SK284915B6 - Trombínové inhibítory a ich použitie - Google Patents

Abstract

Sú opísané zlúčeniny všeobecného vzorca (I), ich soli s fyziologicky prijateľnými kyselinami a ich použitie na výrobu liečiv a na kontrolu chorôb.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka päťčlenných heterocyklických amidínov, ich prípravy a ich použitia ako kompetitívnych inhibítorov trypsínovitých serínových proteáz, najmä trombínu a kininogenáz, ako je napríklad kalikreín. Vynález sa týka aj farmaceutických kompozícií, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny ako účinné zložky, a použitia týchto zlúčenín ako trombínových inhibítorov, antikoagulantov a protizápalových prostriedkov.

Doterajší stav techniky

Trombín patrí do skupiny serínových proteáz a hrá ústrednú úlohu v kaskáde koagulácie krvi ako terminálny enzým. Vnútorná aj vonkajšia koagulačná kaskáda vedie cez viacero zosilňovacích štádií k produkcii trombínu z protrombínu. Trombínom katalyzované štiepenie fibrinogénu na fibrín potom iniciuje zrážanie krvi a agregáciu krvných doštičiek, ktoré zas v dôsledku viazania krvnodoštičkového faktora 3 a koagulačného faktora XIII a veľkého počtu vysoko aktívnych mediátorov urýchľujú tvorbu trombínu.

Tvorba a pôsobenie trombínu sú ústrednými udalosťami vo vývoji bielych - arteriálnych a červených - venóznych trombov a sú preto potenciálne efektívnymi bodmi ataku pre liečivá. Trombínové inhibítory sú na rozdiel od heparínu schopné nezávisle od kofaktorov úplne inhibovať simultánne účinky trombínu a účinky viazané na krvné doštičky. Sú schopné zabrániť v akútnej fáze tromboembolickým príhodám po perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike (PTCA) a lýze, a pôsobiť ako antikoagulanty v mimotelovom obehu (srdcovo-pľúcny pristroj, hemodialýza). Možno ich používať aj všeobecne na profylaxiu trombózy, napríklad po chirurgických operáciách.

Je známe, že syntetické arginínové deriváty ovplyvňujú enzymatickú aktivitu trombínu interakciou s aktívnym serínovým zvyškom proteázového trombínu. Peptidy na báze Phe-Pro-Arg, v ktorých N-koncová aminokyselina je v D forme, sa ukázali ako osobitne prínosné. D-Phe-Pro-Arg izopropylester je opísaný ako kompetitívny trombínový inhibítor (C. Mattson a kol., Fólia Haematol, 109 (1983) 43 -51).

Derivatizácia arginínu na C konci na aldehyd vedie k urýchleniu inhibičného účinku. Bolo preto opísaných mnoho arginálov schopných viazať hydroxylovú skupinu „aktívneho“ serínu do poloacetálu (EP 185390, 479489, 526877,542525; WO 93/15756, 93/18060).

Trombín-inhibičnú aktivitu peptidových ketónov, fluórovaných alkylketónov a ketoesterov, derivátov kyseliny boritej, esterov kyseliny fosforečnej a a-ketokarboxamidov možno podobne vysvetliť touto serínovou interakciou (EP 118280, 195212, 362002, 364344, 410411, 471651, 589741, 293881, 503203, 504064, 530167; WO 92/07869, 94/08941).

Peptidové 4-amidinofenylglycínfosfonát difenylestery, ktoré opísali J. Oleksyszyn a kol. v J. Med. Chem. 37 (1994) 226 - 231, sú ireverzibilnými trombínovými inhibítormi s neadekvátnou selektivitou vzhľadom na iné serínové proteázy.

DE 3 108 810, WO93/11152 a EP 601 459 opisujú agmatínové a tým aj arginínové deriváty, ktoré nie sú schopné interakcie s aktívnym serínom v serínových proteázach.

WO 94/29336, EP 0 601 459 a WO 95/23609 predstavujú ďalší vývojový stupeň, v ktorom je agmatín nahradený arylamidínovým zvyškom.

Kininogenázy sú serínové proteázy, ktoré uvoľňujú vazoaktívne peptidy nazývané kininy (bradykinín, kalidín a Met-Lys-bradykinín) z kininogénov. Kininogény sú viacfunkčné proteíny, ktoré sa vyskytujú pri koagulačných a zápalových kaskádových reakciách. Ako inhibítory chránia bunky pred poškodením cysteínovými proteázami (Mtiller Esteri, FEBS Lett. 182 (1985) 310 - 314). Dôležitými kininogenázami sú plazmový kalikreín, tkanivový kalikreín a heparinocytová tryptáza.

Kininy ako bradykinín a kalidín sú vazoaktívne peptidy, ktoré ovplyvňujú veľký počet biologických procesov. Hrajú dôležitú úlohu v zápalových procesoch. Zvýšením vaskulámej priepustnosti vedú k hypotenzii a edému. Navyše sú veľmi potentnými bolesť vyvolávajúcimi antacoidmi [sic] a majú veľký význam ako bunkové mediátory v patofyziológii astmy, alergickej rinitídy a artritídy (K. D. Bhoola, C. D. Figueroa, K. Worthy, Pharmacological Revies [sic] 44 (1) (1992) 1 -80).

Bez ohľadu na mechanizmy, ktoré sú na pozadí zápalových procesov, z ciev uniká tekutina obsahujúca všetky proteínové systémy v cirkulujúcej krvi. To znamená, že únik plazmatickej tekutiny z ciev sa vyskytuje pri chorobách, ako je astma, rinitída a zápalové vnútorné choroby. Navyše heparinocytová tryptáza sa uvoľňuje najmä pri alergických procesoch (Salomonsson a kol., Am. Rev. Respir. Dis. 146 (1992) 1535 - 1542).

Arginínové chlórmetylketóny H-(D)-Pro-Phc-Arg-CH₂C1 a H-(D)-Phe-Phe-Arg-CH₂-Cl opísali Kettner a Shaw ako inhibítory plazmového kalikreínu (Biochem. 17 (1978) 4778 - 4784 a Meth. Enzým. 80 (1981) 826 - 842).

Rôzne syntetické deriváty benzamidínov a benzylamínov sa osvedčili ako inhibítory plazmového kalikreínu, pričom benzamidíny majú výrazne silnejší inhibičný účinok (F. Markward, S. Drawert, P. Walsmann, Biochemical Pharmacology 23 (1974) 2247 - 2256).

PKSI-527, hydrochlorid N-(trans-4-aminomctylcyklohexylkarbonyl)-L-fenylalanín 4-karboxymetylanilidu, je tiež účinným inhibitorom tejto kininogenázy (Wanaka, Ohamoto a kol., Thromb. Res., 57 (6) (1990) 889 - 895).

Podstata vynálezu

Vynález sa týka zlúčenín vzorca (1)

NH

NH₂ kde

A je

R²

I

R¹-- (CH₂),„ — C -- (CH₂)_n -- ,

R^J kde m je 0, 1 alebo 2, n je 0, 1 alebo 2,

R¹ je HOOC-, C^-alkyl-OOC- alebo -OH,

R² je H, C_M-alkyl alebo R'-(CH₂)_m-,

R³ je H alebo C_w-alkyl,

Bje

R

R⁴ (R⁷-C-R“)_p — N---- C---- CO — ,

R⁵ kde

R⁴ je H, C|_4-alkyl alebo R’-(CH₂)_m- (kde R¹ a m majú uvedené významy), p je 0 alebo 1,

R⁵ je H alebo Cj^-alkyl,

R^ó je H, C,.₈-aIkyI, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny C_b4-alkyl, CF₃, C_b4-alkoxy, F alebo Cl, alebo C₃.₈-cykloalkyl, ktorý môže niesť do štyroch rovnakých alebo rôznych C_b4-alkylových radikálov, alebo kde jedna alebo dve jednoduché väzby C-C v kruhu môžu byť nahradené dvojitou väzbou C=C, alebo naň môže byť prikondenzovaný fenylový kruh, C₇-C|₂-bicyklo-alkyl alebo C]₀-tricykloalkyl alebo

R⁴ a R⁶ spolu sú etylénovou alebo propylénovou skupinou,

R⁷ je H, Cb8-alkyl, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny Cb4-alkyl, CF3, Cb4-alkoxy, F alebo Cl, alebo C3.8-cykloalkyl, ktorý môže niesť až štyri rovnaké alebo rôzne Cb4-alkylové radikály, R⁸ je H alebo Cb4-alkyl,

Eje

P je 0,1,

R⁴ je H, Ci ₄-alkyl alebo HOOC-(CH₂)_m- (m = 1,2 alebo 3),

R⁵ je H, metyl

R⁶ je H, C_b8-alkyl, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny CH₃, CF₃, CH₃-O, F alebo Cl, alebo C₃.₈-cykloalkyl, ktorý môže niesť až štyri metylové radikály, 1,4-cyklohexadienyl, bicyklo[2.2.2]oktyl, bicyklo[2.2.1]heptyl, norbomyl, adamantyl, indanyl, dekalinyl,

R⁷ je H, Ci._g-alkyl, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny CH₃, CF₃, CH₃O, F alebo Cl, alebo C₃._s-cykloalkyl, ktorý môže niesť až štyri metylové radikály,

R⁸ je H, C_b4-alkyl, (B má výhodne D konfiguráciu),

Eje

q je 0,1 (E má výhodne L konfiguráciu),

Oje

H

q je 0 alebo 1 D je | Y^- 2

R¹¹

R¹· alebo

-N—C

kde

R⁹ je H alebo C_b3-alkyl,

R¹⁰ je H alebo C_b4-alkyl,

R je H alebo Cj^-alkyl,

X je O, S, -NR¹² (R¹² = H, C^-alkyl),

Y je -N= alebo -CR¹³= (R¹³ = H, C_M-alkyl, Cl, CF₃),

Z je-N= alebo-CR¹³=, a ich soli s fyziologicky tolerovanými kyselinami.

Deriváty aminokyselín, ktoré predstavuje B, majú výhodne (D) konfiguráciu; 3,4-dehydroprolín a kyselina 4,5-dchydropipekolová majú (L) konfiguráciu.

Výhodnými zlúčeninami vzorca (I) sú tie, kde A až E majú nasledujúce významy:

A je

HOOC-(CH₂)_t- (t= 1, 2 alebo 3), (HOOC-CH₂)₂-CH-, (HO-CH₂)₂CH-, HOOC-CH₂-CH(COOH)-, HOOC-CH(CH₂-CH₂-OH)-, HOOC-CH(C_w-alkyl)-, HOOC-C(C_b4-alkyl)₂-,C_b4-alkyl-OOC-(CH₂)_t-,

B je

R⁶

I

R⁴ (R⁷-C-R“)_p

I I — N---- C---- CO — >

R⁵

Y^-Z pričom

X =S, O, NH, NCH₃, NC₂H₅,

Y =CH, C-CH₃, C-Cl, C-CF₃ a

Z-CH, C-CH₃, C-Cl, C-CF₃ alebo X = S, O, NH, N-CHj Y = N Z = CH, C-ch₃, c-cf₃ alebo X = S, O, NH, N-CH, Y = CH, C-CH₃, Z = N

C-CF₃ alebo X = S, O, NH, N-CH₃ Y = N Z = N

H

pričom

X =S, O, NH, NCH₃, NC₂H₅,

Y =CH, C-CH₃, C-CF₃ a

Z=CH, C-CH₃, C-CF₃, C-Cl

alebo	X = O, NH, NCH3		Y = N Z - CH, C-CH3, C-CF:
alebo	X = O, S,	NH,	Y = CH, C- Z = N
	nch3		-ch3,c-cf3
alebo	X = 0, s, NCH3	NH,	Y = Z = N

SK 284915 Β6 pričom

X =S, O, NH, NCH₃, NC₂H₅,

Y =CH, C-CHj, C-CF₃ a

Z=CH, C-CHj, C-CF₃, C-Cl

alebo	x = o,	Y = N	Z = CH, C-CH3,
	NH, NCH3		c-cf3, C-CI
alebo	x = o,s,	Y = CH, C-CHj,	Z-N
	NH, NCH3	c-cf3
alebo	X = O, NH, NCHj.	Y = Z = N.

Osobitne výhodné zlúčeniny vzorca (I) sú tie, kde A, B, D a E majú nasledujúce významy

A je HOOC-CH₂, HOOC-CH₂-CH₂, HOOC-CH(CH₃),

HOOC-CH(C₂H₅),

B je

R⁶

R⁴ (R⁷-C-R^a)_p — N---- C----- ’

R⁵

P je 0,1,

R⁴ je H, CHj,

R⁵ je H, CH₃,

R⁶ je Ci-g-alkyl, C₅__s-cykloalkyl ktorý môže niesť až štyri metylové radikály, bicyklo[2.2.2]oktyl, bicyklo[2.2.ljheptyl [sic], norbomyl, adamantyl, indanyl, dekalinyl, pričom cyklopentyl, cyklohexyl a cykloheptyl sú osobitne výhodné,

R⁷ je H, CH₃,

R⁸ je H, CH₃,

Eje

H

H

I °—F — N--CH₂-H

N—N q je 0, 1 D je

H

R¹⁴:

R'⁵:

R¹⁶:

R¹⁷:

pričom

H, CH₃, Cl, CF₃, výhodne H

H, Cl, CFj, výhodne H

H, CHj, C₂H_5j výhodne CH₃

H, CH₃, CFj, výhodne H, CHj.

Nasledujúce zlúčeniny sú osobitne výhodné:

tBuOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH,-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, tBuOOC-CH₂-(D)Chg-Dep-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D)Chg-Dep-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Cpg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Cheg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Cog-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Nog-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Adaala-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)4-MeCha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)y-MeCha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)4-MeChg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)3,3-Me₂Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)3,3-Me₂Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)4-iPrChg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)3,4,5(MeO)₃Phe-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Chea-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Diphe-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D,L)pP-Me₂Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)Adagly-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph,

HOOC-CH₂-(D,L)-l-Tic-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D,L)Dch-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D,L)4-iPrCha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)a-MeCha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)a-MeCha-Dep-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(N-Me)(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-4-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-4-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-5-(3-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-4-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-5-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-4-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-4-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-5-(3-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5 -(1 -Me-2-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-( 1 -Me-2-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-5-(l-Me-2-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-4-( 1 -Me-2-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-4-( 1 -Me-2-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-( 1 -Me-3-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dcp-NH-CH₂-5-(l-Me-3-am)-pyrr, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am-3,4-Me₂)-thioph,

HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am-3-Me)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am-4-Me)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am-3-Me)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am-4-Me)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am-2-Me)-fur, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-2-(5-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-2-(4-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-4-(2-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-2-(5-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-2-(4-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-4-(2-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Dep-NH-CH₂-2-(5-am)-thiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-2-(4-am)-oxaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-2-(4-am-)-oxaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am-1 -Me)-pyraz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-3-(5-am)-l,2,4-oxadiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-l,2,4-oxadiaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(3-am)-l,2,4-oxadiaz, HOOC-CI I₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(3 -am-1 -Me)-1,2,4-triaz,

HOOC-CH₂-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-fur, HOOC-CH₂-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5 -(1 -Me-2-am)-pyrr, (HOOC-CH₂)₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, (HOOC-CH₂)₂CH-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-thioph, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5 -(2-am)-1,3,4-thiadaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-1,3,4-thiadaz, HOOC-CH₂-(D)Chg-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-1,3,4-oxadiaz, HOOC-CH₂-(D)Cha-Pyr-NH-CH₂-5-(2-am)-1,3,4-oxadiaz,

Zoznam skratiek:

Adaala: Adamantylalanín

Adagly: Adamantylglycín

AIBN: Azobisizobutyronitril

Ac: Acetyl

Ala: Alanin am: Amidino

Asp: Kyselina asparágová

Aze: Kyselina azetidínkarboxylová

Bn: Benzyl

Boe: terc-Butyloxykarbonyl

Bu: Butyl

Cbz: Benzyloxykarbonyl

Cha: Cyklohexylalanín

Chea: Cykloheptylalanín

Cheg: Cykloheptylglycín

Chg: Cyklohexylglycín

Cog: Cyklooktylglycín

Cpa: Cyklopentylalanín

Cpg: Cyklopentylglycín

DCC: Dicyklohexylkarbodiimid

Dch: Dicyklohexylalanín

Dcha: Dicyklohexylamín

DCM: Dichlórmetán

Dep: Kyselina 4,5-dehydropipekolová

DMF: Dimetylformamid

DIPEA: Diizopropyletylamín

Dpa: Difenylalanín

Diphe: 2,5-Dihydrofenylalanín

Et: Etyl

Ekv: Ekvivalenty fur: Furán

Gly: Glycín ham: Hydroxyamidino

HOSucc: Hydroxysukcínimid

HPLC: Vysokovýkonná kvapalinová chromatografia (high performance liquid chromatography)

Hyp: Hydroxyprolín imi: Imidazol

2-Ind: Kyselina 2-dihydroindolkarboxylová iPr: izo-Propyl

Leu: Leucín

Me: Metyl α-MeCha: a-Metylcyklohexylalanín [![J-Me₂Cha: Kyselina 2-amino-3-cyklohexyl-3-metylbutánová alebo ββ-dimetylcyklohexylalanín

4-MeCha: (4-Metyl-1 -cyklohexyl)alanín γ-MeCha: (1 -Metyl-1 -cyklohexyl)alanín

3.3- Me₂Cha: (3,3-Dimetyl-l-cyklohexyl)alanín 4-MeChg: (4-Metyl-1-cyklohexyl)glycín [sic]

3.3- Me₂Chg: (3,3-Dimetyl-l -cyklohexyl)glycin

MPLC: Médium pressure liquid chromatography (strednotlaková kvapalinová chromatografia)

MTBE: Metyl terc-butyl éter

NBS: N-Brómsukcínimid

Nog: Norbomylglycín

SK 284915 Β6

Oxadiaz: 1,2,4-Oxadiazol

Oxaz: Oxazol

Ph: Fenyl

Phe: Fenylalanín

2Phi: Kyselina 2-perhydroindolkarboxylová

Pic: Kyselina pipekolová pico: Pikolyl pim: Piperidinylmetyl

PPA: Anhydrid kyseliny propylfosfóniovej

Pro: Prolín

Py: Pyridín

Pyr: 3,4-Dehydroprolín pyraz: Pyrazol pyrr: Pyrol

RT: Teplota miestnosti

RP-18: Reversed Phase C-18 (C-18 v reverznej fáze) t: Terciámy tBu: Terciámy butyl tert: Terciámy

TBAB: Tetrabutylamónium bromid

TEA: Trietylamín [sic]

TFA: Kyselina trifluóroctová

TFFA: Anhydrid kyseliny trifluóroctovej

TLC: Thin layer chromatography (tenkovrstvová chromatografia) thiaz: Tiazol thioph: Tiofén

Tie: Kyselina 1-tetrahydroizochinolínkarboxylová

3Tic: Kyselina 3-tetrahydroizochinolínkarboxylová

TOTU: O-(Kyanoetoxykarbonylmetylén)amino]-Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametylurónium [sic] tetrafluórborát triaz: 1,3,4-Triazol

Z: Benzyloxykarbonyl

Vynález sa ďalej týka medziproduktov vzorca (Ha) a (Ilb)

A -- B -- E -- D -- CN Ú la],

A -- B -- E -- D -- CSNH₂ (llb) kde A, B, E a D majú významy uvedené v nároku 1.

Tieto medziprodukty sa používajú na prípravu zlúčenín I a sú hodnotnými stavebnými komponentmi na syntézu inhibítorov serínovej proteázy.

Zlúčeniny vzorca (I) môžu existovať samotné alebo vo forme svojich solí s fyziologicky tolerovanými kyselinami. Príkladmi takých kyselín sú: kyselina chlorovodíková, kyselina citrónová, kyselina vínna, kyselina mliečna, kyselina fosforečná, kyselina metánsulfónová, kyselina octová, kyselina mravčia, kyselina maleínová, kyselina fumárová, kyselina jantárová, kyselina hydroxyjantárová, kyselina sírová, kyselina glutárová, kyselina asparágová, kyselina pyruvová, kyselina benzoová, kyselina glukurónová, kyselina šťaveľová, kyselina askorbová a acetylglycín.

Zlúčeniny vzorca (I) možno využiť na nasledujúce indikácie:

- choroby, ktorých patogenetický mechanizmus sa odvíja priamo alebo nepriamo od proteolytického účinku trombínu,

- choroby, ktorých patogenetický mechanizmus sa odvíja od na trombíne závislej aktivácie receptorov a signálových transdukcií,

- choroby spojené so stimuláciou [napr. pomocou PAI-1, PDGF (rastový faktor odvodený od krvných doštičiek), P-selektin, ICAM-1, tkanivový faktor] alebo inhibíciou (napr. syntéza NO v bunkách hladkej svaloviny) vylučovania génov v telových bunkách,

- choroby odvíjajúce sa od mitogénneho účinku trombinu,

- choroby odvíjajúce sa od trombinu závislej zmeny kontraktility a priepustnosti epitelových buniek (napr. vaskulámych endotelových buniek),

- od trombinu závislé trombocmbolické príhody, napríklad hlbokožilná trombóza, pulmonámy embolizmus, srdcový alebo mozgový infarkt, atriálna fibrilácia, oklúzia bypassu,

- diseminovaná intravaskuláma koagulácia (DIC),

- reoklúzia a na zníženie času reperfúzie pri komedikácii s trombolytikami, ako sú napríklad streptokináza, urokináza, prourokináza, t-PA, APSAC, plazminogénové aktivátory zo slinných žliaz zvierat, a rekombinantné a mutované formy všetkých týchto látok,

- výskyt skorej reoklúzie a neskorej restenózy po PTCA,

- od trombinu závislá proliferácia buniek hladkej svaloviny, akumulácia aktívneho trombinu v CNS (napr. pri Alzheimerovej chorobe),

- rast nádorov a na zabránenie adhézii a metastáz nádorových buniek.

Zlúčeniny možno použiť najmä na terapiu a profylaxiu od trombinu závislých tromboembolických príhod, ako sú hlbokožilné trombózy, pulmonáme embolizmy, srdcové alebo mozgové infarkty a nestabilná angína a tiež na terapiu diseminovanej intravaskulámej koagulácie (DIC). Sú ďalej vhodné na kombinačnú terapiu s trombolytikami, ako je napríklad streptokináza, urokináza, prourokináza, t-PA, APSAC a iné plazminogénové aktivátory na skrátenie času reperfúzie a predĺženie času reoklúzie.

Ďalšími výhodnými oblasťami použitia je zabránenie od trombinu závislej reoklúzii a neskorej restenóze po perkutánnej transluminálnej koronárnej angioplastike, na zabránenie trombínom indukovanej proliferácii buniek hladkej svaloviny, na zabránenie akumulácii aktívneho trombínu v CNS (napr. pri Alzheimerovej chorobe), na kontrolu nádorov a na zabránenie mechanizmom, ktoré vedú k adhézii a metastázam nádorových buniek.

Tieto zlúčeniny možno tiež použiť na povrchovú úpravu umelých povrchov, ako sú napríklad hemodialyzačné membrány a príslušné hadičkové systémy, a okysličovačov pri extravaskulárnej cirkulácii, stentov a srdcových chlopni.

Tieto zlúčeniny možno navyše použiť pri chorobách, ktorých patogenetický mechanizmus sa odvíja priamo alebo nepriamo od proteolytického účinku kininogenáz, najmä kalikreínu, napr. pri zápalových chorobách, ako je astma, pankreatitída, rinitída, artritída, urtikária a iné vnútorné zápalové choroby.

Zlúčeniny podľa vynálezu možno podávať konvenčným spôsobom orálne alebo parenterálne (subkutánne, intravenózne, intramuskuláme, intraperitoneálne, rektálne). Podanie sa tiež môže uskutočniť prostredníctvom pár alebo sprejov cez priestor nosohltanu.

Dávkovanie závisí od veku, stavu a váhy pacienta a od režimu podávania. Spravidla denná dávka účinnej látky na osobu je asi 10 - 2000 mg pri orálnom podaní a asi 1 -

- 200 mg pri parenterálnom podaní. Túto dávku možno podať v 2 až 4 jednotlivých dávkach alebo raz denne ako zásobnú formu.

Tieto zlúčeniny možno použiť v konvenčných tuhých alebo kvapalných farmaceutických formách, napr. ako nepoťahované alebo poťahované tablety, kapsuly, prášky, granuly, supozitóriá, roztoky, masti, krémy alebo spreje. Tieto sa vyrábajú konvenčným spôsobom. Účinné látky možno na tento účel miešať s konvenčnými farmaceutickými pomocnými látkami, ako sú napríklad tabletové spojivá, napučiavacie činidlá, konzervačné látky, dezintegrátory tabliet, regulátory toku, plastifikátory, zmáčacie činidlá, disperzanty, emulzifikátory, rozpúšťadlá, činidlá spoma ľujúce uvoľňovanie, antioxidanty a/alebo výtlačné plyny (porovnajte H. Sucker a kol.: Pharmazeutische Technológie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978).

Takto získané liekové formy bežne obsahujú od 0,1 do 99 % hmotnostných účinnej látky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Experimentálna časť

Zlúčeniny vzorca (I) možno pripraviť tak, ako je uvedené na schémach I - III.

Komponenty A, B, E a D sa výhodne zostavia osobitne vopred a použijú sa vo vhodne chránenej forme (pozrite schému I - III).

Schéma I

(P = chrániaca skupina, (P) = chrániaca skupina alebo H)

Schéma I opisuje lineárne zostavenie molekuly I spojením amínu H-D-CN s N-chránenou aminokyselinou P-E-OH, čím sa získa P-E-D-CN, odstránením chrániacej skupiny N-konca, čím sa získa H-E-D-CN, spojením s N-chránenou aminokyselinou P-B-OH, čím sa získa P-B-E-D-CN, odstránením chrániacej skupiny P, čim sa získa H-B-E-D-CN, následnou alkyláciou nechráneným alebo chráneným komponentom (P)-A-U (U = odchádzajúca skupina) alebo redukčnou alkyláciou s (P)-A’-U (U = aldehyd, ketón) alebo Michaelovou adíciou s vhodným derivátom (P)-A“-C=C-, čím sa získa (P)-A-B-E-D-CN. Konverzia nitrilovej skupiny na amidínovú prebieha buď klasickou Pinnerovou syntézou (R. Boder, D.G. Neilson, Chem. Rev. 61 (1962) 179) alebo modifikovanou Pinnerovou syntézou, ktorá prebieha cez iminotioesterové soli ako intermediáty (II. Vieweg a kol., Pharmazie 39 (1984) 226) alebo priamo metódou A. Eschenmosera, Helv. Chimica Acta 69 (1986) 1224. Následne sa chrániace skupiny ešte prítomné v molekule odstránia, výhodne kyselinovou hydrolýzou.

Ak je komponent D do syntézy zapojený ako H-D-CONH₂, dehydratácia amidu na nitril alebo konverzia na tioamidové funkcie prebieha na jednom z chránených intermediátov. Ako alternatívu možno komponent D použiť v syntéze ako H-D-CSNH₂.

kyláciou, redukčnou amináciou [sic] alebo Michaelovou adíciou H-B-P na vhodne chránené komponenty A, čim sa získa (P)-A-B-OH, spojením s [sic] H-E-P za vzniku (P)-A-B-E-P, odstránením chrániacej skupiny konca C za vzniku (P)-A-B-E-OH, spojením s H-D-CN za vzniku (P)-A-E-C-D-CN a reakciou tohto intermediátu za vzniku konečného produktu podľa schémy I.

Keď zlúčeniny (P)-A-B-P ešte majú voľnú NH funkciu na B, táto musí byť vybavená vhodnou chrániacou skupinou skôr, ako sa odstráni chrániaca skupina konca C. Chrániace skupiny použité v každom prípade musia byť navzájom ortogonálne.

Ako alternatívu pre komponent H-D-CN je tiež možné použiť H-D-CONH₂, H-D-CSNH,, H-D-C(NH)NH₂, H-D-C(NP)NH₂, H-D-C (NP)NHP, pričom spojený intermediát (P)-A-B-E-D-CONH₂ v prvom prípade sa dehydruje na (P)-A-B-E-D-CN alebo sa priamo konvertuje na (P)-A-B-E-D-CSNH₂.

Schéma III

A B B D

				'''NH. x-S-Alkyl
				NH
				nh2

Schéma III opisuje veľmi efektívny spôsob na prípravu zlúčenín I konvergentnou syntézou. Vhodne chránené komponenty (P)-A-B-OH a H-E-D-CN sa navzájom spoja a získaný intermediát (P)-A-B-E-D-CN sa nechá zreagovať za vzniku konečného produktu podľa schémy I.

Ako alternatívu H-E-D-CN možno tiež použiť H-E-D-CONH₂ alebo H-E-D-CSNH₂ a v prvom prípade sa spojený intermediát (P)-A-B-E-D-CONH₂ dehydruje na (P)-A-B-E-D-CN alebo konvertuje na (P)-A-B-E-D-CSNII₂.

Používané chrániace skupiny N konca sú Boe, Cbz alebo Fmoc, výhodne Boe, a chrániace skupiny C konca sú metyl, terebutyl a benzyl. Ak je v molekule prítomných viacero chrániacich skupín, musia byť navzájom ortogonálne, ak sa nemajú odstraňovať súčasne. Ak intermediáty obsahujú komponent E, Cbz a benzyl sú ako chrániace skupiny nevhodné.

SK 284915 Β6

Požadované reakcie spájania a ďalšie reakcie zavádzania a odstraňovania chrániacich skupín sa vykonávajú za štandardných podmienok peptidovej chémie (pozrite M. Bodanszky, A. Bodanszky „The Practice of Peptide Synthesis“, 2nd edition, Springer Verlag Hcidelberg, 1994).

Chrániace skupiny Boe sa odstraňujú pomocou dioxánu/HCl alebo TFA/DCM a chrániace skupiny Cbz sa odstraňujú hydrogenolýzou alebo pomocou HF. Hydrolýza esterických skupín prebieha pomocou LiOH v alkoholickom rozpúšťadle alebo v dioxáne/vode. TFA alebo dioxán/HU [sic] sa používa na štiepenie t-butyl esterov.

Reakcie sa kontrolovali pomocou TLC bežne pomocou nasledujúcich mobilných fáz:

A. DCM/MeOH 95: 5

B. DCM/MeOH 9 :1

C. DCM/MeOH8:2

D. DCM/MeOH/50 % HOAc 40 : 10 :5

E. DCM/MeOH/50 % HOAc 35 : 15 :5

Kde sa spomínajú separácie pomocou stĺpcovej chromatografie, ide o separácie na silikagéli s použitím uvedených mobilných fáz.

HPLC separácie na reverznej fáze sa uskutočnili pomocou zmesi acetonitril/voda a tlmivého roztoku HOAc.

Východiskové zlúčeniny možno pripraviť nasledujúcimi metódami:

Príkladmi stavebných komponentov A použitých na alkyláciu sú terebutyl α-brómacctát, terebutyl β-brómpropionát, terebutyl α-brómpropionát, terebutyl γ-brómbutyrát, terebutyl α-brómbutyrát, THP-chránený brómetanol, THP-chránený γ-brómpropanol, a-bróm-y-butyrolaktón, na redukčnú amináciu sú dihydroxyacetón, diterebutyl acetóndikarboxylát, a na Michaelovu adíciu sú terebutyl akrylát, terebutyl metakrylát, diterebutyl fumarát. Tie z uvedených terebutyl esterov, ktoré nie sú komerčne dostupné, sú pripravené metódami podobnými G. Uray, W. Lindner, Tetrahedron, 44 1988 4357-4362.

Komponenty B:

V literatúre je k dispozícii široké spektrum možnosti na všeobecnú a špecifickú syntézu aminokyselín. Prehľad je medzi iným uvedený v Houben-Weyl, zväzok E16d/Part 1, strany 406 a nasl.

Prekurzory, ktoré sa často používali, boli etylester kyseliny benzofenónimínoctovej [sic], dietyl acetamidomalonát a etyl izonitrilacetát [sic].

Rôzne glycínové a alanínové deriváty boli pripravené napríklad vychádzajúc z etyl izonitrilacetátu [sic] a vhodného ketónu alebo aldehydu (pozrite H.-J. Prätorius, J. Flossdorf, M.-R. Kula Chem. Ber. 108 (1975) 3079).

Syntézy cyklooktylglycínu, 2-norbornylglycínu, adamantylalanínu, y-metyleyklohexylalanínu, 4-izopropyl-1-cyklohexylalanínu, 4-metyl-l-cyklohexylalanínu a 4-metyl-l-cyklohexylglycínu sa uskutočnili cez zodpovedajúce etyl 2-formylaminoakryláty (U. Schollkopf a R. Meyer, Liebigs Ann. Chem. 1977, 1174) vychádzajúc z etyl izokyanoacetátu s relevantnými karbonylovými zlúčeninami - cyklooktanón, 2-norbomanón, 1-formyladamantán, 1-formyl-l-metylcyklohexán, l-formyl-4-izopropylcyklohexán, 1 -formyl-4-metylcyklohexán a 4-metyl-cyklohexanón - nasledujúcimi všeobecnými metódami:

Všeobecná metóda na syntézu etyl 2-formylaminoakrylátov

Roztok 100 mmol etyl izokyanoacetátu v 50 ml THF sa po kvapkách pridal do 100 mmol terebutoxidu draselného v 150 ml THF pri 0 až -10 °C. Po 15 minútach pri rovnakej teplote sa pridalo 100 mmol príslušnej karbonylovej zlúčeniny v 50 ml THF, reakčná zmes sa nechala pomaly ohriať na teplotu miestnosti a rozpúšťadlo sa odparilo na rotačnej odparke. Zvyšok sa zmiešal s 50 ml vody, 100 ml kyseliny octovej a 100 ml DCM a produkt sa extrahoval do DCM. Fáza DCM sa vysušila nad Na₂SO₄ a rozpúšťadlo sa odparilo na rotačnej odparke. Produkty sa získali takmer čisté, ale v prípade potreby ich možno ďalej vyčistiť stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (mobilné fázy: zmesi éter/petroléter).

Všeobecná metóda na hydrochloridy aminokyselín vychádzajúc z etyl 2-formylaminoakrylátov

100 mmol etyl 2-formylaminoakryIátu sa hydrogenovalo pomocou Pd/C (10 %) a vodíka v 200 ml ľadovej kyseliny octovej až do skončenia reakcie. Katalyzátor sa potom odfiltroval, kyselina octová bola čo najviac odparená v rotačnej odparke a zvyšok sa refluxoval v 200 ml 50 %-nej koncentrovanej kyseline chlorovodíkovej 5 hodín. Kyselina chlorovodíková sa odparila v rotačnej odparke a produkt sa vysušil pri 50 °C za zníženého tlaku a potom sa niekoľkokrát premyl éterom. Hydrochloridy sa získali vo forme svetlo sfarbených kryštálov.

25,0 g cyklooktylglycín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc z 18,9 g (150 mmol) cyklooktanónu. 26,6 g 2-norbomylglycín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc zo

16,5 g (150 mmol) 2-norbomanónu. 26,0 g adamantylalanín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc z 19,7 g (120 mmol) 1-formyladamantánu. 16,6 g y-metylcyklohexylalanín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc z 12,6 g (100 mmol) 1-formyl-l-metyl-cyklohexánu. 25,9 g 4-metylcyklohexylglycín hydrochloridu sa získalo zo 16,8 g (150 mmol) 4-mctylcyklohexanónu. 18 g trans-4-metyl-l-cyklohexylalanín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc z 15 g trans-l-formyl-4-metylcyklohexánu. 10 g 3,3-dimetyl-1-cyklohexylalanín hydrochloridu sa získalo vychádzajúc z 9 g 3,3-dimetyl-l-formylcyklohexánu.

Aldehyd - 1 -formyl-3,3-dimetylcyklohexán - potrebný na syntézu bol pripravený spôsobom založeným na metódach Moskala a Lensena (Rec. Tráv. Chim. Pays-Bas 106 (1987) 137 - 141).

Roztok n-butyllítia v n-hexáne (72 ml, 115 mmol) sa po kvapkách pridal v priebehu 10 minút do miešaného roztoku dietyl izokyanometylfosfonátu (17 ml, 105 mmol) v 280 ml bezvodého dietyléteru pri -60 °C. Získaná suspenzia sa potom miešala pri -60 °C 15 minút a v priebehu 10 minút sa pridal roztok 3,3-dimetylcyklohexanónu (13 g, 105 mmol) v 100 ml bezvodého dietyléteru, pričom teplota sa udržiavala pod -45 °C. Teplota reakčnej zmesi sa nechala vystúpiť na 0 °C a po miešaní pri tejto teplote počas 90 minút sa opatrne pridalo 150 - 200 ml 38 %-nej vodnej kyseliny chlorovodíkovej. Zmes sa intenzívne miešala pri teplote miestnosti počas 15 hodín, aby sa dokončila hydrolýza. Organická fáza sa oddelila a premyla 200 ml vody, nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nasýteného roztoku chloridu sodného. Vysušila sa nad síranom horečnatým, prefiltrovala a nakoncentrovala v rotačnej odparke. Získaný zvyšok sa použil bez ďalšieho čistenia ako východisková látka na syntézu aminokyseliny.

Boc-(D)-a-metylcyklohexylalanín

3,4 g (12,2 mmol) Boc-(D)-a-metyl-Phe-OH sa hydrogenovalo v 100 ml MeOH v prítomnosti 250 mg 5 % Rh na A1₂O₃ pod 10 bar vodíka pri 50 °C počas 24 hodín. Filtráciou a odparením rozpúšťadla sa získalo 2,8 g Boc-(D)-ct-metyl-Cha-OH.

'H-NMR (DMSO-d⁶, δ v ppm): 12 (veľmi široký signál, COOH); 1,7-0,8 (25 H; 1,35 (s, Boe), 1,30 (s, Me))

Boc-(3-Ph)-Pro-OH bol syntetizovaný spôsobom podobným metóde J. Y. L. Chunga a kol. (J .Y. L. Chung a kol. J. Org. Chem. 55(1990)270).

Príprava Boc-1 -tetralinylglycínu

Boc-1-Tetralinylglycín bol pripravený vychádzajúc z

1.2- dihydronaftalénu. 1,2-dihydronaftalén bol najprv konvertovaný na 1-tetralylbromid pomocou HBr (podobne ako J. Med. Chem. 37 (1994) 1586). Bromid následne reagoval s dietyl acetamidomalonátom a po hydrolytickom štiepení sa získaná α-aminokyselina za štandardných podmienok konvertovala na Boc-chránenú formu. Ďalšiu možnú prípravu opísali E. Reimann a D. Voss (E. Rcimann, D. Voss, Árch. Pharm. 310 (1977) 102).

Príprava Boc-l-(D,L)Tic-OH

Boc-l-(D,L)Tic-OH bol pripravený metódou R. T. Shumana a kol. (R. T. Shuman a kol. J. Med. Chem. 36 (1993)314).

Príprava Boc-(D,L)Dch-OH

Boc-(D,L)-Dpa-OH (1 mmol) bol hydrogenovaný v 12 ml MeOH spolu s katalytickými množstvami 5% Rh/Al₂O₃ pod tlakom 5 bar. Filtráciou a odstránením rozpúšťadla za zníženého tlaku sa získal produkt v kvantitatívnom výťažku.

Príprava cykloheptylglycínu, cyklopentylglycinu, 4-izopropylcyklohexylglycínu a 3,3-dimetylcyklohexylglycínu

Tieto aminokyseliny boli pripravené reakciami cykloheptanónu, cyklopentanónu, 4-izopropylcyklohexanónu a

3.3- dimetylcyklohexanónu s etyl izonitrilacetátom [sic] metódou H. J. Prätoriusa (H. J. Prätorius, J. Flossdorf, M. Kula, Chem. Ber. 108 (1985) 3079).

Príprava H-D,L-Chea-OH

4,0 g cykloheptylmetyl metánsulfonátu (19,39 mmol), pripraveného z cykloheptylmetanolu a metánsulfonyl chloridu, sa spolu refluxovali so 4,9 g etylesteru benzofenónimínglycinu [sic] (18,47 mmol), 8,9 g suchého, jemne práškového uhličitanu draselného (64,65 mmol) a 1 g tetrabutylamónium bromidu (3 mmol) v 50 ml suchého acetonitrilu pod atmosférou inertného plynu počas 10 hodín. Uhličitan draselný sa potom odfiltroval, filtrát sa odparil dosucha a surový produkt sa priamo hydrolyzoval 20 ml 2 N kyseliny chlorovodíkovej v 40 ml etanolu s miešaním pri teplote miestnosti počas 1,5 hodiny. Reakčný roztok sa zriedil a benzofenón sa potom extrahoval etylacetátom za kyslých podmienok a potom sa extrahoval H-D,L-Chea-OEt dichlórmetánom v alkalickom prostredí (pH = 9) a roztok sa vysušil nad síranom horečnatým a nakoncentroval na rotačnej odparke. Výťažok 3,7 g = 95 % teoretickej hodnoty.

Boc-(D,L)-(3,4,5-(MeO)₃)Phe-OH bol pripravený alkyláciou etylesteru benzofenóniminglycínu [sic] trimetoxybenzyl chloridom, následným zavedením chrániacej skupiny Boe a hydrolýzou esteru.

D-(l,4-Cyklohexadien-l-yl)ala-OH [sic] bol pripravený metódou podľa G. Zivilichovsky, V. Gurvich J. Chem. Soc., Perkin Trans I 19 (1995) 2509-15.

H-(D,L)-P3-Me₂Cha-OH bol pripravený metódou podľa U. Schollkopf, R. Meyer, L. Ann. Chem. (1977) 1174 -82.

Uvedené aminokyseliny boli konvertované pomocou diterebutyl dikarbonátu v zmesi voda/dioxán konvenčnými metódami na Boc-chránenú formu v každom prípade a potom rekryštalizované zo zmesí etylacetát/hexán alebo čiste né stĺpcovou chromatografiou na silikagéli (mobilné fázy: zmesi etylacetát/'petroléter).

Boc-chránené aminokyseliny boli použité ako stavebné komponenty B podľa schémy I.

Uvedené aminokyseliny ako stavebné komponenty B boli tiež v niektorých prípadoch konvertované na príslušné benzylestery a pripojené na vhodne chránené stavebné komponenty A. V prípade zlúčenín s funkciou N-H, ktorá bola ešte voľná, táto bola potom chránená skupinou Boe, benzylesterová skupina sa odstránila hydrogenáciou a stavebný komponent A-B-OH sa vyčistil kryštalizáciou, vyzrážaním soli alebo stĺpcovou chromatografiou. Tento prístup je opísaný na príklade tBuOOC-CH₂-(Boc)(D)Cha-OH.

Syntéza benzylesteru D-cyklohexylalanínu

Suspenzia 100 g (481 mmol) D-cyklohexylalanín hydrochloridu, 104 g (962 mmol) benzylalkoholu a 109,7 g (577 mmol) monohydrátu kyseliny p-toluénsulfónovej v 2200 ml toluénu sa pomaly zahrievala na reflux so separátorom vody. Vývoj chlorovodíka a rozpúšťanie suspenzie za vzniku číreho roztoku sa pozorovali v teplotnom rozsahu 80 - 90 °C. Keď sa už neoddeľovala žiadna ďalšia voda (asi po 4 hodinách), oddestilovalo sa 500 ml toluénu, reakčná zmes sa nechala cez noc vychladnúť a získaný zvyšok sa odfiltroval a dvakrát premyl po 1000 ml hexánu. Získaný zvyšok (195 g) sa potom suspendoval v 2000 mi dichlórmetánu a po pridaní 1000 ml vody sa jeho pH upravilo na 9 - 9,5 postupným pridávaním 50 % roztoku hydroxidu sodného počas miešania. Organická fáza sa oddelila, premyla dvakrát po 500 ml vody, vysušila nad síranom sodným a prefiltrovala, aby sa odstránilo sušidlo, a nakoncentrovaním filtrátu sa získalo 115 g (94 %) titulného produktu vo forme svetlého oleja.

Benzylester N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-D-cyklohcxylalanínu [sic]

115 g (440 mmol) benzylesteru D-cyklohexylalanínu sa rozpustilo v 2000 ml acetonitrilu a pri teplote miestnosti sa pridalo 607,5 g (4,40 mol) uhličitanu draselného a 94,3 g (484 mmol) terebutyl brómacetátu a zmes sa miešala pri tejto teplote 3 dni. Uhličitan sa odfiltroval, premyl acetonitrilom, získaný roztok sa nakoncentroval (30 °C, 20 mbar), zvyšok sa rozpustil v 1000 ml metyl terebutyl éteru a organická fáza sa extrahovala 5 % kyselinou citrónovou a nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáza sa vysušila nad síranom sodným, filtráciou sa odstránilo sušidlo, nakoncentrovala sa a získaný olej (168 g) sa použil priamo v nasledujúcej reakcii.

Benzyl ester N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-D-cyklohexylalanínu [sic]

Olej (168 g, 447 mmol) získaný v predchádzajúcej syntéze sa rozpustil v 1400 ml acetonitrilu a po pridaní 618 g (4,47 mmol) práškového uhličitanu draselného a

107,3 g (492 mmol) diterebutyl dikarbonátu sa miešal pri teplote miestnosti 6 dní. Uhličitan draselný sa odsal, premyl asi 1000 ml acetonitrilu a filtrát sa nakoncentroval. Získalo sa 230 g požadovaného produktu.

Cyklohexylamóniová soľ N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-D-cyklohexylalanínu [sic]

115 g benzylesteru N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-D-cyklohexylalanínu [sic] sa rozpustilo v 1000 ml čistého etanolu a hydrogenovalo sa v prítomnosti 9 g 10 % Pd na aktívnom uhlí vodíkom pri atmosférickom tlaku a teplote 25 - 30 °C počas 2 hodín. Filtráciou a odstránením rozpúšťadla v rotačnej odparke sa získalo 100 g (260 mmol) žltého oleja, ktorý sa rozpustil v 1600 ml acetónu a zahrieval sa na reflux. Zahrievací kúpeľ sa odstránil a cez prikvapkávací lievik sa rýchlo pridal roztok 27 g (273 mmol) cyklohexylamínu v acetóne. Požadovaná soľ vykryštalizovala pri chladnutí reakčnej zmesi na teplotu miestnosti. Tuhá látka sa odfiltrovala, premyla 200 ml acetónu a v rámci konečného čistenia sa ešte raz prekryštalizovala z acetónu. Vysušením zvyšku vo vákuovej peci pri asi 30 °C sa získalo 70,2 g požadovanej soli vo forme bieleho prášku.

Cyklohexylamóniová soľ N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-D-cyklohexylglycinu [sic] bola pripravená podobným spôsobom z cyklohexylglycínu ako prekurzora.

Cyklohexylamóniová soľ N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonyletylén)-D-cyklohexylalanínu [sic]

a) tercbutyl 3-brómpropionát

16,64 g (109 mmol) kyseliny brómpropiónovej, 150 ml kondenzovaného 2-metylpropénu a 2 ml koncentrovanej kyseliny sírovej sa umiestnili pri -30 °C pod protiprúdom dusíka do sklenej nádoby vhodnej ako autokláv, tesne sa uzavreli a miešali pri teplote miestnosti počas 72 hodín. Pri spracovaní sa reakčná nádoba znova ochladila na -30 °C a roztok sa opatrne nalial do 200 ml ľadovo studeného nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Nadbytočný 2-mctylpropcn sa nechal odpariť počas miešania, zvyšok sa extrahoval trikrát po 50 ml dichlórmetánu, spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným, sušidlo sa odfiltrovalo a roztok sa nakoncentroval pod vákuom vodnej vývevy. Olejovitý zvyšok sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou (mobilná fáza n-hexán, neskôr n-hexán/dietyléter 9:1). Získalo sa 18,86 g titulnej zlúčeniny.

b) Benzylester N-(tercbutyloxykarbonyletylén)-D-cyklohexylalanín [sic]

49,4 g (189 mmol) benzyl esteru D-cyklohexylalanínu sa rozpustilo v 250 ml acetonitrilu a po pridaní 31,6 g (151 mmol) tercbutylbrómpropionátu pri teplote miestnosti sa refluxovalo 5 dní. Získaná zrazenina sa odfiltrovala a premyla niekoľkokrát acetonitrilom, filtrát sa nakoncentroval pod vákuom vodnej vývevy, zvyšok sa rozpustil v 350 ml dichlórmetánu a organická fáza sa extrahovala 5 % kyselinou citrónovou a nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného. Organická fáza sa vysušila nad síranom sodným, sušidlo sa odstránilo filtráciou a roztok sa nakoncentroval. Olejovitý zvyšok sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou (mobilná fáza dichlórmetán, neskôr dichlórmetán/metanol 95 : 5). Získal sa mierne znečistený olej, ktorý sa priamo použil v nasledujúcej reakcii.

c) Benzylester N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonyletylén)-D-cyklohexylalanínu [sic]

Olej získaný v predchádzajúcej syntéze (30 g, max. 70 mmol) sa rozpustil v 150 ml acetonitrilu a po pridaní 28 ml (160 mmol) diizopropyletylaminu a 19,2 g (88 mmol) ditercbutyldikarbonátu sa miešal pri teplote miestnosti počas 3 dní. Reakčná zmes sa nakoncentrovala v rotačnej odparke pod vákuom vodnej vývevy, zvyšok sa rozpustil v n-hexáne a premyl päťkrát po 3 ml 5 % kyseliny citrónovej, spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným, sušidlo sa odfiltrovalo a zvyšok bol po nakoncentrovaný separovaný stĺpcovou chromatografiou (mobilná fáza hexán/etylacetát 95 : 5). Získalo sa 32,66 g (64 mmol) požadovaného produktu.

d) Cyklohexylamóniová soľ N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonyletylén)-D-cyklohexylalanínu [sic]

32,66 g (64 mmol) benzylesteru N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonyletylén)-D-cyklohexylalanínu [sic] sa rozpustilo v 325 ml čistého etanolu a hydrogenovalo sa vodíkom pod atmosférickým tlakom pri teplote 25 - 30 °C v prítomnosti 3 g 10 % Pd na aktívnom uhlí počas 14 hodín. Filtráciou roztoku cez Celíte*, premytím etanolom a odstránením rozpúšťadla na rotačnej odparke sa získalo 26,7 g žltého oleja, ktorý sa rozpustil v acetóne a zahrieval sa na reflux. Zahrievací kúpeľ sa odstránil a cez prikvapkávací lievik sa rýchlo pridal roztok 7 g (70 mmol) cyklohexylamínu v acetóne. Požadovaná soľ vykryštalizovala pri chladnutí reakčnej zmesi na teplotu miestnosti. Tuhá látka sa odfiltrovala, premyla 25 ml acetónu a v rámci konečného čistenia sa ešte raz prekryštalizovala z acetónu. Vysušením zvyšku vo vákuovej peci pri 30 °C sa získalo 26,6 g (54 mmol) požadovanej soli vo forme bieleho prášku.

N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolín [sic]

a) N-Boc-Pyr-OH (5 g, 23,45 mmol) sa rozpustil v MeOH (50 ml) a pridala sa HC1 v dioxáne (4 N, 30 ml). Po refluxovaní počas 12 h sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a ako produkt sa získal H-Pyr-OMe hydrochlorid. Výťažok: 3,84 g (100%).

b) N-(t-Bu0₂C-CH₂)-N-Boc-(D)-Cha-OH (8 g,

20,75 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (75 ml) a pri -10 °C sa pridal etyl diizopropylamín (15,5 mi, 89,24 mmol). Po miešaní pri tejto teplote počas 5 minút sa po kvapkách pridal roztok H-Pyr-OMe hydrochloridu (3,4 g, 20,75 mmol) v dichlórmetáne (25 ml). Potom sa pridal po kvapkách roztok anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (50 %, 20 ml, 26,96 mmol) a zmes sa miešala pri -10 až 0 °C počas 2 hodín. Zmes sa zriedila dichlórmetánom a premyla nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x 80 ml), 5 % roztokom kyseliny citrónovej (2x15 ml) a nasýteným roztokom chloridu sodného (1 x 20 ml). Organická fáza sa vysušila nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke. Surový produkt sa vyčistil flash chromatografiou (silikagél, dichlórmetán/metanol = 95/5). Výťažok = 6,2 g (60 %).

c) N-(t-BuO₂C-CH₂)-N-Boc-(D)-Cha-Pyr-OMe (5,5 g, 11,12 mmol) sa rozpustil v dioxáne (40 ml) a po pridaní roztoku hydroxidu sodného (1 N, 22,2 ml, 22,24 mmol), sa miešal pri teplote miestnosti počas 2hodin. Dioxán sa odstránil na rotačnej odparke a vodná fáza sa premyla etylacetátom a okyslila sa na pH 1 - 2 roztokom hydrogensíranu draselného (20 %). Vodná fáza sa extrahovala dichlórmetánom a spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným. Výťažok: 5 g (94 %) bezfarebnej peny. Rekryštalizáciou z n-hexánu nasýteného vodou sa získali bezfarebné kryštály (t. t. = 158-160 °C).

N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolín [sic]

Táto zlúčenina bola získaná podobným spôsobom z N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycínu [sic] a metylesteru 3,4-dehydroprolínu.

(L)3,4-Dehydroprolín používaný ako stavebný komponent E možno kúpiť a kyselinu (D,L)-4,5-dehydropipe-kolovú možno pripraviť metódou podľa A. Burgstahler, C. E. Aiman, J. Org. Chem. 25 (1960) 489 alebo C. Herdeis, W. Engel Árch. Pharm. 326 (1993) 297 a následne konvertovať pomocou (Boc)₂O na Boc-(D,L)-Dep-OH.

Stavebné komponenty D boli syntetizované nasledovne:

-Aminometyl-2-kyanotiofén

Príprava tohto stavebného komponentu sa uskutočnila podľa opisu vo WO 95/23609.

4-Aminometyl-2-kyanotiofén

a) 2-Bróm-4-formyltiofén g (320 mmol) 3-formyltiofénu sa rozpustilo v 600 ml dichlórmetánu a ochladilo sa na 5 °C, po častiach sa pridalo 100 g (750 mmol) chloridu hlinitého a reakčná zmes sa potom refluxovala. Roztok 59 g (19 ml, 360 mmol) brómu v 40 ml dichlórmetánu sa pridal po kvapkách v priebehu 45 minút a reakcia sa nechala pokračovať pod refluxom 4 hodiny. Po ochladení sa reakčný roztok vylial do 600 g ľadovej vody a extrahoval sa dichlórmetánom a organická fáza sa premyla nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vysušila nad síranom horečnatým a nakoncentrovala na rotačnej odparke. Získalo sa 64,5 g surového produktu, ktorý sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou (silikagél, dichlórmetán/petroléter), čim sa získalo celkom

56,5 g mierne znečisteného produktu.

b) 2-Kyano-4-formyltiofén

7,6 g (85 mmol) kyanidu med’ného sa pridalo do roztoku 13,53 g (70,82 mmol) 2-bróm-4-formyltiofénu v 25 ml DMF a reakčná zmes sa refluxovala 3,5 hodiny, počas ktorých sa pôvodne svetlozelená suspenzia zmenila na čierny roztok. Po pridaní vody sa reakčná zmes niekoľkokrát extrahovala etylacetátom, organické fázy sa spojili, premyli nasýteným roztokom NaCl, vysušili nad síranom sodným a nakoncentrovali v rotačnej odparke pod miernym vákuom. Pridaním éteru do zvyšku (7 g) sa získalo 1,6 g čistého produktu. Kryštalizačný roztok sa vyčistil spolu so surovými produktmi z iných várok chromatografiou (silikagél, dichlórmetán/petroléter 1 : 1). Na reakcie sa použilo celkom

56,5 g 2-bróm-4-formyltiofénu a získalo sa 12,6 g čistého 2-kyano-4-formyltiofénu (31 % výťažok).

c) 2-Kyano-3-hydroxymetyltiofén

3,47 g (91,8 mmol) bórhydridu sodného sa pridalo po častiach do suspenzie 12,6 g (91,8 mmol) 2-kyano-4-formyltiofénu v 200 ml etanolu a reakčná zmes sa miešala pri teplote miestnosti počas 2 hodín, počas ktorých postupne vytvorila číry roztok. Zvyšok sa po nakoncentrovani za zníženého tlaku rozpustil v etylacetáte a premyl postupne nasýteným roztokom NaCl, 5 % kyselinou citrónovou a nasýteným roztokom NaCl a organická fáza sa vysušila síranom sodným a nakoncentrovala za zníženého tlaku, čim sa získalo 11,7 g takmer čistého produktu (výťažok 91,5 %).

d) 3-Brómmetyl-2-kyanotiofén

11,7 g (84,07 mmol) 2-kyano-3-hydroxymetyltiofénu sa rozpustilo spolu s 24,1 g (91,87 mmol) trifenylfosflnu v 100 ml THF pri teplote miestnosti a s chladením (ľadový kúpeľ) sa po častiach pridalo 30,47 g (91,87 mmol) tetrabrómmetánu. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 3 hodín nasledovalo nakoncentrovanie za zníženého tlaku a čistenie chromatografiou na silikagéli (dichlórmetán/petroléter), čím sa získalo 18,8 g svetložltého kryštalického produktu obsahujúceho petroléter.

e) 4-N,N-Bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-2-kyanotiofén

18,81 g 3-brómmetyl-2-kyanotiofénu (surový produkt, maximum 84,07 mmol) sa rozpustilo v 160ml THF a ochladilo na 5 °C a po častiach sa pridalo 3,07 g (102,4 mmol) 80% suspenzie hydridu sodného. Potom sa po kvapkách pridalo 22,25 g (102,4 mmol) ditercbutyliminodikarboxylátu rozpusteného v 160 ml THF pri 5 °C a zmes sa potom miešala pri teplote miestnosti cez noc. Keďže podľa TLC bola konverzia neúplná, zmes sa zahrievala na 30 - 35 °C počas 4,5 hodiny. Po ochladení na 0 - 5 °C sa pomaly po kvapkách pridalo 33 ml nasýteného roztoku chloridu amónneho, THF sa oddestiloval za zníženého tlaku, zvyšok sa niekoľkokrát extrahoval etylacetátom a etylacetátové fázy sa premyli nasýteným roztokom NaCl, vysušili nad síranom sodným a nakoncentrovali v rotačnej odparke. Viskózny červený zvyšok (34,61 g) sa použil ako surový produkt v nasledujúcej reakcii.

f) 4-Aminometyl-2-kyanotiofén hydrochlorid

34,61 g 4-N,N-bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-2-kyanotiofénu (surový produkt, maximum 84,07 mmol) sa rozpustilo v 600 ml etyl acetátu, ochladilo na 0 - 5 °C, nasýtilo plynným HCl a zahrialo na teplotu miestnosti. Po 3 hodinách sa získaná suspenzia nakoncentrovala v rotačnej odparke a niekoľkokrát sa predestilovala spolu s dichlórmetánom a zvyšok sa extrahoval miešaním s éterom a vysušil za zníženého tlaku. Získalo sa 13,85 g produktu ako svetlý prášok. Výťažok za dva stupne 94,3 %.

2-Aminometyl-4-kyanotiofén

a) 4-Kyanotiofén-2-karbaldehyd

49,3 g (258,05 mmol) 4-brómtiofén-2-karbaldehydu a

27,8 g (310,41 mmol) kyanidu meďného sa suspendovali v 130 ml absolútneho DMF a refluxovali sa 8 hodín. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke pri 40 °C a zvyšok sa suspendoval v etylacetáte a preniesol sa do Soxhletovho [sic] prístroja. Tento zvyšok sa extrahoval cez noc, žltý roztok sa vysušil nad síranom sodným, nakoncentroval na rotačnej odparke a získaná žltá tuhá látka sa rekryštalizovala z éteru, čím sa získalo 25,3 g produktu (80 % teoretickej hodnoty).

b) 4-Kyanotiofén-2-karbaldehyd oxím

11,6 g (84,6 mmol) 4-kyanotiofcn-2-karbaldehydu sa rozpustilo v 140 ml metanolu a pridalo sa 12,3 g (116,1 mmol) uhličitanu sodného. Potom sa po častiach pridalo 6,5 [lacuna] (93,5 mmol) hydroxylamín hydrochloridu s chladením na 15 °C a zmes sa miešala pri 10 °C počas 2 hodín. Po pridaní 80 ml vody sa reakčná zmes extrahovala päťkrát po 50 ml dietyléteru, organická fáza sa vysušila nad síranom sodným a rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku, čím sa získalo 12,5 g požadovaného produktu vo forme žltého kryštalického prášku (96 % teoretickej hodnoty).

c) 2-Aminometyl-4-kyanotiofén hydrochlorid

11,22 g (171,64 mmol) jemného zinkového prachu sa opatrne pridalo po niekoľkých malých častiach do roztoku 4,65 g (30,60 mmol) 4-kyanotiofén-2-karbaldehyd oximu v 50 ml kyseliny trifluóroctovej ochladenej na 0 - 5 °C takým spôsobom, že teplota neprekročila 15 °C. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 3 hodín a dekantácii od nadbytku zinku sa kyselina trifluóroctová väčšinou odstránila za zníženého tlaku (olejová výveva), ostávajúci olej sa ochladil na 0 °C a po častiach sa pridala zmes 150 ml 3 N roztoku hydroxidu sodného a 2 1 dichlórmetánu, ktorý bol ochladený na 0 °C. Nerozpustné podiely sa odstránili filtráciou a potom sa oddelila organická fáza, vodná fáza sa extrahovala osemkrát 20 ml dichlórmetánu, spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným a potom sa počas chladenia ľadom pridalo 20 ml 6 M metanolického roztoku kyseliny chlorovodíkovej. Produkt sa vyzrážal vo forme hydrochloridu ako biela tuhá látka a kryštalizácia sa dokončila chladením suspenzie na 4 °C cez noc. Získalo sa 2,2 g produktu vo forme bezfarebných ihličiek (50 % teoretickej hodnoty).

5-Aminometyl-3,4-dimetyltiofén-2-karboxamid hydrochlorid g (105,42 mmol) 5-kyano-3,4-dimetyltiofén-2-karboxamidu sa suspendovalo v 760 ml metanolu a 110 ml 2 N roztoku kyseliny chlorovodíkovej a po pridaní 9,5 g Pd na uhlíku (10 %) sa hydrogenovalo pri teplote miestnosti. Po spotrebovaní 4,7 1 vodíka (4 hodiny) sa metanol oddestiloval za zníženého tlaku a vodná fáza sa extrahovala trikrát etylacetátom a potom sa vysušila vymrazením. Získalo sa 16,3 g požadovaného produktu vo forme bielej tuhej látky (70,4 % teoretickej hodnoty).

5-Aminometylizoxazol-3-karboxamid

a) Etyl 5-chlórmetylizoxazol-3-karboxylát

21.2 g (210 mmol) trietylamínu sa po kvapkách pridalo do miešanej zmesi 30 g (198 mmol) etyl 2-chlór-2-hydroxyiminoacetátu a 150 ml propargylchloridu ochladenej na 10 - 15 °C a po miešaní pri teplote miestnosti počas 1 hodiny sa pridala voda, zmes sa extrahovala éterom a organická fáza sa vysušila nad síranom horečnatým a nakoncentrovala na rotačnej odparke. Zvyšok sa predestiloval pod tlakom 0,5 torr, pričom produkt destiloval v rozmedzí 116 - 122 °C.

b) Kyselina 5-chlórmetylizoxazol-3-karboxylová

47.3 g (250 mmol) etyl 5-chlórmetylizoxazol-3-karboxylátu v 150 ml etanolu sa zmiešalo so 14 g (250 mmol) hydroxidu draselného a zmes sa miešala pri 60 - 70 °C počas 6 hodín. Po ochladení a nakoncentrovaní za zníženého tlaku sa zvyšok rozpustil vo vode a extrahoval éterom, vodná fáza sa okyslila kyselinou chlorovodíkovou a potom sa extrahovala niekoľkokrát éterom. Éterová fáza sa vysušila nad síranom sodným a nakoncentrovala za zníženého tlaku (olejová výveva, 50 °C). Získalo sa 31 g požadovaného produktu (77 % teoretickej hodnoty).

c) 5-Chlórmetylizoxazol-3-karbonylchlorid

120 g (743 mmol) kyseliny 5-chlórmetylizoxazol-3-karboxylovej sa refluxovali spolu s 500 ml tionylchloridu a 2 kvapkami pyridínu počas 10 hodín, zmes sa nakoncentrovala za zníženého tlaku a potom sa predestilovala pod tlakom 20 ton. Produkt destiloval v rozmedzí 125 - 133 °C, čím sa získalo 78 g (58 % teoretickej hodnoty).

d) 5-Chlórmetylizoxazol-3-karboxamid

Amoniak sa zavádzal do roztoku 10 g (55,56 mmol) 5-chlórmetylizoxazol-3-karbonyl chloridu v 100 ml dichlórmetánu pri 10 - 15 °C počas 1 hodiny a zmes sa potom miešala pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Po ochladení roztoku na 0 °C sa zrazenina odsala a premyla sa troškou studeného dichlórmetánu a zvyšok sa extrahoval miešaním s vodou dvakrát, aby sa odstránili amóniové soli. Vysušením za zníženého tlaku sa získalo 6,58 g čistého produktu vo forme svetlého prášku (74 % teoretickej hodnoty).

e) 5-AminometylizoxazoI-3-karboxamid hydrochlorid

2,44 g (15,2 mmol) 5-chlórmetylizoxazol-3-karboxamidu sa pridalo do zmesi 100 ml koncentrovaného roztoku amoniaku a 72 ml metanolu, roztok sa zahrial na 40 °C a počas toho sa sústavne nasycoval plynným amoniakom. Prekurzor reagoval po 6 hodinách. Metanol sa odstránil za zníženého tlaku, vodná fáza sa extrahovala dvakrát dich lórmetánom a potom sa vodná fáza opatrne odparila dosucha za zníženého tlaku. Biely tuhý zvyšok sa použil ako surový produkt v reakcii spájania s Boc-dehydroprolínom.

2-Aminometyltiazol-4-tiokarboxamid sa pripravil podľa opisu G. Videnov, D. Kaier, C. Kempter a G. Jung, Angew. Chemie 108, (1996) 1604, odstránením chrániacej skupiny z N-Boc-chránenej zlúčeniny tam opísanej éterickou kyselinou chlorovodíkovou v dichlórmetáne.

4- Aminometyltiazol-2-tiokarboxamid

Prekurzor - etyl 4-aminometyltiazol-2-karboxylát - bol pripravený podľa opisu v americkom patente 4 826 816. Po zavedení chrániacej skupiny Boe na amínová funkciu sa esterická skupina hydrolyzovala, získaná kyselinová skupina sa konvertovala pomocou zmiešaného anhydridu (izobutylkarbonátu) na karboxamid a potom pomocou Lawessonovho činidla na tioamid. Odstránením chrániacej skupiny sa získala uvedená intermediátna zlúčenina.

5- Aminometyl-2-kyanofurán

a) 5-Kyanofurán-2-karbaldehyd:

165 ml (264 mmol) 1,6 mólového roztoku n-butyllítia v n-hexáne sa pridalo v priebehu 20 minút do roztoku 26,7 g (264 mmol) diizopropylamínu v 600 ml tetrahydrofuránu ochladeného na -78 °C. Roztok sa nechal ohriať na -20 °C, znova sa ochladil na -75 °C a pri tejto teplote sa pomaly po kvapkách pridal roztok 22,3 g (240 mmol) 2-kyanofuránu v 100 ml tetrahydrofuránu. Po miešaní počas 30 minút sa pomaly po kvapkách pridalo 93 ml dimetylformamidu a zmes sa miešala ďalších 30 minút. V rámci spracovania sa pridal roztok 40 g kyseliny citrónovej v 200 ml vody pri -70 °C. Po nakoncentrovaní v rotačnej odparke sa pridalo 600 ml nasýteného roztoku chloridu sodného a zmes sa extrahovala trikrát po 200 ml dietyléteru. Spojené organické extrakty sa vysušili nad síranom horečnatým. Sušidlo sa odfiltrovalo a rozpúšťadlo sa potom oddestilovalo za vákua vodnej vývevy a zvyšok sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou (mobilná fáza dichlórmetán). Eluát sa nakoncentroval a zvyšok sa predestiloval s parou (rozmedzie teplôt varu azeotropu s vodou: 60 - 65 °Cpri p = 0,1 mm Hg). Extrakciou destilátu dietyléterom, vysušením organickej fázy a nakoncentrovaním roztoku sa získalo 10,6 g (88 mmol, 36 %) titulnej zlúčeniny. 'H-NMR (270 MHz, d₆-DMSO): δ = 7,7 (d, 1 H), 7,8 (d, 1 H), 9,75 (s, 1 H).

b) 5-Hydroxymetyl-2-kyanofurán:

2,34 g (62 mmol) bórhydridu sodného sa pridalo po častiach do roztoku 30 g (0,25 mol) 5-kyanofurán-2-karbaldehydu v 500 ml absolútneho etanolu pri -30 °C. Roztok sa miešal pri -30 °C počas 2 hodín a počas chladnutia sa pH upravilo na 7 pomocou 5 % roztoku kyseliny citrónovej vo vode. Reakčná zmes sa nakoncentrovala za vákua vodnej vývevy, k zvyšku sa pridal nasýtený roztok chloridu sodného, zmes sa extrahovala niekoľkokrát po 150 ml dietyléteru, spojené organické fázy sa vysušili nad síranom horečnatým, sušidlo sa odfiltrovalo a rozpúšťadlo sa oddestilovalo pod vákuom vodnej vývevy pri teplote miestnosti. Tak sa získalo 27 g (22 mmol, 88 %) titulnej zlúčeniny vo forme tmavočerveného oleja, ktorý sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcich reakciách. 'H-NMR (250 MHz, d₆-DMSO): δ = 4,4 (m, 2H), 5,6 (bs, IH), 6,6 (d, IH), 7,5 (d, IH).

c) 5-Brómmetyl-2-kyanofurán g (145 mmol) trifenylfosfínu sa pridalo do roztoku 15 g (121 mol [sic]) 5-hydroxymetyl-2-kyanofuránu v 250 ml tetrahydrofuránu. Zmes sa ochladila na -10 °C a

SK 284915 Β6 pridal sa roztok 48 g (145 mmol) tetrabrómmetánu v 100 ml tetrahydrofuránu. Zmes sa nechala ohriať na teplotu miestnosti a miešala sa pri tejto teplote počas 3 hodín. Zmes sa nakoncentrovala na rotačnej odparke za vákua vodnej vývevy a zvyšok sa vyčistil stĺpcovou chromatografiou (mobilná fáza petroléter : dichlórmetán 1 : 1, Rf = 0,5). Získalo sa 11,5 g titulnej zlúčeniny. ’H-NMR (250 MHz, d₆-DMSO): δ = 4,8 (m, 2H), 6,7 (d, IH), 7,7 (d, IH).

d) 5-N,N-Bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-2-kyanofurán

4,0 g (135 mmol) hydridu sodného (80 % suspenzia v minerálnom oleji) sa pridalo po častiach do roztoku 22,9 g (123 mmol) 5-brómmetyl-2-kyanofuránu v 400 ml tetrahydrofuránu ochladeného na 0 °C. Potom sa po kvapkách pridal roztok 29,4 g (135 mmol) ditercbutyl iminodikarboxylátu v 200 ml tetrahydrofuránu, počas čoho teplota neprekročila 5 °C. Zmes sa nechala ohriať na teplotu miestnosti a miešala sa cez noc. Keďže podľa TLC bola konverzia neúplná, pridalo sa celkom 1,2 g hydridu sodného v troch častiach v priebehu 9 hodín. Na dokončenie reakcie sa zmes potom zahrievala na 35 °C tri hodiny a po vychladnutí na teplotu miestnosti sa pomaly pridalo 600 ml nasýteného roztoku chloridu amónneho. Rozpúšťadlo sa oddestilovalo za vákua vodnej vývevy, zvyšok sa niekoľkokrát extrahoval etylacetátom, spojené organické fázy sa premyli nasýteným roztokom chloridu sodného, vysušili nad síranom horečnatým a nakoncentrovali na rotačnej odparke. Získalo sa 37,3 g olejovitého zvyšku, ktorý ešte obsahoval ditercbutyl iminodikarboxylát a použil sa ako surový produkt v nasledujúcej reakcii. 'H-NMR (250 MHz, d₆-DMSO): δ = 1,40, 1,45 (s, J8H), 4,75 (s, 2H), 6,55 (d, IH), 7,55 (d, IH).

e) 5-Aminometyl-2-kyanofurán hydrochlorid

37,3 g 5-N,N-bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-2-kyanofuránu (surový produkt z d), maximum 123 mmol) sa rozpustilo v 600 ml etylacetátu a ochladilo na 0 °C. Roztok sa nasýtil plynným chlorovodíkom. Po 30 minútach sa vyzrážala biela zrazenina. Zmes sa nechala dosiahnuť teplotu miestnosti a miešala sa cez noc a potom sa získaná suspenzia nakoncentrovala v rotačnej odparke, zvyšok sa extrahoval miešaním s dietyléterom, rozpúšťadlo sa odstránilo filtráciou a tuhý zvyšok sa vysušil pri teplote miestnosti za zníženého tlaku. Získalo sa 15,1 g titulnej zlúčeniny (77 % výťažok za dva stupne) vo forme svetlookrového prášku. ’H-NMR (250 MHz, d₆-DMSO): δ = 4,15 (bs, 2H), 6,85 (d, IH), 7,65 (d, IH), 8,8 - 9,0 (bs, 3H).

-Aminomety 1-3 -kyanofurán

a) Etyl 4-oxopentanoát

100 g (0,86 mol) kyseliny 4-oxopentánovej, 150 g etanolu a 1 ml kyseliny sírovej v 200 ml benzénu sa refluxovali, kým neustalo oddeľovanie vody v Dean-Starkovom nástavci. Ochladená reakčná zmes sa premyla vodou, roztokom uhličitanu sodného a znova vodou a potom sa vysušila refluxom pod Dean-Starkovým nadstavcom. Keď skončilo oddeľovanie vody, rozpúšťadlo sa odstránilo destiláciou a zvyšok sa predestiloval za zníženého tlaku. Teplota varu 85 - 87 °C/16 mm Hg, výťažok 105,5 g (85 %).

b) Etyl 4,4-dietoxypentanoát

Zmes 171,3 g (1,19 mol) etyl 4-oxopentanoátu, 207 ml (184,2 g, 1,24 mol) trietyl ortoformátu, 26 ml absolútneho etanolu a 1 g kyseliny p-toluénsulfónovej sa refluxovala počas 8 hodín s intenzívnym miešaním a potom sa predestilovala za zníženého tlaku. Získalo sa 187,9 g (72,5 %) etyl 4,4-dietoxypentanoátu, teplota varu 104 - 106 °C/ /14mm Hg.

c) Etyl 2-formyllevulinát

Zmes 106,3 g (0,489 mol) etyl 4,4-dietoxypentanoátu a 80 ml (73,6 g, 0,99 mol) etylformátu sa po kvapkách pridala do intenzívne miešanej suspenzie 12,7 g (0,55 gramatómu) sodíka (hoblín) v 300 ml bezvodého benzénu pri 10 - 15 °C v priebehu 3 h. Miešanie pokračovalo ďalšie 3 hodiny a reakčná zmes sa nechala stáť cez noc. Za intenzívneho miešania sa pridalo 250 ml vody a miešanie pokračovalo ďalších 15 minút. Vodná vrstva sa oddelila a benzénová vrstva sa extrahovala 70 ml vody. Spojené vodné extrakty sa okyslili na pH 2 a extrahovali etylacetátom (5 x 50 ml) a organické extrakty sa vysušili nad chloridom vápenatým.

Etylacetátový roztok sa predestiloval za zníženého tlaku a zbierala sa frakcia vrúca pri 102 - 110 °C/1 mm Hg. Táto frakcia je zmesou etyl 2-formyllevulinátu a jeho dietylketálu. Pomer v zmesi závisí do intenzity miešania a trvania oddeľovania fáz pri izolácii formylačných produktov.

Benzénová vrstva bola podobne vysušená nad chloridom vápenatým, rozpúšťadlo sa odstránilo a zvyšok sa predestiloval za zníženého tlaku, po čom sa získaná zmes etyllevulinátu a ketálu spracovala tak, ako je opísané v b) namiesto čistého etyllevulinátu. Kroky (2) a (3a) sa opakovali, kým sa nezískalo požadované množstvo etyl 2-formyllevulinátu.

d) Etyl 5-metylfurán-3-karboxylát

Uvedená zmes etyl 2-formyllevulinátu a jeho dietylketálu sa rozpustila v benzéne, pridal sa katalyzátor a získaný roztok sa refluxoval pod Dean-Starkovým nadstavcom 3 -

- 3,5 hodiny, kým sa voda úplne neodstránila. Reakčná zmes sa potom destilovala za zníženého tlaku, čím sa získalo 15 g (97 mmol) etyl 5-metylfurán-3-karboxylátu s teplotou varu 97 °C/15 mm Hg.

e) Kyselina 5-metylfurán-3-karboxylová

Zmes 31,7 g (206 mmol) etyl 5-metylfurán-3-karboxylátu, 40 ml 45 % hydroxidu draselného a 100 ml vody sa refluxovala 4 hodiny, potom sa ochladila na 10 °C a okyslila na pH 1 pomocou 15 % kyseliny chlorovodíkovej. Získaná zmes sa nechala pri tejto teplote 2 hodiny a zrazenina sa odfiltrovala a vysušila na konštantnú hmotnosť pri 45 -

- 50 °C, čím sa získalo 23,7 g (188 mmol, 91 %) kyseliny 5-metylfurán-3-karboxylovej.

f) 5-Metylfurán-3-karbonylchlorid

39,2 g (188 mmol) chloridu fosforečného sa pridalo po malých častiach do miešanej suspenzie 23,7 g (188 mmol) kyseliny 5-metylfurán-3-karboxylovej v 100 ml benzénu. Pozoroval sa značný vývoj tepla a chlorovodíka. Získaná zmes sa refluxovala 4 hodiny a potom sa predestilovala za zníženého tlaku, čím sa získalo 24,7 g (171 mmol, 91 %) chloridu kyseliny s teplotou varu 79 °C/12 mm Hg.

g) 5-Metylfurán-3-karboxamid

24,7 g (171 mmol) 5-metylfurán-3-karbonylchloridu sa pridalo po kvapkách do miešanej zmesi 80 ml 25 % roztoku hydroxidu amónneho a 80 ml benzénu pri 25 - 40 °C. Získaná zmes sa miešala 3 hodiny a nechala sa stáť cez noc. Na druhý deň sa biele kryštály amidu odfiltrovali, premyli studenou vodou a vysušili na konštantnú hmotnosť pri 40 -

- 45 °C. Výťažok 19,7 g (158 mmol, 92 %), teplota topenia 158 °C.

SK 284915 Β6

h) 5-Metyl-3-kyanofurán

32,9 g chloridu fosforečného sa pridalo v malých častiach do suspenzie 19,7 g (158 mmol) 5-metylfurán-3-karboxamidu v 100 ml benzénu pri 30 - 40 °C. Získaná zmes sa refluxovala, až kým sa nevyčírila (3,5 - 4 h), a potom sa predestilovala za zníženého tlaku. Zbierala sa frakcia vrúca pri 79 - 140 °C/15 mm Hg. Druhou destiláciou sa získalo 12,7 g (119 mmol, 75%) titulnej zlúčeniny s teplotou varu 79 - 80 °C/15 mm Hg.

i) 5-Brómmetyl-3-furánkarbonitril

12,7 g (119 mmol) 5-metyl-3-kyanofuránu sa rozpustilo v 100 ml tetrachlórmetánu a pridalo sa 22 g (122 mmol) NBS a 12 g (73 mmol) AIBN. Získaná zmes sa s intenzívnym miešaním zahrievala na 70 °C, keď začala exotermická reakcia. Keď ustal vývoj tepla, reakčná zmes sa miešala pri 80 °C počas 3 hodín a potom sa ochladila na teplotu miestnosti a získaný sukcínimid sa odfiltroval a premyl na filtri tetrachlórmetánom (2x15 ml).

Rozpúšťadlo sa odstránilo za zníženého tlaku a destiláciou zvyšku za zníženého tlaku sa získalo 12,7 g (86 mmol, 57 %) 5-brómmetyl-3-furánkarbonitrilu s teplotou varu 105 °C/1 mmHg. ’H-NMR spektrum ukazuje, že látka obsahuje nečistoty, ktoré dávajú signály pri δ 1,3 a 2,2 ppm. Ich podiel bol uspokojivo nižší po druhej destilácii, ale stratilo sa asi 15 % produktu. 5-BrómmetyI-3-furánkarbonitril je biela kryštalická látka s teplotou topenia 40 - 45°C. Ή-NMR (CDClj, ppm): 4,41 (2H, CH₂), 6,58 (IH, H4), 7,92 IH, H2); ^l3C-NMR (CDClj, ppm): 20,86 (CH₂), 99,03 (CN alebo s menšou pravdepodobnosťou C3), 109,97 (C4), 112,27 (C3 (alebo CN)), 149,84 (C2), 152,32 (C5).

Reakčný produkt je veľmi dráždivý a preto s ním treba manipulovať s mimoriadnou opatrnosťou.

5-N,N-Bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-3-kyanofurán bol syntetizovaný podobným spôsobom ako 5-N,N-bis(tercbutoxykarbonyl)aminometyl-2-kyanofurán. Následné odstránenie tercbutoxykarbonylových skupín sa uskutočnilo v nasýtenom roztoku chlorovodíka v chloroforme.

2-Amidino-5-(N-Boc-aminometyl)-l-metylpyrol hydroacetát

a) 5-Kyano-1 -metylpyrol-2-karbaldehyd

1-Mctylpyrol možno konvertovať na 2-kyano-l-metylpyrol reakciou s chlórsulťonylizokyanátom a dimetylformamidom v acetonitrile (pozrite napríklad C. E. Loader a kol. Can. J. Chem. 59, (1981) 2673-6). Diizopropylamín (17,5 ml, 124,38 mmol) bol zavedený do THF (100 ml) pod dusíkom. Pri -78 °C sa po kvapkách pridal roztok n-butyllítia v hexáne (15 %, 75,9 ml, 124,38 mmol). Zmes sa potom miešala pri -20 °C počas 45 minút a následne sa ochladila znova na -78 °C a pri tejto teplote sa po kvapkách pridal roztok N-metylpyrol-2-karbonitrilu (12 g, 113,07 mmol) v THF (50 ml). Po miešaní pri -78 °C počas 45 minút sa po kvapkách pridal DMF (43,9 ml, 546,46 mmol) a miešanie pri tejto teplote pokračovalo 2 hodiny. Po pridaní monohydrátu kyseliny citrónovej (20,56 g) nasledovalo ohriatie na teplotu miestnosti a pridanie vody (112 ml). THF sa odstránil na rotačnej odparke a vodná fáza sa nasýtila chloridom sodným a extrahovala dietyléterom (3 x 200 ml). Spojené organické fázy sa premyli nasýteným roztokom chloridu sodného a vysušili sa nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa prečistil flash chromatografiou (silikagél, dichlórmetán). Výťažok: 8,25 g (54 %). Ή-NMR (CDClj) δ = 4,1 (s, 3H), 6,8 (d, IH), 6,9 (d, IH),

9,7 (s, IH).

b) 5-Hydroxymetyl-1 -metylpyrol-2-karbonitril

Produkt (8,2 g, 61,1 mmol) získaný v a) sa rozpustil v etanole (200 ml) a pri -10 °C sa pridal bórhydrid sodný (2,31 g, 61,13 mmol). Po miešaní pri 0 - 5 °C počas 1,5 hodiny sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a k zvyšku sa pridala ľadová voda a 20 % roztok hydrogensíranu sodného. Vodná fáza sa extrahovala etylacetátom. Spojené organické fázy sa premyli nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného po neutrálnu reakciu a vysušili sa nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil flash chromatografiou (silikagél, dichlórmetán/metanol = 97,5/2,5). Výťažok:

7.6 g (91 %).

Ή-NMR (CDClj) Z = 1,9 (t, IH), 3,75 (s, 3H), 4,6 (d, 2H), 6,1 (d, 1H),6,7 (d, IH).

c) 5-Azidometyl-1 -metylpyrol-2-karbonitril

Produkt (7,5 g, 55,08 mmol) získaný v b) sa rozpustil v DMF (220 ml) a pri 0 °C sa pridal trifenylfosfin (43,34 g, 165,25 mmol). Po miešaní pri tejto teplote počas 5 minút sa pridal tetrabrómmetán (54,8 g, 165,25 mmol). Zmes sa potom miešala pri 0 °C počas 30 minút a pri teplote miestnosti 1,5 hodiny. Po ochladení na 0 °C sa pridal azid sodný (4,37 g, 67,21 mmol) a zmes sa miešala pri teplote miestnosti 4,5 hodiny. Nasýtený roztok chloridu sodného sa pridal po kvapkách pri 0 °C a zmes sa zriedila etylacetátom. Organická fáza sa oddelila a vodná fáza sa extrahovala dietyléterom. Spojené organické fázy sa premyli vodou a vysušili nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo v rotačnej odparke a surový produkt sa prečistil flash chromatografiou (silikagél, ctylacctát/hcxán = 1/20). Výťažok:

5.6 g (63 %).

Ή-NMR (CDClj) δ = 3,75 (s, 3H), 4,35 (s, 2H), 6,2 (d, IH), 6,7 (d, IH).

d) 5-Aminometyl-1 -metylpyrol-2-karbonitril

Produkt (4,71 g, 29,25 mmol) získaný v c) sa rozpusti] v metanole (100 ml) a pridalo sa paládium na uhlíku (10 %, 1 g). Zmes sa potom hydrogenovala vodíkom pod tlakom 1 atmosféry počas 4 hodín. Katalyzátor sa odfiltroval cez Celíte’ a filtrát sa nakoncentroval na rotačnej odparke. Zvyšok sa extrahoval miešaním so zmesou dichlórmetán/dietyléter = 1/1. Produkt sa odsal a vysušil vo vákuovej peci pri 35 °C. Výťažok: 2,7 g (68 %).

Ή-NMR (CDClj) δ = 3,75 (s, 3H), 3,85 (s, 2H), 6,05 (d, IH), 6,7 (d, IH).

e) 5-(N-Boc-Aminometyl)-l-metylpyrol-2-karbonitril

Produkt (2,7 g, 19,97 mmol) získaný v d) sa rozpustil v dichlórmetáne (50 ml) a pridal sa trietylamín (2,8 ml, 19,97 mmol). Potom sa po kvapkách pridal roztok ditercbutyldikarbonátu (4,36 g, 19,97 mmol) v dichlórmetáne (30 ml). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 2 hodín sa pridala voda a vodná fáza sa extrahovala dichlórmetánom. Spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným a nakoncentrovali na rotačnej odparke. Surový produkt sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcej reakcii. Výťažok: 4,4 g (94 %).

'H-NMR (CDClj) δ = 1,45 a 1,55 (každý s, celkom 9H),

3.7 (s, 3H), 4,3 (d, 2H), 4,7 (sbr, IH), 6,05 (d, IH), 6,7 (d, IH).

f) 5-(N-Boc-Aminometyl)-l-metylpyrol-2-hydroxyamidín [sic]

Produkt (4,3 g, 18,27 mmol) získaný v e) sa rozpustil v zmesi metanol/dichlórmetán (100 ml, 1/1) a pridal sa hydroxylamín hydrochlorid (3,17 g, 45,61 mmol). Potom sa pri teplote miestnosti po kvapkách pridal etyldiizopropylamin (19,1 ml, 109,65 mmol). Po miešaní pri 40 °C počas 12 h a odstránením rozpúšťadla na rotačnej odparke sa k zvyšku pridala voda a zmes sa okyslila na pH 5 kyselinou octovou a extrahovala sa dichlórmetánom a etylacetátom. Spojené organické fázy sa vysušili nad síranom sodným a nakoncentrovali na rotačnej odparke. Surový produkt sa vyčistil flash chromatografíou (silikagél, dichlórmetán/metanol = = 95/5). Výťažok: 3,4 g (69 %).

’H-NMR (CDClj) δ = 1,4 (s, 9H), 3,7 (s, 3H), 4,3 (d, 2H),

4,7 - 4,9 (m, 3H), 6,05 (d, IH), 6,3 (d, IH), 7,3 (sbr, IH).

g) 2-Amidino-5-(N-Boc-aminomctyl)-l-metylpyrol hydroacetát

Produkt (3,4 g, 12,67 mmol) získaný v f) sa rozpustil v metanole (150 ml) a pridala sa kyselina octová (1,45 ml, 25,31 mmol) a Raneyho nikel (421 mg). Potom sa hydrogenoval pod tlakom 1 atmosféry vodíka pri 50 °C počas 5 hodín. Po ochladení na teplotu miestnosti sa katalyzátor odfiltroval cez Celíte* a filtrát sa nakoncentroval. Výsledný produkt sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcej reakcii. Výťažok: 3,7 g (94 %).

FAB-MS (M+H⁺): 253.

2-Amidino-4-(N-Boc-aminometyl)-1 -metylpyrol hydroacetát

a) 5 -Kyano-1 -metylpyrol-3-karbaldehyd

Chlorid hlinitý (24,24 g, 180,86 mmol) sa rozpustil v zmesi nitrometán/dichlórmetán (1/1, 320 ml) a po ochladení na -20 °C sa pridal l-metylpyrol-2-karbonitril (8 g, 75,36 mmol). Potom sa po kvapkách pridal α,α-dichlórdimetyléter (10,4 g, 90,43 mmol) rozpustený v dichlormetáne (42 ml). Po miešaní pri 0 °C počas 4 hodín sa zmes vyliala na ľad (200 g). Vodná fáza sa extrahovala dietyléterom. Spojené organické fázy sa premyli nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasýteným roztokom chloridu sodného až do neutrálnej reakcie. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke. Surový produkt sa použil bez ďalšieho čistenia v nasledujúcich reakciách. Výťažok: 9,2 g (91 %).

’H-NMR (CDClj) δ = 3,8 (s,3H); 7,2 (s,lH); 7,4 (s, IH); 9,85 (s,lH).

b) 4-Ammometyl-l-metylpyrol-2-karbonitril bol pripravený vychádzajúc z 5-kyano-l-metylpyrol-3-karbaldehydu podobne ako pri syntéze 5-aminometyl-l-metylpyrol-2-karbonitrilu. 4-Azidometyl-l-metylpyrol-2-karbonitril sa však výhodne redukoval Staudingerovou reakciou (pozrite napríklad S. Nagarajan a kol., J. Org. Chem. 52 (1987) 5044-6).

c) 2-Amidino-4-(N-Boc-aminometyl)-l-metylpyrol hydroacetát bol pripravený vychádzajúc z 4-aminometyl-l-metylpyrol-2-karbonitril podobne ako pri syntéze 2-amidino-5-(N-Boc-aminometyl)-1 -metylpyrol hydroacetátu. FAB-MS (M+H⁺): 253.

4-Amidino-2-(N-Boc-aminometyl)-1 -metylpyrol hydroacetát

a) 4-Kyano-1 -metylpyrol-2-karbaldehyd l-Mctylpyrol-2-karbaldehyd (10 g, 91,6 mmol) sa rozpustil v acetonitrile (100 ml) a ochladil sa na -45 °C. Chlórsulfonylizokyanát (38,9 g, 274,9 mmol) v acetonitrile (40 ml) sa pridal po kvapkách v priebehu 40 minút. Zmes sa potom miešala pri teplote miestnosti 12 hodín. Po prikvapkaní dimetylformamidu (35 ml) sa zmes zahrievala na 50 °C 1 hodinu. Po ochladení na teplotu miestnosti sa re akčná zmes vyliala do ľadu (200 ml) a 2 N roztoku hydroxidu sodného (286 ml). Vzniknutá zrazenina sa odsala. Filtrát sa [sic] extrahoval dietyléterom. Spojené éterové fázy sa premyli zriedeným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou do neutrálnej reakcie a vysušili sa nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa oddestilovalo pod vákuom vodnej vývevy a zvyšok sa spojil so skôr získanou zrazeninou. Rekryštalizáciou z petroléteru sa získal 4-kyano-l-metylpyrol-2-karbaldehyd (4,3 g) (pozrite napríklad C.E. Loader a kol. Can. J. Chem. 59 (1981) 2673-6).

’H-NMR (CDClj) δ = 4,0 (s,3H); 7,2 (s,lH); 7,3 (s, IH);

9,6 (s,lH).

”C-NMR (CDClj) δ = 37,4; 94,1; 114,7; 125,8; 132,2; 135,8; 179,7.

b) 5-Aminometyl-l-metylpyrol-3-karbonitril bol pripravený vychádzajúc zo 4-kyano-l -metylpyrol-2-karbaldehydu podobne ako pri syntéze 5-aminometyl-l-metylpyrol-2-karbonitrilu.

’H-NMR (DMSO-d₆) δ = 3,6 (s, 3H), 3,8 (s, 2H), 4,2 (sbr, 2H), 6,4 (s, IH), 7,6 (s, IH).

c) 3-Amidino-5-(N-Boc-aminometyl)-l-metylpyrol hydroacetát bol pripravený vychádzajúc z 5 aminometyl-l-metylpyrol-3-karbonitrilu podobne ako pri syntéze 2-amidino-5-(N-Boc-aminometyl)-1 -metylpyrol hydroacetátu. FAB-MS (M+H⁺): 253.

5-Aminometyl-3-kyano-l ,2,4-oxadiazol hydrochlorid

a) N-Boc-5-Aminometyl-3-kyano-l,2,4-oxadiazol

Etyl N-Boc-5-aminometyl-1,2,4-oxadiazol-2-karboxylát (S. Borg a kol. J. Org. Chem. 60 (1995) 3112 - 20) sa rozpustil v metanole (50 ml). Do tohto roztoku sa zavádzal amoniak od -10 °C až po teplotu miestnosti, kým nebola konverzia úplná. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke. Získaný surový produkt sa rozpustil v dichlórmetáne (70 ml) a pri -5 °C sa pridal diizopropyletylamin (2,9 ml, 16,55 mmol). Potom sa po kvapkách pridal anhydrid kyseliny trifluóroctovej (1,06 ml, 7,61 mmol) rozpustený v dichlórmetáne (10 ml). Po miešaní pri 0 °C počas 1,5 hodiny sa zmes zriedila dichlórmetánom, premyla 2 x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a 1 x nasýteným roztokom chloridu sodného a potom sa vysušila nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo v rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil chromatografíou (silikagél, dichlórmetán : metanol = 97,5 : 2,5). Výťažok: 1,2 g (80 %).

b) 5-Aminometyl-3-kyano-l,2,4-oxadiazol hydrochlorid

Produkt (0.9 g, 4.0 mmol) získaný v a) sa rozpustil v dichlórmetáne (45 ml) a pri teplote miestnosti sa pridala 4 M kyselina chlorovodíková v dioxáne (3,9 ml, 15,61 mmol). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 16 hodín sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke. Výťažok: 645 mg (100 %).

’H-NMR (DMSO-d₆) δ = 4,6 (s, 2H), 9,2 (s, 3H).

N-Metyl-5-aminometylpyrazol-3-karboxamid

a) Metyl N-metyl-5-amidopyrazol-3-karboxylát [sic]

N-Metyl-3-metoxykarbonylpyrazol-5-karbonylchlorid (pripravený z 3,7 g, 20,09 mmol kyseliny N-metyl-3-metoxykarbonyl-3-karboxylovej [sic], J. Org. Chem. 54 (1989) 428) sa rozpustil v toluéne a ochladil sa na -10 °C. Potom sa pri teplotách od -10 °C do 0 °C zavádzal amoniak, kým konverzia nebola úplná. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke. Zvyšok sa rozpustil v etanole a po 15 minútach miešania sa etanol odstránil na rotačnej odpar

SK 284915 Β6 kc a zvyšok sa rozpustil v teplej vode a vyzrážal ochladením na 0 °C. Zrazenina sa odsala, premyla acetónom a vysušila pri 45 “C za zníženého tlaku. Výťažok: 1,5 g (41 %).

b) Metyl N-metyl-5-kyanopyrazol-3-karboxylát

Produkt (1,5 g, 8,19 mmol) získaný v a) sa rozpustil v dichlórmetáne (20 ml). Pri -10 °C sa pridal diizopropyletylamín (3,85 ml, 22,11 mmol) a pri tejto teplote sa po kvapkách pridal roztok anhydridu kyseliny trifluóroctovej (1,3 ml, 9,44 mmol) v dichlórmetáne (5 ml) v priebehu 45 minút. Zmes sa potom miešala pri 0 °C počas 1 hodiny a potom sa zriedila dichlórmetánom a premyla 2 x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a 1 x nasýteným roztokom chloridu sodného. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke. Výťažok: 1,35 g (100%). EI-MS(M+): 165.

c) N-Metyl-5-kyanopyrazol-3-karboxamid

Produkt (1,35 g, 8,19 mmol) získaný v b) sa rozpustil v metanole (50 ml) a zmes sa ochladila na -10 °C. Potom sa počas 8 hodín do nej zavádzal amoniak. Po miešaní pri teplote miestnosti počas 12 hodín prekurzor úplne zreagoval. Vyzrážaný produkt sa odsal, premyl studeným metanolom a vysušil sa za zníženého tlaku. Výťažok: 1,22 g (100%).

'H-NMR (DMSO-d_č) δ = 4,0 (s, 3H), 7,4 (s, IH), 7,5 (s, IH), 7,8 (s, IH).

d) N'-Metyl-5-aminometylpyrazol-3-karboxamid

Produkt (0,4 g, 2,66 mmol) získaný v c) sa rozpustil v kyseline octovej (30 ml) a pridalo sa 10 % paládium na uhlíku (78 mg). Zmes sa potom hydrogenovala pod atmosférickým tlakom pri teplote miestnosti až do úplnej konverzie. Katalyzátor sa odfiltroval cez Celíte* a rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke. Výťažok: 0,4 g (100 %). EI-MS (M+): 154.

Príklad 1

N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

a) 3,4-Dehydroprolyl 5-(2-kyano)-tienylmetylamid [sic]:

Boc-3,4-dehydroprolín (5 g, 23,4 mmol) a 5-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochlorid (4,5 g, 25,8 mmol) sa rozpustili v dichlórmetáne (25 ml) a pri 0 °C sa pridal etyldiizopropylamín (28 ml, 163,8 mmol) s [sic] 50% roztokom anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (24,8 ml, 117 mmol). Po miešaní pri 0 °C počas 1 hodiny sa zmes zahriala na teplotu miestnosti a potom sa miešala počas 12 h. Reakčná zmes sa zriedila dichlórmetánom a premyla roztokom hydrogensíranu sodného (4 x), roztokom hydrogenuhličitanu sodného (3 x) a nasýteným roztokom chloridu sodného (1 x). Po vysušení nad síranom sodným a odstránení sušidla filtráciou sa rozpúšťadlo oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Aby sa odstránila skupina Boe, zvyšok sa miešal [lacuna] v dichlórmetáne (95 ml) pri teplote miestnosti, odparil sa dosucha, predestiloval dvakrát s dichlórmetánom, znova nakoncentroval a vyčistil stĺpcovou chromatografiou. Získalo sa 6,6 g požadovaného produktu obsahujúceho ešte malé množstvo rozpúšťadla.

b) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-kyano)-tienylmetylamid [sic]:

t-BuO₂C-CH₂-Boc-(D)-Cha-OH (7,3 g, 18,98 mmol) a H-Pyr-NH-CH₂-5-(2-CN)-tioph hydrochlorid (5,12 g,

18,98 mmol) sa rozpustili v dichlórmetáne (100 ml), a pridal sa etyldiizopropylamín (12,26 g, 94,9 mmol). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C a po kvapkách sa pridal 50 % roztok anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (20 ml). Po miešaní pri 0 - 10 °C počas 3 hodín nasledovalo zriedenie dichlórmetánom (100 ml) a premytie zriedeným roztokom hydrogensíranu sodného (3 x), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x) a vodou (1 x). Po vysušení nad síranom sodným a odstránení sušidla sa rozpúšťadlo oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Získalo sa 12,47 g svetlohnedého oleja.

c) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidotiokarbonyl)-tienyl -metylamid [sic]:

Produkt získaný v b) sa rozpustil v pyridíne (70 ml) a trietylamíne (12 ml). Reakčná zmes sa ochladila na 0 °C nasýtila sa sírovodíkom (roztok zozelenel). Potom sa miešal pri teplote miestnosti 48 hodín. Nadbytok sírovodíka sa vytlačil dusíkom a rozpúšťadlo sa oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Zvyšok sa rozpustil v dietyléteri (200 ml) a premyl sa zriedeným roztokom hydrogensíranu sodného (2 x), nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného (2 x) a vodou (1 x). Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Surový produkt (12,6 g) sa vyčistil flash chromatografiou (silikagél, gradient od dichlórmetánu po dichlórmetán : metanol = = 40 : 1). Získalo sa 12,1 g požadovaného produktu, ktorý ešte obsahoval malé množstvo rozpúšťadla.

d) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-S-metylimidokarbonyl)-tienylmetylamid [sic] hydrojodid:

Produkt získaný v c) sa rozpustil v dichlórmetáne (120 ml) a pridal sa metyljodid (16,24 g, 114,38 mmol). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 12 hodín sa rozpúšťadlo oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Získalo sa

14,6 g žltkastého oleja.

e) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

Surový produkt získaný v d) sa rozpustil v acetonitrile (90 ml) a pridal sa octan amónny (2,94 g, 38,12 mmol). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 2 hodín a pri 40 °C počas 1,5 hodiny sa pridal 10% roztok octanu amónneho v metanole (14,65 g, 19,05 mmol). Zmes sa potom miešala pri 50 °C počas 4,5 hodiny a rozpúšťadlo sa oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Zvyšok sa zmiešal s dichlórmetánom, soli sa odsali a filtrát sa nakoncentroval. Zvyšok sa previedol na octanovú soľ na ionexi (Fluka, objednávacie číslo 00402), čím sa získalo 11,15 g žltkastého oleja.

f) N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát

Produkt získaný v e) sa rozpustil v dichlórmetáne (175 ml) a po kvapkách sa pridal éterický roztok kyseliny chlorovodíkovej (38,3 ml). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 2 hodín sa rozpúšťadlo oddestilovalo za vákua vodnej vývevy. Zvyšok sa zmiešal s dichlórmetánom, a rozpúšťadlo sa oddestilovalo za vákua vodnej vývevy (2 x). Surový produkt (9,35 g) sa vyčistil na ionexi (Fluka, objednávacie číslo 00402) a potom flash chromatografiou (silikagél, gradient od dichlórmetán : metanol : [sic] 4 : 1 cez dichlórmetán : metanol : 50 % kyselina octová : [sic] 40 : : 10 : 2 po dichlórmetán : metanol: 50 % kyselina octová = = 35 : 15:5). Takto získaný produkt sa rozpustil vo vode. Nerozpustné podiely sa odstránili filtráciou a filtrát sa lyofilizoval, čím sa získalo 5,55 g vo forme amorfnej bielej tuhej látky.

FAB-MS (m+H⁺) [sic] : 462

Nasledujúce látky boli pripravené ako v príklade 1:

Príklad 2 N-(Hydroxykarbonyletylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H⁺): 476

Pripravený v niekoľkých stupňoch ako v príklade 1 vychádzajúc z N-(tercbutoxykarbonyletylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanínu [sic] a 3,4-dehydroprolyl 5-(2-kyano)-tienylmetylamidu [sic].

Príklad 3 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 448

Pripravený v niekoľkých stupňoch ako v príklade 1 vychádzajúc z N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylglycínu [sic] a 3,4-dehydroprolyl 5-(2-kyano)-tienylmetylamidu [sic].

Príklad 4 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino-3,4-dimetyl)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 490

Pripravený vychádzajúc z 5-aminometyl-3,4-dimetyltiofén-2-karboxamidu spojením s Boc-3,4-dehydroprolínom za vzniku Boc-3,4-dehydroproly) 5-(2-karbamoyl-3,4-dimetyl)-tienylmetylamidu [sic] ako v príklade 1. Po odstránení chrániacej skupiny Boe bol tento stavebný komponent spojený s N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanínom [sic] ako v príklade 1. Dehydratácia amidu na nitril sa uskutočnila nasledovne:

4,8 g (7,42 mmol) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-kar- bamoyl-3,4-dimetyl)-tienylmetylamidu [sic] sa rozpustilo v 60 ml dichlórmetánu a po pridaní 3,83 g (29,64 mmol) diizopropyletylamínu sa zmes ochladila na 0 °C. Pomaly sa po kvapkách pridalo 2,8 g anhydridu kyseliny trifluóroctovej v 3 ml dichlórmetánu a zmes sa miešala pri 0 - 5 °C dve hodiny. Zmes sa potom zriedila 60 ml dichlórmetánu a následne sa premyla trikrát 20 ml 20 % kyselinou citrónovou, dvakrát 20 ml nasýteného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a dvakrát nasýteným roztokom chloridu sodného a dichlórmetánová fáza sa vysušila nad síranom sodným a nakoncentrovala na rotačnej odparke. Získalo sa 5,35 g N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-kyano-3,4-dimetyl)-tienylmetylamidu [sic], ktorý ešte obsahoval rozpúšťadlo, a táto látka sa použila priamo v nasledujúcom stupni.

Konverzia nitrilovej funkcie na amidínovú skupinu a následné odstránenie chrániacej skupiny prebehlo rovnako ako v príklade 1.

Príklad 5 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohcxylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺⁾: 462

Pripravený rovnako ako v príklade 1 s použitím 5-aminometyl-3-kyanotiofén hydrochloridu namiesto 5-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochloridu.

Príklad 6 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 4-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 462

Pripravený rovnako ako v príklade 1 s použitím 4-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochloridu namiesto 5-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochloridu.

Príklad 7a N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-(D)-4,5-dehydropipekolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 476

Príklad 7b

N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-4,5-dehydropipekolyl 5-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 476

Pripravený rovnako ako v príklade 1 s použitím racemickej kyseliny Boc-(D,L)-4,5-dehydropipekolovej namiesto Boc-3,4-dehydroprolínu. V štádiu N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-(D,L)-4,5-dehydropipekolyl 5-(2-kyano)-tienylmetylamidu [sic] bolo možné oddeliť dve diastereoméme zlúčeniny chromatografiou (silikagél, cyklohexán/etylacetát 7 : 3). Dva diastereoizoméry boli následne konvertované na konečné produkty rovnako ako v príklade 1.

Príklad 8 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 448

Pripravený rovnako ako v príklade 1 vychádzajúc z 5-aminometyl-3-kyanotiofénu a N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-N-Boc-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolínu [sic].

Príklad 9 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 4-(2-amidino)-tienylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 448

Pripravený rovnako ako v príklade 1 vychádzajúc z 4-aminometyl-2-kyanotiofénu a N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-N-Boc-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolínu [sic]·

Príklad 10 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-furanylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 446

Pripravený rovnako ako v príklade 1 s použitím 5-aminometyl-2-kyanofurán hydrochloridu namiesto 5-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochloridu.

SK 284915 Β6

Príklad 11

N-(Hydroxykarbonyletylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-furanylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (Μ+1Γ): 460

Pripravený rovnako ako v príklade 1 s použitím 5-aminometyl-2-kyanofurán hydrochloridu namiesto 5-aminometyl-2-kyanotiofén hydrochloridu.

Príklad 12 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)-furanylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 432.

Príklad 13 N-(Hydroxykarbony1metylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino-furanylmetylamid [sic] hydroacetát:

FAB-MS (M+H⁺): 446.

Príklad 14

N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino-1 -metyl)-pyrolmetylamid [sic] hydrochlorid:

a) 5-(N-Boc-Aminometyl)-l-metylpyrol-2-amidín [sic] hydroacetát (1,5 g, 4,4 mmol) sa rozpustil v izopropanole (70 ml) a po pridaní kyseliny chlorovodíkovej v izopropanole (5,5 M, 4,5 ml, 24,0 mmol) sa zahrieval na 50 °C počas 2 hodín. Po ochladení na teplotu miestnosti sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a zvyšok sa pridal do roztoku t-BuO₂C-CH₂-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-OH v DMF (50 ml). Roztok sa ochladil na 0 °C a pridal sa N-metylmorfolín (1,92 ml, 17,44 mmol). Následne sa po častiach pridal TOTU (1,18 g, 3,58 mmol). Po miešaní pri 0 °C počas 45 minút sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil pomocou MPLC (RP-18, acetonitril/voda). Výťažok: 980 mg (45 %).

FAB-MS (M+H⁺):615.

b) Produkt (550 mg, 0,845 mmol) získaný rovnako ako v

a) sa rozpustil v dichlórmetáne (50 ml) a roztok sa nasýtil pri 0 - 5 °C plynným HCI. Potom sa miešal pri 0 °C počas 1,5 h. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa lyofilizoval. Výťažok: 450 mg (100 %). FAB-MS (M+H⁺): 459.

Príklad 15 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 2-(4-amidino-1 -metyl)-pyrolmetylamid [sic] hydrochlorid bol pripravený rovnako ako v príklade 14.

FAB-MS (M+H⁺): 459.

Príklad 16 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 4-(2-amidino-l-metyl)pyrolmetylamid [sic] hydrochlorid bol pripravený rovnako ako v príklade 14.

FAB-MS (M+H⁺): 459.

Príklad 17 N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 2-(4-amidotiokarbonyl)oxazolemetylamid [sic] hydrochlorid:

a) t-Bu0₂C-CH₂-(Boc)-(D)-Cha-Pyr-OH (2,36 g, 4,92 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (60 ml). Pri -10 °C sa po kvapkách pridal diizopropyletylamín (4,3 ml, 24,59 mmol). Po miešaní pri tejto teplote počas 5 minút sa pridal 2-aminometyloxazol-4-tiokarbamid [sic] hydrochlorid (1 g, 5,16 mmol, G. Videnov a kol. Angew. Chem. 108 (1996) 1604-9, skupina Boe v N-Boc-2-aminometyloxazol-4-tiokarbamide [sic] opísaná v tomto odkaze bola štiepená éterickou kyselinou chlorovodíkovou a príslušný hydrochlorid sa získal nakoncentrovaním) a potom sa po kvapkách pridal 50 % roztok anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (5,06 ml, 6,39 mmol) zriedený dichlómietánom (10 ml) v priebehu 20 minút. Po miešaní pri 0 °C počas 1 hodiny nasledovalo zahriatie na teplotu miestnosti počas 3 hodín. Zmes sa zriedila dichlórmetánom, premyla 2x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a lx nasýteným roztokom chloridu sodného a vysušila sa nad síranom sodným. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil chromatografiou (silikagél, dichlórmetán : metanol = 95 : 5) (Výťažok: 2,5 g (82 %). 'H-NMR (DMSO-d₆) δ = 0,5-2,0 (m, 31H), 3,1-5,5 (m, 8H), 5,8-6,2 (m, 2H), 8,5-9,3 (m, 3H), 9,8 (sbr, IH).

b) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 2-(4-amidino)oxazolmetylamid [sic] hydroacetát:

Produkt získaný v a) sa rozpustil v acetóne (50 ml) a po pridaní metyljodidu (1,97 ml, 31,29 mmol) sa refluxoval 2 hodiny. Rozpúšťadlo a nadbytok metyljodidu sa odstránili na rotačnej odparke. Potom sa získaný surový produkt rozpustil v tetrahydrofuráne (50 ml) a po pridaní octanu amónneho (466 mg, 6,05 mmol) sa zahrieval na 60 °C počas 1,5 hodiny. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa konvertoval na acetát pomocou ionexu (acetát na polymémom nosiči, Fluka 00402), po čom nasledovalo čistenie chromatografiou (silikagél, dichlórmetán : metanol : kyselina octová = 75 : 20 : 5). Výťažok: 2,0 g (75 %).

FAB-MS (M+H⁺): 603.

c) N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-

-3,4-dehydroprolyl 2-(4-amidino)oxazolmetylamid [sic] hydrochlorid:

Produkt (1,95 g, 2,94 mmol) získaný v b) sa rozpustil v dichlórmetáne (50 ml) a pridala sa 4 M kyselina chlorovodíková v dioxáne (3,7 ml, 14,71 mmol). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 20 hodín sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa rozpustil vo vode a lyofilizoval. Výťažok: 1,5 g (100 %).

13-H-NMR [sic] (DMSO-d₆) δ = 168,6, 167,8, 166,2, 162,2, 156,4, 144,7, 129,6, 127,7, 125,5, 67,9, 55,0, 53,5, 45,3, 36,4,35,7, 33,0, 32,5, 32,0, 25,7,25,4, 25,2.

Príklad 18 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)-l,2,4-oxadiazolmetylamid [sic] hydrochlorid:

a) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-kyano)-l ,2,4-oxadiazolmetylamid [sic]

N-(t-BuO₂C-CH₂)-N-Boc-(D)-Cha-Pyr-OH (1,93 g, 4,0 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (65 ml) a pri -10 °C sa pridal diizopropyletylamín (3,1 ml, 17,67 mmol). Potom sa pridal 5-aminometyl-3-kyano-l,2,4-oxadiazol hydrochlorid (645 mg, 4,0 mmol) rozpustený v dichlórmetáne (30 ml). Po 5 minútach miešania sa po kvapkách pridal 50 % roztok anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (3,9 ml, 4,93 mmol) zriedený dichlórmetánom (15 ml) v priebehu 30 minút. Po 1 h pri 0 °C sa zmes zriedila dichlórmetánom a premyla 2x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a lx nasýteným roztokom chloridu sodného. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil chromatografiou (silikagél, dichlórmetán : metanol = 95 : 5). Výťažok:

I, 55 g (71 %).

FAB-MS (M+H⁺): 587.

b) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)-l ,2,4-oxadiazolmetylamid hydroacetát

Produkt (1,5 g, 2,56 mmol) získaný v a) sa rozpustil v metanole (5 ml) a pridal sa acetylcysteín (450 mg, 2,76 mmol). Potom sa do zmesi zavádzal amoniak pri 35 °C, kým konverzia nebola úplná. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa konvertoval na acetát pomocou ionexu (acetát na polymérnom nosiči, Fluka 00402). Získaný surový produkt sa vyčistil chromatografiou (RP-18, acetonitril, voda). Výťažok: 300 mg (18%).

FAB-MS (M+H⁺): 604.

c) N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)-1,2,4-oxadiazolmetylamid [sic] hydrochlorid

Produkt (300 mg, 0,45 mmol) získaný v b) sa rozpustil v dichlórmetáne (20 ml) a pri teplote miestnosti sa pridal 4 M roztok kyseliny chlorovodíkovej v dioxáne (0,6 ml, 2,48 mmol). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 20 hodín sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a produkt sa rozpustil vo vode a lyofilizoval sa. Výťažok: 230 mg (98 %).

FAB-MS (M+H⁺): 448.

Príklad 19 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino-N-metylpyrazolmetylamid [sic] hydrochlorid:

a) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amido-N-metyl)-pyrazolmetylamid [sic]

N-(t-BuO₂C-CH₂)-N-Boc-(D)-Cha-Pyr-OH (1,25 g, 2,59 mmol) sa rozpustil v dichlórmetáne (30 ml). Pri -10 °C sa po kvapkách pridal diizopropyletylamín (1,95 ml,

II, 16 mmol). Potom sa pridal roztok N-metyl-5-aminometylpyrazol-3-karboxamidu (0,4 g, 2,59 mmol) v tetrahydrofuráne (20 ml). Po 5 minútach miešania sa po kvapkách pridal 50 % roztok anhydridu kyseliny propánfosfóniovej v etylacetáte (2,36 mi, 3,11 mmol) a dichlórmetánu (5 ml) v priebehu 5 minút. Po miešaní pri 0 °C počas 45 minút nasledovalo zahriatie na teplotu miestnosti počas 12 hodin. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a zvyšok sa rozpustil v dichlórmetáne a premyl 2x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a 1 x nasýteným roztokom chloridu sodného. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa vyčistil chromatografiou (RP-18, acetonitril, voda). Výťažok: 220 mg (14 %). FAB-MS (M+H⁺): 617.

b) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-kyano-N-metyl)pyrazolmetylamid [sic]

Produkt (220 mg, 0,36 mmol) získaný v a) sa rozpustil v dichlórmetáne (15 ml) a pri -10 °C sa pridal diizopropyletylamín (0,17 ml, 0,96 mmol). Po 5 minútach miešania sa po kvapkách pridal roztok anyhdrídu kyseliny trifluóroctovej (0,057 ml, 0,41 mmol) v dichlórmetáne (1 ml). Po 1 hodine pri 0 °C sa zmes zriedila dichlórmetánom a premyla 2x nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, 2 x 5 % roztokom kyseliny citrónovej a lx nasýteným roztokom chloridu sodného. Po vysušení nad síranom sodným sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke. Výťažok: 180 mg (84%).

c) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino-N-metyl)pyrazolmetylamid [sic] hydroacetát

Produkt (180 mg, 0,3 mmol) získaný v b) sa rozpustil v metanole (1 ml), a pridal sa acetylcysteín (52,8 mg, 0,32 mmol). Potom sa pri 35 “C do zmesi zavádzal amoniak, kým konverzia nebola úplná. Rozpúšťadlo sa odstránilo na rotačnej odparke a surový produkt sa konvertoval na acetát pomocou ionexu (acetát na polymérnom nosiči, Fluka 00402). Surový produkt sa vyčistil chromatografiou (RP-18, acetonitril, voda). Výťažok: 50 mg (16 %). FAB-MS (M+H⁺): 616.

d) N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino-N-metyl)pyrazolmetylamid [sic] hydrochlorid

Produkt (50 mg, 0,081 mmol) získaný v c) sa rozpustil v dichlórmetáne (5 ml) a pridala sa 5 M kyselina chlorovodíková v dietyléteri (0,147 ml). Po 12 hodinách miešania pri teplote miestnosti sa rozpúšťadlo odstránilo na rotačnej odparke a produkt sa dal do vody a lyofilizoval. Výťažok: 40 mg (92 %).

FAB-MS (M+H⁺): 460.

Príklad 20 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)izoxazolmetylamid [sic] hydrochlorid:

Pripravený vychádzajúc z 5-aminometylizoxazolyl-3-karboxamidu a BOC-3,4-dehydroprolínu. Po spojení a eliminácii chrániacej skupiny BOC sa získaný stavebný komponent pripojil na N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanín [sic], čím sa získal N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-karbamoyl)-izoxazolmctylamid [sic]. Po dehydratácii primárneho amidu na nitril ako v príklade 4 vznikol amidin, ako je uvedené.

N-(tcrcbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-amidino)izoxazolmetylamid [sic] hydroacetát:

1,75 g (3,0 mmol) N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-(N-Boc)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(3-kyano)-izoxazolmetylamidu [sic] sa rozpustilo v 10 ml metanolu a po pridaní 0,54 g (3,28 mmol) N-acetylcysteínu sa zmes refluxovala so zavádzaním plynného amoniaku počas 4 hodín. Odstránenie N-acetylcysteínu, vyčistenie produktu a konverzia na acetát prebehla MPL chromatografiou (RP-18, acetonitril/voda/0,1 M kyselina octová). Vymrazenim sa získalo 1,39 g bieleho prášku (70 % teoretickej hodnoty)·

Odstránením chrániacej skupiny vyčisteného produktu éterickou kyseliny chlorovodíkovej v dichlórmetáne sa získala titulná zlúčenina [sic]. FAB-MS (M+H⁺): 448.

Príklad 21 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 2-(4-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H⁺): 463.

Pripravený rovnako ako v príklade 1 vychádzajúc z 2-aminometyltiazol-4-tiokarboxamidu a N-Boc-N-(tercbutyloxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolinu [sic].

Príklad 22

N-(Hydroxykarbonylmetyl én)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolín 2-(4-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydrochlorid

FAB-MS (M+H*): 449.

Príklad 23 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 4-(2-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 463.

Pripravený rovnako ako v príklade 1 vychádzajúc z 4-aminometyltiazol-2-tiokarboxamidu a N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-N-Boc-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolínu [sic].

Príklad 24 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 4-(2-amidino)tiazolmetyiamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 449.

Pripravený rovnako ako v príklade 1 vychádzajúc z 4-aminometyltiazol-2-tiokarboxamidu a N-(tercbutoxykarbonylmetylén)-N-Boc-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolínu [sic].

Príklad 25 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 2-(5-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 463.

Pripravený ako v príklade 21.

Príklad 26 N-(Hydroxykarbonylmetylén-(D)-cyklohexylglycyl-3,4-dehydroprolyl 2-(5-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 449.

Pripravený ako v príklade 22.

Príklad 27 N-(Hydroxykarbonylmetylén)-(D)-cyklohexylalanyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 463.

Pripravený ako v príklade 23.

Príklad 28 N-(Hydroxykarbonylmctylčn)-(D)-cyklohcxylglycyl-3,4-dehydroprolyl 5-(2-amidino)tiazolmetylamid [sic] hydroacetát

FAB-MS (M+H*): 449.

Pripravený ako v príklade 24.

Výsledky farmakologických skúšok

Štruktúra	ECTW ti potkanov 1 hod po orálnej aplikácii	Test na inhibíciu trombínu IC50[mol/l]	Inhibícia kalikreínu ICH [mol/l]	Príklad
	>800	9.81E-10		1
	514	1.18E-09	2.00E-06	3
	608	7.24E-10		2
	728	1.65E-09		8
	603	9.86E-09		v rozsahu nárokov
Äý’+.Ž'	618	9.88E-O9		v rozsahu nárokov
	653	2,15E-O9	8.00E-07	v rozsahu nárokov
	625	3.23E-09		v rozsahu nárokov

	565	2.65E-09		v rozsahu nárekov
	583	8.78E-D9		v rozsahu nárokov
rj	775	2.00E-09		v rozsahu nárokov
	>800	3.37E-08		v rozsahu nárokov
	639	2.69E-09	2.00E-06	5
	>800	1.39E-09		21 ________________________________________________________________I

MATERIÁL A METÓDY:

Chromogénny test na inhibíciu kalikreínu:

Činidlá:

Kalikreín z ľudskej plazmy (č. K 3126, Sigma, Deisenhofen, Nemecko).

Substrát:

Chromozym GK (No. 709875, Boehringer, Mannhein, Nemecko).

Tlmivý roztok:

mM Tris /HCI, pH = 8,50.

Experimentálny postup:

Chromogénny test na určenie aktivity kalikreínu sa uskutočňuje v 96-jamkových mikroplatničkách (č. 650101,

SK 284915 Β6

Greiner, Nurtingen, Nemecko). 2 μΐ roztoku látky v DMSO alebo rozpúšťadle sa pridajú do 93 μΐ tlmívého roztoku obsahujúceho kalikreín do konečnej koncentrácie 0,01 jednotick/ml ainkubujú sa 10 minút pri 20 - 25 °C. Test sa naštartuje pridaním 100 μΐ roztoku substrátu v tlmivom roztoku (konečná koncentrácia 500 μπιοί/ΐ). Po 30 min. inkubácie pri 20 - 25 °C sa zmeria absorbancia v každej jamke oproti prázdnej vzorke pri 405 nm vdvojlúčovom mikroplatničkovom fotometri (Easy rcader, Ear 340 AT, SLTLABI-NSTRUMENTS, Rakúsko).

Meraný parameter:

Absorbancia oproti prázdnej vzorke pri 405 nm.

Kritérium:

IC₅₀: koncentrácia inhibítora potrebná na zníženie amidolytickej aktivity kalikreínu o 50 %.

Štatistická analýza:

Krivky koncentračného účinku a hodnoty IC₅₀ sa vypočítavajú z dátových bodov viacnásobnými iteráciami pomocou algoritmu regresnej nelineárnej analýzy sigmoidálnou metódou najmenších štvorcov.

Ekarínový koagulačný čas u potkanov 60 min. po orálnej aplikácii testovaných zlúčenín:

Činidlá

Ekarínové činidlo (Pentapharm, Bazilej, Švajčiarsko).

Podávanie zlúčeniny a príprava citrátovaných vzoriek celej krvi

Testované zlúčeniny sa rozpustia vo vode alebo inom vehikule noc pred orálnym podaním potkanom Sprague Dawley pri vedomí, ktoré pred tým cez noc hladovali. Podávaný objem je 1 ml/kg na orálne podanie nazogastrickou sondou. Vzorky krvi sa odoberú 1 h po orálnom podaní 21,5 mg/kg'¹ testovanej zlúčeniny alebo vehikula (kontrola). Päť minút pred odberom vzoriek krvi sa zvieratá anestetizujú i.p. podaním 25 % roztoku urctánu (dávka 1 g.kg'¹ i.p.) vo fyziologickom roztoku. Vzorka krvi (2 ml) sa odoberie z katetrizovanej A. carotis priamo do skúmaviek obsahujúcich citrát (1,5 dielu roztoku citrátu sodného s koncentráciou 0,11 mol/I plus 8,5 dielu krvi) a opatrne sa zamieša. Okamžite po odbere vzorky sa určí ekarínový koagulačný čas (ECT, ecarin clotting tíme).

Experimentálny postup

ECT (ekarínový koagulačný čas): 100 μΐ citrátovancj krvi sa inkubuje 2 minúty pri 37 °C v koagulometri guľového typu (CL 8, Bender & Hobein, Mníchov, Nemecko). Po pridaní 100 μΐ predhriateho (37 °C) ekarinového reagentu (Pentapharm) sa určí čas do vytvorenia fibrínovej zrazeniny. Všetky merania sa vykonávajú duplicitne.

Meraný parameter

Koagulačný čas

Chromogénny test na inhibíciu trombínu (modifikácia na skríning):

Činidlá

Trombín z ľudskej plazmy (č. T-8885, Sigma, Deisenhofen, Nemecko). Substrát: H-D-Phe-Pip-Arg-pNA.2HCI (S-2238, Chromogenix, Molndahl, Švédsko). Tlmivý roztok: Tris 50 mmol/1, NaCI 154 mmol/1, pH 8,0.

Experimentálny postup

Chromogénny test na určenie aktivity trombínu sa uskutočňuje v 96-jamkových mikroplatničkách (č. 650101, Greiner, Nurtingen, Nemecko). 10 μΐ roztoku látky v DMSO alebo rozpúšťadle sa pridá do 250 μΐ tlmivého roztoku obsahujúceho trombín do konečnej koncentrácie 0,1 jednotiek NIH/ml a inkubujú sa 5 minút pri 20 - 28 °C. Test sa naštartuje pridaním 50 μΐ roztoku substrátu v tlmivom roztoku (konečná koncentrácia 100 pmoľ'l) a zastaví sa po 5 min. inkubácie pri 20 - 28 °C pridaním 50 μΐ kyseliny citrónovej (35 %). Absorbancia sa zmeria v každej jamke oproti prázdnej vzorke pri 405/630 nm vdvojlúčovom mikroplatničkovom fotometri (MR5000, Dynatech, Denkcndorf, Nemecko).

Meraný parameter

Absorbancia oproti prázdnej vzorke pri 405/630 nm.

Kritérium

IC₅₀: koncentrácia inhibítora potrebná na zníženie amidolytickej aktivity trombínu o 50 %.

Štatistická analýza

Krivky koncentračného účinku a hodnoty IC₅₀ sa vypočítavajú z dátových bodov viacnásobnými iteráciami pomocou algoritmu regresnej nelineárnej analýzy sigmoidálnou metódou najmenších štvorcov.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zlúčenina vzorca (I)

   NH

   NH₂ kde

   Aje

   R²

   I

   R¹--- (CH₂)m -- C --- (CH₂)_n -- ,

   R^J kde m je 0, 1 alebo 2, n je 0,1 alebo 2,

   R¹ je HOOC-, C,.₆-alkyl-OOC- alebo -OH,

   R² je H, C,.₄-alkyl alebo R'-jCH,)^,

   R³ je H alebo C|.₄-alkyl,

   B je

   R⁶

   R⁴ (R⁷-C-R“)_p — N---- C---- CO — >

   R^b kde

   R⁴ je H, C|.₄-alkyl alebo R‘-(CH₂)_m- (kde R¹ a m majú uvedené významy), p je 0 alebo 1,

   SK 284915 Β6

   R'je H alebo C|.₄-alkyl,

   R⁶ je H, C|_₈-alkyl, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny C_M-alkyl, CF₃, C_b4-alkoxy, F alebo Cl, alebo C₃.₈-cykloalkyl, ktorý môže niesť až štyri rovnaké alebo rôzne C|.₄-alkylovc radikály, alebo kde jedna alebo dve jednoduché väzby C-C v kruhu môžu byť nahradené dvojitou väzbou C=C, alebo môže byť naň nakondenzovaný fenylový kruh, C₇-C₁₂-bicykloalkyl alebo C|₀-tricykloalkyl alebo

   R⁴ a R⁶ spolu sú etylénová alebo propylénová skupina,

   R⁷ je H, C|.8-alkyl, fenyl, ktorý môže niesť až tri rovnaké alebo rôzne radikály zo skupiny Cb4-alkyl, CF3, Cb4-alkoxy, F alebo Cl, alebo C3.8-cykloalkyl, ktorý môže niesť až štyri rovnaké alebo rôzne Cb4-alkylové radikály, R⁸ je H alebo Cb4-alkyl,

   Eje

   - zápalové choroby, ako je astma, pankreatitída, rinitída, artritída, urtikária a iné vnútorné choroby, na ktorých sa zúčastňuje kalikreín.

   5. Zlúčenina vzorca (I) podľa nároku 1 na povrchovú úpravu.

   6. Zlúčenina vzorca (Ila) a (Ilb)

   Ä -- B -- E -- D -- CN (ila),

   A -- B -- E -- D -- CSNH₂ (ilb) kde A, B, E a D majú významy uvedené v nároku 1.

   Koniec dokumentu q jc 0 alebo 1 D je kde

   R⁹ je H alebo Cj_₃-alkyl,

   R¹⁰ je H alebo C_M-alkyl,

   R¹¹ je H alebo C]_₄-alkyl,

   X je O, S, -NR¹² (R¹² = H, C^-alkyl),

   Yjc -N= alebo -CR¹³= (R¹³ = H, C_M-alkyl), Cl, CF₃, Zje-N= alebo -CR₁₃=, a ich soli s fyziologicky tolerovanými kyselinami.
2. 2. Zlúčenina vzorca (I) podľa nároku 1 na použitie na kontrolu chorôb.
3. 3. Použitie zlúčeniny vzorca (I) podľa nároku 1 na výrobu liečiv na:

   - choroby, ktorých patogenetický mechanizmus sa priamo alebo nepriamo odvíja od proteolytického účinku trombínu,

   - choroby, ktorých patogenetický mechanizmus sa odvíja od trombínu závislej aktivácie receptorov a transduckcie signálov,

   - choroby spojené so stimuláciou alebo inhibíciou expresie génov v telových bunkách,

   - choroby odvíjajúce sa od mitogénneho účinku trombínu,

   - choroby odvíjajúce sa od trombínu závislej zmeny v kontraktilite a priepustnosti epitelových buniek,

   - od trombínu závislé tromboembolické príhody,

   - diseminovanú intravaskulárnu koaguláciu,

   - reoklúziu a na zníženie času reperfúzie pri komedikácii s trombolytikami,

   - výskyt skorej reoklúzie a neskorej restenózy po PTCA,

   - od trombínu závislú proliferáciu buniek hladkej svaloviny,

   - akumuláciu aktívneho trombínu v CNS,

   - rast nádorov a na zabránenie adhézie a metastáz nádorových buniek.
4. 4. Použitie zlúčeniny vzorca (I) podľa nároku 1 na výrobu liečiv na:

   - choroby, ktorých patogenetický mechanizmus sa priamo alebo nepriamo odvíja od proteolytického účinku kininogenáz, najmä kalikreínu,