SK68996A3

SK68996A3 - Enzyme stabilization by block-copolymers

Info

Publication number: SK68996A3
Application number: SK689-96A
Authority: SK
Inventors: James C Lee
Original assignee: Buckman Labor Inc
Priority date: 1993-12-03
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1997-06-04
Also published as: CN1064074C; ZA949653B; CA2177997C; BR9408185A; ES2148479T3; EP0731834B1; ATE193319T1; CN1136823A; DE69424683D1; WO1995015371A1; CZ154996A3; NO962263D0; PT731834E; CA2177997A1; FI118341B; US5780283A; NO962263L; EP0731834A1; FI962304A; JPH09506127A

Description

Oblasť techniky

Predmetom vynálezu je stabilizácia enzýmov neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérom polyéter-polyolu.

Doterajší stav techniky

Enzýmy sa všeobecne umiestňujú do vodných kvapalných enzýmových prípravkov navrhnutých pre určitý postup. Tieto kvapalné enzýmové prípravky sú historicky postihované problémami, ako je chemická nestálosť, ktorá môže viesť k strate enzýmovej aktivity najmä pri skladovaní. Tento kritický problém straty enzýmovej aktivity skladovaním bol zvlášť ovplyvnený priemyslom kvapalných detergentov.

Nie je zriedkavosťou, že priemyselný produkt, ako je kvapalný enzýmový prípravok, sa skladuje v sklade v rôznych klimatických podmienkach na svete, kde je produkt vystavený teplotám, ktoré môžu hraničiť od mrazu do asi 50 °C počas dlhého obdobia. Pri skladovaní počas mnohých mesiacov pri extrémnych teplotách od °C do 50 °C väčšina kvapalných enzýmových prípravkov stráca 20 až 100 % svojej enzýmovej aktivity v dôsledku nestability enzýmu.

Robili sa rôzne pokusy stabilizovať enzýmy nachádzajúce sa v kvapalných enzýmových prípravkoch. Pokusy zvýšiť stabilitu kvapalných enzýmových prípravkov použitím prípravkov obsahujúcich alkoholy, glyceroly, dialkyIglykolétery a zmesi týchto látok s inými zlúčeninami mali iba okrajový úspech a to dokonca v rozmedzí miernych teplôt skladovania.

Munk v U. S. patente č. 4,801,544 popísal systém etylénglykolu a neiónogenného tenzidu, etoxylovaného lineárneho alkoholu, s uhľovodíkovým rozpúšťadlom, ktorý slúžil ako stabilizátor, a enkapsuláciu enzýmov v micelách zmesou rozpúšťadlo - tenzid.

Obsah vody v prípravku sa udržoval na menej ako 5 percentách, enzýmová stabilita sa overovala pri 1,7°, 21,1°a 37,8 °C.

Stabilizáciu vodného enzýmového prípravku istými estermi popísal Shaer v U. S. patente č. 4,587,727. Ester, ktorý sa použil ako stabilizátor, má vzorec RCOOR', kde R je alkyl s jedným až tromi uhlíkmi alebo vodík, a R' je alkyl s jedným až šiestimi uhlíkmi. Vo vodnom enzýmovom prípravku sa ester nachádza v množstve 0.1 až 2.5 hmotnostných %. Použitá enzýmová zložka podľa prihlasovateľa je obchodný enzýmový prípravok’dodávaný vo forme prášku, roztoku alebo suspenzie obsahujúci od asi 2 percent do asi 80 percent aktívnych enzýmov a nosič ako je síran sodný alebo vápenatý, chlorid sodný, glycerol, neiónogenný tenzid alebo ich zmesi ako zvyšných 20 percent do 98 percent.

Letton a spol. v U. S. patente č. 4,318,818 popisujú stabilizačný systém pre vodné enzýmové prípravky, kde stabilizačný systém zahrňuje vápenaté ióny a nízkomolekulovú karboxylovú kyselinu alebo jej soľ. Stabilizačný systém má pH od asi 6,5 do asi

10.

Guilbert a spol. v U. S. patente č. 4,243,543 popisujú stabilizáciu kvapalných detergentných prípravkov obsahujúcich proteolytický enzým. Detergentné prípravky sa stabilizujú prídavkom antioxidantu a hydrofilného polyolu k prípravku, pričom sa stabilizuje pH prípravku.

Weber v U. S. patente č. 4,169,817 popisuje kvapalný čistiaci prostriedok obsahujúci stabilizované enzýmy. Prípravok je vodný roztok obsahujúci tuhé látky od 10 do 50 hmotnostných % a zahrňuje detergentové zložky, povrchovo aktívne činidlá, enzýmový systém odvodený od Bacillus subtilis a enzým stabilizujúci činidlo. Stabilizačné činidlá zahrňujú vysoko vo vode rozpustné sodné alebo draselné soli a/alebo vo vode rozpustné hydroxyalkoholy a umožňujú skladovanie roztoku v predĺženom čase bez dezaktivácie enzýmov.

Dorrit a spol. v Európskom patente č. 0 352 244 A2 popisujú stabilizované kvapalné detergentné prípravky používajúce emfoterný tenzid.

Kaminsky a spol. v U. S. patente č. 4,305 837 popisujú stabilizovaný vodný enzýmový prípravok obsahujúci stabilizačný systém vápenatých iónov a nízkomolekulovú karboxylovú kyselinu alebo soli a nízkomolekulový alkohol.Tento stabilizovaný enzým sa používa v detergentných prípravkoch. Prípravky môžu zahrňovať neiónogenné tenzidy vzorca RA(CH2CH2)nH, kde R je hydrofóbny zvyšok, A je založená na skupine nesúcej reaktívny vodíkový atóm a n predstavuje priemerný počet etylénoxidových jednotiek. R má typicky 8 až 22 atómov uhlíka, ale môže sa pripraviť kondenzáciou propylénoxidu s nízkomolekulovou zlúčeninou, kde n je zvyčajne v medziach asi 2 až asi 24. Použitý nízkomolekulový alkohol môže byť buď jednosýtny alkohol s 1 až 3 uhlíkovými atómami alebo polyol s 2 až 6 uhlíkovými atómami a s 2 až 6 hydroxylovými skupinami. Kaminsky a spol. uvádzajú, že polyoly môžu zaistiť zvýšenú stabilitu enzýmu a zahrňujú propylénglykol, etylénglykol a glycerol.

Tai v U. S. patente č. 4,404,115 popisuje vodný enzýmový kvapalný čistiaci prostriedok, ktorý obsahuje stabilizátor enzýmu, pentaborát alkalického kovu, prípadne so siričitanom alkalického kovu a/alebo polyolom. Polyol má 2—6 hydroxylových skupín a zahrňuje látky ako je 1,2-propandiol, etylénglykol, erytritan, glycerol, sorbitol, manitol, glukózu, fruktózu, laktózu a podobne.

Boskamp v U. S. patente č. 4,462,922 taktiež popisuje vodný enzýmový detergentový prípravok so stabilizátorom založeným na zmesi kyseliny boritej alebo soli kyseliny boritej s polyolom alebo polyfunkčnú aminozlúčeninu spoločne s redukujúcou soľou alkalického kovu. V podstate sa použili tie isté polyoly ako u Kaminského a spol.

Predložený vynález je zameraný na spôsob poskytnutia stabilizovaných enzýmov a stabilizovaného enzýmového prípravku, v ktorých budú prekonané predchádzajúce a iné nevýhody.

Vyhľadávanými výhodami podľa tohto typu vynálezu je poskytovanie nového spôsobu stabilizácie enzýmov a taktiež stabilizovaného enzýmového prípravku.

Podstata vynálezu

Predložený vynález je zameraný na nový spôsob a prípravok, ktorý v podstate odstraňuje skôr uvedené a iné problémy dané obmedzeniami a nevýhodami súvisejúceho stavu techniky,

Dodatočné vlastnosti a výhody vynálezu budú uvedené v nasledujúcom popise a sčasti budú zrejmé z popisu, alebo sa môžu získať používaním vynálezu. Výhody vynálezu sa budú realizovať a získavať spôsobom a zložením látky zvlášť uvedených v tu uvedenom popise a nárokoch.

K dosiahnutiu týchto a iných výhod a v súlade s účelom vynálezu, ako sa uvádza a široko popisuje, je uvedený nový spôsob stabilizácie enzýmu voči strate aktivity pri zvýšených teplotách alebo vodou, ktorý zahrňuje spojenie enzýmu so stabilizujúcim množstvom neiónogenného povrchovo aktívneho blokového kopolyméru polyéter-polyolu.

Ak sa enzým stabilizuje proti dezaktivácii pri zvýšených teplotách, vybraný tenzid má teplotu zakalenia vyššiu ako tieto teploty.

V jednom uskutočnení je neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu celoblok (all-block), blok-hetero (block-heteric), hetero-blok (hetéric-block) alebo hetero-hetero (heteric-heteric) blokovým kopolymérom polyoxyalkylénglykoléteru, kde alkylénové jednotky majú od 2 do asi 4 uhlíkové atómy a najmä tie tenzidy, ktoré obsahujú hydrofóbne a hydrofilné bloky, kde je každý blok založený prinajmenej na oxyetylénových skupinách alebo oxopropylénových skupinách alebo zmesiach týchto skupín.

Vynález taktiež zahrňuje zloženie látky založené na skôr uvedenom enzýme a tenzide.

Treba si uvedomiť, že ako predchádzajúci všeobecný popis, tak i nasledujúci podrobný popis sú iba príklady a vysvetlenia a sú určené k poskytnutiu ďalších vysvetlení vynálezu, ako je nárokované.

Najlepší spôsob uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález je zameraný na spôsob stabilizácie enzýmu voči strate aktivity, buď zvýšenou teplotou alebo vodou, spojením enzýmu s neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérom polyéter-polyolu.

Použitie enzýmov a kvapalných enzýmových prípravkov v priemysle a na obchodnom trhu rýchle vzrastá v posledných niekoľkých rokoch. Ako je dobre známe, enzýmy môžu byť kyslé, alkalické alebo neutrálne, v závislosti na rozsahu pH, v ktorom sú aktívne. Lipáza samotná alebo enzým zahrňujúci lipázu, t. j. lipáza je akákoľvek kombinácia s nasledujúcimi enzýmami, ktoré sa môžu použiť. Všetky tieto typy enzýmov sa považujú za použiteľné v súvislosti s vynálezom tu uvedeným.

S kvapalnými detergentami je zviazaných veľa enzýmov a kvapalných enzýmových prípravkov, ktoré preukázali úžitkové vlastnosti ako rozpúšťacie a čistiace prípravky. Navyše k aplikáciám v kvapalných detergentoch enzýmy a kvapalné enzýmové prípravky preukázali použiteľnosť v rade rôznych obchodných a priemyselných oblastiach, v ktorých sa teraz široký rozsah tried enzýmov používa.

Proteázy sú dobre známou triedou enzýmov často používanou v širokom rozmedzí priemyselných aplikácií, kde hydrolyzujú peptidové väzby proteínov a proteínových substrátov. Proteáz sa používa na odstraňovanie škvŕn spôsobených proteínmi, ako sú škvrny od krvi alebo vajec. Kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce alkalické proteázy taktiež preukázali použiteľnosť ako dispergačné prostriedky bakteriálnych filmov a povlakov rias a húb vo vodách chladiacich veží alebo nádržiach kvapalín v kovopriemysle.

Proteázy sa môžu charakterizovať ako kyslé, neutrálne alebo alkalické proteázy v závislosti na rozmedzí pH, v ktorom sú aktívne. Kyslé proteázy zahrňujú mikrobiálne renety, renin (chymotrypsín), pepsín a kyslé proteázy húb. Neutrálne proteázy zahrňujú trypsín, papain, bromelain/ficín a bakteriálne neutrálne proteázy. Alkalické proteázy zahrňujú subtilizín a príbuzné proteázy. Komerčné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce proteázy sú dostupné pod názvami Rennilase®, PTN (pankreatický trypsín NOVO), ”PEM (zmes proteolytických enzýmov), Neutrase®, Alcalase®, Esperase® a Savinase®, ktoré všetky dodáva Novo Nordisk Bioindustrials, Inc. z Danbury, CT. Iná obchodná proteáza je dostupná pod názvom HT-Proteolytic dodávaná Solvay Enzýme Product.

Amylázy, iná trieda enzýmov, sa taktiež používajú v mnohých priemyselných a obchodných postupoch, v ktorých katalyzujú alebo urýchľujú hydrolýzu škrobu. Trieda amyláz zahrňuje α-amylázu, βamylázu, amyloglukozidázu (glukoamylázu), amylázu z húb a pululanázu. Obchodné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce amylýzy sú dostupné pod názvami BAN, Termamyl®, AMG, Fungamyl® a Promozyme®, ktoré dodáva Novo Nordisk, a Diazyme L-200, produkt Solvay Enzýme Product.

Ďalšie obchodne cenné triedy enzýmov sú tie, ktoré ovplyvňujú hydrolýzu vlákien. Tieto triedy zahrňujú celulázy, hemicelulázy, pektinázy a β-glukanázy. Celulázy sú enzýmy, ktoré odbúravajú celulózu, lineárny polymér glukózy nachádzajúci sa v bunkových stenách rastlín. Hemicelulázy sú zapojené do hydrolýzy hemicelulóz, ktoré podobne ako celulóza sú rastlinnými polysacharidmi. Pektinázy sú enzýmy, ktoré sa zúčastňujú odbúrania pektínu, glycidu, ktorého hlavnou zložkou je kyselina cukrová, βGlukanázy sú enzýmy, ktorú sa zúčastňujú hydrolýzy β-glukanov, ktoré sú taktiež podobné celulóze v tom, že sú lineárnymi polymérmi glukózy.

Súhrnne celulázy zahrňujú endocelulázu, exocelulázu, exocelo-biohydrolázu, celobiázu a na účely predloženého vynálezu budú taktiež zahrňovať hemicelulázu. Komerčné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce celulázy sú dostupné pod názvami Celluclast® a Novozym® 188, ktoré obidva dodáva Novo Nordisk.

Hemicelulázy, ktoré sa môžu použiť, zahrňujú xylanázy. Výrobok PUĽPZYM®, dostupný od Novo Nordisk, a výrobok ECOPULP® od Alko Biotechnology sú dva príklady komerčne dostupných kvapalných enzýmových prípravkov obsahujúcich enzýmy na báze xylanázy.

Hemicelulázy ako trieda zahrňujú zmes hemiceluláz a galaktomananázu. Komerčné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce hemicelulázy sú dostupné ako PUĽPZYM® od Novo Nordisk, ECOPULP® od Alko Biotechnology, Novozym® 280 a Gamanase™, kedy obidva sú produktami Novo Nordisk.

Pektinázy, ktoré sa môžu použiť, zahrňujú endopolygalakturonázu, exopolygalakturonázu, endopektátlyázu (transelimináza), exopektátlyázu (transelimináza) a endopektin lyázu (transelimináza). Komerčné kvapalné enzýmové zmesi obsahujúce pektinázy sú dostupné pod názvami Pectinex™ Ultra SP a Pectinex ™*, obidva dodávané Novo Nordisk.

β-Glukanázy, ktoré sa môžu použiť, zahrňujú lišajníkovú βglukanázu, laminarinázu a exoglukanázu. Komerčné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce β-glukanázy sú dostupné pod názvami Novozym® 234, Cereflo®, BAN, Finizym® a Ceremix®, ktoré všetky dodáva Novo Nordisk.

Vedľa lipáz sa môžu taktiež použiť fosfolipázy. Lipázy a fosfolipázy sú esterázové enzýmy, ktoré hydrolyzujú tuky a oleje napádaním esterových väzieb v týchto zlúčeninách. Lipázy pôsobia na triglyceridy, zatiaľ čo fosfolipázy pôsobia na fosfolipidy. V oblasti priemyslu predstavujú lipázy a fosfolipázy komerčne dostupné esterázy. Novo Nordisk ponúka dva kvapalné lipázové prípravky pod názvami Resinae™ A a Resinase™ A 2X.

Dostupné sú komerčné kvapalné enzýmové prípravky obsahujúce lipázy. Takéto prípravky sú napríklad dostupné pod obchodnými názvami Lipolase 100, Greasex 50L, Palatase™A, Palatase™M a Lipozyme™, ktoré všetky dodáva Novo Nordisk.

Inou komerčne cenenou triedou enzýmov sú izomerázy, ktoré katalyzujú konverzné reakcie medzi izomérmi organických zlúčenín. Výrobok Sweetzyme™ je kvapalným enzýmovým prípravkom obsahujúcim glukozoizomerázu a dodáva ju Novo Nordisk.

Redoxné enzýmy sú enzýmy, ktoré pôsobia ako katalyzátory v chemických oxidačno-redukčných reakciách a sú teda zapojené do rozkladu a syntézy rady biochemikálií. V súčasnej dobe mnoho redoxných enzýmov nezískalo významné miesto v priemysle, lebo väčšina redoxných enzýmov vyžaduje prítomnosť kofaktora. Ovšem ak sú kofaktory integrálnou súčasťou enzýmu alebo nemusia byť dodávané, sú redoxné enzýmy komerčne použiteľné.

Môžu sa použiť redoxné enzýmy glukózooxidáza a lipoxidáza (lipoxigenáza). Ďalšie redoxné enzýmy majú možné použitie hraničiace od enzýmovej syntézy steroidných derivátov po použitie v diagnostických testoch. Tieto redoxné enzýmy zahrňujú peroxidázu, superoxiddismutázu, alkoholoxidázu, polyfenoloxidázu, xantinoxidázu, sufhydryloxidázu, hydroxylázy, cholesteroloxidázu, laktázu, alkoholdehydrogenázu a steroidné dehydrogenázy.

Z rôznych dostupných neiónogenných povrchovo aktívnych blokových kopolymérov polyéter-polyolov výhodné materiály zahrňujú polyoxyalkylénglykolétery, ktoré obsahujú hydrofóbne a hydrofilné bloky, každý blok je výhodne založený prinajmenšom prípadne na oxyetylénových skupinách alebo oxypropylénových skupinách alebo zmesiach týchto skupín.

Najbežnejšou metódou získania týchto povrchovo aktívnych látok je reakcia etylénoxidu s hydrofóbnym materiálom, ktorý obsahuje najmenej jeden reaktívny vodík. Alternatívny spôsob zahrňuje reakciu hydrofóbnej látky s vopred pripraveným polyglykolom alebo použitie etylénchlórhydrínu namiesto etylénoxidu.

Reagujúca hydrofóbna látka musí obsahovať aspoň jeden aktívny vodík, výhodne sa jedná o alkoholy, prípadne kyseliny, amidy, merkaptány, alkylfenoly a podobne. Rovnako sa môžu použiť primárne amíny.

Zvlášť výhodné sú neiónogenné tenzidy získané technikami blokovej polymerizácie. Starostlivou kontrolou pridávania monoméru a reakčných podmienok je možné pripraviť rad tenzidov, u ktorých je možné presne a reprodukovateľné kontrolovať také charakteristiky, ako sú hydrofilno-lipofilná rovnováha (hydrophilelipophile balance) (HPL), zmáčanie a penivosť. Chemická povaha východiskových zložiek, ktoré sa používajú pri vytváraní začiatočného polymérneho bloku, všeobecne určuje klasifikáciu tenzidov. Východisková zložka nemá byť hydrofóbna, lebo hydrofobicita bude odvodená od jedného z dvoch polymémych blokov. Chemická povaha východiskovej zložky pri vytváraní prvého polymérneho bloku všeobecne určuje klasifikáciu tenzidov. Typické východiskové materiály alebo východiskové zložky zahrňujú jednosýtne alkoholy ako je metanol, etanol, propanol, butanol a podobne, taktiež dvojsýtne zložky ako je glykol, glycerol, vyššie polyoly, etyléndiamín a podobne.

Rôzne triedy výhodných tenzidov, vhodných na aplikáciu predloženého vynálezu popísal Schmolka v Non-lonic Surfactants, Surfactant Science Šerieš Vol. 2, Schick, M. J., Ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1967, Kapitola 10, ktorá je tu zaradená ako odkaz. Prvé a najjednoduchšie sú tie, kde každý blok je homogénny, čo znamená, že jediný alkylénoxid sa použije ako dodávaný monomér v priebehu každého kroku prípravy. Takéto materiály sa nazývajú celoblok (all-block) tenzidy. Ďalšie triedy sa označujú ako blok-hetero (block-heteric) a hetero-blok (heteric-block), v ktorých jednu časť molekuly (t. j. buď hydrofóbna alebo hydrofilná) tvorí jeden alkylénoxid, zatiaľ čo druhá je zmesou dvoch alebo viac takýchto zložiek, z ktorých jedna môže byť rovnaká so zložkou homogénneho bloku, ktorý je časťou molekuly. Pri príprave takýchto materiálov, hetero-časť molekuly bude celkom náhodná. Vlastnosti týchto neiónogenných tenzidov budú úplne odlišné od vlastností iba blokových tenzidov. Inou podtriedou sú tie kopolyméry, kde obidva kroky prípravy hydrofóbnej a hydrofilnej časti zahrňujú pridávanie zmesi alkylénoxidov a sú definované ako hetero-hetero (hetericheteric) blokové kopolyméry.

Blokovo polymémy tenzid je typizovaný monofunkčným východiskovým materiálom ako je jednosýtny alkohol, kyselina, merkaptan, sekundárny amín alebo N-substituované amidy. Tieto látky je možné všeobecne popísať nasledujúcim vzorcom:

•[Am ‘ ^nlx kde I je molekula východiskovej zložky predtým popísanej. Časť A je hydrofóbna, zahrňujúca alkylénoxidovú jednotku, v ktorej aspoň jeden vodík bol nahradený alkylovou alebo arylovou skupinou a m je polymeračný stupeň, ktorý je zvyčajne väčší ako asi 6. Zvyšok B je skupina solubilizujúca vo vode, ako je oxyetylénová skupina, kde n je znova polymeračný stupeň. Hodnota x je funkciou I. Teda, ak je I jednosýtny alkohol alebo amín, x je 1; ak je I polyfunkčná východisková látka ako je diol (napr. propylénglykol) x je 2, ako je tomu v prípade tenzidov Pluronic®. Ak je I tetrafunkčná východisková látka ako je etyléndiamín, x bude 4, ako je tomu v prípade tenzidov Tetronic®. Výhodnými tenzidmi tohto typu sú polyoxypropylén-polyoxyetylén blokové kopolyméry.

Multifunkčné východiskové látky je možné tiež použiť na prípravu homogénnych blokových tenzidov.

V blok-hetero a hetero-blok materiáloch bude buď A alebo B zmes oxidov a zvyšujúci blok bude homogenný. Jeden blok bude hydrofóbny a druhý hydrofilný. Jedna z dvoch polymérnych jednotiek bude slúžiť ako solubilizačná jednotka, ale charakteristiky sa budú odlišovať v závislosti od spôsobu použitia. Multifunkčné východiskové látky sa môžu taktiež použiť v materiáloch tohto typu.

Hetero-hetero (heteric-heteric) blokové kopolyméry sa pripravujú samozrejme rovnakým spôsobom, ktorý už bol skôr diskutovaný, s veľkým rozdielom v tom, že monomér privádzaný pre alkylénoxid sa v každom kroku skladá zo zmesi dvoch alebo viac látok. Bloky potom budú náhodilé kopolyméry dodaných monomérov s rozpúšťacími charakteristikami danými relatívnymi pomermi potenciálne vo vode rozpustných a nerozpustných zložiek.

Priemerná molekulová hmotnosť polyoxyalkylénglykoléter blokových kopolymérov, ktoré sa používajú v súlade s týmto vynálezom, je od asi 500 do asi 30.000, najmä od asi 800 do asi 25.000 a výhodne od asi 1000 do asi 12.000. Hmotnostný pomer hydrofóbnej časti k hydrofilnej časti sa bude tiež pohybovať od asi 0,4:1 do asi 2,5:1, najmä od asi 0,6:1 do asi 1,8:1 a výhodne od asi 0,8:1 do asi 1,2:1.

V zvlášť výhodnom uskutočnení tieto tenzidy majú všeobecný vzorec:

RX(CH2CH₂O)_nH kde hydrofóbna časť blokového kopolyméru má priemernú molekulovú hmotnosť od asi 500 do asi 2.500, najmä od asi 1.000 do asi 2.000, výhodne od asi 1.200 do asi 1.500, a kde R je zvyčajne typická povrchovo aktívna hydrofóbna skupina, ale môže sa tiež jednať o polyéter, ako je polyoxypropylénová skupina alebo zmes polyoxypropylénových a polyoxyetylénových skupín. Vo vyššie uvedenom vzorci je X buď kyslík alebo dusík alebo iná funkčná skupina schopná viazať polyoxyetylénový reťazec k hydrofóbnej časti. Vo väčšine prípadov n, priemerný počet polyoxyetylénových jednotiek v hydrofilnej skupine, musí byť väčší než asi 5 alebo 6, aby sprostredkoval dostatočnú rozpustnosť vo vode a urobil použiteľný materiál.

Polyoxyalkylénglykolétery sú výhodné neiónogenné povrchovo aktívne blokové kopolyméry polyéter-polyolu. Ovšem inými neiónogennými povrchovo aktívnymi blokovými kopolymérmi použiteľnými v predloženom vynáleze môžu byť modifikované blokové kopolyméry pri použití ďalej uvedených východiskových látok: (a) alkoholov, (b) mastných kyselín, (c) derivátov alkylfenolov, (d) glycerolu a jeho derivátov, (e) mastných amínov, (f) 1,4sorbitanových derivátov, (g) ricínového oleja a jeho derivátov, (h) derivátov glykolu.

Bod zakalenia je jednou z najvýznamnejších charakteristík pre väčšinu neiónogenných tenzidov a závisí na počte oxyetylénových, oxypropylénových a/alebo oxybutylénových skupín, ktoré reagovali pri príprave povrchovo aktívneho blokového kopolyméru, ktorý je predmetom predloženého vynálezu. Bod zakalenia je taktiež ovplyvnený inými zložkami v roztoku, koncentráciou tenzidov a rozpúšťadlami, ak sú v systéme. Bod zakalenia bol definovaný ako náhly začiatok zákalu roztoku neiónogenného tenzidu pri vzraste teploty. Pokiaľ je neiónogenný tenzid rozpustený vo vode, uvažuje sa, že vzrast teploty zvýši aktivitu molekúl vody, čo spôsobí dehydratáciu éterických kyslíkových atómov polyoxyetylénovej skupiny neiónogenného tenzidu. Molekuly s vyšším zastúpením oxyetylénových skupín majú vyššiu hydratačnú kapacitu a teda majú i vyšší bod zakalenia. Toto je dôležité na stabilizáciu enzýmov v roztoku, pretože dlhodobá stabilita enzýmov sa vyhodnocuje pri teplote 50 °C. Pokiaľ je bod zakalenia neiónogenného tenzidu nižší ako 50 °C a roztok dosiahne túto teplotu, enzým sa hydratuje, ale dôjde ku koalescencii tenzidu, ktorý bude vo vode menej rozpustný.

Bod zakalenia sa taktiež popisuje ako charakteristika neiónogenných tenzidov, v ktorej sa vykazuje inverzná závislosť rozpustnosti vo vode na teplote, čo znamená, ža s nárastom teploty roztoku rozpustnosť tenzidu klesá. Tento jav sa pripisuje prerušeniu špecifických interakcií, ako sú vodíkové mostíky medzi vodou a polyoxyetylénovými jednotkami molekuly. Teplota, pri ktorej sa začínajú zložky polyoxyetylénového tenzidu vylučovať z roztoku, sa taktiež definovala ako bod zakalenia. Všeobecne bod zakalenia danej rodiny tenzidov bude narastať s priemerným počtom oxyetylénových skupín.

Bod zakalenia heiónogenného povrchovo aktívneho blokového kopolyméru polyéter-polyolu a najmä polyoxyalkylénglykoléterových povrchovo aktívnych polymérov predloženého vynálezu je vyšší ako teplota, pri ktorej sa enzým alebo enzýmový systém odburáva a môže byť kdekoľvek od asi 0 °C do asi 110 °C, najmä od asi 10 °C do asi 100 °C a výhodne od asi 20 °C do asi 95 °C. Tieto body zakalenia sú pre roztoky obsahujúce 1 hmotnostné % tenzidu vo vode.

Hoci prihlasovatelia nechcú byť obmedzovaní žiadnou teóriou, predpokladá sa, že neiónogenné tenzidy predloženého vynálezu prispievajú k stabilite enzýmu narastaním viskozity vody v prípravku. Všeobecne vyššia viskozita vody povedie k zlému transportu v Ca⁺⁺bohatých zónach v enzýmoch, ako je proteáza, alebo k pomalšiemu prenosu iónov. To taktiež pomáha udržovať enzýmovú matricu intaktnou, hoci v niektorých z prípadov popísaných v súlade s predloženým vynálezom vyššia viskozita nemusí byť nutná na stabilitu.

Chelatačné činidlá všeobecne deaktivujú enzýmy, klesá molekulová kompaktnosť enzýmu a dochádza k deformácii enzýmu. Neiónogenné tenzidy nie sú ovplyvňované elektrostatickými efektami, t. j. nabitými skupinami enzýmu, a nepôsobia tak na špeciálnu štruktúru enzýmu.

Vhodný blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, ktorý sa môže použiť v súlade s predloženým vynálezom, obsahuje hydrofóbnu časť založenú na uhľovodíkovom zvyšku alifatického jednosýtneho alkoholu obsahujúceho 1 až asi 8 atómov uhlíka, kde uhľovodíkový zvyšok má k tomu pripojenou väzbou éterickým kyslíkom heterický zmiešaný reťazec oxyetylénových a 1,2-oxypropylénových skupín. Hmotnostný pomer oxyetylénových skupín k 1,2-oxypropylénovým skupinám v hydrofóbnej časti je od asi 5:95 do asi 15:85 a priemerná molekulová hmotnosť hydrofóbnej od asi 1.000 do asi 2.000. Hydrofilná časť je pripojená k zmiešanému reťazcu a je založená na oxyetylénových skupinách. Hmotnostný pomer hydrofilnej časti k hydrofóbnej je kdekoľvek medzi asi 0,8:1 do asi 1,2:1. Tento polyoxyalkylénglykoléter ďalej určili Steele, Junior a spol., U. S. patent č. 3,078,315, ktorý je tu zahrnutý ako odkaz.

Jedným z výhodných polyoxyalkylénglykoléterov je Tergitol XD, vyrábaný podľa postupu Steele, Jr. a spol. v U. S. patente č. 3,078,315 a dostupný z Union Carbide. Je to neiónogenný blokový kopolymér s bodom zakalenia asi 76 °C pre 1 % roztok vo vode a s molekulovou hmotnosťou asi 3120 danou jeho hydroxylovým číslom.

Môžu sa použiť iné neiónogenné polyoxyalkylénglykoléterové blokové kopolyméry, ako sú tie, ktoré vyrába BASF Wyandotte Corporation, ktoré zahrňujú typy Pluronic® a Tetronic®. Polyolové tenzidy Pluronic® a Tetronic® sú pohyblivé kvapaliny až vločkovité tuhé látky a tie s vysokými obsahmi etylénoxidu nevykazujú bod zakalenia roztoku dokonca pri 100 °C. Môžu sa použiť iné podobné neiónogenné polyoxyalkylénglykoléterové povrchovo aktívne blokové kopolyméry, ako sú tie, ktoré vyrába Dow Chemical Company a Witco Chemical Corporation.

Tenzidy Pluronic®, ktoré sa môžu tiež použiť v súlade s predloženým vynálezom, sa pripravujú syntézou hydrofóbnej časti požadovanej molekulovej hmotnosti kontrolovanou adíciou propylénoxidu na dve hydroxylové skupiny propylénglykolu. Potom sa na oba konce hydrofóbnej časti aduje etylénoxid za vzniku oxyetylénových reťazcov, ktoré tvoria od asi 10 hmotnostných % do asi 80 hmotnostných % konečnej molekuly. Priemerná molekulová hmotnosť tenzidu Pluronic® je od asi 1.100 do asi 12.600 a HLB (hydrofilne lipofilná rovnováha) je od asi 1—7 do asi 18—23 alebo väčšia ako asi 24. Pluronic® P-105, ktorý sa použil v súlade s predloženým vynálezom, mal priemernú molekulovú hmotnosť asi

6.500, teplotu topenia asi 35 °C, bod zakalenia asi 91 °C a HLB asi 12—18.

Tenzidy Tetronic®, ktoré sa môžu taktiež použiť v súlade s predloženým vynálezom, sú tetrafunkčné blokové kopolyméry odvodené zo sekvenčnej adície propylénoxidu a potom etylénoxidu na etyléndiamín. Priemerná molekulová hmotnosť týchto tenzidov je od asi 1.650 do asi 30.000 a majú HLB od asi 1—7 do asi 12—23 a väčšiu ako asi 24. Tetronic® 1304, ktorý sa použil v súlade s predloženým vynálezom, mal priemernú molekulovú hmotnosť asi

10.500, teplotu topenia asi 50 °C, bod zakalenia vyšší ako asi 100 °C a HLB vyššiu ako asi 24.

Enzým a tenzid sa môžu taktiež použiť v kombinácii s organickým rozpúšťadlom kompatibilným s enzýmom, ktoré bude taktiež pôsobiť ako rozpúšťadlo pre neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu. Výhodné rozpúšťadlo je hydrofilné, ako je polyol alebo zmes polyolov, kde polyol má od 2 do asi 6 uhlíkových atómov a od 2 do asi 6 hydroxylových skupín a zahrňuje látky ako 1,2-propandiol, etylénglykol, erytritan, glycerol, sorbitol, manitol, glukózu, fruktózu, laktózu a podobne.

Stabilizovaný enzýmový prípravok podľa tohto vynálezu môže teda obsahovať enzým v množstve od asi 2 do asi 95 hmotnostných dielov, najmä od asi 5 do asi 90 hmotnostných dielov a výhodne od asi 10 do asi 80 hmotnostných dielov, vodu v množstve od asi 1 do asi 90 hmotnostných dielov, najmä od asi 2 do asi 85 hmotnostných dielov a výhodne od asi 5 do asi 80 hmotnostných dielov, rozpúšťadlo od asi 0 do asi 70 hmotnostných dielov, najmä od asi 2 do asi 60 hmotnostných dielov a výhodne od asi 3 do asi 55 hmotnostných dielov a neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu v množstve od asi 0,2 do asi 40 hmotnostných dielov, najmä od asi 0,8 do asi 30 hmotnostných dielov a výhodne od asi 1 do asi 25 hmotnostných dielov.

15a

Vynález taktiež zahrňuje spôsob stabilizácie enzýmu a rovnako aj stabilizovaný enzýmový prípravok obsahujúci od asi 1 do asi 90 hmotnostných % vody, vzt'ažené na uvedený enzým a vodu v kombinácii s uvedeným neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérém polyéter-polyolu. V inom uskutočnení vynález tiež zahrňuje spôsob stabilizácie enzýmu a taktiež stabilizovaný enzýmový prípravok obsahujúci viac ako 20 hmotnostných % vody, vzt’ažené na uvedený enzým a vodu v kombinácii s uvedeným neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérom polyéter-polyolu.

Nasledujúce príklady sú ilustratívne.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Ďalej uvedený prípravok sa vyrobil z Pulpzyme HB, vodnej enzymovej suspenzie, komerčne dostupnej od Novo Nordisk Bioindustrials, Inc., ktorá je xylanasovým prípravkom bakteriálneho pôvodu. Rovnako sa použil vyššie popísaný Tergitol XD. Glycerol, ktorý sa použil, mal čistotu 96 %, nečistotou bola voda. Je možné tiež použiť glycerol väčšej čistoty. Glycerol slúži ako rozpúšťadlo Tergitolu XD, ktorý je tuhý pri teplote miestnosti. Viskozita prípravku, 0,22 Pa s, sa merala na Brookfieldovom viskozimetri model číslo LVT pri 30 obrátkach za minútu, vreteno číslo 4 pri teplote miestnosti (20 °C). Prípravok sa ľahko rozpúšťa vo vode. Enzýmová aktivita, IU na ml, sa merala podľa metódy, ktorú popísali Bailey, M. J. a spol., J. Biotech. 23, 257—270, 1992. Táto metóda zahrňuje päťminútovú inkubáciu enzýmu xylanázy (vhodne nariedenom v pH 5,3 citrátového tlmivého roztoku) s 1 % xylánovým substrátom z brezového dreva. Po inkubácii sa uvoľnené cukry stanovili päťminútovou reakciou s pôvodným DNS činidlom Sumnera (1921). Absorbancia sa meria pri 540 nm oproti slepému pokusu činidla zahrňujúceho substrát, DNS činidlo a tlmivý roztok. Enzýmový odpočet sa koriguje odpočítaním enzýmového slepého pokusu zloženého zo substrátu a DNS činidla, ku ktorému sa pridá zriedený enzým s okamžitým vznikom zafarbenia/ukončením reakcie miesto inkubácie.

Zložka

Hmotnostné percentá

Pulpzyme HB Glycerol Tergitol XD

Tabuľka 1 uvedená ďalej ukazuje vynikajúcu stabilitu tohto prípravku. Nárast aktivity enzýmu je v rámci experimentálnej chyby.

Tabuľka 1

Stabilizácia enzýmu v Príklade 1 Enzýmová aktivita (IU na ml) *

Pôvodná vzorka	Teplota miestnosti	8 °C	50 °C
9170	9130	9820	10900

* Tridsať dní v uvedených podmienkach.

Príklad 2

Príklad 1 sa opakoval s použitím Pulpzymu HB, ovšem Tergitol XD sa nahradil prípravkom Pluronic® P-105, ktorý je neiónogenným blokovým kopolymérom dodávaným BASF Wyandotte Corporation. Bod zakalenia tohto kopolyméru je 91 °C (1 % vodný roztok) a 94 °C (10 % vodný roztok). Priemerná molekulová hmotnosť tenzidu je asi

6.500.

Tabuľka 2 ukazuje v medziach experimentálnej chyby zníženie stability tohto prípravku v porovnaní s Príkladom 1, čo sa zdá byť vlastnosť Pluronicu® P-105 v porovnaní s Tergitolom XD. Stabilita je napriek tomu lepšia ako u enzýmov bez Pluronicu® P-105. Enzým bude rýchlo strácať svoju aktivitu za týchto podmienok bez stabilizácie poskytnutej prídavkom Pluronic® P-105.

Tabuľka 2

Stabilizácia enzýmu v Príklade 2 Enzýmová aktivita (IU na ml) *

Pôvodná vzorka	Teplota miestnosti	8 °C	50 °C
8400	8280	8970	7370

* Tridsať dní v uvedených podmienkach.

Príklad 3

Príklad 1 sa opakoval s použitím proteázového enzýmu od. Solvay Enzymes, Inc., alebo lipázového enzýmu od Novo Nordisk Bioindustrials, Inc. a výsledky sú uvedené ďalej v Tabuľke 3.

Tabuľka 3

Zložka	hmotnostné %
HT-Proteolytic L-175® (proteáza)		70	100
glycerol (96 % plus)		20
Tergitol XD		10
aktivita (14 dní)	pri 50°C	45	24
pri teplote miestnosti	(20°C)	90	91

Zložka	hmotnostné %
Resinase A2X™ (lipáza)	85	85	85	85
glycerol (96 % plus)		5	—	5	5
Tergitol XD		10	—	—	__
voda		—	15	—	—
Pluronic® P-105		—	—	10	—
Tetronic 1304® BASF Wyandotte	—	—	—	10
aktivita (30 dní) pri	50 °C	0.049	0.033	0.047	0.0553
pri teplote miestnosti	(20 °C)	0.048	0.067	0.054	0.0472

Odborníkovi v odbore bude samozrejmé, že je možné uskutočňovať modifikácie a variácie spôsobov a prípravkov predloženého vynálezu bez toho, aby došlo k odchýleniu od podstaty alebo rozsahu tohto vynálezu. Určuje sa, že tieto modifikácie a variácie a ich ekvivalenty sú zahrnuté ako časť tohto vynálezu, čo zabezpečuje, že spadajú do rozsahu pripojených nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob stabilizácie enzýmového prípravku obsahujúceho viac ako 20 hmotnostných % vody voči strate aktivity pri zvýšených teplotách alebo vodou, vyznačujúci sa tým, že sa spojuje uvedený enzým so stabilizujúcim množstvom neiónogenného povrchovo aktívneho blokového kopolyméru polyéter-polyolu, pričom uvedený neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu je celoblok, blok-hetero, hetero-blok alebo hetero-hetero blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, kde uvedené alkylénové jednotky majú 2 až 4 uhlíkové atómy.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je stabilizovaný voči rozkladu pri zvýšených teplotách uvedeným neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérom polyéter-polyolu, ktorý má bod zákalu vyšší ako uvedené teploty.
3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedené teploty sú od 0 °C do 100 °C.
4. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že uvedený neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu je rozpustený v organickom rozpúšťadle kompatibilnom s uvedeným enzýmom.
5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci satým, že uvedený neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu je rozpustený v organickom rozpúšťadle kompatibilnom s uvedeným enzýmom.
6. Spôsob podľa nároku 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je hydrofilné.
7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúštadlo je polyol alebo zmes polyolov.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že uvedený polyol má od 2 do 6 uhlíkových atómov a od 2 do šesť hydroxylových skupín.
9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedené enzýmy sú proteáza, amyláza, celuláza, hemiceluláza, pektináza, βglukanáza, lipáza, fosfolipáza, glukózoizomeráza, glukózooxidáza a lipoxidáza.
10. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že uvedený polyoxyalkylénglykoléter obsahuje hydrofóbne a hydrofilné bloky založené aspoň na oxyetylénových, oxypropylénových skupinách alebo zmesiach týchto skupín.
11. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že priemerná molekulová hmotnosť uvedeného polyoxyalkylénglykoléteru je od 500 do 30.000, hmotnostný pomer hydrofóbnej k hydrofilnej časti uvedeného polyoxyalkylénglykoléteru je od 0,4:1 do 2,5:1 a bod zákalu uvedeného polyoxyalkylénglykoléteru je od 0 °C do 110 °C.
12. Enzýmový prípravok obsahujúci viac ako 20 hmotnostných % vody stabilizovaný oproti strate aktivity pri zvýšených teplotách alebo vodou, vyznačujúci sa tým, že uvedený prípravok je enzým v kombinácii so stabilizujúcim množstvom neiónogenného povrchovo aktívneho blokového kopolyméru polyéter-polyolu, kde uvedený neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu je celoblok, blok-hetero, hetero-blok alebo hetero-hetero blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, v ktorom uvedené alkylénové jednotky majú 2 až 4 uhlíkové atómy.
13. Prípravok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedený enzým je stabilizovaný voči rozkladu pri zvýšených teplotách uvedeným neiónogenným povrchovo aktívnym blokovým kopolymérom polyéter-polyolu, ktorý má bod zákalu vyšší ako uvedené teploty.
14. Prípravok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že uvedené teploty sú od 0 °C do 110 °C.
15. Prípravok podľa nároku 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že uvedený neiónogenný povrchovo aktívny blokový kopolymér polyéter-polyolu je rozpustený v organickom rozpúšťadle kompatibilnom s uvedeným enzýmom.
16. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je hydrofilné.
17. Prípravok podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je polyol alebo zmes polyolov.
18. Prípravok podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedený polyol má od 2 do 6 uhlíkových atómov a od 2 do 6 hydroxylových skupín.
19. Prípravok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedené enzýmy sú proteáza, amyláza, celuláza, hemiceluláza, pektináza, β-glukanáza, lipáza, fosfolipáza, glukozoizomeráza, glukozooxidáza a lipoxidáza.
20. Prípravok podľa nároku 13 alebo 14, vyznačujúci sa tým, že uvedený polyoxyalkylénglykoléter obsahuje hydrofóbne a hydrofilné bloky, každý blok je založený aspoň na oxyetylénových skupinách alebo oxypropylénových skupinách alebo zmesiach týchto skupín.
21. Prípravok podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že priemerná molekulová hmotnosť uvedeného polyoxyalkylénglykolu je od 500 do 30.000, hmotnostný pomer hydrofóbnej k hydrofilnej časti uvedeného polyoxyglykoléteru je od 0,4:1 do 2,5:1 a bod zákalu uvedeného polyoxyalkylénéteru je od 0 °C do 110 °C.
22. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený blokový kopolymér polyéter-polyolu je- blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, ktorý má hydrofóbnu časť založenú na uhľovodíkovom zvyšku jednosýtneho alifatického alkoholu obsahujúceho 1 až 8 atómov uhlíka, kde uhľovodíkový zvyšok má pripojenú k tomu cez éterickú kyslíkovú väzbu heterický zmiešaný reťazec oxyetylénových skupín a 1,2-oxypropylénových skupín, hmotnostný pomer oxyetylénových skupín k 1,2-oxypropylénovým skupinám v hydrofóbnej časti je od 5:95 do 15:85 a priemerná molekulová hmotnosť hydrofóbnej časti je od 1.000 do 2.000, hydrofilná časť je pripojená k zmiešanému reťazcu a je založená na oxyetylénových skupinách a hmotnostný pomer hydrofilnej a hydrofóbnej časti je od 0,8:1 do 1,2:1.
23. Prípravok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje ako rozpúšťadlo polyol, ktorý má od 2 do 6 uhlíkových atómov a od 2 do 6 hydroxylových skupín.
24. Prípravok podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedené enzýmy sú proteáza, amyláza, celuláza, hemiceluiáza, pektináza, β-glukanáza, lipáza, fosfolipáza, glukozoizomeráza, glukozooxidáza a lipoxidáza.
25. Prípravok podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je glycerol a uvedené enzýmy sú amyláza, proteáza alebo lipáza.
26. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený blokový kopolymér polyéter-polyolu je blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, ktorý má hydrofóbnu časť založenú na propylénoxidovom adukte propylénglykolu, kde propylénglykol má k tomu nadviazané cez éterickú kyslíkovú väzbu oxypropylénové skupiny, hydrofilná časť je nadviazaná na hydrofóbnu časť a je založená na oxyetylénových skupinách, priemerná molekulová hmotnosť tenzidu je od 1.100 do 12.600 a HLB je od 1 —7 do 24.
27. Prípravok podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že prípadne obsahuje ako rozpúšťadlo polyol, ktorý má od 2 do 6 uhlíkových atómov a od 2 do 6 hydroxylových skupín.
28. Prípravok podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že uvedené enzýmy sú proteáza, amyláza, celuláza, hemiceluláza, pektináza, β-glukanáza, lipáza, fosfolipáza, glukozoizomeráza, glukozooxidáza a lipoxidáza.
29. Prípravok podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je glycerol a uvedené enzýmy sú amyláza, proteáza, alebo lipáza.
30. Prípravok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že uvedený blokový kopolymér polyéter-polyolu je blokový kopolymér polyoxyalkylénglykoléteru, ktorý má hydrofóbnu časť založenú na propylénoxidovom adukte etyléndiamínu, kde etyléndiamín má k tomu nadviazané cez éterickú kyslíkovú väzbu 1,2-oxypropylénové skupiny, hydrofilná časť je pripojená k zmiešanému reťazcu a je založená na oxyetylénových skupinách, priemerná molekulová hmotnosť tenzidu je od 1.650 do 30.000 a HLB je od 1 —7 do 24.
31. Prípravok podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že obsahuje ako rozpúšťadlo polyol, ktorý má od 2 do 6 uhlíkových atómov a od 2 do 6 hydroxylových skupín.
32. Prípravok podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že uvedené enzýmy sú proteáza, amyláza, celuláza, hemiceluláza, pektináza, β-glukanáza, lipáza, fosfolipáza, glukozoizomeráza, glukozooxidáza a lipoxidáza.
33. Prípravok podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že uvedené rozpúšťadlo je glycerol a uvedené enzýmy sú amyláza, proteáza alebo lipáza.