa odvodil od vektora GV10. Vektor GV10 založený na vektore Ad5 obsahuje gén lacZ, ktorý riadi promótor vírusu Rousovho sarkómu (to znamená, že obsahuje RSV lacZ). Začlenenie reportného génu do GV10 sa uskutočnilo v oblasti EI (to znamená, že vektor je ET). Vektor GV10 tiež obsahuje deléciu oblasti E3, aleje E4⁺. V porovnaní s GV10 (to je RSV lacZ ΕΓ E3‘ E4⁺) A2F ďalej obsahuje deléciu E4 adenovírusových génov, aleje E3⁺ (to je RSV lacZ ΕΓΕ3Ε4).

Bunky 293 obsahujú EI komplementárnu sekvenciu, ale neobsahujú E4 komplementárnu o sekvenciu. Neprítomnosť E4 komplementárnej sekvencie bráni replikách vektora A2F E4’ v bunkovej línii 293. Keď je A2F začlenený do buniek 293 spolu s pAd BS 59-100 UTV, prebehne homológna rekombinácia medzi UTV vektorom a A2F adenovírusovým genómom, pričom vzniká adenovírusový genóm E3⁺ E4⁺, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín, ktorý je schopný sa replikovať v bunkách 293. Tento výsledný UTV vektor sa označil GV10 UTV.

Vektor GV10 UTV sa izoloval s použitím štandardnej metódy izolácie plakov buniek 293. Nasledujú tri cykly úspešného čistenia plakov. Vektor GV10 UTV obsahoval mutáciu vlákna a neobsahoval žiadne kontaminácie vektorom A2F E4. Prítomnosť chimérických sekvencii vlákna vo vektore GV10 UTV sa zistila sekvenovaním mRNA vlákna polymerázovou reťazovou reakciou s použitím reverznej transkriptázy (RT-PCR), ktorá potvrdila prítomnosť polyadeninového chvosta v chimérickej mRNA vlákna.

Podobne analýza westernovým prenosom potvrdila produkciu chimérického vláknitého proteínu s použitím vektora. Za účelom uskutočnenia tejto analýzy sa bunky 293 infikovali pri multiplicite infekcie (MOI) 5 buď vektorom GV10, ktorý obsahuje adenovírusový vláknitý proteín divokého typu, alebo vektorom GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín. Dva dni po infekcii sa bunky premyli a lýzovali sa v PBS v troch cykloch zmrazeniarozmrazenia. Lyzáty sa vyčistili centrifugáciou a naniesli sa na gél 10% dodecylsulfátu sodného/polyakrylamid. Nasledovala elektroforéza. Proteín sa preniesol na nitrocelulózu a detegoval sa chemolumuniscenciou s použitím polyklonálnych protilátok proti vláknu. Analýza westernovým prenosom je znázornená na obr. č. 5. Ako je zrejmé z obrázku, migrácia proteínov ukazuje, že chimérické vlákno UTV je približne o 1,5 až 2,0 kilodaltonov väčšie než nemodifikovaný vláknitý proteín divokého typu, ktorý je 62 kilodaltonov veľký.

Tieto výsledky potvrdzujú, že tento spôsob sa môže použiť na zavedenie modifikácií do vláknitého proteínu za účelom produkcie chimérického vláknitého proteínu. Podobne sa tento spôsob môže použiť pri zavedení modifikácii do hexónového alebo pentónového proteínu alebo pri zavedení podobných modifikácií (napr. adícia radu aminokyselín, ktoré obsahujú arginín, lyzín a/alebo histidín alebo aspartát a/alebo glutamát alebo adícia ľubovoľnej z týchto sekvencii do kódujúcej oblasti obalových proteínov).

Príklad 3:

Tento príklad opisuje proces naviazania adenovirusového vektora na bunky, pričom vektor obsahuje chimérický obalový protein, ako je chimérický vláknitý protein pri porovnaní s adenovírusovým vektorom divokého typu, buď keď je prítomný alebo neprítomný pridaný vláknitý protein divokého typu.

V týchto experimentoch sa používajú bunky opísané v príklade 1, na ktoré sa adenovírus viaže buď s vysokou účinnosťou (to sú bunky, ktoré obsahujú receptor) alebo s nízkou účinnosťou (to sú bunky, ktoré receptor neobsahujú). Ako reprezentant buniek, ktoré obsahujú receptor, sa použila bunková línia epiteliálnych buniek A549 a bunky, ktoré nenesú receptor, reprezentuje bunková línia fibroblastov HS 68. Konfluentné monovrstvy buniek buď A549 alebo HS 68 sa preinkubovali pri teplote 4°C za prítomnosti rozpustného vláknitého proteínu v koncentráciách 0 až približne 10 gg/ml. Vektory GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický vláknitý protein (UTV), alebo GV10, ktorý obsahuje vláknitý protein divopkého typu (WT), sa označili tritiovaným tymidínom, ako sa opisuje v príklade 1. Približne 20 000 cpm vektora GV10 UTV alebo GV10 značeného [³H]-tymidínom sa inkubovalo spoločne s bunkami počas doby okolo 2 hodín pri teplote 4°C. Bunky sa tri krát premyli chladeným PBS a scintilačným počítaním sa stanovilo cpm spojené s bunkami. Získané výsledky pre bunkové línie A549 a HS 68 sú priemery zdvojeného merania a sú znázornené na obrázkoch 6A a 6B.

Ako je možné vidieť na obrázkoch 6A až B chimérický vláknitý protein vektora GV10 UTV je schopný sa viazať na oba druhy buniek, či už ide o bunky obsahujúce receptor (obr. č. 6A) alebo o bunky, ktoré receptor neobsahujú (obr. č. 6B), s vysokou účinnosťou. Naproti tomu vektor GV10, ktorý obsahuje vlákno divokého typu, sa viaže s vyššou účinnosťou na bunky, ktoré nesú receptor. Najmä rádioaktívne značený vektor GV10 UTV viazaný na bunky exprimuje detegovateľné množstvo receptora vlákna (použili sa alveolárne epiteliálne bunky A549). Expresia je približne 2 až 2,5 krát silnejšia než v prípade vektora GV10. Zatiaľ čo naviazanie vektora GV10 bolo inhibované rekombinantným vláknitým proteínom, v prípade vektora GV10 UTV sa inhibovalo adíciou kompetívneho vlákna iba 40%. Pri použití buniek HS 68, čo sú ľudské fibroblasty hornej vrstvy kože, ktoré nenesú receptor, sa nepozorovalo detegovateľné naviazanie vektora GV10, ktorý obsahuje adenovírusový protein divokého typu. Vektor GV10 UTV účinne viaže bunky HS 68, pričom adícia kompetívneho vláknitého proteínu nemala žiadny účinok na naviazanie.

Tieto výsledky potvrdzujú, že naviazanie vektora GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický obalový proteín (to je chimérický vláknitý proteín), sa neuskutočňuje prostredníctvom adenovírusového receptora vlákna divokého typu, ale namiesto toho prostredníctvom až doposiaľ nerozoznateľného receptora vlákna. Výsledky však potvrdzujú, že začlenenie chimérického obalového proteínu, ako je chimérický vláknitý proteín, do adenovírusového vektora vedie ku zdokonaleniu adenovírusového vektora. Modifikácie vektora GV10 UTV umožňujú prekonať predtým spomínanú relatívnu neschopnosť adenovírusu divokého typu viazať sa na bunky, ktoré nemajú receptor, zvlášť na bunky, ktoré nie sú epiteliálne. Tieto modifikácie tiež umožňujú vektoru viazať sa na bunky, ktoré obsahujú receptor, so zvýšenou účinnosťou.

Príklad 4:

Tento príklad opisuje skúmanie schopnosti rôznych rozpustných faktorov a inhibítorov týchto rozpustných faktorov zablokovať naviazanie adenovírusu, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín, na fibroblastové bunky HS 68, ktoré neobsahujú receptor.

V týchto experimentoch sa určuje inhibícia naviazania vektora GV10 UTV spôsobená rôznymi negatívne nabitými molekulami, medzi ktoré patrí DNA spermy lososa, mucín, sulfát chondrotínu a heparín. Sulfát chondrotínu a heparín sú negatívne nabité molekuly, ktorých náboj udávajú sulfátové skupiny. Mucín nesie negatívny náboj, ktorý je spôsobený prítomnosťou časti sialovej kyseliny a DNA nesie negatívny náboj, ktorý spôsobuje začlenenie častí fosforečnanov. Približne 20 000 cpm UTV vo 250 μΐ väzobného pufru (to je Dulbeccovo modifikované Eagle médium (D-MEM)) sa inkubovalo pri teplote miestnosti počas doby približne 30 min s negatívne nabitými molekulami, ktorých koncentrácia sa pohybovala v rozmedzí približne 1 x 10'³ až 1 x 10⁴ pg/ml. Potom nasleduje inkubácia. Zmes sa schladila na ľade a potom sa pridala k predchladeným bunkám HS 68 a naniesla sa na platne s 24 miskami. Bunky sa inkubovali približne 1 hodinu a potom sa premyli tri krát pufrom PBS. S bunkami spojené cpm sa stanovilo scintilačným počítaním a udáva sa ako priemer dvoch meraní.

Ako je znázornené na obrázku č. 7, zatiaľ čo prítomnosť kompetívneho vláknitého proteínu divokého typu nepôsobí na naviazanie GV10 UTV vektora (obsahuje chimérické vlákno) na bunky HS 68, negatívne nabité kompetívne molekuly sú schopné blokovať naviazanie GV10 UTV. Všetky štyri molekuly vykazujú schopnosť inhibovať naviazanie GV10 UTV na bunky

HS 68. Najefektívnejší je v tomto ohľade heparín a DNA. Tieto molekuly nemajú podstatný účinok na naviazanie vektora GV10 (obsahuje vlákno divokého typu) na bunky, ktoré exprimujú veľké množstvo receptora vlákna (to sú bunky A549; dáta nie sú uvedené).

Tieto výsledky potvrdzujú, že negatívne nabité molekuly sú schopné blokovať naviazanie vektora GV10 UTV na bunky, ktoré je sprostredkované chimérickým vláknitým proteínom. Predpokladá sa, že táto inhibícia je spôsobená naviazaním negatívne nabitých molekúl na pozitívne nabité polylyzínové zvyšky, ktoré sa nachádzajú na vlákne GV10 UTV. Určil sa účinok enzýmov, ktoré štiepia tieto negatívne nabité molekuly, na ich schopnosť viazať sa na bunky s vektorom GV10 UTV.

Bunky HS 68 sa naniesli na platne s 24 miskami a inkubovali sa s rôznym riedením heparinázy (Sigma, St. Louis, MO), chondroitinázy (Sigma) a sialidázy (Boehringer Mannheim, Inc ), ktoré je v rozpätí 0,0001 až 1 počas doby 45 minút pri teplote 37°C, potom nasleduje inkubácia počas doby 15 minút pri teplote 4°C. Zatiaľ čo chondroitináza štiepi sulfát chondroitínu, heparináza štiepi heparín sulfátheparínu a sialidáza štiepi sialovú kyselinu. Počiatočné koncentrácie riedení sú nasledujúce: heparináza 25 U/ml (U=0,l pmólov za hodinu, pH je 7,5, teplota 25°C); chondroitináza 2,5 U/ml (U=l,0 pmólov za minútu, pH je 8,0, teplota 37°C); a sialidáza 0,25 U/ml (U=l,0 pmólov za minútu, pH je 5,5, teplota 37°C). Nasleduje inkubácia. Bunky sa tri krát premyli chladeným pufrom PBS a potom sa inkubovali s 20 000 cpm značeného vektora GV10 UTV počas doby približne 1 hodinu pri teplote 4°C. Bunky sa potom tri krát premyli chladeným pufrom PBS a stanovilo sa cpm spojené s bunkami pomocou scintilačného počítania. Výsledky sa udávali ako priemer dvoch meraní.

Ako sa ukázalo na obrázku č. 8, ak sa bunky HS 68 pred inkubáciou upravili enzýmami, ktoré odstraňujú negatívne nabité molekuly z povrchu bunky, potvrdilo sa, že vektor GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín interaguje s negatívne nabitými miestami na povrchu bunky. Zvlášť heparináza a sialidáza sú schopné redukovať naviazanie GV10 UTV, hoci v prípade buniek HS 68 je heparináza v porovnaní so sialidázou účinnejšia.

Takto tieto výsledky potvrdzujú, že vektor obsahujúci chimérický vláknitý proteín (napr. vektor GV10 UTV), ktorý je iný než adenovírus divokého typu, interaguje novým spôsobom s * negatívne nabitými molekulami na povrchu bunky a tak ovplyvňuje vstup do bunky. Tieto výsledky ďalej ukazujú vektor, ktorý obsahuje negatívne nabité zvyšky (napr. aspartát a glutamát) namiesto pozitívne nabitých molekúl (napr. lyzín), ktoré môžu byť podobne využité pri naviazaní na bunku a vstupu do bunky prostredníctvom pozitívne nabitých molekúl, ktoré sa nachádzajú na povrchu bunky.

Príklad 5:

Tento príklad hodnotí zavedenie génu do rôznych typov buniek sprostredkované adenovírusovým vektorom, ktorý obsahuje chimérický obalový proteín, ako je chimérický vláknitý proteín (napr. GV10 UTV), čo sa porovnáva so zavádzaním génu sprostredkovaného adenovírusom, ktorý obsahuje obalový proteín divokého typu, ako je vláknitý proteín (napr. GV10).

V týchto experimentoch relatívna úroveň zavedenia génu lacZ vektorom, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV10) a vektorom, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín (to je GV10 UTV) sa porovnáva za použitia buniek, ktoré sú podobné epiteliálnym (to sú bunky HeLa, A549, HepG2 a H700 T), bunky hladkého svalstva (to sú HA SMC a Hl SMC), endoteliálne bunky (to sú bunky HUVEC a CPAE), fibroblasty (HS 68 a MRC-5), bunky gioblastómu (U118) a monocyty makrofágov (THP-1). Približne 2 x 10⁵ buniek sa inokulovalo jeden deň pred transdukciou adenovírusom na platne s 24 miskami. Každá miska sa potom infikovala pri MOI 1 GV10 (obsahuje adenovírusový vláknitý proteín divokého typu) alebo GV10 UTV (obsahuje chimérické adenovírusové vlákno) v objeme 250 μΐ počas doby približne jednej hodiny. Misky sa potom premyli a inkubovali sa počas doby dvoch dní, potom sa určila lacZ aktivita bunkového lyzátu. Výsledky sa uvádzajú ako priemerné hodnoty dvoch meraní.

Ako je zobrazené na obr. č. 9 použitie vektora GV10 UTV pre transfer reportného génu do rôznych bunkových línií potvrdzuje, že prítomnosť chimérického vláknitého proteínu (UTV) zvyšuje približne 5 krát až 300 krát zavedenie génu lacZ do buniek exprimujúcich malé množstvo alebo nedetegovateľné množstvo receptora vlákna (to je do buniek, ktoré nemajú receptor), čo sa porovnáva s vektorom divokého typu (GV10). U buniek, ktoré exprimujú veľké množstvo receptora vlákna (to sú bunky, ktoré obsahujú receptor), inkorporácia chimérického vláknitého proteínu do vektora GV10 UTV vedie ku zvýšeniu zavedenia génu až približne trikrát.

Táto redukcia expresie pozorovaná pri transdukcii neepiteliálnych buniek, ktoré neobsahujú receptor, v porovnaní s epiteliálnymi bunkami, ktoré receptor obsahujú, adenovírusom, kto rý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (to je GV10) priamo koreluje s relatívnou schopnosťou vektora viazať sa na tieto rôzne bunkové typy, ako sa uvádza v príklade 3. Tieto výsledky podporujú názor, ktorý uvádza, že slabá expresia receptorov pre adenovirusový vláknitý proteín divokého typu je podstatný limitujúci faktor pri transdukcii buniek adenovírusovými vektormi.

Podobne sa odhaduje schopnosť chimérického obalového proteínu (to je chimérický vláknitý proteín) zvýšiť transfer génu in vivo. Tri Balb/c myši sa intranazálne inokulovali približne 1 x 10⁸ pfu GV10 vo fyziologickom roztoku s objemom 50 μΐ, ktorý obsahuje lOmM MgCI₂ a 10 mM Tris (pH 7,8). Ďalším trom myšiam sa aplikovala rovnaká dávka GV10 UTV a dvom myšiam sa aplikoval samotný fyziologický roztok. Zvieratá sa usmrtili dva dni po aplikácii a v pľúcach sa testovala aktivita génu lacZ. Pre analýzu sa pľúca pripravili zmrazením v kvapalnom dusíku, rozmeľnenim tkaniva v trecej miske tlčikom a lýzovaním rozmeľneného tkaniva v 1,0 ml lacZ reportného lyzačného pufru (Promega Corp., Madison, WI). Fluorometrický test sa použil na monitorovanie aktivity lacZ a výsledky experimentov sa uvádzajú ako priemer aktivity meranej u každej skupiny zvierat.

Výsledky týchto experimentov sú znázornené na obr. č. 10. Ako je z tohto obrázku zrejmé, transfer génu in vivo sprostredkovaný vektorom GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín (UTV), čo sa porovnáva s vektorom, ktorý obsahuje vláknitý proteín divokého typu (GV10), vedie k priemerne 8 krát vyššiemu zavedeniu do pľúc myši.

Tieto výsledky tak potvrdzujú, že inkorporácia chimérického obalového proteínu (v tomto prípade chimérický vláknitý proteín) do adenovírusového vektora podstatne zvyšuje účinnosť zavedenia génu sprostredkované vektorom ako in vitro tak in vivo, čo sa porovnáva s adenovírusovým vektorom, ktorý obsahuje proteín divokého typu. Výsledky podporujú záver, že slabá expresia receptoru vlákna je podstatný faktor, ktorý sa podieľa na suboptimálnom zavádzaní do pľúc a do iných tkanív. Tieto výsledky tiež potvrdzujú uprednostňovanie vektora GV10 UTV alebo iných vektorov podobných vektorom UTV pred inými súčasne dostupnými vektormi za účelom transferu génu (napr. zavedenie génu CFTR) do pľúc a iných tkanív.

Príklad 6:

Tento príklad hodnotí schopnosť vektora podľa vynálezu, ktorý obsahuje chimérický obalový proteín (napr. chimérický vláknitý proteín), interagovať s cudzorodou DNA v zmysle interakcie proteín/DNA, čím vnáša DNA do bunky spôsobom “piggy-back”.

V týchto experimentoch sa použil adenovírusový vektor, ktorý obsahuje vlákno divokého typu (to je GV10) a adenovírusový vektor, ktorý obsahuje chimérické vlákno (to je GV10 UTV), na odhad transferu génu do epiteliálnych buniek, ktoré majú receptor, (to sú bunky 293, A549 a H700 T). V kontrolných experimentoch sa bunky transdukovali predtým opísanými vektormi. V podmienkach experimentu sa vektory inkubovali s plazmidom pGUS, ktorý obsahuje reportný gén β-glukuronidázy, tak, že chimérický adenovírusový vláknitý proteín je schopný tvoriť komplex s plazmidovou DNA. Špecificky približne 5 x 10⁷ aktívnych partikúl (to sú fluorescenčné ohniskové jednotky (ffu)) GV10 alebo GV10 UTV sa inkubovalo počas doby 1 hodiny s približne 2,5 μg DNA plazmidu pGUS. Zmes sa potom pridala k určeným bunkám v množstve 2 x 10⁵ v 250 μΙ DMEM, ktorý obsahuje 10% fetálne bovinné sérum, βglukuronidázová a β-galaktozidázová aktivita sa potom odhadla fluorometrickým testom desiaty deň po transdukcii. Expresia β-glukuronidázy v bunkách sa monitorovala spôsobom, ktorý je podobný β-galaktozidázovému testu pre expresiu lacZ. Ide o monitorovanie tvorenia modrej farby, ak β-glukuronidáza katalyzuje reakciu so substrátom X-glu.

Výsledky týchto experimentov sú znázornené na obrázku č. 11. Porovnateľné úrovne expresie lacZ sa dosiahli, keď sa vektor GV10 (obsahuje vláknitý proteín divokého typu) alebo vektor GV10 UTV (obsahuje chimérický vláknitý proteín) použil pre transfer reportného génu v cis forme do epiteliálnych buniek. Pre porovnanie vektor divokého typu bol schopný intracelulárne preniesť plazmid pGUS iba v relatívne nízkom množstve do všetkých epiteliálnych buniek, ako sa odhaduje z expresie β-glukuronidázového génu. Táto základná úroveň transferu génu sa dosiahla spôsobom, pojatím nezúčastnených molekúl prostredníctvom receptora, ako sa opisuje v patentovej prihláške PCT WO 95/21259). Použitím vektora GV10 UTV, ktorý obsahuje chimérický vláknitý proteín sa podstatne zvýšil transfer plazmidu pGUS. V prípade transferu génu do buniek 293 β-glukuronidázová expresia riadená plazmidom pGUS prekročila expresiu pozorovanú po transfere cA-naviazaného reportného génu sprostredkovanú vektorom GV10 UTV.

Tieto výsledky potvrdzujú, že vektor obsahujúci chimérický obalový proteín, ako je chimérický vláknitý proteín podľa vynálezu, demonštruje zvýšený transfer nukleovej kyseliny, ktorá sa nenachádza v cis polohe s vektorom. Toto zvýšenie transferu génu je zdanlivo ovplyvnené výskytom interakcie proteín/DNA medzi negatívne nabitými zvyškami na chimérickom vlákne (napr. zvyškami polylyzínového radu), čo vedie k naviazaniu nukleovej kyseliny na vektor; avšak je možný aj ďalší spôsob zvýšenia.

Príklad 7:

Tento príklad opisuje konštrukciu ďalších plazmidov, ktoré obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV na C-konci vláknitého proteínu.

Ako počiatočný bod pre konštrukciu týchto ďalších plazmidov sa použil transferový plazmid pl93(F5*) (obr. č. 12; tiež známy ako p!93NS (F5‘) a pAd NS 83-100 UTV), ktorý sa opisuje v príklade 2. Tieto plazmidy obsahujú chimérický adenovírusový vláknitý proteín. Ako je znázornené na obr. 12, plazmid pl93(F5*) obsahuje mutovaný gén vlákna s reštrikčným miestom BamHI medzi posledným kodónom vláknitého proteínu a v rámci posunutým stop kodónom vláknitého proteínu. Ďalej sa mutantné transferové plazmidy konštruovali, ako sa tu opisuje. Obsahujú sekvencie C-konca vlákna kódujúce linker, ktorý obsahuje opakujúce sa aminokyseliny glycín/serín, cieľovú sekvenciu a stop kodón. Tieto plazmidy sa pripravili klonovaním syntetických oligonukleotidov do reštrikčného miesta BamHI plazmidu pl93(F5*) za účelom vytvoriť transferový plazmid pl93NS (F5*) pGS(K7) (tiež známy ako pl93(F5*) pGS(K7) alebo pNS (F5’) pK7), ktorý je znázornený na obrázku č. 13.

Sekvencia génu Ad5 vlákna divokého typuje:

TCA TAC ATT GCC CAA GAA TAA AAA AGAA (SEQ ID NO:59)

Ser Tyr íle Ala Gin Glu (SEQ ID NO:60), kde “TAA” je terminačný kodón a polyadenylačná sekvencia je zvýraznená. C-koniec mutovaného génu vlákna prítomného v plazmide pl93(F5‘) je:

TCA TAC ATT GCC CAA GAA GGA TCC AATAAA GAA

Ser Tyr íle Ala Gin Glu Gly Ser (SEQIDNO: 19) (SEQ ID NO: 20) kde podčiarknutá sekencia označuje mutované reštrikčné miesto BamHI zavedené do vláknitého proteínu a polyadenylačná sekvencia je zvýraznená. Pre porovnanie aminokyselinová sekvencia C-konca génu vlákna, ktorý je prítomný v plazmide p 193NS (F5*) pGS(K7) je:

G S GS GS G S GS KKKKKKK (SEQ ED NO:22) kde podčiarknutá sekvencia označuje mutované reštrikčné miesto BamHI zavedené do vláknitého proteínu a zvýraznená sekvencia indikuje polylyzínový rad pridaný k C-koncu. Táto aminokyselinová sekvencia je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny: GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAA AAG AAG AAG TAA (SEQ ID NO:21), kde “TAA” je terminačný kodón.

Pri konštrukcii transferového vektora pl93NS (F5‘) pGS(K7) sa použili prekrývajúce sa syntetické oligonukleotidy, kde pK7s (sense primér) má sekvenciu GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAA TAA G (SEQ ID NO:61); a pK7a (antisense primér) má sekvenciu GA TCC TTA CTT CTT CTT TTT CTT CTT TTT AGA GCC ACT CCC TGA TCC T (SEQ ID NO:62). Tieto sense a antisense oligonukleotidy sa zmiešali v ekvimolárnom pomere a klonovali sa do reštrikčného miesta BamHI pl93NS (F5*) za účelom vytvoriť plazmid pl93NS (F5*) pGS(K7). Overenie správnej orientácie inzertu v plazmide pl93NS (F5*) pGS(K7) sa uskutočnilo PCR s použitím pK7s sense priméru a downstream antisense oligonukleotidového priméru A5a32938 so sekvenciou CAGGTTGAATAGGGTTCT (SEQ ID NO:63). Urobilo sa tiež overenie správnosti orientácie inzertu v plazmide sekvenovaním sekvencie DNA v oblasti inzertu s použitím priméru A5a32938.

Transferový plazmid pl93NS (F5*) sa použil pri konštrukcii ďalších mutantných transferových plazmidov, ktoré naviac obsahujú na C-konci vláknitého proteínu UTV alebo sekvenciu podobnú UTV cieľových buniek. Tieto plazmidy zahrnujú pl93NS (F5‘) pGS(null) (ktorý je tiež známy ako pl93 (F5‘) pGS(null) alebo pl93NS (F5*) pGS), pBSS 75-100 pGS (null), pBS 75100 pGS(RK32), pBSS 75-100 pGS(RK33) a pBSS 75-100 pGS(tat).

Za účelom konštrukcie pl93NS (F5*) pGS(null) sa skonštruovali komplementárne sa prekrývajúce oligonukleotidy pGSs so sekvenciou GATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAAA (SEQ ID NO:64) a pGSa so sekvenciou GATCTTTAACTAGTCGAGCCACTGCCAGATCCTGAACCG (SEQ ID NO:65), ktoré sa použijú na priamu ligá ciu do plazmidu pl93NS (F5*) štiepeného reštrikčným enzýmom BamHI. Overenie správnej orientácie klonu sa uskutočnilo PCR s použitím pGSs priméru a downstream antisense oligonukleotidového priméru A5a32938. Sekvenovaním sekvencie DNA v oblasti inzertu s použitím priméru A5a32938 sa zistilo, že plazmid zahrnuje správne orientovaný inzert.

Vektor pBSS 75-100 pGS (null) (tiež známy ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(null)) zobrazený na obr. č. 14 sa skonštruoval zámenou fragmentu NheI až Sali z pBSS 75-100 za zodpovedajúci fragment z pl93NS (F5*) pGS(null). Reštrikčné miesto Spel, ktoré sa nevyskytuje v géne vláknitej chiméry, sa potom eliminovalo čiastočným štiepením plazmidu s reštriktázou Spel, vyplnením s Klenow fragmentom a potom sa vektor znovu ligoval. Výsledný vektor obsahuje relevantnú sekvenciu nukleovej kyseliny: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAA (SEQ ID NO: 23) (kde “TAA” je terminačný kodón), ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser (SEQ ID NO: 24).

Inzerty plazmidov pBSS 75-100 pGS(RK32) (tiež známe ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK)₂ alebo pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK2)), pBSS 75-100 pGS (RK33) (tiež známy ako pBSS 75-100 ΔΕ3 pGS(RKKK3)) a pBSS 75-100 pGS(tat) sa konštruovali za účelom priamej ligácie do plazmidu pBSS 75-100 pGS (null) štiepeného reštrikčným enzýmom Spel. Konštrukcia plazmidu pBSS 75-100 pGS(RK32) je znázornená na obr. č. 15. Použili sa komplementárne sa prekrývajúce oligonukleotidy RK32s so sekvenciou CTAGAAAGAAGAAACGCAAAAGAAGA (SEQ ID NO: 66) a RK32a so sekvenciou

CTAGTCTTCTTTTTGCGTTTCTTCTTT (SEQ ĽD NO. 67). Výsledný vektor obsahuje relevantnú sekvenciu nukleovej kyseliny:

GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGCATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAA GAAACGCAAAAAGAAGACTAGTTAA (SEQ ID NO:25) (kde “TAA” je terminačný kodón), ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (SEQ ID NO: 26).

Konštrukcia plazmidu pBSS 75-100 pGS(RK33) je znázornená na obr. č. 16, kde sa použili komplementárne sa prekrývajúce oligonukleotidy RK33s so sekvenciou CTAGAAAGAGAAGCGCAAAAAAAAAAGAAAGAAAGA (SEQ ID NO: 68) a RK33a so sekvenciou CTAGTCTTCTTCTTTCTTTTTTTTTTGCGCTTCTTCTTCTTT (SEQ ID NO. 69). Výsledný vektor obsahuje relevantnú sekvenciu nukleovej kyseliny:

GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAG AAGCGAAAAAAAAAGAAAGAAGACTAGTTAA (SEQ ID NO:27) (kde “TAA” je terminačný kodón), ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu Ala Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (SEQ ID NO: 28).

Za účelom konštrukcie plazmidu pBSS 75-100 pGS(tat) sa použili komplementárne sa prekrývajúce oligonukleotidy TATs so sekvenciou CT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA AGA CGG GCA T (SEQ ID NO: 70) a TATa so sekvenciou CT AGA TGC CCG TCT TCG TTG CCT GCG CTT TTT TCT CCC ATA A(SEQ ID NO. 71). Výsledný vektor obsahuje sekvenciu relevantnej nukleovej kyseliny: ACT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA TCT AGT (SEQ ID NO:72), ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu Thr Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Ser Ser (SEQ ID NO: 73).

Overenia správnej orientácie klonu sa uskutočnili PCR s použitím primérov (RK32s, RK33s alebo TATs) pre každý z troch plazmidov a ďalej sa použil downstream antisense oligonukleotidového priméru A5a32938. Sekvenovaním sekvencie DNA v oblasti inzertu s použitím priméru A5a32938 sa zistilo, že plazmid zahrnuje správne orientovaný inzert.

Príklad 8:

Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidov, ktoré obsahujú oblasti UTV v slučke vlákna.

Plazmidy obsahujúce sekvenciu UTV (a/alebo intergénovú sekvenciu) vo vyčnievajúcej slučke vláknitého proteínu sa konštruovali začlenením ľubovoľnej sekvencie uvedenej predtým v texte (rovnako to môžu ďalej byť sekvencie podobné UTV) do vláknitého proteínu. To je uskutočnené použitím plazmidového transferového vektora pl93NS (F5*) za účelom konštrukcie ďalšieho transferového vektora pl93NS F5F2K (tiež nazývaného pl93 F5F2K) zobrazeného na obr. č. 17. Plazmid pl93NS F5F2K obsahuje jediné reštrikčné miesto Spel v géne vlákna Ad2, ktorý kóduje v proteíne vyčnievajúcu slučku. Gén vlákna prítomný v plazmide pl93NS F5F2K obsahuje sekvenciu vlákna:

ATT ACA CTT AAT GGC ACT AGT GAA TCC ACA íle Thr Leu Asn Gly Thr Ser Glu Ser Thr

GAA ACT

Glu Thr (SEQ ID NO: 29) (SEQ JD NO: 30) kde podčiarknutá sekvencia označuje nové reštrikčné miesto Spel, ktoré je zavedené do génu vlákna.

Tento vektor sa potom použil na klonovanie cieľovej sekvencie do reštrikčného miesta Spel. Zvlášť sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca rad 8 základných aminokyselín RKKKRKKK (Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys (SEQ ID NO: 74)) obsahujúca oblasť viažúcu heparín sa klonovala do reštrikčného miesta Spel plazmidu p 193 F5F2K s použitím prekrývajúceho sa sense a antisense oligonukleotidov.

Sekvencia (RKKK)2 sčasti obsahuje sekvenciu:

TCT AGA AAA AAA AAA CGC AAG AAG AAG ACT AGT (SEQ ID NO: 75)

Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (SEQ ID NO:76).

27-mér sense oligonukleotid RK32s a 27-mér antisense oligonukleotid RK32a opísaný v príklade 7 sa používa pri klonovaní sekvencie PolyGS(RKKK)₂, ktorá obsahuje RKKKRKKK (SEQ ID NO:74) peptidový motív. Plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₂ sa skonštruoval klonovaním sekvencie DNA kódujúcej väzobnú oblasť do reštrikčného miesta Spel plazmidu pl93NS F5FK2. Prekrývajúce sa sense a antisense oligonukleotidy, ktoré kódujú väzobnú oblasť, sa najprv spojili a potom sa priamo ligovali do reštrikčného miesta Spel. Vznikol výsledný plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₂, ktorý je znázornený na obrázku č. 18. Tento plazmid je tiež známy ako pl93NS F5F2K(RKKK2), pl93NS F5F2K(RK32) alebo pl93 F5F2K(RKKK2). V plazmide p!93NS F5F2K(RKKK)₂ je prítomná relevantná časť modifikovanej slučky oblasti “knob” vlák na:

ATT ACA CTT AAT GGC ACT AGA AAG AAG AAA CGC AAA AAG AAG ACT íle Thr Leu Asn Gly Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr

AGT GAA TCC ACA GAA ACT (SEQIDNO:31)

Ser Glu Ser Thr Glu Thr (SEQ ID NO:32).

Sekvencia (RKKK)₃ alebo jej variácie sa môžu začleniť do plazmidu pl93NS F5F2K.

Táto sekvencia sčasti obsahuje:

TCT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG

Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys

ACT AGT

Thr Ser (SEQ ID NO:77) (SEQ ID NO:78).

Sekvencia sa môže začleniť s použitím 39-méru sense oligonukleotidu (RKKK)3(s) (obsahuje sekvenciu CT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG A (SEQ ĽD NO: 79)) a 39-méru antisense oligonukleotidu (RKKK)₃ (a) (obsahuje sekvenciu CT

AGT CTT CTT CTT TCT TTT TTT TTT GCG CTT CTT CTT(SEQ

Výsledný plazmid pl93NS F5F2K(RKKK)₃ je znázornený na obrázku č. 19. Tento plazmid je tiež známy ako pl93NS F5F2K(RKKK3), p 193 F5F2K(RKKK3) alebo p 193 F5FK(RK33). Relevantná časť modifikovanej slučky oblasti “knob” vlákna prítomného v plazmide p 193 F5F2K(RKKK)₃ je:

CTT AAT GGC ACT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG

Leu Asn Gly Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys

ACT AGT GAA TCC ACA (SEQ ID NO:33)

Thr Ser Glu Ser Thr (SEQ ID NO:34).

Príklad 9:

Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidov, ktoré obsahujú chimérické proteíny s pentónovou bázou, ktoré zahrnujú UTV alebo sekvencie podobné UTV.

Transferový plazmid p ACT (ARGD) (tiež opísaný ako plazmid p AT v US patente 5,559,099) sa sčasti získal manipuláciou plazmidu, ktorý obsahuje jediný fragment BamHI/Pmel (13259 až 21561) genómu Ad5 a ďalej obsahuje medzi inými proteín s pentónovou bázou s deléciou 8 aminokyselín, väzobnú doménu <x_v integrínu a substitúciu deletovanej oblasti pre amino

kyseliny obsahujúcu jedno reštrikčné miesto Spel, ktoré je vhodné pre inzerciu exogénnych sekvencií.

Za účelom konštrukcie plazmidu pACT (RKKK)3 (tiež je známy ako pACT (RKKK3) alebo pACT (RK33)), ktorý je znázornený na obr. 20, sa sa priamo ligovali komplementárne sa prekrývajúce oligonukleotidy RK33s a RK33a do plazmidu pACT (ARGD) štiepeného reštrikčným enzýmom Spel. Na overenie správnej orientácie klonu sa použila metóda PCR s primér RK33a v prípade plazmidu a upstream sense oligonukleotidový primér A5sl5002. Sekvenovaním sekvencie DNA oblasti inzertu s použitím priméru A5sl5002 sa tiež zistilo, že plazmid obsahuje správne orientovaný inzert. Relevantná časť oblasti UTV, ktorá povedie ku vzniku chimérického proteínu s pentónovou bázou v plazmide pACT (RKKKh je:

AAC GAT ACT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG

Asn Asp Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys

ACT AGT GCC ACA (SEQ ID NO: 35)

Thr Ser Ala Thr (SEQ ID NO:36).

Podobne s použitím RK32s a RK32a prekrývajúcich sa primérov možno skonštruovať plazmid pACT (RK32) (ktorý je známy ako pACT (RKKK2) alebo pACT(RKKK)2), ktorý je znázornený na obr. č. 21. Relavantná časť oblasti UTV prítomnej v chimérickom proteine s pentónovou bázou v plazmide pACT (RKKK)₂ je

AAC GAT ACT AGA AAG AAG AAG AGA AAG AAG AAG ACT AGT

Asn Asp Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser

GCC ACA (SEQ ID NO 37)

Ala Thr (SEQ ID NO:38).

Príklad 10:

Príklad opisuje konštrukciu plazmidov, ktoré v adenovírusovom hexónovom proteine obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV, a zvlášť ktoré obsahujú tieto sekvencie vo vyčnievajúcich slučkách adenovírusového hexónového proteínu.

Konštrukcia týchto plazmidov dáva vznik iným transferovým plazmidom, ako je plazmid pACT Hli, znázornený na obr. č.22. Samotný plazmid pACT Hli sa odvodil od plazmidu pACT (obsahuje Ad5 genóm od pozície 13259 až 21561), ktorý obsahuje väčšinu kódujúcej sekvencie hexónového proteínu (zodpovedajúcej približne pozíciám 18842 až 21700). Plazmid pACT Hli sa môže skonštruovať začlenením reštrikčného miesta Xbal do oblasti slučky 1 hexónového proteínu Ad5. Podobné spôsoby sa môžu použiť pri začlenení reštrikčného miesta Xbal alebo ľubovoľného vhodného reštrikčného miesta do oblasti buď slučky 1 alebo 2 alebo do inej vyčnievajúcej slučky hexónového proteínu. Pri amplifikácii oblasti slučky 1 Ad5 DNA pomocou PCR sa použili sense a antisense priméry a v rovnaký čas sa zaviedli mutácie, ktoré vedú k jednému mutovanému reštrikčnému miestu Xbal v oblasti slučky 1.

Zvlášť sa môže použiť sense primér so sekvenciou

GGAC AGGGGCCCT ACTTTT AAGCCCT ACTCTGGC A (SEQ ID NO: 81), ktorý obsahuje prirodzene sa vyskytujúce jediné reštrikčné miesto Apal, ktoré sa vyskytuje v plazmide pACT, a antisense primér ATCTTCACTGTACAATACCACTTTAGGAGTCAAGTTATCACCTCTAGATGCGGTCGCCT (SEQ ID NO: 82), ktorý obsahuje jediné reštrikčné miesto BsrGI. Produkt PCR obsahujúci reštrikčné miesto Xbal sa môže štiepiť reštriktázou BsrGI a Apal a klonovať do plazmidu pACT za účelom nahradenia fragmentu Apal až BsrGI. Výsledný plazmid pACTHll obsahuje jediné reštrikčné miesto Xbal, ktoré je vhodné pre začlenenie sekvencií UTV do slučky 1 hexónu. Prítomnosť reštrikčného miesta Xbal v klone pACTHll sa môže overiť reštrikčným štiepením s použitím Xbal, ktoré môže linearizovať plazmid.

Časť nemutovanej aminokyselinovej sekvencie hexónovej slučky 1 obsahuje sekvenciu TEATGNGDNL (SA ID NO: 83). Aminokyselinová sekvencia mutovanej hexónovej slučky 1, ktorá nasleduje v plazmide pACT Hli (obr. č. 22) po TEA zvyškoch divokého typu, obsahuje sekvenciu TASRGDNL (SEQ ID NO: 40) (táto sekvencia je kódovaná sekvenciou nukleovej kyseliny ACCGCATCTAGAGGTGATAACTTG (SEQ ID NO:39)).

Reštrikčné miesto plazmidu pACT Hli sa potom môže použiť ako jediné reštrikčné miesto, kam je možné klonovať univerzálne cieľové sekvencie, ako je RKKKRKKK (SEQ ID NO:74) napr. s použitím presahujúcich oligonukleotidov RK32s a RK32a. Určitý plazmid, ktorý vznikne na základe takých manipulácií, pACT Hli (RKKK)₂ (alebo pACT Hli (RK32) alebo pACT Hli (RKKK2) je znázornený na obr. č. 23. Tento plazmid obsahuje sekvenciu :

ACC GCA TCT AGA AAG AAG AAA CGC AAA AAG AAG ACT AGA GGT GAT

Thr Ala Ser Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Arg Giy Asp

AAC TTG (SEQ ĽD N0:41)

Asn Leu (SEQ ID NO:42).

Iné UTV alebo sekvencie podobné UTV sa môžu tiež klonovať do oblasti slučky 1 hexónového proteinu a/alebo do oblasti slučky 2 hexónového proteinu. Podobný prístup sa môže napríklad použiť pri mutácii sekvencie, ktorá kóduje hexónovú slučku 2 za vzniku plazmidu pACT H12 (nie je zobrazený), ktorý obsahuje jediné reštrikčné miesto (ako je reštrikčné miesto Xbal), do ktorého sa môžu klonovať ďalšie sekvencie UTV.

Plazmid pACT Hli (RKKK)₃ (alebo pACT Hli (RKKK3) alebo pACT Hli (RK33)) sa môže skonštruovať s použitím komplementárne sa prekrývajúcich nukleotidov RK33s a RK33a a priamou ligáciou produktu PCR do plazmidu pACT Hli štiepeného reštrikčným enzýmom Xbal. Overenie správnej orientácie klonu môže prebehnúť pomocou PCR s použitím sense priméru RK32 v prípade plazmidu a vhodného downstream antisense oligonukleotidového priméru. Sekvenovaním sekvencie DNA oblasti inzertu s použitím downstream antisense priméru sa zistilo, že plazmid obsahuje správne orientovaný inzert. Podobné prístupy sa použili pri konštrukcii analógových transferových vektorov, zvlášť analógových transferoxých vektorov pACT H12 (RKKK)₂ a pACT H12 (RKKK)₃.

Príklad 11:

Tento príklad opisuje konštrukciu plazmidu, ktorý má vláknitý proteín s krátkou strednou časťou. Tento príklad zvlášť opisuje konštrukciu plazmidu p 193 F5F9sK.

Plazmid p 193 F5F9sK (tiež známy ako pl93 F5F9K-Short) je znázornený na obrázku č. 24). Tento vektor kóduje chimérický vláknitý proteín, kde sa odstránili približne dve tretiny strednej časti vlákna Ad5 a “knob” vlákna Ad5 sa nahradil oblasťou “knob” vlákna Ad9.

Plazmid pl93F5F9K-short sa skonštruoval z plazmidu pl93NS (F5*). Oligonukleotidové priméry so sekvenciami GGACTAGTAGCATTTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC (SEQ ID NO:84) a CCGGATCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG (SEQ IS NO:85) sa použili pre amplifikáciu sekvencie Ad9, ktorá kóduje poslednú repetíciu strednej časti a oblasti “knob” génu vlákna. Produkt PCR sa potom čistil s použitím štandardných metód a štiepil sa reštrikčnými enzýmami NheI a BamHI, čo umožňuje klonovanie produktu PCR do oblasti Nhel/BamHI transferového plazmidu pl93NS (F5*). Výsledný vláknitý proteín s krátkou strednou časťou sa môže použiť pri konštrukcii adenovírusových vektorov, ako sa opisuje ďalej v texte. Do oblasti krátkej strednej časti vlákna sa môže začleniť jedna alebo viac predtým uvedených UTV alebo sekvencii podobných UTV a výsledné vlákno sa môže vniesť do bunky.

Príklad 12:

Príklad opisuje konštrukciu plazmidov, ktoré v predĺženej štruktúre obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV, zvlášť v proteíne s hexónovou a/alebo pentónovou bázou tak, že výsledkom sú predĺžené proteíny s hexónovou a/alebo pentónovou bázou, ktoré sú schopné lepšie kontaktovať bunky a podielať sa na cielení buniek. Výsledné chimérické proteíny sú “vyčnievajúce” v zmysle, že obsahujú inzerciu sekvencie neprirodzenej aminokyseliny, ktorá bude vyčnievať z povrchu vírusu.

Pri amplifikácii oblasti pentónového génu, ktorá kóduje 32 aminokyselín a-helikálnej oblasti, ktorá nasleduje po sekvencii RGD, sa môžu použiť priméry 1 alpha(s) so sekvenciou

GGGCTGCAGGCGGCCGCAGAAGCTGAAGAGGCAGCCACACGGGCTGAGGAGAA (SEQ ID NO: 86) a lalpha(a) so sekvenciou

GGGGTGCACACAGCTTCGGCCTTACGTTAGCCTGTTTCTTCTGAGGCTTCTCGACCT (SEQ ID NO: 87). Táto sekvencia obsahujúca 32 aminokyselín obsahuje sekvenciu

ATRAEEDRAEAEAAAEAAAPAAQPEVEKPQKK (SEQ ID NO:88).

Používané priméry môžu tiež kódovať na každý koniec pridanú α-helikálnu sekvenciu tak, že napríklad konečná amplifikovaná sekvencia DNA kóduje sekvenciu:

CTG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

Sln

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

GCT

GCG

CAA

CCC

GAC

GTC

GAG

AAG

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

CCT

CAG

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAC

[SEQ ID

NO:

: 89]

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Yai

[SEQ ID NO:90] kde zvýraznená sekvencia zodpovedá nepentónovej sekvencii. ktorú kódujú priméry, a podčiarknutá sekvencia reprezentuje aminokyseliny kódované kompatibilnými reštrikčnými miestami Sfcl a Apall. Tieto aminokyseliny tiež chránia integritu alfa helixu, ktorý je navrhnutý štandardným počítačovým programom tak, aby tvoril a helixovú štruktúru.

Produkt PCR kódujúci tieto aminokyseliny sa môže štiepiť oboma reštrikčnými enzýmami Sfcl a ApaLI, znovu ligovať a potom opäť štiepiť oboma enzýmami. Ligácia podobných miest chráni miesta pred opätovným štiepením; avšak ligácia kompatibilných, ale rozdielnych miest porušuje tieto reštrikčné miesta. Preto opätovným štiepením ligovaného produktu vzniká niekoľko fragmentov, ktoré sú násobkami pôvodnej veľkosti produktov PCR. Vzniknú kompletne štiepené fragmenty (približne 150 bp veľké), fragmenty s približnou veľkosťou 300 bp (majú porušené jedno reštrikčné miesto) a fragmenty s veľkosťou 450 bp (majú porušené 2 reštrikčné miesta) a podobne. Uvedený postup umožňuje zdvojiť (2alfa), strojiť (3alfa) a podobne pôvodnú sekvenciu kódujúcu 50 aminokyselín za účelom klonovania veľkých neporušených a helikálnych oblasti do proteínu za účelom vytvorenia väčšieho vyčnievajúceho alebo predĺženého proteínu.

Napríklad zdvojený produkt 2alfa (to je 2alfa2) sa môže klonovať do prvého reštrikčného miesta PpulOI plazmidu pSPdelta (zobrazeného na obr. č. 25) za účelom vytvoriť plazmid pSP2alfa (označený na obr. č. 26). Plazmid pSPdelta sa skonštruoval na základe bázy plazmidu pUC19 alebo z iného vhodného klonovacieho plazmidu. Transferový plazmid pSPdelta sa môže použiť na vytvorenie ďalších modifikácií pentónového alebo hexónového proteínu, ktoré umož54 ňujú UTV sekvencii (alebo ľubovoľnej inej cieľovej sekvencii) pozdvihnúť sa von z povrchu viriónov. Toto vyzdvihnutie cieľovej sekvencie vo vyčnievajúcej štruktúre (napr. typ “veža”) bude minimalizovať priestorové blokovanie interakciou pentónu a hexónu s bunkovým povrchom pomocou vláknitého proteinu a umožní väčší úspech interakcie chimérických pentónových a hexónových proteínov s bunkovým povrchom.

Plazmid pSPdelta obsahuje jediné Spel klonovacie miesto vhodné pre inkorporáciu sekvencií UTV. Klonovacie miesto Spel je na oboch stranách lemované klonovacími miestami Ppul, ktoré umožňujú inkorporáciu sekvencii DNA kódujúcej aminokyseliny, ktoré vyzdvihnú UTV sekvenciu von z povrchu viriónov. Plazmid pSPdelta sa skonštruoval klonovaním presahujúcich oligonukleotidov do jediného reštrikčného miesta Xbal plazmidu pUC19. Tieto nukleotidy sú vytvorené tak, aby sa mohli začleniť priamo do reštrikčného miesta Xbal. Sense oligonukleotid má sekvenciu CTAGAGCAGCTATGCATGAAGGGACTAGTGGAGAGATGCATGCAGCCT (SEQ ID NO: 91). Antisense komplementárny oligonukleotid má sekvenciu CTAGAGGCTGCATGCATCTCTCCACTAGTCCCTTCATGCATAGCTGCT (SEQ ID NO: 92). Oligonukleotidy sa zmiešajú v ekvimolárnych pomeroch a klonujú sa do reštrikčného Xbal miesta plazmidu pUC19. Prítomnosť správneho inzertu sa môže potvrdiť sekvenáciou krížovej oblasti inzertu a štiepením plazmidu reštrikčným enzýmom PpulOI. Reštrikčné miesta Xbal umiestnené na oboch stranách inzertu umožňujú v neskorších klonoch vhodné odstránenie tejto sekcie.

Pretože v plazmide pSPdelta existujú dve reštrikčné miesta PpulOI, plazmid môže byť čiastočne rozdelený štiepením reŠtriktázou PpulOI tak, že sa štiepi iba jediné miesto. Ligácia produktu PCR, ktorý obsahuje reštrikčné miesta ApaLI a Sfcl, do kompatibilného reštrikčného miesta PpulOI poruší prvé PpulOI reštrikčné miesto plazmidu a tiež poruší reštrikčné miesta ApaLI a Sfcl. Tieto porušené reštrikčné miesta sú zobrazené na obr. č. 26 (ukazujú plazmid pSP2alpha2) ako “j”. Druhý zdvojený produkt sa potom môže klonovať do zostávajúceho reštrikčného miesta PpulOI plazmidu pSP2alpha2 za účelom produkcie plazmidu pSP2alpha2 znázorneného na obrázku č. 27. Uvedený plazmid obsahuje reštrikčné miesto Spel vhodné pre inzerciu sekvencie UTV alebo iných cieľových sekvencii. Počítačová analýza sekundárnej štruktúry predvídaného proteinu 2alfa2 potvrdila, že ide o celý a helix mimo oblasť klonovacieho miesta Spel.

Zatiaľ čo plazmid pSPdelta obsahuje sekvenciu:

TCT AGA GCA GCT ATG CAT GAA GGG ACT AGT GGA GAC ATG CAT GCA

Ser Arg Ala Ala Met His Glu

Gly Thr Ser Gly Glu Met His Ala

GCC TCT AGA

Ala Ser Arg (SEQ ID NO:43) (SEQ ID NO:44), plazmid pSP2alpha obsahuje sekvenciu:

TCT AGA GCA Ser Arg Ala

GCT ATG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA

Ala Met Gin

Ala

Ala

Ala Glu

Ala Glu Glu Ala

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAG

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

Gin

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

CCT

GAG

GAG

Ala

Ala

Ala

G1U

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

á

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

CCT

GAG

AAG

AAA

CAG

GCT

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

*

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAT

GAA

GGG

ACT

AGT

GGA

GAG

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Väl

His

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

Glu

ATG

CAT

GCA

GCC

TCT

AGA

[SEQ ID

NO:

45]

Met

His

Ala

Ala

Ser

Arg

[SEQ ID

NO:

46] ,

a plazmid pSP2alpha2 obsahuje sekvenciu:

Ser iSž a?* m^{TG 0X0 GCG GCC GCA}

Ser Arg Ala Ala Met Gin Ala Ala Ala Glu

ACA CGG GCT GAG GAG Thr Arg Ala Glu Glu

GCT GCC GCC CCC GCT Ala Ala Ala Pro Ala

AAA CAG GCT AAC GCT Lys Gin Ala Asn Ala

GCT Ala

GAA GAG GCA Glu Glu Ala

AAG CGC GCT GAG GCC Lys Arg Ala Glu Ala

GCC CAA CCC GAG GTC Ala Gin Pro Glu Val

AAG GCC GAA GCT GTG Lys Ala Glu Ala Val

GCC Ala GAA GCA GCG GCC GAA Glu Ala Ala Ala Glu

GAG AAG CCT CAG AAG Glu Lys Pro Gin Lys

CAG GCG GCC GCA GAA

Gin Ala Ala Ala Glu

GCT

GAA

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

GAG

AAG

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

CAT

GAA

GGG

ACT

AGT

GGA

GAG

ATG

CAG

GCG

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

His

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

Glu

Met:

Gin

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

GCT

GAG

GAG

AAG

CGC

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

GAA

GCT

GTG

CAG

GCG

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Val

Gin

Ala

GCC

GCA

GAA

GCT

GAA

GAG

GCA

GCC

ACA

CGG

GCT

GAC

GAG

AAG

CGC

Ala

Ala

Glu

Ala

Glu

Glu

Ala

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Glu

Lys

Arg

GCT

GAG

GCC

GAA

GCA

GCG

GCC

GAA

GCT

GCC

GCC

CCC

GCT

GCG

CAA

Ala

Glu

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Glu

Ala

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Gin

CCC

GAG

GTC

GAG

AAG

CCT

CAG

AAG

AAA

CAG

GCT

AAC

GCT

AAG

GCC

Pro

Glu

Val

Glu

Lys

Pro

Gin

Lys

Lys

Gin

Ala

Asn

Ala

Lys

Ala

GAA

GCT

GTG

CAT

GCA

GCC

TCT

AGA

[SEQ ID NO

:47]

Glu

Ala

Val

His

Ala

Ala

Ser

Arg

[SEQ ID NO

: 48]

Cieľové sekvencie, ako sú UTV alebo sekvencie podobné UTV, sa môžu klonovat do reštrikčného miesta Spel plazmidu pSP2alpha2. Zvlášť prekrývajúce sa oligonukleotidy RK32s a RK32a sa môžu klonovať do reštrikčného miesta Spel za účelom vytvoriť plazmid pSP2alpha2 (RKKK)₂ (alebo pSP2alpha2 (RK32) alebo pSPSalpha2 (RKKK2). Podobne sa môže skonštruovať plazmid pSP2alpha2 (RKKK)₃ (alebo pSP2alpha2 (RKK33) alebo pSPSalpha2 (RKKK3)). V inom prípade sa môže z plazmidu odstrániť celá α-helikálna oblasť 2alpha2 štiepením reštriktázou Xbal a môže sa klonovať do kompatibilného reštrikčného miesta Spel plazmidu pACT (ARGD) za účelom vytvoriť plazmid pACT 2alpha2 (RKKK)₃ (ktorý sa tiež môže nazývať pACT 2alpha2 (RKKK2) alebo pACT 2alpha2 (RK32)). Podobné metódy sa môžu využiť pri produkcii plazmidu pACT 2alpha2 (RKKK)₃ (ktorý sa tiež môže nazývať pACT 2alpha2 (RKKK3) alebo pACT 2alpha2 (RK33)).

Podobne sa môžu klonovaním 2alpha2 a helikálnej oblasti do reštrikčného miesta Xbal plazmidu pACT Hli skonštruovať vyčnievajúce chimérické hexónové proteíny (obsahujúce sek vencie, ktoré ich predĺžia) za vzniku plazmidu pACT Hli 2alpha2 (RKKIQ2 (ktorý je tiež známy ako pACT Hli 2alpha2 (RKKK2) alebo pACT Hli 2alpha2 (RK32)). Podobné metódy sa môžu využiť pri produkcii plazmidu pACT H12 2alpha2 (RKKK)2 (ktorý je tiež známy ako pACT H12 2alpha2 (RKKK2) alebo pACT H12 2alpha2 (RK32)).

Príklad 13:

Tento príklad opisuje konštrukciu ďalších adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú v adenovírusovom vláknitom proteíne sekvencie UTV alebo sekvencie im podobné.

Konštrukciu adenovírusových vektorov vo vlákne, ktoré obsahuje modifikáciu UTV, môže odborník uskutočniť niekoľkými spôsobmi. Jeden spôsob ako vytvoriť UTV vláknité vektory z plazmidov, ktoré sú opísané predtým v texte, je linearizácia plazmidovej DNA pomocou reštrikčného enzýmu Sali a transfekcia tejto DNA do bunkovej línie 293, ktorá sa tesne pred transfekciou infikovala adenovírusom, ktorému sa odstránila oblasť E4. Adenovírusové vektory s odstránenou E4 oblasťou nie sú schopné sa replikovať v bunkových líniách ako je bunková línia 293, ktorá poskytuje iba adenovírus, ktorý obsahuje oblasť El v polohe trans. Pri rekombinácii plazmidov, ktoré obsahujú modifokovaný gén vlákna a oblasti E4 s DNA, ktorým sa oblasť E4 odstránila, vzniká replikačný komponent vektor E4, ktorý nesie modifikovaný vláknitý proteín.

Plazmidy pl93NS(F5*) pGS(K7), pBSS 75-100 pGS(null), pBSS 75-100 pGS (RKKK)₂, pBSS 75-100 pGS(RKKK)₃, pBSS 75-100 pGS(tat), pl93NS F5F2K(RK32) a pl93 FF9sK sa linearizovali reštrikčným enzýmom Sali a transfektovali sa s nimi bunky 293, ktoré boli infikované hodinu pred transfekciou, buď adenovírusovým vektorom s deletovanou oblasťou E4 GV11A.Z (ktorý nesie gén LacZ riadený cytomegalovírusovým promótorom (CMV)) alebo GV11A.S (ktorý obsahuje gén alkalickej fosfatázy, ktorý je riadený promótorom CMV). Výsledné adenovírusové vektory AdZ.F(pK7), AdZ.F(pGS), AdZ.F(RJCKK)2 (tiež známe ako AdZ.F(RKKK2) alebo AdZ.F(RK32)), AdZ.F(RKKK)₃ (tiež známy ako AdZ.F(RKKK3) alebo AdZ.F(RK33)), AdZ.F(tat), AdZ.F5F2K(RKKK)₂ (tiež známy ako AdZ.F5F2K(RKKK2) alebo AdZ.F5F2K(RK32)) a AdZ.F5F9sK (tiež známy ako AdZ.F5F9K-Short) sa získali a čistili vo dvoch cykloch tvorby plakov na bunkách 293.

Pomocou PCR oblasti inzertu a reštrikčnou analýzou vírusovej DNA získanej pomocou Hirtonovej extrakcie z buniek 293 infikovaných vektorom sa overilo, že všetky vektory obsahujú správnu sekvenciu. Westernova analýza (ako sa opisuje predtým v texte), ak je to nutné, sa môže tiež použiť pri testovaní veľkosti proteínu. Westernova analýza vláknitého proteínu z partikúl s vektorom a/alebo z lyzátov buniek infikovaných vektorom elektroforézovaných na polyakrylamidovom géle vykazuje korešpondujúci posun v pohyblivosti vláknitého proteínu v porovnaní s nemodifikovaným vláknitým proteínom v súlade s prítomnosťou pridaných aminokyselinových sekvencii. Napríklad westernova analýza partikúl AdZ.F(pK7) overila, že ich vláknitý proteín je posunutý vyššie v porovnaní s vláknitým proteínom AdZ vektora, ktorý nesie nemodifikované vlákno v zhode s prítomnosťou prídavných aminokyselín vo vláknitom proteíne AdZ.F(pK7). Iné plazmidové mapy, ktoré sú tu podobne znázornené, sa môžu vytvoriť do adenovírusových vektorov využitím tu uvedených spôsobov (alebo ich minoritných variantov).

Príklad 14

Tento príklad opisuje konštrukciu adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú v adenovírusovom proteíne s pentónovou bázou UTV alebo sekvencie podobné UTV. Spôsob prípravy adenovírusového vektora, ktorý obsahuje chimérický proteín s pentónovou bázou sa opisuje napríklad v publikácii Wickham et al., J. Virol., 70, 6831-6838 (1996)). Vektor pACT opísaný predtým v texte, ktorý obsahuje chimérický proteín s pentónovou bázou (napr. transferové plazmidy pACT 2alpha2(RKKK)₂, pACTH12 2alpha2 (RKKK)₂ a pACT (ÁRGD)) sa môže štiepiť napríklad reštrikčným enzýmom BamHI za účelom linearizácie plazmidu. DNA Ad5 sa štiepi reštrikčnou endonukleázou XmnI, ktorá štiepi divoký typ Ad5 v pozíciách 14561 a 15710 genómu Ad5. Dva väčšie fragmenty sa oddelili od menšieho kusu s veľkosťou lkb a potom sa transfektovali spolu s linearizovaným plazmidom do vhodnej bunkovej línie (napr. bunková línia 293) za vzniku rekombinantného vírusu.

Adenovírusové vektory, ktoré vznikajú týmto spôsobom sa izolujú od potencionálne kontaminovaných nemodifikovaných vektorov pomocou plakového čistenia vo dvoch cykloch na bunkách 293. Reštrikčnou analýzou vírusovej DNA, ktorá sa získala nasledujúcou Hirtonovou extrakciou vektorom infikovaných buniek 293, sa overilo, že výsledné vektory obsahujú správnu sekvenciu v oblasti pentónovej bázy. Sekvenovanie produktov PCR, ktoré vznikli amplifikáciou oblasti inzertu z vírusovej DNA, sa tiež môže použiť na overenie prítomnosti inzertu. Westernova analýza chimérickej pentónovej bázy spracovanej elektroforézou na polyakrylamidovom géle vykazuje zodpovedajúci posun v pohyblivosti pentónovej bázy v porovnaní s nemodifikovanou pentónovou bázou, čo je v súlade s prítomnosťou pridaných aminoky selinových sekvencii v chimérickom proteíne.

Príklad 15:

Tento príklad opisuje konštrukciu adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú v hexónovom proteíne UTV alebo sekvencie podobné UTV.

Pre konštrukciu vírusu AdZ.H(RKKK)₂ sa pripravilo ľavé a pravé rameno vektora, ktoré obsahujú sekvencie DNA, ktoré sa prekrývajú a budú sa rekombinovať na jednej strane so sekvenciou pACT H11(RK32) od reštrikčného miesta Pmel do BamHI za vzniku intaktného genómu AdZ.H(RK32). Pri konštrukcii ľavého ramena izolovaná DNA Ad5 je štiepená reštrikčným enzýmom Agel, ktorý rozoznáva v genóme Ad5 pozície 14499, 15283, 19017, 23063, 23656, 23411 a 31102. Fragment 0 až 14499 sa môže použiť ako ľavé rameno a izoluje sa od iných fragmentov gélovou elektroforézou. Pravé rameno sa môže pripraviť štiepením DNA Ad5 s reštrikčným enzýmom Drdl. Reštrikčná endonukleáza rozoznáva pozície 5458, 7039, 14004, 15593, 17257 a 21023. Fragment 21023 až 35938 bp sa potom môže použiť ako pravé rameno a izoluje sa od iných fragmentov gélovou elektroforézou. Týmito dvomi fragmentárni spolu s fragmentom Pmel/BamHI vektora pACT H11(RK32) sa potom transfektujú bunky 293. Reštrikčný enzým Pmel rozoznáva v Ad5 pozíciu 13258 a BamHI štiepi Ad5 v pozícii 21562. Podobné metódy sa môžu použiť pri produkcii AdZ.H(RKKK)₃.

Príklad 16:

Tento príklad opisuje konštrukciu vektorov, ktoré obsahujú vláknitý proteín s krátkou strednou časťou.

Tu opísaný spôsob konštrukcie adenovírusu z transferového plazmidu p 193 F5F9kshort sa môže podobne použiť pri konštrukcii iných adenovírusových vektorov z vlákien s krátkou strednou časťou. Transferový plazmid p 193 F5F9kshort, ktorý obsahuje podstatnú oblasť adenovírusu E4, sa štiepil reštriktázou Sali a transfektovali sa s ním bunky 293, ktoré sa hodinu pred transfekciou infikovali adenovírusovým vektorom AdSE.E4Gus. Vektoru AdSE.E4Gus chýba oblasť E4 adenovírusového vektora a nemôže sa replikovať v bunkách 293 za neprítomnosti komplementácie génov E4. Iba ak sa DNA AdSE.E4Gus rekombinuje s plazmidovou DNA pl93 F5F9Kshort za účelom získania génov E4, potom je vektor schopný sa replikovať v bunkách 293. Počas rekombinácie novo vytvorený vektor tiež nadobúda kódujúce sekvencie mutovaného vláknitého proteínu, ktorý je kódovaný plazmidmi. Päť dní po transfekcii sa izoloval pla» kovaním lyzátov transfektovaných buniek rekombinantný E4⁺ adenovírus, ktorý obsahuje vlák• nitú chiméru F5F9Kshort. Výsledný vektor AdSE.F5F9Kshort sa izoloval a čistil štandardnými virologickými metódami, ktoré zahrnujú tvorbu plakov vo dvoch cykloch na bunkách 293. Pomocou PCR a reštrikčnou analýzou sa overilo, že vektor obsahuje správny inzert vírusovej DNA. Oligonukleotidové priméry, ktoré sú na oboch stranách génu vlákna, potvrdili, že produkt PCR má správnu veľkosť vlákna, ktoré kóduje skrátený chimérický gén vlákna. Reštrikčná analýza vektora DNA ukazuje, že nový vektor obsahuje správne reštrikčné miesta, ktoré sú jediné v oblasti “knob” vlákna Ad9.

Príklad 17:

Λ

Tento príklad opisuje konštrukciu adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú vláknité proteíny s krátkou strednou časťou a chimérické proteíny s pentónovou bázou, ktoré majú začlenené UTV a sekvencie podobné UTV.

V prípade tejto konštrukcie vírusová DNA AdS.F9sK sa môže štiepiť reštrikčným enzýmom Xmnl ako sa opisuje vyššie v texte. Plazmid pACT H11(RK32) sa potom štiepi reštrikčnými enzýmami Pmel a BamHI. Vírusová a plazmidová DNA štiepená reštrikčnými enzýmami sa čistí a transfektujú sa s ňou bunky 293. Výsledné vektory sa izolujú plakovou purifíkáciou vo dvoch cykloch na bunkách 293 a reštrikčná analýza vírusovej DNA získanej Hirtovou extrakciou z buniek 293 infikovaných vektorom overila, že oblasť pentónovej bázy obsahuje správne sekvencie.

Sekvenovanie produktov PCR, ktoré vznikli amplifikáciou oblasti inzertu z vírusovej DNA sa tiež môže použiť na overenie prítomnosti inzertu. Westernova analýza chimérického proteínu s pentónovou bázou na polyakrylamidovom géle by mala vykázať zodpovedajúci posun pohyblivosti chimérickej pentónovej bázy v porovnaní s nemodifikovariou pentónovou bázou, čo je v súlade s prítomnosťou pridaných neprirodzených aminokyselinových sekvencií (a neprítomnosťou natívnych aminokyselinových sekvencií).

Iné plazmidy, ktorých mapa je tu uvedená, a ktoré neboli pripravené do adenovírusových vektorov sa môžu využívať v rovnakej alebo slabo modifikovanej verzii tu uvedeného postupu. Zvlášť vláknitý proteín s krátkou strednou časťou sa môže začleniť do adenovírusu, ktorý má vyčnievajúci proteín s chimérickou pentónovou bázou a do ktorého sa môže ďalej začleniť UTV alebo sekvencie podobné UTV.

Príklad 18:

Tento príklad opisuje konštrukciu adenovírusových vektorov, ktoré obsahujú vláknité proteíny s krátkou strednou Časťou a chimérické hexónové proteíny, ktoré inkorporujú UTV alebo sekvencie podobné UTV.

Vírusová DNA sa môže izolovať z vektora s krátkou strednou časťou, ako je AdZ.F9sK, a môže sa štiepiť vyššie opísanými reštrikčnými enzýmami za účelom prípravy vektorov, ktoré zahrnujú UTV obsahujúce chimérické hexónové proteíny. Všetky iné kroky sú podobné tým, ako sú opísané napr. v príklade 17. Výsledný vektor by mal obsahovať vláknitý proteín s krátkou strednou časťou a chimérický hexónový proteín, do ktorého je začlenený UTV a sekvencie podobné UTV. Tento prístup sa môže použiť v rôznych transferových plazmidoch, ktoré obsahujú rôzne chimérické hexónové proteíny. Zvlášť vláknitý proteín s krátkou strednou časťou sa môže začleniť do adenovírusu, ktorý má vyčnievajúci chimérický proteín a do ktorého sa môže ďalej začleniť UTV a sekvencie podobné UTV.

Príklad 19:

Tento príklad opisuje hodnotenie vektorov, zvlášť adenovírusových vektorov podľa vynálezu, ktoré obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV.

Napríklad v prípade potvrdenia predpokladu, že pridané UTV alebo sekvencie podobné UTV neovplyvňujú zostavenie vírusu, sa musí odhadnúť vírusová rastová kinetika vektora. U vektora pAd.F(pK7), ktorý je reprezentant plazmidu, ktorý obsahuje sekvenciu UTV, sa monitorovalo jeho rastové chovanie a porovnával sa s adenovírusom divokého typu (Ad5), rovnako ako s adenovírusovým vektorom AdZ.F(RGD), ktorý obsahuje inzerciu RGD peptidového motívu prítomného v sekvencií SACDCRGDCFCGTS (SEQ ID NO:93). V týchto štúdiách sa bunky 293 infikovali s multiplicitou infekcie 5 aktívnych vírusových partikúl/bunku buď s Ad5, AdZF(RGD) alebo AdZ.F(pK7) a počet infikujúcich partikúl (fluorescenčné ohniskové jednotky (FFU)) na jednu bunku sa určil nasledujúcim zhromaždením buniek 1, 2 alebo 3 dni po infekcii. Titre AdZ.F(RGD) alebo AdZ.F(pK7) boli o niečo nižšie, ale nie významne odlišné od titru Ad5. Ako je možné vidieť na obr. č. 28, maximálna hodnota titrov u AdZ.F(RGD) a AdZ.F(pK7) tvorí 80% a 56% titrov Ad5. Tieto výsledky potvrdzujú, že rastové kinetiky dvoch vektorov nie sú podstatne ovplyvnené adíciou sekvencií, zvlášť UTV alebo sekvenciami podobnými UTV, na koniec vláknitého proteínu. Výsledky tiež naznačujú, že ďalšie vektory, ktoré obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV, nevykazujú odlišné rastové chovanie.

U vektorov, ktoré obsahujú UTV alebo sekvencie podobné UTV, sa môže hodnotiť, ako je ich schopnosť viazať sa na bunky alebo zavádzať gény do bunky, inhibovaná negatívne nabitými molekulami (napr. heparín, sulfát heparanu, sulfát chondroitanu, atď.), rozpustnými adenovírusovými obalovými proteínmi alebo ošetrením buniek činidlami (napr. chondroitinázou, heparinázou, sialidázou, atď.), ktoré štiepia také negatívne nabité časti (napr. Wickham et al., Náture Biotechnology, 14, 1570-1573 (1996)), rovnako ako uvedené príklady. Rozpustný vláknitý proteín nebude inhibovať väčšinu väzieb UTV vektora na bunku (Wickham et al., Náture Biotechnology, 14, 1570-1573 (1996)). Tieto výsledky naznačujú, že inkorporácia UTV alebo sekvencií podobných UTV do pentónu alebo hexónu alebo do vlákna nebude poškodzovať schopnosť rekombinantného adenovírusu obsahujúceho chimérický obalový proteín ovplyvňovať zavedenie génu.

Tiež štúdie infekcie in vivo alebo in vitro transfekciou uskutočnené v prítomnosti úplnej krvi sa môžu využiť na potvrdenie, že UTV vektory podľa vynálezu sa neobmedzujú iba na systematické zavádzanie, ktoré je spôsobené saturáciou polykatiónov na rekombinantné adenovírusy s polyaniónami v krvi. Také viazanie ohrozuje schopnosť určitého vírusu transdukovať cieľovú bunku. Vírus môže byť aplikovaný vo vyššej dávke, uprednostňuje sa opatrenie, ktoré redu kuje ľubovoľnú imunitnú odozvu spojenú s takou vyššou dávkou (napr. aplikácia iného sérotypu adenovírusového vektora alebo metódy opísané v medzinárodnej prihláške PCT WO 96/12406; Mastrangeli et al., Human Gene Therapy, 7, 79-87 (1996)).

SEKVENČNÝ PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (1) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 8 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (C) druh reťazca: j ednoreťazco vá (D) topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: peptid (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 1

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys

5 (2) Údaje k SEQ ĽD NO: 2 (1) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 8 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (ii) Druh molekuly; peptid (xi ) Opis sekvencie. SEQ ID NO: 2

Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg

5 (2) Údaje k SEQ ID NO: 3 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 8 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: peptid (i i i) Znaky:

(C) iné informácie: Xaa je Lys alebo Arg (xi) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 3

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa (2) Údaje k SEQ ID NO:4 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 15 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: peptid (i i i) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 4

Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Ly3 Ly3 Lys Lys Lys Lys ¹ S io 15 (2) Údaje k SEQ ID NO: 5 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 aminokyselín (B) typ: aminokyselinová (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: peptid (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 5

Lys

Lys Lys (2) Údaje k SEQ ID NO: 6 (1) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 8 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: dvojreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (genómová) (i i i) Opis sekvencie: SEQ DD NO: 6

GGA TCC AA 8

Gly Ser (2) Údaje k SEQ ID NO: 7 (1) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 30 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: dvojreťazcová (D) topológia: lineárna (ii) Druh molekuly: DNA (genómová) (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO:7

GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT 30

Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Cys

5 10 (2) Údaje k SEQ ID NO: 8 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 36 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: d voj reťazco vá (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (genómová) (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO:8

GCC GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA 36

Ala Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu

5 10 (2) Údaje k SEQ ID NO: 9 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 55 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (iii) Opis sekvencie. SEQ ID NO:9

TATGGAGGAT CCAATAAAGA ATCGTTTGTG TTATGTTTCA ACGTGTTTAT TTTTC

(2)	Údaje k SEQ ĽD NO: 10
(i)	Charakteristika sekvencie:
(A)	dĺžka: 57 párov báz
(B)	typ: nukleová kyselina
(C)	druh reťazca: jednoreťazcová
(D) topológia: lineárna
(ii)	Druh molekuly: DNA (syntetická)

AATTGAAAAA TAAACACGTT GAAACATAAC ACAAACGATT CTTTATTGGA TCCTCCA (iii) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 10 (2) Údaje k SEQ ID NO: 11 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 43 párov báz (B) typ. nukleová kyselina (C) druh reťazca: j ednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (i i i) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 11

TCCCCCCGGG TCTAGATTAG GATCCTTCTT GGGCAATGTA TGA (2) Údaje k SEQ ID NO: 12 (i) Charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 21 párov báz (B) typ: nukleová kyselina (C) druh reťazca: jednoreťazcová (D) topológia: lineárna (i i) Druh molekuly: DNA (syntetická) (i i i) Opis sekvencie: SEQ ID NO: 12

CGTGTATCCA TATGACACAG A ?//

Claims (25)

1. Chimérický adenovírusový obalový proteín, zahrnujúci neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu začlenenú do vnútornej sekvencie obalového proteínu alebo namiesto nej, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa efektívne viaže na širší rozsah eukaryotických buniek než adenovírusový obalový proteín divokého typu a kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín nie je selektívny pre špecifický typ eukaryotickej bunky.

2. Chimérický adenovírusový obalový proteín, zahrnujúci neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu začlenenú do vnútornej sekvencie obalového proteínu alebo namiesto nej, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa efektívne viaže na epitelovú bunku, bunku hladkého svalu, endotelovú bunku, fibroblastovú bunku, gliobíastómovú bunku a monocytovú bunku.

3. Chimérický adenovírusový obalový proteín, zahrnujúci neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu začlenenú do vnútornej sekvencie obalového proteínu alebo namiesto nej, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa efektívne viaže na väčšinu všetkých eukaryotických buniek.

4. Chimérický adenovírusový obalový proteín, zahrnujúci neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa viaže na bunky HA SMC, bunky HuVec, bunky CPAE, bunky HS 68, bunky MRC-5, bunky U118 a bunky THP-1 efektívnejšie než vláknitý proteín sérotypu 5 divokého typu.

5. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 4, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa efektívne viaže na v podstate všetky eukaryotické bunky.

6. Chimérický adenovírusový obalový proteín, zahrnujúci neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa efektívne viaže na jednotku prítomnú na povrchu väčšiny všetkých eukaryotických buniek.

7. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 5, kde uvedenou jednotkou je záporne nabitá jednotka.

8. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 6, kde tento chimérický adenovírusový obalový proteín sa viaže na aspoň jednu povrchovú jednotku buniek, vybranú zo skupiny zahrnujúcej heparín, heparínsulfát, kyselinu hyalurónovú, dermatansulfát, kyselinu sialovú, keratínsulfát a chondroitínsulfát.

9. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 6, kde uvedenou jednotkou je heparínsulfát.

10. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 6 alebo 7, kde uvedená jednotka je prítomná v podstate na všetkých eukaryotických bunkách.

11. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 10, kde uvedená neprirodzená aminokyselinová sekvencia zahrnuje tri alebo viac kladne nabitých aminokyselinových zvyškov.

12. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 11, kde uvedená neprirodzená aminokyselinová sekvencia je vo vyčnievajúcej slučke uvedeného proteínu.

13. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 12, zahrnujúci prirodzenú aminokyselinovú sekvenciu a karboxy-terminálnu neprirodzenú aminokyselinovú sekvenciu obsahujúcu 3 až asi 30 polylyzínových aminokyselinových zvyškov.

14. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 13, kde uvedená prirodzená aminokyselinová sekvencia zahrnuje deléciu aspoň jednej aminokyseliny.

15. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 14, kde uvedená neprirodzená aminokyselinová sekvencia zahrnuje intergénovú sekvenciu.

16. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 15, kde uvedená neprirodzená sekvencia zahrnuje sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ JD NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ED NO:54, SEQ ĽD NO:55, SEQ ĽD NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ DD NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ DD NO:90 aSEQDDNO:93.

17. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa nároku 16, kde uvedená neprirodzená aminokyselinová sekvencia zahrnuje SEQ ID NO: 4 alebo SEQ ED NO: 5 a uvedené neprirodzené aminokyselinové sekvencie zahrnujú asi 3 až asi 30 lyzínových zvyškov.

18. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 17, kde uvedený chimérický adenovírusový obalový proteín je vláknitý proteín.

19. Chimérický adenovírusový obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 18, kde uvedený chimérický adenovírusový obalový proteín je hexónový alebo pentónový proteín.

20. Vektor, zahrnujúci alebo kódujúci obalový proteín podľa ľubovoľného z nárokov 1 až 19.

21. Vektor podľa nároku 20, kde uvedený vektor je vírusový vektor, vybraný zo skupiny zahrnujúcej vírusy bez obalu.

22. Vektor podľa nároku 21, kde uvedený vektor je adenovírusový vektor.

23. Vektor podľa ľubovoľného z nárokov 20 až 22, kde uvedený vektor zahrnuje cudzorodý gén.

24. Hostiteľská bunka, zahrnujúca vektor podľa ľubovoľného z nárokov 20 až 23.

25. Spôsob genetickej modifikácie bunky, vyznačujúci sa tým, že sa uvedená bunka uvádza do styku s vektorom podľa ľubovoľného z nárokov 19 až 22.

1/30

71/ 77

BUNKOVÁ LÍNIA (percento vstupu)

4> s