CZ296415B6

CZ296415B6 - Erythropoietinová liposomální disperze

Info

Publication number: CZ296415B6
Application number: CZ20002959A
Authority: CZ
Inventors: Näff@Rainer; Delmenico@Sandro; Wetter@André; Flöther@Frank-Ulrich
Original assignee: Cilag Ag International
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2006-03-15
Also published as: CN1184958C; JP2002503685A; NZ506429A; RU2218914C2; CZ20002959A3; EP0937456A1; US20040052838A1; CN1298296A; ES2224299T3; ATE271376T1; IL137808A0; BR9908202A; HUP0101026A2; KR20010041152A; US20020028236A1; SI0937456T1; IL137808A; CA2320072C; SK12222000A3; PL194502B1

Abstract

Liposomální parenterální kompozice, která obsahuje: (a) úcinné mnozství úcinné prísady zahrnující erythropoietin nebo jeho farmaceuticky vhodné deriváty s takovými biologickými vlastnostmi, které u bunek kostní drene vyvolávají zvýsenou produkci retikulocytu a cervených krvinek; (b) lipidovou fázi zahrnující: (i) lecithin nebo hydrogenovaný lecithin; (ii) nabitou elektropozitivní nebo elektronegativní lipidovou slouceninu; (iii) cholesterol nebojeho derivát zvolený z esteru cholesterolu, polyethylenglykolových derivátu cholesterolu a derivátucholesterolu s organickými kyselinami; a (c) fosfátový pufr.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká liposomální erythropoietinové kompozice, zejména liposomální parenterální dávkovači formy erythropoietinu vyrobené způsobem se vstřikováním ethanolu, která vykazuje zlepšenou stabilitu.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin (EPO) je glykoprotein, který slouží jako hlavní faktor, jenž se účastní regulace syntézy červených krvinek. Erythropoietin je produkován v ledvinách a jeho účinek spočívá ve stimulaci prekurzorových buněk v kostní dřeni, kdy vyvolává jejich dělení a diferenciací na zralé červené krvinky. Po určitou dobu je již dostupný rekombinantně produkovaný 165ti-aminokyselinový glykoprotein, jako terapeutické činidlo účinné při léčení různých forem anémie, jako jsou anémie spojené s chronickým selháním ledvin, anémie u HIV pacientů léčených zidovidinem a pacientů trpících rakovinou léčených chemoterapeuticky. Tento glykoprotein se podává parenterálně, a to ve formě intravenosních (IV) nebo subkutánních (SC) injekcí.

V současné době používané parenterální kompozice jsou obvyklé sterilní tlumené vodné roztoky pro IV nebo SC injekce, které obsahují lidský sérový albumin (HSA), jako nosič. Takové kompozice jsou ve spojených státech amerických na trhu pod obchodními názvy EPOGEN^ aPROCRIT^(R)· Tyto produkty obsahují erythropoietin v lml jednodávkové lahvičce bez konzervačních přísad nebo 2ml vícedávkové lahvičce s konzervačními přísadami.

Zatímco se tyto kompozice ukázaly jako velmi úspěšné, s použitím lidského sérového albuminu jako nosiče jsou spojeny určité nevýhody. Jelikož HSA pochází z přírodních zdrojů, může být potenciálně nebezpečný jako nosič infekčního agens, jako HIV nebo hepatitidy, a musí se tedy provádět pečlivý screening této látky. Kromě toho, častým problémem může být dostupnost HSA ve vhodné kvalitě. Existuje tedy potřeba vyvinout injekční kompozici na bázi erythropoietinu, která umožňuje vyloučit použití HSA jako nosiče.

Byly učiněny pokusy vyvinout zlepšenou kompozici na bázi erythropoietinu bez použití HSA jako nosiče. Tato kompozice by současně měla být stabilní a vykazovat prodlouženou dobu skladovatelnosti a neměla by vyvolávat problémy spojené s ulpíváním účinné přísady k povrchu lahvičky, v níž je obsažena.

Liposomy jsou malé vesikuly, které obsahují amfipatické lipidy uspořádané v kulovitých dvojvrstvách. Liposomy mohou obsahovat řadu soustředných lipidových dvojvrstev oddělených vodnými kanálky (multilamelámí vesikuly, či ML V), nebo mohou obsahovat jedinou membránovou dvojvrstvu (unilamelámí vesikuly), což mohou být malé unilamelámí vesikuly (SUV) nebo velké unilamelámí vesikuly (LUV). Lipidová dvojvrstva je tvořena dvěma lipidovými monovrstvami s oblastí hydrofobního „chvostíku“ a hydrofílní „hlavičky“. V membránové dvojvrstvě jsou hydrofobní „chvostíky“ lipidové monovrstvy orientovány směrem ke středu dvojvstvy, zatímco hydrofílní „hlavičky“ jsou orientovány směrem k vodné fázi.

Liposomů lze používat pro zapouzdření různých látek tak že se hydrofílní sloučeniny zachytí ve vodném vnitřní fázi nebo mezi dvojvrstvami, nebo se hydrofobní sloučeniny zachytí ve dvojvrstvě. Liposomy jako takové jsou zvláště užitečné pro dodávku biologicky aktivních látek, tím, že zapouzdří sloučeniny, které vykazují špatnou rozpustnost ve vodě nebo nepřijatelnou toxicitu v terapeutických dávkách.

-1 CZ 296415 B6

Konkrétní způsob výroby Iiposomů pouze s jednou dvojvrstvou je popsán vEP 253 619.

V průběhu let se staly známými liposomální kompozice různých účinných látek a byly také navrženy liposomální kompozice erythropoietinu. Například Maitani et al., v J. Pharm. Sci., 85: 440 až 445 (1996) popisuje liposomální erythropoietinové kompozice zamýšlené pro perorální podávání s liposomy připravenými způsobem odpaření s obrácenými fázemi. Jelikož je uvedená kompozice zamýšlena pro perorální podávání, dává se přednost vysokému procentu zavedení EPO do Iiposomů. Avšak kompozice, jako je výše popsaný příklad, s vysokým poměrem zapouzdření v malých vesikulách, mohou vykazovat vysokou koncentraci v játrech vedoucích k toxicitě. Kromě toho, výrobní postupy, kterých se pro jejich přípravu využívá, vyžadují speciální suroviny (například polyglycerolfosfolipid) a použití organických rozpouštědel. Při tomto způsobu s obrácenými fázemi dále dochází k vysokým ztrátám nezapouzdřeného EPO, což je nežádoucí a nákladné.

Úkolem tohoto vynálezu tedy je vyvinout parenterální kompozice vhodnou pro EPO, bez použití HA jako nosiče, která by byla stabilní po přijatelně dlouhou dobu, což prodlouží její skladovatelnost a kterou by bylo možno vyrábět způsobem přizpůsobitelným výrobě ve velkém měřítku.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je liposomální parenterální kompozice, jejíž podstata spočívá v tom že obsahuje:

(a) účinné množství účinné přísady zahrnující eiythropoietin nebo jeho farmaceuticky vhodné deriváty s takovými biologickými vlastnostmi, které u buněk kostní dřevě vyvolávají zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek;

(b) lipidovou fázi zahrnující:

(i) lecithin nebo hydrogenovaný lecithin;

(ii) popřípadě, nabitou elektropozitivní nebo elektronegativní lipidovou sloučeninu; a (iii) cholesterol nebo jeho derivát zvolený z esterů cholesterolu, polyethylenglykolových derivátů cholesterolu (PEG-cholesterolů) a sloučenin cholesterolů s organickými kyselinami; a (c) vodný tlumivý roztok (pufr).

Kompozice podle tohoto vynálezu obsahuje liposomy s jedinou dvojvrstvou, které se vyrobí tak, že se připraví alkoholický roztok lipidové fáze, který se pod tlakem vstřikuje do vodného tlumivého roztoku ve vysokorychlostním homogenizéru. Takto získané liposomy se inkubují s erythropoietinovou účinnou přísadou za vzniku liposomální disperze podle vynálezu.

V přednostním provedení jsou účinnou přísadou erythropoietin a jeho deriváty s biologickými vlastnostmi, které u buněk kostní dřevě vyvolávají zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek. Glykoprotein EPO je možno získat z přírodních zdrojů nebo ho vyrobit rekombinantně za použití způsobů popsaných v patentech US 4 703 008, 5 441 868, 5 547 933, 5 618 698 a 5 621 080, které jsou zde citovány náhradou za přenesení celého jejich obsahu do tohoto textu.

V souvislosti s tímto vynálezem bylo zcela neočekávaně zjištěno, že liposomální EPO kompozice, připravené za zde popsaných mírných podmínek, vykazují zlepšenou stabilitu, tj. že liposomy jsou stabilní při současné minimalizaci chemického rozkladu a agregace biologicky účinné látky. Další neočekávanou výhodou je, že aktivní přísada, EPO, neulpívá na povrchu lahvičky nebo IV hadičky, a to dokonce přestože EPO v podstatě není začleněný do Iiposomů, ale v podstatě zůstává v intersticiální kapalině jako liposomální disperze.

-2 CZ 296415 B6

Následuje podrobnější popis vynálezu

V kompozicích podle tohoto vynálezu je účinnou složkou erythropoietin a jeho deriváty s biologickými vlastnostmi, které u buněk kostní dřevě vyvolávají zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek. Liposomální disperze podle vynálezu je užitečná jako parenterální kompozice při léčení poruchy krvetvorby, které se vyznačují nízkou nebo defektní tvorbou červených krvinek, jako jsou různé formy anémií, jako jsou anémie spojené s chronickým selháním ledvin, anémie u pacientů infikovaných HIV léčených zidovidinem a pacientů trpících rakovinou léčených chemoterapií. Lze ji také použít při léčení různých chorobných stav, poruch a stavů hematologické nepravidelnosti jako jsou srpkovitost, β-talasémie, cystická fibrosa, těhotenství a menstruační poruchy, časná anémie nedonošených, poranění míchy, kosmický let, akutní krevní ztráta, stárnutí apod. Kompozice na bázi EPO podle tohoto vynálezu se přednostně podává parenterálně (například intravenosně, intraperitoneálně). Účinné dávkování bude do značné míry záviset na léčeném stavu a způsobu podávání, avšak má se za tom, že dávka účinné látky bude ležet v rozmezí od 0,1 (asi 7 U) do 100 (asi 7000 U) pg/kg tělesné hmotnosti. Přednostní dávka pro léčení anémie činí asi 50 až asi 300 U/kg při podávání třikrát za týden.

Liposomální disperze EPO podle vynálezu obvykle obsahuje od asi 200 000 jednotek do asi 1 milionu jednotek glykoproteinu EPO na 100 g kompozice. Účinná přísada, EPO, je dispergována v liposomální suspenzi vytvořené z;

(a lipidové fáze, která obsahuje:

(i) lecithin nebo hydrogenovaný lecithin;

(ii) popřípadě, nabitou elektropozitivní nebo elektronegativní lipidovou sloučeninu; a (iii) cholesterol nebo jeho derivát zvolený z esterů cholesterolu, polyethylenglykolových derivátů cholesterolu (PEG-cholesterolů) a sloučenin cholesterolů s organickými kyselinami; a (b) vodného tlumivého roztoku.

Taková kompozice, zejména připravená způsobem popsaným vEP 0 253 619, který je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do tohoto textu, vykazuje vlastnosti, které z ní činí vhodnou náhradu za kompozice podle dosavadního stavu techniky obsahující HSA.

Lecithin se používá buď v přírodní, nebo v purifikované formě nebo, přednostně, ve formě stabilnějšího hydrogenovaného lecithinu. Použití hydrogenovaného lecithinu umožní snížit koncentraci stabilizačních činidel. Lecithinová složka je obvykle přítomna v množství od asi 0,5 do asi 5,0 g na 100 g kompozice. Hydrogenovaný lecithin by přednostně měl být kvalitní, bez detegovatelné hladiny katalyzátorů, které mohou negativně ovlivnit stabilitu EPO a liposomů.

Cholesterolu se používá jako činidla pro stabilizaci liposomů v množství od asi 0,1 do asi 1,0 g na 100 g kompozice. Kromě cholesterolu se může používat jiných derivátů cholesterolu, jako jsou estery cholesterolu, polyethylenglykolové deriváty cholesterolu (PEG-cholesteroly), jakož i sloučenin cholesterolů s organickými kyselinami, například hemisukcinátu cholesterolu.

Nabitým elektropozitivním nebo elektronegativním lipidem je lipidová sloučenina s kladně nebo záporně nabitou částí. Elektropozitivními lipidy jsou oleylamin nebo stearylamin. Elektronegativními lipidy jsou olejové kyseliny, fosfatidové kyseliny, jako dipalmitoylfosfatidová kyselina (DPPA), dipalmitoylglycerol (DPPG), distearoylfosfatidová kyselina (DSPA) nebo dimyristylfosfatidová kyselina (DMPA). Za použití takových nabitých lipidů se získají nabité liposomy, které zajišťují opalescentní disperzi tím, že zabraňují sedimentaci liposomů. Jak již bylo uvedeno výše, zcela neočekávaným výsledkem je, že aktivní glykoprotein erythropoietin neulpívá na stěnách skleněné lahvičky nebo silikonové hadičky použité pro podávání, přestože aktivní přísada není začleněna do liposomů, nýbrž existuje pouze ve formě disperze s nabitými liposomy.

-3CZ 296415 B6

Alkoholická složka zahrnující nižší alkanol s 1 až 6 atomy uhlíku, jako methanol, ethanol, n-propanol, izopropylalkohol, n-butanol apod., v množství od 0,5 do asi 5,0 g na 100 g kompozice, je obvykle přítomna v kompozici připravené za použití způsobem se vstřikováním ethano5 lického roztoku. Ethanolu se dává přednost.

Vodná tlumivá složka je zvolena z běžných solí kyselin, kterých se obvykle používá jako pufrů v parenterálních kompozicích. Jako příklady této složky je možno uvést citrany, octany a fosforečnany. Fosfátovému pufru se dává přednost. Jako příklady lze uvést dihydráty dihydro10 genfosforečnanu sodného nebo dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného a jejich směsi. Přednost se dává směsi dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného a dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného v množství od 0 do 2,0 g/100 g.

Za účelem zabránění tvorbě agregátů je do kompozice popřípadě možno přidat stabilizátor, jako 15 glycin. V mnoha případech však takové stabilizátory nejsou nutné, jelikož liposomy v kompozici účinkují jako stabilizátor i jako nosič.

Liposomální kompozice podle vynálezu se vyrábí za použití způsobů, které jsou v oboru připraveny liposomálních kompozic známy a jsou popsány v EP 0 253 619. Při tomto způsobu se vyro20 bí liposomy s jedinou dvojvrstvou tak, že se připraví ethanolický roztok fosfolipidu a aktivní přísady a tento roztok se pod tlakem vstříkne do vodného tlumivého roztoku ve vysokorychlostním homogenizéru. Liposomy se vytvoří spontánně a mají průměr méně než 1 pm. Konkrétně se způsobme podle vynálezu liposomy vyrábějí tak, že se připraví vodný tlumivý roztok v purifikované vodě. Lecithin, cholesterol a nabitá lipidová složka se odděleně rozpustí v alkoholickém 25 roztoku, jako ethanolu. Vodný roztok se zavede do vysoce účinného homogenizéru, aby se dosáhlo cirkulace a alkoholický roztok se přímo vstřikuje do homogenizéru. Spontánně vzniknou liposomy menší než 1 pm. Takto získané liposomy se poté inkubují s účinnou přísadou, EPO, za vzniku liposomální disperze podle vynálezu.

Transparentní liposomální disperze s dobře vymezeným průměrem liposomů se získá tak, že se liposomy přednostně protlačí filtry s velikostí pórů asi 0,05 až 0,08 mm, což vede k liposomům s průměrem asi 80 až 100 nm. Tento přídavný třídicí stupeň se zařazuje, aby se zajistila transparentnost roztoku, ve kterém lze snadno zjistit přítomnost agregát, a za účelem prodloužení doby cirkulace v krvi.

Jak již bylo uvedeno výše, erythropoietinové kompozice, které jsou v současné době na trhu mají omezenou skladovatelnost a pro udržení stability obsahují stabilizátory, jako látky typu Tween, aminokyseliny atd., nebo se skladují lyofilizované. Zjistilo se, že liposomální kompozice podle tohoto vynálezu vykazuje vynikající stabilitu, tj. že liposomy samotné jsou stabilní a současně 40 jsou minimalizovány rozklad a agregace biologicky účinné látky. Bylo dosaženo až dvouleté skladovatelnosti, což je velmi důležité pro průmyslové využití. Tuto zlepšenou stabilitu lze připsat ohleduplnějšímu způsobu výroby podle vynálezu a lepším přísadám a složení kompozice (jak z kvalitativního, tak kvantitativního hlediska ve srovnání s kompozicemi popsanými v literatuře).

Stabilitu kompozice je možno dále zvýšit přídavkem antioxidantů, jako je tokoferol, butylovaný hydroxytoluen, butylovaný hydroxyanisol, askorbylpalmitát, nebo edetátů, jako je edetát disodný, s edetáty, které navíc vážou případně přítomné těžké kovy. Stabilitu lze ještě zvýšit přídavkem konzervačních činidle, jako jsou kyselina benzoová a parabeny, například methylparaben a/nebo 50 propylparaben.

-4CZ 296415 B6

Přednostní kompozice má následující složení:

EPO nebo analogické sloučeniny

Hydrogenovaný lecithin (sójový) Cholesterol

Nabitý lipid

Ethanol

Glycin

Pufr

Další případné přídavné látky a voda na 100 g

200 000 až 4 miliony U

0,5 až 5,000 g

0,1 až 1,000 g

0,05 až 0,5 g

0,5 až 5,000 g

0,0 až 1,00 g až 2,0 g

q.s. do 100,0 g

Konkrétní výhody tohoto vynálezu jsou ilustrovány v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Liposomální disperze

Způsob popsaný v EP 0 253 619 se vyrobí liposomální disperze o následujícím složení:

na 100 g

Erythropoietin 1 milion IU

Hydrogenovaný lecithin (sójový) 0,500 g

Cholesterol 0,100 g

Farmaceutický nedenaturovaný ethanol 0,500 g

Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného 0,1164 g

Dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného 0,2225 g Chlorid sodný 0,584 g

Purifíkovaná voda 97,9771 g

Způsob:

Liposomy se získají tak, že se při 80 °C připraví vodný roztok elektrolytu (pufr) z dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného a chloridu sodného 40 ve vodě po injekci. Odděleně se lecithin a cholesterol při 55 až 70 °C rozpustí v alkoholickém roztoku, jako ethanol. Vodný roztok se uvede do vysoce výkonného homogenizéru pro zajištění cirkulace (nádoba 1) a alkoholický roztok (nádoba 2) se přímo vstřikuje do homogenizáru. Ethanolickým roztokem se během celého postupu nechá procházet dusík. Spontánně vzniknou liposomy o průměru méně než 1 pm. Liposomy s dobře vymezeným průměrem se získají tak, že se 45 liposomální disperze nechá projít filtry Nucleopore s definovanou velikostí pórů (například 0,8 a

0,5 pm). Erythropoietin se inkubuje s liposomální disperzí a poté podrobí jedné sterilní filtraci. Lahvičky se plní za aseptických podmínek.

Technické údaje:

Frekvence otáčení homogenizéru: 13 000 min’¹

Průtok ethanolického roztoku: 20 až 100 ml/s

-5CZ 296415 B6

Příklad 2

Liposomální disperze

Složení na 100 g

Erythropoietin 1 milion IU

Hydrogenovaný lecithin (sójový) 0,500 g

Cholesterol 0,100 g

Sodná sůl DPPA 0,040 g

Farmaceutický nedenaturovaný ethanol 0,500 g

Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného 0,1164 g Dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného 0,2225 g Chlorid sodný 0,584 g

Purifíkovaná voda 97,9371 g

Způsob:

Výše popsaná liposomální disperze se připraví způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že se před vstřikováním k ethanolickému roztoku kromě lecithinu a cholesterolu přidá sodná sůl DPPA.

Příklad 3

Liposomální disperze

Složení:	na 100 g
Erythropoietin Hydrogenovaný lecithin (sójový) Cholesterol Sodná sůl DPPA Farmaceutický nedenaturovaný ethanol Dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného Dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného Chlorid sodný Purifíkovaná voda	1 milion IU 0,500 g 0,100 g 0,050 g 0,500 g 0,1164 g 0,2225 g 0,584 g 97,9271 g

Způsob:

Výše popsaná liposomální disperze se připraví způsobem popsaným v příkladu 2.

Příklad 4

Zkušební stability

Podle příkladů 1 a 2 se připraví dvě várky liposomální erythropoietinové kompozice. Várky se zkouší na stabilitu v různých časových intervalech. Postupy pro biostanovení in vitro a in vivo jsou popsány dále a jejich výsledky jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2.

-6CZ 296415 B6

Tabulka 1

Produkt: Erythropoietinová liposomální kompozice z příkladu 1 BN: nenabité liposomy

Dávka: 10 000 IU/ml

Doba skladování	Podmínky skladování (°C)	Vzhled	pH	Identita EPO	ELISA	Biostanovení
Počátek	NA	vyhovuje	6,86	vyhovuje	9695	NA
3	2-8	vyhovuje	6,97	vyhovuje	9194	NA
3	25	vyhovuje	6,98	vyhovuje	8715	NA
6	2-8	vyhovuje	7,07	vyhovuje	9925	NA
6	25	vyhovuje	7,08	vyhovuje	7886	NA
9	2-8	vyhovuje	7,01	vyhovuje	9452	NA
12	2-8	vyhovuje	7,02	vyhovuje	9452	NA
18	2-8	NA	NA	vyhovuje*	8635	NA
24	2-8	vyhovuje	7,05	vyhovuje	9200	8900**

* < 2 % agregační standard (2%-AGG-l“) podle denzitometrie ** in vivo biostanovení na myši

Tabulka 2

Produkt: Erythropoietinová liposomální kompozice

BN: negativně nabité liposomy (Na-DPPA)

Dávka: 10 000 IU/ml

Doba skladování	Podmínky skladování (°C)	Vzhled	pH	Identita EPO	ELISA	Biostanovení
Počátek	NA	vyhovuje	6,71	vyhovuje	8757	10120
3	2-8	vyhovuje	7,03	vyhovuje	8776	8020
3	25	vyhovuje	7,02	vyhovuje	7854	NA
6	2-8	vyhovuje	7,02	vyhovuje	9621	7710
6	25	vyhovuje	7,06	vyhovuje	8453	NA
9	2-8	vyhovuje	7,03	vyhovuje	9189	8870
12	2-8	vyhovuje	NA	vyhovuje*	9150	NA
18	2-8	vyhovuje	6,99	vyhovuje	9003	9500**
24	2-8					NA

* <2% agregační standard (2%-AGG-l “) pomocí denzitometrie ** in vivo biostanovení na myši, ostatní jsou biostanovení in vitro

Biostanovení in vivo

Biostanovení erythropoietinu na exhypoxických polycythemických myších

Myši se 18 hodin ponechají za sníženého tlaku a poté 6 hodin za okolního tlaku. Tento postup se následujících 14 dní opakuje. Po 3 dnech pobytu za okolního tlaku se myším podá erythropoietin a po 1 dni injekčně ⁵⁹FeCl3. Po dalších 2 dnech se analyzují krevní vzorky a stanoví se začlenění ⁵⁹FeCl3 do erythrocytů.

Biostanovení in vitro

Biostanovením in vitro je buněčné biostanovení navržené pro přesnou kvantifikaci biologické aktivity epoetinu alfa.

Vzorky se nejprve zředí v médiu pro kultivaci tkání a poté smísí s buněčnými kulturami HEP.G2. Tato adherentní buněčná linie udržuje kapacitu hepatické tkáně, pokud se týče její schopnosti odstraňovat desialované proteiny. Je známo, že k podobnému metabolickému pochodu dochází in vivo, což vede ke snížené aktivitě desialovaného erythropoietinu. Po ošetření buňkami HEP.G2 nebude docházet k odstraňování sialovaného erythropoietinu v epoetinu alfa z média. Biostanovení in vitro tedy napodobuje zkoušku in vivo na myši.

Ve druhém stupni se zbývající erythropoietin oddělí od buněk HEP.G2 a podrobí zkoušce buněčné proliferace za použití buněčné linie BóSUtA. Tyto buňky rostou za přítomnosti erythropoietinu a rozsah růstu je přímo úměrný množství eiythropoietinu. Následně se změří buněčný růst jako intenzita zbarvení produkovaného po přidání MTT k buňkám. Zbarvení je přímo úměrné počtu buněk BóSUtA.

Závěr:

Výše uvedené údaje demonstrují dobrou stabilitu obou kompozic po dobu až 24 měsíců.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Liposomální parenterální kompozice, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje:

(a) účinné množství účinné přísady zahrnující erythropoietin nebo jeho farmaceuticky vhodné deriváty s takovými biologickými vlastnostmi, které u buněk kostní dřeně vyvolávají zvýšenou produkci retikulocytů a červených krvinek;

(b) lipidovou fázi zahrnující:

(i) lecithin nebo hydrogenovaný lecithin;

(ii) nabitou elektropozitivní nebo elektronegativní lipidovou sloučeninu; a (iii) cholesterol nebo jeho derivát zvolený z esterů cholesterolu, polyethylenglykolových derivátů cholesterolu (PEG-cholesterolů) a derivátů cholesterolů s organickými kyselinami; a (c) fosfátový pufř.

2. Liposomální kompozice podle nároku 1,vyznačující se tím, že obsahuje liposomy s jedinou dvojvrstvou vyrobené tak, že se připraví roztok lipidové fáze v alkoholickém rozpouštědle, který se pod tlakem vstřikuje do vodného tlumivého roztoku obsaženého ve vysokorychlostním homogenizéru.

3. Liposomální kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že erythropoietin nebo jeho farmaceuticky vhodný derivát v podstatě není zabudován v liposomech, nýbrž je obsažen hlavně v interstinální tekutině, jako liposomální disperze.

4. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3,vyznačující se tím, že dále obsahuje stabilizátor.

5. Liposomální kompozice podle nároku 4, vyznačující se tím, že stabilizátorem je glycin.

-8CZ 296415 B6

6. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5,vyznačující se tím, že lecithinem je hydrogenovaný lecithin.

7. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že nabitá elektropozitivní nebo elektronegativní lipidová sloučenina je zvolena z dipalmitoylfosfatidové kyseliny, dipalmitoylglycerolu, oleylaminu a stearylaminu.

8. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že pufr je zvolen z dihydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, dihydrátu hydrogenfosforečnanu disodného a jejich směsí.

9. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že dále obsahuje konzervační činidlo.

10. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že dále obsahuje antioxidant.

11. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků lažlO, vyznačující se tím, že dále obsahuje komplexotvomé činidlo.

12. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků lažll,vyznačující se tím,

že má následující složení: na 100 g erythropoietin nebo analogické sloučeniny hydrogenovaný lecithin (sójový) cholesterol nabitý lipid ethanol glycin pufr další případné přídavné látky a voda 200 000 až 1 milion IU 0,5 až 5,000 g 0,1 až 1,000 g 0,05 až 0,5 g 0,5 až 5,000 g 0,0 až 1,00 g 0 až 2,0 g q.s. do 100,0 g

13. Liposomální kompozice podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 a 12, vyznačující se

tím, že má následující složení: na 100 g erythropoietin hydrogenovaný lecithin (sójový) cholesterol sodná sůl dipazmitoylfosfatidové kyseliny farmaceutický nedeturovaný ethanol dihydrát dihydrogenfosforečnanu sodného dihydrát hydrogenfosforečnanu disodného chlorid sodný purifikovaná voda 1 milion IU 0,500 g 0,100 g 0,040 g 0,500 g 0,1164 g 0,2225 g 0,584 g 97,9371 g

14. Liposomální kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13 pro použití jako farmaceutický přípravek pro léčení anémie.