SK284036B6

SK284036B6 - Lipozomálna parenterálna kompozícia

Info

Publication number: SK284036B6
Application number: SK1222-2000A
Authority: SK
Inventors: Rainer N�ff; Sandro Delmenico; Andr Wetter; Frank-Ulrich Fl�ther
Original assignee: Cilag Ag International
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2004-08-03
Also published as: KR100591871B1; PL342514A1; CN1298296A; WO1999042085A1; EP0937456A1; NO20004186L; CA2320072C; SI0937456T1; NZ506429A; JP2002503685A; RU2218914C2; CZ20002959A3; ATE271376T1; DE69825137T2; ES2224299T3; HUP0101026A2; US20040052838A1; IL137808A0; IL137808A; PT937456E

Abstract

Lipozomálna parenterálna kompozícia, ktorá obsahuje: (a) účinné množstvo účinnej priesady zahŕňajúcej erytropoetín alebo jeho farmaceuticky vhodné deriváty s takými biologickými vlastnosťami, ktoré pri bunkách kostnej drene vyvolávajú zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek; (b) lipidovú fázu zahŕňajúcu: (i) lecitín alebo hydrogenovaný lecitín; (ii) poprípade, nabitú elektropozitívnu alebo elektronegatívnu lipidovú zlúčeninu; (iii) cholesterol alebo jeho derivát zvolený z esterov cholesterolu a polyetylénglykolových derivátov cholesterolu; a (iv) alkoholickú zložku zahŕňajúcu nižší alkanol s 1 až 6 atómami uhlíka; a (c) fosfátový pufor.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka lipozomálnej erytropoetín kompozície, najmä lipozomálnej parenterálnej dávkovacej formy erytropoetinu vyrobenej spôsobom so vstrekovaním etanolu, ktorá má zlepšenú stabilitu.

Doterajší stav techniky

Erytropoetín (EPO) je glykoproteín, ktorý slúži ako hlavný faktor, ktorý sa zúčastňuje regulácie syntézy červených krviniek. Erytropoetín sa produkuje v obličkách a jeho účinok spočíva v stimulácii prekurzorových buniek v kostnej dreni, kde vyvoláva ich delenie a diferenciáciu na zrelé červené krvinky. Dlhší čas je už dostupný rekombinantne produkovaný 165-aminokyselinový glykoproteín ako terapeutické činidlo účinné pri liečení rôznych foriem anémie, ako sú anémie spojené s chronickým zlyhaním obličiek, anémie u HIV pacientov liečených zidovidínom a pacientov trpiacich rakovinou liečených chemoterapeuticky. Tento glykoproteín sa podáva parentálne, a to vo forme intravenóznych (IV) alebo subkutánnych (SC) injekcií.

V súčasnosti požívané parentálne kompozície sú obyčajné sterilné tlmené vodné roztoky pre IV alebo SC injekcie, ktoré obsahujú ľudský sérový albumín (HSA) ako nosič. Tieto kompozície sú v Spojených štátoch amerických na trhu pod obchodnými názvami EPOGEN^R a PROCRJT^r. Tieto produkty obsahujú erytropoetín v 1 ml jednodávkovej fľaštičke bez konzervačných prísad alebo v 2 ml viacdávkovej fľaštičke s konzervačnými prísadami.

Zatiaľ, čo sa tieto kompozície ukázali ako veľmi úspešné, s použitím ľudského sérového albumínu ako nosiča sú spojené určité nevýhody. Nakoľko HSA pochádza z prírodných zdrojov, môže byť potenciálne nebezpečný ako nosič infekčného agens, ako HIV alebo hepatitídy a musí sa teda uskutočňovať dôkladný skríning tejto látky. Okrem toho, častým problémom môže byť dostupnosť HSA vo vhodnej kvalite. Existuje teda potreba vyvinúť injekčnú kompozíciu na báze erytropoetínu, ktorá umožňuje vylúčenie použitia HSA ako nosiča.

Boli uskutočnené pokusy vyvinúť zlepšenú kompozíciu na báze erytropoetínu bez použitia HSA ako nosiča. Táto kompozícia by mala byť súčasne stabilná, mala by mať predĺžený čas skladovateľnosti a nemala by vyvolávať problémy spojené s prichytávaním účinnej prísady na povrch fľaštičky, v ktorej je obsiahnutá.

Lipozómy sú malé vezikuly, ktoré obsahujú amfipatické lipidy usporiadané v guľovitých dvojvrstvách. Lipozómy môžu obsahovať rad sústredných lipidových dvojvrstiev oddelených vodnými kanálikmi (multilameláme vezikuly, či MLV), alebo môžu obsahovať jedinú membránovú dvojvrstvu (unilameláme vezikuly), čo môžu byť malé unilamelárne vezikuly (SUV) alebo veľké unilameláme vezikuly (LUV). Lipidová dvojvrstva je vytvorená dvoma lipidovými monovrstvami s oblasťou hydrofóbneho „chvostíka“ a hydrofílnej „hlavičky“. V membránovej dvojvrstve sú hydrofóbne „chvostíky“ lipidovej monovrstvy orientované smerom na stred dvojvrstvy, zatiaľ čo hydrofilnc „hlavičky“ sú orientované smerom k vodnej fáze.

Lipozómy môžeme používať na zapuzdrenie rôznych látok tak, že sa hydrofilné zlúčeniny zachytia vo vodnej vnútornej fáze alebo medzi dvojvrstvami, alebo sa hydrofóbne zlúčeniny zachytia v dvojvrstve. Lipozómy samy osebe sú predovšetkým užitočné na dodávku biologických aktívnych látok tým, že zapuzdria zlúčeniny, ktoré majú zlú rozpustnosť vo vode alebo neprijateľnú toxicitu v terapeutických dávkach.

Konkrétny spôsob výroby lipozómov len s jednou dvojvrstvou je opísaný v EP 253 619. V priebehu rokov sa stali známymi lipozomálne kompozície rôznych účinných látok a boli tiež navrhnuté lipozomálne kompozície erytropoetínu. Napríklad Maitani et al., v J. Pharm. Sci., 85: 440 až 445 (1996) opisuje lipozomálne erytropoetinové kompozície zamýšľané na perorálne podávanie s lipozómami pripravenými spôsobom odparenia s obrátenými fázami. Nakoľko je uvedená kompozícia zamýšľaná na perorálne podávanie, prednosť sa dáva vysokému percentu zavedenia EPO do lipozómov. Ale kompozície, ako je opísaný príklad, s vysokým pomerom zapuzdrenia v malých vezikulách, môžu mať vysokú koncentráciu v pečeni vedúcu k toxicite. Okrem toho, výrobné postupy, ktoré sa používajú na ich prípravu, vyžadujú špeciálne suroviny (napríklad polyglycerolfosfolipid) a použitie organických rozpúšťadiel. Pri tomto spôsobe s obrátenými fázami ďalej dochádza na vysoké straty nezapuzdreného EPO, čo je nežiaduce a nákladné.

Úlohou tohto vynálezu je teda vyvinúť parentálnu kompozíciu vhodnú pre EPO, bez použitia HSA ako nosiča, ktorá by bola stabilná na prijateľne dlhý čas, čo predĺži jej skladovateľnosť a ktorú by bolo možné vyrábať spôsobom prispôsobiteľným výrobe vo veľkom meradle.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je lipozomálna parentálna kompozícia, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje:

(a) účinné množstvo účinnej prísady zahŕňajúcej erytropoetín alebo jeho farmaceutický vhodné deriváty s takými biologickými vlastnosťami, ktoré pri bunkách kostnej drene vyvolávajú zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek;

(b) lipidovú fázu zahŕňajúcu:

(i) lecitín alebo hydrogenovaný lecitín;

(ii) pripadne nabitú elektropozitivnu alebo elektronegatívnu lipidovú zlúčeninu; a (iii) cholesterol alebo jeho derivát zvolený z esterov cholesterolu, polyetylénglykolových derivátov cholesterolu (PEG-cholesterolov) a zlúčenín cholesterolov s organickými kyselinami; a (c) vodný tlmivý roztok (pufor).

Kompozícia podľa tohto vynálezu obsahuje lipozómy s jedinou dvojvrstvou, ktoré sa vyrobia tak, že sa pripraví alkoholický roztok lipidovej fázy, ktorý sa pod tlakom vstrekuje do vodného tlmivého roztoku vo vysokorýchlostnom homogenizéri. Takto získané lipozómy sa inkubujú s erytropoetínovou účinnou prísadou za vzniku lipozomálnej disperzie podľa vynálezu.

V prednostnom uskutočnení sú účinnou prísadou erytropoetín a jeho deriváty s biologickými vlastnosťami, ktoré pn bunkách kostnej drene vyvolávajú zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek. Glykoproteín EPO je možné získať z prírodných zdrojov alebo ho vyrobiť rekombinantne s použitím spôsobov opísaných v US patentoch č. 4 703 008, 5 441 868, 5 547 933, 5 618 698 a 5 621 080, ktoré sú tu citované náhradou za prenesenie celého ich obsahu do tohto textu.

V súvislosti s týmto vynálezom sa neočakávane zistilo, žc lipozomálne EPO kompozície, pripravené za tu opísaných miernych podmienok, majú zlepšenú stabilitu, to znamená, že lipozómy sú stabilné pri súčasnej minimalizácii chemického rozkladu a agregácie biologicky účinnej látky. Ďalšou neočakávanou výhodou je to, že aktívna prísada EPO sa neuchytáva na povrchu fľaštičky alebo hadičky, a to dokonca aj napriek tomu, že EPO v podstate nie je začlenený do lipozómov, ale v podstate zostáva v intersticiálnej kvapaline ako lipozomálna disperzia.

Nasleduje podrobnejší opis vynálezu.

V kompozíciách podľa tohto vynálezu je účinnou zložkou erytropoetín a jeho deriváty s biologickými vlastnosťami, ktoré pri bunkách kostnej drene vyvolávajú zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek. Lipozomálna disperzia podľa vynálezu je užitočná ako parentálna kompozícia pri liečení porúch krvotvorby, ktoré sa vyznačujú nízkou alebo defektnou tvorbou červených krviniek, ako sú rôzne formy anémii, ako sú anémie spojené s chronickým zlyhaním obličiek, anémie u pacientov infikovaných HIV liečených zidovidínom a pacientov trpiacich rakovinou liečených chemoterapiou. Môžeme ju tiež použiť pri liečení rôznych chorobných stavov, porúch a stavov hematologickej nepravidelnosti, ako je kosáčikovitosť, β-talazémia, cystická fibróza, tehotenstvo a menštruačné poruchy, časná anémia nedonosených, poranenia miechy, kozmický let, akútna krvná strata, starnutie a podobne. Kompozícia na báze EPO podľa tohto vynálezu sa prednostne podáva parenterálne (napríklad intravenózne, intramuskuláme, subkutánne alebo intraperitoneálne). Účinné dávkovanie bude do značnej miery závisieť od liečeného stavu a spôsobu podávania, ale dávka účinnej látky bude ležať v rozmedzí od 0,1 (asi 7U) do 100 (asi 7000U) ug/kg telesnej hmotnosti. Prednostná dávka na liečenie anémie je asi 50 až asi 300 U/kg pri podávaní trikrát za týždeň.

Lipozomálna disperzia EPO podľa vynálezu zvyčajne obsahuje od asi 200 000 jednotiek do asi 1 milióna jednotiek glykoproteínu EPO na 100 g kompozície. Účinná prísada EPO je dispergovaná v lipozomálnej suspenzii vytvorenej z (a) 1 ipidovej fázy, ktorá obsahuje (i) lecitín alebo hydrogenovaný lecitin;

(ii) prípadne nabitú elektropozitívnu alebo elektronegatívnu lipidovú zlúčeninu; a (iii) cholesterol alebo jeho derivát zvolený z esterov cholesterolu, polyetylénglykolových derivátov cholesterolu (PEG-cholesterolov) a zlúčenín cholesterolov s organickými kyselinami; a (b) vodného tlmivého roztoku.

Taká kompozícia, ktorá je predovšetkým pripravená spôsobom opísaným v EP 0 253 619, ktorý je tu citovaný náhradou za prenesenie celého jeho obsahu do tohto textu má vlastnosti, ktoré z nej robia vhodnú náhradu za kompozície podľa doterajšieho stavu techniky obsahujúce HSA.

Lecitín sa používa v prírodnej alebo v purifíkovanej forme, alebo prednostne vo forme stabilnejšieho hydrogenovaného lecitínu. Použitie hydrogenovaného lecitínu umožní znížiť koncentráciu stabilizačných činidiel. Lecitínová zložka je obyčajne prítomná v množstve od asi 0,5 do asi 5,0 g na 100 g kompozície. Hydrogenovaný lecitín by mal byť predovšetkým kvalitný, bez detekovateľnej hladiny katalyzátorov, ktoré môžu negatívne ovplyvniť stabilitu EPO lipozómov.

Cholesterol sa používa ako činidlo na stabilitu lipozómov v množstve od asi 0,1 do asi 1,0 g na 100 g kompozície. Okrem cholesterolu sa môžu používať iné deriváty cholesterolu, ako sú estery cholesterolu, polyetylénglykolové deriváty cholesterolu (PEG-cholesteroly), ako aj zlúčeniny cholesterolov s organickými kyselinami, napríklad hemisukcinát cholesterolu.

Nabitým eletropozitívnym alebo elektronegatívnym lipidom je lipidová zlúčenina s kladne alebo záporne nabitou časťou. Elektropozitívnymi lipidmi sú oleylamín alebo stearylamín. Elektronegatívnymi lipidmi sú olejové kyseliny, fosfatídové kyseliny, ako dipalmitoylfosfátová kyselina (DPPA), dipalmitoylglycerol (DPPG), distearoylfosfatídová kyselina (DSPA) alebo dimyristylfosfatídová kyselina (DMPA). S použitím takých nabitých lipidov sa získajú nabité lipozómy, ktoré zaisťujú opalescentnú disperziu tým, že zabraňujú sedimentácii lipozómov. Ako sme už uviedli skôr, neočakávaným výsledkom je, že aktívny glykoproteín a erytropoetín sa neuchytáva na stenách sklenenej fľaštičky alebo silikónovej hadičky použitej na podávanie, aj keď aktívna prísada nie je začlenená do lipozómov, ale existuje len vo forme disperzie s nabitými lipozómami.

Alkoholická zložka zahŕňajúca nižší alkanol s 1 až 6 atómami uhlíka, ako metanol, etanol, n-propanol, izopropylalkohol, n-butanol a podobne v množstve od 0,5 do asi 5,0 g na 100 g kompozície, je zvyčajne prítomná v kompozícii pripravenej s použitím spôsobu so vstrekovaním etanolického roztoku. Prednosť sa dáva etanolu.

Vodná tlmivá zložka je zvolená z bežných solí kyselín, ktoré sa zvyčajne používajú ako pufre v parenterálnych kompozíciách. Ako príklady tejto zložky môžeme uviesť citrany, octany a fosforečnany. Prednosť sa dáva fosfátovému pufru. Ako príklady môžeme uviesť dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného alebo dihydrát hydrogenfosforečnanu dvojsodného a ich zmesi. Prednosť sa dáva zmesi dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného a dihydrátu hydrogenfosforečnanu dvojsodného v množstve od 0 do 2,0 g/100 g.

S cieľom zabrániť tvorbe agregátov môžeme do kompozície pridať prípadne stabilizátor, ako glycín. Vo viacerých prípadoch však také stabilizátory nie sú nutné, nakoľko lipozómy v kompozícii účinkujú ako stabilizátor aj ako nosič.

Lipozomálna kompozícia podľa vynálezu sa vyrába s použitím spôsobov, ktoré sú v obore prípravy lipozomálnych kompozícií známe a sú opísané v EP 0 253 619. Pri tomto spôsobe sa vyrobia lipozómy s jedinou dvojvsrstvou tak, že sa pripraví etanolický roztok fosfolipidu a aktívne prísady a tento roztok sa pod tlakom vstriekne do vodného tlmivého roztoku vo vysokorýchlostnom homogenizéri. Lipozómy sa vytvoria spontánne a majú priemer menej ako 1 pm. Konkrétne sa lipozómy podľa spôsobu vynálezu vyrábajú tak, že sa pripraví tlmivý roztok v purifíkovanej vode. Lecitin, cholesterol a nabitá lipidová zložka sa oddelene rozpustí v alkoholickom roztoku, ako napríklad v etanole. Vodný roztok sa zavedie do vysoko účinného homogenizéra, aby sa dosiahla cirkulácia a alkoholický roztok sa priamo vstrekuje do homogenizéra. Spontánne vzniknú lipozómy menšie ako 1 pm. Takto získané lipozómy sa potom inkubujú s účinnou prísadou EPO, za vzniku lipozomálnej disperzie podľa vynálezu.

Transparentná lipozomálna disperzia s dobre vymedzeným priemerom lipozómov sa získa tak, že sa lipozómy prednostne pretlačia filtrami s veľkosťou pórov asi 0,05 až 0,08 mm, čo vedie na lipozómy s priemerom asi 80 až 100 nm. Tento prídavný triediaci stupeň sa zaraďuje preto, aby sa zaistila transparentnosť roztoku, v ktorom je možné ľahko zistiť prítomnosť agregátov a s cieľom predĺžiť čas cirkulácie v krvi.

Ako sme uviedli skôr, erytropoetínové kompozície, ktoré majú v súčasnosti na trhu obmedzenú skladovatcľnosť a na udržanie stability obsahujú stabilizátory, ako látky typu Tween, aminokyseliny atď., alebo sa skladujú lyofilizované. Zistilo sa, že lipozomálna kompozícia podľa tohto vynálezu má vynikajúcu stabilitu, t. j., že lipozómy samotné sú stabilné a súčasne je minimalizovaný rozklad a

SK 284036 Β6 agregácia biologicky účinnej látky. Dosiahla sa až dvojročná skladovateľnosť, čo je veľmi dôležité na priemyselné využitie. Túto zlepšenú stabilitu môžeme pripísať ohľaduplnejšiemu spôsobu výroby podľa vynálezu a lepším prísadám a zloženiu kompozície (tak z kvalitatívneho ako aj z kvantitatívneho hľadiska v porovnaní s kompozíciami opísanými v literatúre).

Stabilitu kompozície môžeme ďalej zvýšiť prídavkom antioxidantov, ako je napríklad tokoferol, butylovaný hydroxytoluén, butylovaný hydroxyanizol, askorbylpalminát, alebo edetátov, ako je edetát dvojsodný s edetátmi, ktoré navyše viažu prípadne prítomné ťažké kovy. Stabilitu môžeme ešte zvýšiť prídavkom konzervačných činidiel, ako sú kyselina benzoová a parabény, napríklad metylparabén a/alebo propylarabén.

Prednostná kompozícia má nasledujúce zloženie:

EPO alebo analogické zlúčeniny Hydrogenovaný lecitín (sójový) Cholesterol

Nabitý lipid

Etanol

Glycin

Pufor

Ďalšie prípadné prídavné látky a voda na 100 g

200 000 až 4 milióny U

0,5 až 5,000 g

0,1 až 1,000 g

0,05 až 0,5 g

0,5 až 5,000 g

0,0 až 100 g až 2,0 g

q. s. do 100,0 g

Konkrétne výhody tohto vynálezu sú ilustrované v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Lipozomálna disperzia

Spôsobom opísaným v EP 0 253 619 sa vyrobí lipozomálna disperzia nasledujúceho zloženia:

na 100 g Erytropoetin 1 milión IU

Hydrogenovaný lecitín sójový 0,500 g

Cholesterol 0,100 g

Farmaceutický nedenaturovaný etanol 0,500 g

Dihydrát dihydrofosforečnanu sodného 0,1164 g

Dihydrát hydrogenfosforečnanu dvojsodného 0,2225 g Chlorid sodný 0,584 g

Puriftkovaná voda 97,9771 g

Spôsob:

Lipozómy sa získajú tak, že sa pri 80 °C pripraví vodný roztok elektrolytu (pufor) z dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, dihydrátu hydrogenfosforečnanu dvojsodného a chloridu sodného vo vode pre injekcie. Oddelene sa lecitín a cholesterol pri 55 až 70 °C rozpustí v alkoholickom roztoku, ako etanole. Vodný roztok sa uvedie do vysoko výkonného homogenizéra na zaistenie cirkulácie (nádoba 1) a alkoholický roztok (nádoba 2) sa priamo vstrekuje do homogenizéra. Etanolickým roztokom prechádza počas celého postupu dusík. Spontánne vzniknú lipozómy s priemerom menej ako 1 pm. Lipozómy s dobre vymedzeným priemerom sa získajú tak, že sa lipozomálna disperzia nechá prejsť filtrami Nucleopore s definovanou veľkosťou pórov (napríklad 0,8 a 0,5 pm. Erytropoetin sa inkubuje s lipozomálnou disperziou a potom sa podrobí jednej sterilnej filtrácii.

Fľaštičky sa plnia za aseptických podmienok.

Technické údaje:

Frekvencia otáčania homogcnizéra: 13 000 min'¹

Prietok etanolického roztoku: 20 až 100 ml/s

Príklad 2

Lipozomálna disperzia

Zloženie	na 100 g
Erytropoetin	1 milión IU
Hydrogenovaný lecitín (sójový)	0,500 g
Cholesterol	0,100 g
Sodná soľ DPPA	0,040 g
Farmaceutický nedenaturovaný etanol	0,500 g
Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného	0,1164 g
Dihydrát hydrogenfosforečnanu dvojsodného	0,2225 g
Chlorid sodný	0,584 g
Purifikovaná voda	97,9371 g

Spôsob:

Opísaná lipozomálna disperzia sa pripraví spôsobom ako v príklade 1, len s tým rozdielom, že sa pred vstrekovaním k etanolickému roztoku pridá okrem lecitínu a cholesterolu sodná soľ DPPA.

Príklad 3

Lipozomála disperzia

Zloženie:	na 100 g
Erytropoetin	1 milión IU
Hydrogenovaný lecitín (sójový)	0,500 g
Cholesterol	0,100 g
Sodná soľ DPPG	0,050 g
Farmaceutický nedenaturovaný etanol	0,500 g
Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného	0,1164 g
Dihydrát hydrogenfosforečnanu dvojsodného	0,2225 g
Chlorid sodný	0,584 g
Purifikovaná voda	97,9271 g

Spôsob:

Opísaná lipozomálna disperzia sa pripraví spôsobom opisaným v príklade 2.

Príklad 4

Skúšanie stability

Podľa príkladov 1 a 2 sa pripravia dve várky lipozomálnej erytropoctínovej kompozície. Várky sa skúšajú na stabilitu v rôznych časových intervaloch. Postupy na biostanovenie in vitro a in vivo sú opísané ďalej a ich výsledky sú uvedené v tabuľkách 1 a 2.

Tabuľka 1

Produkt: Erytropoetínová lipozomálna kompozícia z príkladu 1 BN: Nenabité lipozómy

Dávka: 10 000 IU/ml

SK 284036 Β6

Doba	Podmienky	Vzhlad	pH	Identita	ELISA	Biosta-
sklado-	sklado-			E PO		novenie
vania	vania
	(’C)
Počiatok	NA	vyhovuj e	6,86	vyhovuj e	9695	NA
3	2-8	vyhovuj e	6,97	vyhovuj e	9194	NA
3	25	vyhovuj e	6,98	vyhovu j e	8715	NA
6	2-8	vyhovuje	7,07	vyhovuje	9925	NA
6	25	vyhovuje	7,08	vyhovuje	7886	NA
9	2-8	vyhovuj e	7,01	vyhovuje	9452	NA
12	2-8	vyhovuje	7,02	vyhovuje	9452	NA
18	2-8	NA	NA	vyhovuje*	8635	NA
24	2-8	vyhovuj e	7,05	vyhovuj e	9200	8900**

*< 2 % agregačný štandard (2 %-AGG-l) podľa denzitometrie ** in vivo biostanovenie na myši

Tabuľka 2

Produkt: Erytropoetínová lipozomálna kompozícia

BN: negatívne nabité lipozómy (Na-DPPA)

Dávka: 10 000 lU/ml

Doba	Podmienky	Vzhlad	PH	Identita	ELISA	Biosta-
sklado-	sklado-			EPO		novenie
vania	vania
	(’C)
Počiatok	. NA	vyhovuje	6,71	vyhovuj e	8757	10120
3	2-8	vyhovuje	7, 03	vyhovuj e	8776	8020
3	25	vyhovuje	7, 02	vyhovuj e	7854	NA
6	2-8	vyhovuje	7,02	vyhovuj e	9621	7710
6	25	vyhovuje	7,06	vyhovuj e	8453	NA
9	2-8	vyhovuje	7,03	vyhovuj e	9189	8870
12	2-8	vyhovuje	NA	vyhovuje’	9150	NA
18	2-8	vyhovuje	5,99	vyhovuj e	9003	9500*¹
24	2-8					NA

*< 2 % agregačný štandard (2 %-AGG-l) pomocou denzitometrie ** in vivo biostanovenie na myši, ostatné sú biostanovenia in vitro

Biostanovenie in vivo

Biostanovenie erytropoetínu na exhypoxických polycytemických myšiach

Myši sa nechajú 18 hodín za zníženého tlaku a potom 6 hodín za okolitého tlaku. Tento postup sa nasledujúcich 14 dní opakuje. Po troch dňoch pobytu za okolitého tlaku sa myšiam podá erytropoetín a po 1 dni injekčné ⁵⁹FeCl3. Po ďalších 2 dňoch sa analyzujú krvné vzorky a stanoví sa začlenenie ⁵⁹FeCl3 do erytrocytov.

Biostanovenie in vitro

Biostanovením in vitro je bunkové biostanovenie navrhnuté na presnú kvantifikáciu biologickej aktivity epoetínu alfa.

Vzorky sa najprv zriedia v médiu na kultiváciu tkanív a potom zmiešajú s bunkovými kultúrami HEP.G2. Táto adherentná bunková línia udržiava kapacitu hepatického tkaniva, pokiaľ sa týka jej schopnosti odstraňovať desialované proteíny. Je známe, že k podobnému metabolickému pochodu dochádza in vivo, čo vedie na zníženú aktivitu desialovaného erytropoetínu. Po ošetrení bunkami HEP.G2 nebude dochádzať na odstraňovanie sialovaného erytropoetínu v epoetíne alfa z média. Biostanovenie in vitro teda nenapodobňuje skúšku in vivo na myši.

V druhom stupni sa zostávajúci erytropoetín oddelí od buniek HEP.G2 a podrobí skúške bunkovej proliferácie s použitím bunkovej línie BóSUtA. Tieto bunky rastú za prítomnosti erytropoetínu a rozsah rastu je priamo úmerný množstvu erytropoetínu. Následne sa zmeria bunkový rast ako intenzita sfarbenia produkovaného po pridaní MTT k bunkám. Sfarbenie je priamo úmerné počtu buniek a zníženiu aktivity buniek BúSutA.

Záver:

Uvedené údaje demonštrujú dobrú stabilitu obidvoch kompozícií až počas 24 mesiacov.

Claims

1. Lipozomálna parentálna kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje (a) účinné množstvo účinnej prísady zahŕňajúcej erytropoetín alebo jeho farmaceutický vhodné deriváty s takými biologickými vlastnosťami, ktoré pri bunkách kostnej drene vyvolávajú zvýšenú produkciu retikulocytov a červených krviniek; (b) lipidovú fázu zahŕňajúcu: (i) lecitín alebo hydrogenovaný lecitín; (ii) prípadne, nabitú elektropozitivnu alebo elektronegatívnu lipidovú zlúčeninu; (iii) cholesterol alebo jeho derivát zvolený z esterov cholesterolu a polyetylénglykolových derivátov cholesterolu; a (iv) alkoholickú zložku zahŕňajúcu nižší alkanol s 1 až 6 atómami uhlíka; a (c) fosfátový pufor.

2. Lipozomálna kompozícia podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že obsahuje lipozómy s jedinou dvojvrstvou.

3. Lipozomálna kompozícia podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje stabilizátor.

4. Lipozomálna kompozícia podľa nároku 3, v y značujúca sa tým, že stabilizátorom je glycin.

5. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 4, vyznačujúca sa tým, že lecitínom je hydrogenovaný lecitín.

6. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 4, vyznačujúca sa tým, že alkoholickou zložkou je etanol.

7. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 6, vyznačujúca sa tým, že nabitá elektropozitívna alebo elektronegatívna lipidová zlúčenina je zvolená z dipalmitoylfosfatídovej kyseliny (DPPA), dipalmitoylglycerolu (DPPG), oleylamínu a stearylamínu.

8. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž7,vyznačujúca sa tým,žepufor je zvolený z dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, dihydrátu hydrogenfosforečnanu dvojsodného a ich zmesí.

9. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 8, vyznačujúca sa tým,že ďalej obsahuje konzervačné činidlo.

10. Lipozomálna kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje antioxidant.

11. Lipozomálna kompozícia podľa nároku 1, v y značujúca sa tým, že ďalej obsahuje komplexotvorné činidlo.

12. Lipozomálna kompozícia podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 11, vyznačujúca sa tým, že v 100 g kompozície obsahuje 200 000 až 1 milión m. j. erytropoetínu alebo analogických zlúčenín, 0,5 až 5,000 g hydrogenovaného sójového lecitínu, 0,1 a 1,000 g cholesterolu, 0,05 až 0,5 g nabitého lipidu, 0,5 až 5,000 g etanolu, 0,0 až 1,00 g glycínu, až 2,0 g pufra, pričom zvyšok do 100,0 g kompozície tvoria ďalšie prípadné prídavné látky a voda.

13. Lipozomálna kompozícia podľa akéhokoľvek z nárokov laž8a 12, vyznačujúca sa tým, že v 100 g kompozície obsahuje 1 milión m. j. erytropoetínu, 0,500 g hydrogenovaného sójového lecitínu, 0,100 g cholesterolu, 0,040 g sodnej soli DPPa, 0,500 g farmaceutického nedenaturovaného etanolu, 0,1164 g dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 0,2225 g dihydrátu dihydrogenfosforečnanu dvojsodného, 0,584 g chloridu sodného a 97,9371 g purifikovanej vody.

14. Lipozomálna kompozícia podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 13 na použitie ako farmaceutický prípravok na liečenie anémie.