SK282452B6 - Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit - Google Patents
Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit Download PDFInfo
- Publication number
- SK282452B6 SK282452B6 SK892-95A SK89295A SK282452B6 SK 282452 B6 SK282452 B6 SK 282452B6 SK 89295 A SK89295 A SK 89295A SK 282452 B6 SK282452 B6 SK 282452B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- temozolomide
- atase
- benzylguanine
- treatment
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
- A61K31/52—Purines, e.g. adenine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Abstract
Kombinovaný farmaceutický prostriedok na simultánne, oddelené alebo postupné použitie na liečbu ľudských nádorových buniek obsahuje účinné množstvo O6-benzylguanínu a účinné množstvo temozolomidu s jedným alebo viacerými farmaceuticky prijateľnými nosičmi. Je opísané aj použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu ľudských nádorových buniek a farmaceutický kit, ktorý obsahuje oddelene farmaceutický prostriedok temezolomid a oddelene farmaceutický prostriedok O6-benzylguanín.ŕ
Description
Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka kombinovaného farmaceutického prostriedku na liečbu ľudských nádorových buniek, použitia inhibítora O6-benzylguanín DNK alkyltransferázy (Atázy) a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutického kitu.
Doterajší stav techniky
V temozolomide, t. j. v 8-karbamoyl-3-metylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-óne, (CCRG 81 045, NSC 362856 boli zistené cenné protinádorové vlastnosti, pozri Newlands a kol., Br. J. Cancer, 65:287 (1992). V klinickej praxi mal temozolomid aktivitu proti astrocytómom, gliómom, zhubným melanónom a mycosis fungoides. Liek je najúčinnejší, ak sa podáva podľa rozvrhu opakovaných dávok.
Metylovaný O6-alkylguanin, napr. z reakcie MTIC (aktívny metyhijúci druh temozolomidu), je upravovaný bielkovinou O6-alkylguanín DNA alkyltransferázou (Atázou). Na predchádzajúce pôsobenie metylačným činidlom (napr. Zlotogoski a kol., Carcinogenesis, 5:83, 1984; Gibson a kol., Cancer Res., 46:4995, 1986), 0Ď-metylguanínom (napr. Dolan a kol., Biophys. Res. Commun., 132:178, 1985) alebo O6-benzylguanímom (O6-BG, Dolan a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:5368, 1990) na ATázu-exprimujúce bunky bolo tiež zistené, že zvyšuje cytotoxický účinok chlóretylačných činidiel, zatiaľ čo v bunkách, ktoré ATázu neexprimujú, bola pozorovaná len malá alebo žiadna citlivosť.
Moschel, Dolan a Pegg v U.S. patente 5 091 430 uvádzajú, že prechodným poklesom v ATázovej aktivite je všetko, čo je potrebné na zvýšenie účinnosti chlóretylačných činidiel.
Publikovaná PCT prihláška WO 91/13898 uvádza napríklad 3,8-násobný pokles EDy, pre Me CCNU, keď je kombinovaný s O6-benzylguanínom v bunkách SF767. Takto Moshel a kol. uvádzajú všeobecné zvýšenie protinádorovej aktivity alkylačného činidla pri použití s depletorom alkyltransferázy.
Podstata vynálezu
Vynález prihlasovateľov, prekvapujúci a nie samozrejmý z hľadiska predchádzajúcich prác, spočíva v tom, že chemoterapeutické účinky temozolomidu môžu byť dramaticky potenciované (až 300-krát pre bunkovú líniu MAWI) použitím určitého dávkovacieho režimu, ktorý obsahuje podávanie inhibítora ATázy. Takto môžu byť ľudské nádorové bunky, ktoré sú inak neprístupné alebo len málo prístupné liečbe tcmozolomidom, liečené kombináciou temozolomidu s inhibítorom ATázy.
V súlade s tým je predmetom predkladaného vynálezu kombinovaný farmaceutický prostriedok na simultánne, oddelené alebo postupné použitie na liečbu ľudských nádorových buniek, ktorý obsahuje účinné množstvo O6-benzylguanínu a účinné množstvo temozolomidu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi.
Ďalším predmetom predloženého vynálezu je použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na prípravu farmaceutického prostriedku na simultánne, oddelené alebo postupné použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek.
Predmetom vynálezu je aj farmaceutický kit na použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek, ktorý obsahuje od delene farmaceutický prostriedok temozolomid a oddelene farmaceutický prostriedok O6-benzylguanín.
Prehľad obrázkov na výkrese
Obrázok 1 je grafom cytotoxicity (IC50) temozolomidu (B) a CCNU (x) oproti hladinám bunkovej ATázy v bunkových líniách ľudských nádorov (v poradí stúpajúce hladiny ATázy): ZR-75-1, U87MG, U373, LS174T, LOVO, MCF-7 a MAWI.
Obrázok 2 je grafom cytotoxicity temozolomidu v pZipneoSV(X) 1-transfekovaných (o, B) alebo phAT-transfekovaných (’, A) XP-odvodených bunkových líniách v prítomnosti («,*) alebo v neprítomnosti (o, ^)10 μΜ BG. Úsečky chýb ukazujú +/-1 s.d.
Obrázok 3 je grafom pomeru cytotoxicity opakovaných denných dávok temozolomidu v ľudských nádorových bunkových líniách MAWI (x), MCF-7 (T) alebo U373 (#) v samotnom lieku, IC50 (-BG), v porovnaní s preinkubáciou s BG, IC50 (+BG).
Obrázok 4 je grafom účinku zvyšujúcich sa koncentrácií temozolomidu na hladiny ATázy v ľudských nádorových bunkových líniách: LOVO (), MAWI (x), MCF-7 C”), U373 (#).
Obrázok 5 je grafom zachytenia rádioaktívnej značky pri 4° C bunkami, na ktoré bolo pôsobené 14C-temozolomidom. MAWI (), ZR-75-1 (x).
Podrobný opis vynálezu
Toxicita temozolomidu, protinádorového činidla, vhodného na liečbu ľudských nádorov, môže byť veľmi zvýšená jeho použitím spoločne s potenciátorom, ktorým je inhibítor enzýmu O6-alkylguanín DNA alkyltransferázy (ATázy). Konkrétnejšie: použitie inhibítorov ATázy, akým je O6-benzylguanín (BG), môže zvýšiť toxicitu temozolomidu, napríklad v bunkovej línii MAWI, až na asi 300-násobok, ak sa používa v režime opakovaných dávok podľa predkladaného vynálezu, a umožňuje použitie temozolomidu v chemoterapii ľudských nádorov inak neprístupných alebo len málo prístupných takejto liečbe.
Paralelná toxicita temozolomidu a lomistinu (CCNU) (po jednohodinovej expozícii na liek) môže byť ukázaná v rade ľudských nádorových bunkových línií, v korelácii s ich obsahom ATázy. Metylácia O6 pozície guanínu v DNA temozolomidom teda vedie k cytotoxickému poškodeniu. Hodnotením ľudských nádorových bunkových línií na ich relatívnu produkciu ATázy môže byť stanovená ich senzitivita na temozolomid. Bunka produkujúca vyššie množstvo ATázy bude teda na samotný temozolomid menej citlivá ako tá, ktorá produkuje minimálne hladiny ATázy.
Predchádzajúcim pôsobením na bunky jednotlivou dávkou BG sa dosahuje mierne (<4-násobné) zvýšenie toxocity temozolomidu. Stupeň zvýšenia temozolomidu a lomustinu (CCNU) je rovnaký. Pri testovaní kolónií zostávali ľudské fibroblasty transfekované cDNA ATázou, vopred opracované BG, rezistentnejšie na temozolomid ako kontrolné transfekované fibroblasty, hoci ATázová bielkovina bola eliminovaná. Je nepravdepodobné, že by to bolo kvôli rozdielu v transporte temozolomidu, môže to jednoducho odrážať resyntézu ATázy phAT fibroblastami na zmenšenie efektu predchádzajúceho pôsobenia inhibítora.
Najviac prekvapujúce však je, že bola zistená značná potencia toxicity temozolomidu (až na asi 300-násobok)
BG v bunkovej línii MAWI po piatich dňoch pôsobenia.
SK 282452 Β6
Podobný stupeň zvýšenia bol pozorovaný v bunkách MCF-7, ktoré tiež obsahujú vysoké hladiny ATázy, ale len malý efekt v bunkách U373, ktoré majú nízke hladiny. Výsledky testovania bunkových línií MAWI a MCF-7 implikujú, že trvalá prítomnosť inhibítora ATázy umožňuje narastanie poškodenia DNA.
Predkladaný vynález uvádza teda spôsob potenciácie toxicity temozolomidu na ľudské nádorové bunky pomocou podávania ATázu-inhibujúceho množstva inhibítora ATázy, a produkt obsahujúci temozolomid a inhibítor ATázy ako kombinovaný prostriedok na súčasné, oddelené alebo postupné podávanie pri liečbe ľudských nádorových buniek.
Výhodne je toto podávanie inhibítora ATázy opakované v období niekoľkých alebo viacerých dní, a pred podávaním dávok temozolomidu. Opakované dávky môžu byť podávané 1,2, 3,4 alebo 5 dní, 4 alebo 5 dní sú výhodným obdobím liečby.
Ďalej a najvýhodnejšie, temozolomid je podávaný pacientovi v opakovaných dávkach počas niekoľkých dní, a ATázu inhibujúce množstvo inhibítora ATázy je podávané pred každou dávkou temozolomidu, čo vedie k značne zvýšenej toxicite temozolomidu na ľudské nádorové bunky, napr. asi 300-násobné v bunkovej línii MAWI.
Vo výhodnom uskutočnení je inhibítor ATázy podávaný v množstvách inhibujúcich ATázu, t. j. v množstve dostatočnom na citlivosť nádoru in vivo bez toho, že by spôsobilo nežiaduce precitlivenie normálneho tkaniva, ak sa inhibítor používa súbežne s temozolomidom.
Množstvo inhibítora ATázy používané v predloženom vynáleze je rôzne, podľa stupňa účinného množstva potrebného na liečenie nádorových buniek. Vhodné dávkovanie je také, ktorým sa dosiahne taká koncentrácia inhibitora ATázy v nádorových bunkách, ktoré majú byť liečené, že spôsobí depleciu ATázovej aktivity, napr. 1 až 2000 mg/kg, výhodne 10 až 800 mg/kg, pred chemoterapiou.
Neoplazie, pre ktoré je liečba temozolomidom zvlášť vhodná, zahŕňajú karcinómy, melanómy, sarkómy, lymfómy a leukémie, so špecifickým využitím pre astrocytómy, gliómy, zhubné melanómy a mycosis fimgoides, Edvingove sarkómy, chronické lymfocytáme leukémie a nádory pľúc a prsníkov. Zvlášť dramatické zvýšenie aktivity temozolomidu inhibítorom ATázy bolo zistené v nádorových bunkách prsníkov, astrocytómov a kolorektálnych nádorov.
Typickým rozsahom dávkovania temozolomidu je všeobecne od 0,1 do 200, výhodne od 1 do 20 mg/kg telesnej hmotnosti denne, alebo vyjadrené na plochu povrchu tela, asi od 40 do 400, výhodne asi od 150 do 300 mg/m2 denne.
Kvantita potenciácie inhibítorom ATázy je závislá od množstva ATázy normálne prítomnej v konkrétnom type nádorových buniek. Nádorové bunky, ktoré majú vyššie hladiny Atázy, budú potenciované predchádzajúcim podávaním inhibítora ATázy dramatickejšie.
Inhibítormi ATázy využiteľnými v predkladanom vynáleze sú tie, o ktorých je známe, že majú túto aktivitu, napríklad O6-alkylguaníny, akým je O6-metylguanín, alkenylguaníny, akým je O6-alylguanín a O6-aiylguaníny, akým je O6-benzylguanín a benzylované guanínové, guanozinové a 2'-dezoxyguanozínové zlúčeniny, dopísané v medzinárodnej prihláške PCT WO 91/13898 (publikovanej 19. septembra 1991). Zvlášť vhodným na použitie v predkladanom vynáleze je O6-benzylguanín.
Konkrétne dávkovanie inhibítora ATázy závisí od množstva ATázy normálne nájdenej v liečených nádorových bunkách, od veku a stavu pacienta a od konkrétne použitého inhibitora ATázy.
O temozolomide bolo zistené, že najvýhodnejšie je jeho podávanie v opakovaných dávkach v po sebe nasledujúcich dňoch, a dramatické potenciačné účinky predkladaného vynálezu sa realizujú v tomto vysoko výhodnom režime, so zahrnutím podávania dávky inhibítora ATázy pred alebo súbežne s podaním každej dávky podávaného temozolomidu. Výhodne je používaný ako inhibítor ATázy O6-benzylguanín spolu s temozolomidom podávaným v dennom dávkovaní 150 až 300 mg/m2 v štyroch až v piatich rozdelených dávkach počas štyroch až piatich po sebe nasledujúcich dní (celková dávka 750 až 1500 mg/m2). Výhodne je každá dávka inhibítora ATázy podávaná 2 až 8 hodín pred každou dávkou temozolomidu. Toto umožňuje najväčšiu potenciáciu toxicity temozolomidu a vedie k najefektívnejšej liečbe konkrétnej pacientovej neoplazie. Najvýhodnejšie je tento režim opakovať po intervale asi štyroch týždňov.
Alternatívnym dávkovacím rozvrhom na podávanie temozolomidu s 06-benzylguaninom je nepretržitý rozvrh, pri ktorom sa tieto dva lieky podávajú denne počas štyroch alebo viacerých dní. Táto kombinovaná liečba môže byť predĺžená na základe potreby jej pokračovania, pokiaľ nenastane remisia.
Navyše môže byť tvorba ATázy konkrétnou ľudskou nádorovou bunkou použitá ako vyhľadávacia metóda na určenie potenciácie toxicity temozolomidu na spomínanú bunku. Vo výhodnom spôsobe sa testuje obsah ATázy tejto konkrétnej bunkovej línie, napr. metódou popísanou v Lee a kol., Cancer Res., 51:619 (1991), a stanoví sa potenciálna senzitivita na temozolomid. Takéto stanovenie potom umožňuje patričnú kombináciu temozolomidu a inhibítora ATázy na podávanie v liečebnom režime.
Inertné, farmaceutický prijateľné nosiče na prípravu farmaceutických prostriedkov zo zlúčenín opísaných predkladaným vynálezom, môžu byť pevné alebo tekuté. Prostriedkami v pevnej forme sú prášok, tabletky, disperzibilné granuly, kapsuly, dražé a čapíky. Prášky a tabletky môžu obsahovať od 5 do 70 % aktívnej zložky. Vhodné pevné nosiče sú v odbore známe, napr. uhličitan horečnatý, stearát horečnatý, talok, cukor, laktóza. Tabletky, prášky, dražé a kapsuly môžu byť použité ako pevné dávkovacie formy vhodné na orálne podávanie.
Na prípravu čaplkov je najprv roztavený nízkotuhnúci vosk, akým je zmes glyceridov mastných kyselín alebo kakaové maslo, a aktívne zložky sú v ňom rovnomerne dispergované, napr. miešaním. Roztavená homogénna zmes je potom naliata do foriem vhodného tvaru, nechá sa vychladnúť a tým stuhnúť.
Prostriedkami v tekutej forme sú roztoky, suspenzie a emulzie. Príkladom môže byť vodný roztok alebo roztoky v propylénglykole pre parenterálne injekcie.
Zahrnuté sú tiež prostriedky v pevnej forme, ktoré majú byť krátko pred použitím prevedené na prostriedky v tekutej forme buď na orálne alebo parenterálne podávanie. Takéto prostriedky v tekutej forme zahrnujú roztoky, suspenzie a emulzie.
Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť tiež podávané transdermálne. Transdermálne prípravky môžu byť vo forme krémov, tekutých prostriedkov, aerosólov a emulzií, a môžu byť obsiahnuté v transdermálnej náplasti typu nosiča alebo rezervoáru tak, ako sa v odbore konvenčné používajú na tento účel.
Farmaceutický prostriedok je výhodne v jednotkovej dávkovacej forme. V tejto forme je rozdelený do jednotkových dávok obsahujúcich príslušné množstvo aktívnej zložky, napr. množstvo účinné na dosiahnutie žiadaného účelu.
Množstvo aktívnej zlúčeniny v jednotkovej dávke možno meniť alebo nastavovať od asi 0,1 mg do 1000 mg, výhodne od 1 mg do 500 mg, podľa konkrétnej aplikácie.
Konkrétne použité dávkovanie sa môže meniť v závislosti od pacienta a vážnosti jeho stavu, ktorý má byť liečený. Stanovenie správneho dávkovania patrí do znalostí v odbore. Pre pohodlie môže byť denná dávka rozdelená a podávaná v priebehu dňa po častiach, pokiaľ je to žiaduce.
Vynález tu uvedený je dokladovaný nasledujúcimi príkladmi uskutočnenia, ktoré sa však nesmú považovať za obmedzenie rozsahu tohto zverejnenia.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Materiály a metódy Materiály
Médium pre bunkové kultúry bolo zakúpené od ICN Biochemicals Ltd. (High Wycombe, Anglicko) a fetálne teľacie sérum od Gibco Ltd. (Paisley, Anglicko). O6-benzylguanín (BG) bol láskavo dodaný Dr. R. C. Moschelom (NCI-Frederick Cancer Research & Development Center, Frederick, Maryland, USA). Temozolomid a jeho chlóretylový analóg, mitozolomid (8-karbamoyl-3-(2-chlóretylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-ón), boli syntetizované v May and Baker Ltd. (Dagenham, Anglicko) a udržiavané ako roztoky v DMSO pri -70 “C. Všetky ostatné chemikálie boli kúpené v Sigma Chemical Co. Ltd. (Poole, Anglicko).
Štúdie cytotoxicity
Bunkové línie boli rutinne rozrastané ako monovrstvy v DMEM s doplnkom 10 % fetálneho teľacieho séra, 25 mM HEPES, glutamínu a penicilínu/streptomycínu. Štúdie cytotoxicity sa uskutočňovali v médiu bez HEPES v atmosfére 5 % CO2.750 až 1000 buniek/jamku bolo nanesených na 96-jamkové doštičky, na ktoré sa pôsobilo po predchádzajúcej inkubácii cez noc, po 2 hodiny s alebo bez 33 μΜ BG. Temozolomid alebo CCNU potom boli pridané na 1 hodinu do toho istého média, pričom konečná koncentrácia DMSO neprevýšila 1 %. Bunky sa rozrastali ďalších 7 dní v čerstvom médiu a potom bol stanovený obsah ich bielkovín pomocou NCI sulforodamínového stanovenia opísaného Shekanom a kol., J. Natl. Cancer Inst., 82:1107 (1990); štúdie rastu ukázali, že bunky počas trvania testu boli v logaritmickej fáze rastu. Pre rozvrh opakovaného dávkovania temozolomidu sa na bunky pôsobilo opakovane v následných 24-hodinových intervaloch, s čerstvým médiom každý deň. Testy sa robili prinajmenšom duplicitne.
Ľudské XP bunky, transfektované cDNA ATázou alebo kontrolné [Fan a kol., Nucleic Acid Res., 18:5723(1990)], boli rozrastané v NEM a nanášané v počte 1000 buniek/jamku. Po 3 hodinách inkubácie bol pridaný temozolomid, čerstvo zriedený do NEM, a doštičky boli inkubované 5 dní. Prežívajúce bunky boli stanovované tak, ako je to opísané v Morten a kol., Carcinogenesis, 13:483 (1992). V pokusoch s BG bolo nanášané po 300 bunkách v triplikátoch na 9 cm misky a ponechané na prichytenie 5 hodín. BG (10 MM v NEM) bol pridávaný 3 hodiny pred pôsobením temozolomidu, ktorý bol čerstvo zriedený v NEM obsahujúcom 10 μΜ BG. Po 7 dňoch boli kolónie zafarbené pomocou Giemsa a spočítané.
Stanovenie O6-alkylguanín DNA alkyltransferázy
Toto stanovenie sa uskutočňovalo tak, ako to opisuje Lee a kol., Cancer Res., 51:619 (1991). Takto sa inkubo valo rôzne množstvo bunkových extraktov s DNA, ktorá obsahuje O6-metylguanín označený [3H] v metylovej skupine, výhodne pri 37 °C 2 hodiny s celkovým objemom 300 μΐ pufra 1, obsahujúceho 1 mg/ml bovinného sérového albumínu. Po inkubácii sa pridá v rýchlom slede bovinný sérový albumín (100 μΐ roztoku 10 mg/ml v pufri f) a kyselina chloristá (100 μΐ 4M roztoku). Pridajú sa ďalšie 2 ml IM kyseliny chloristej a zmes sa zahrieva pri 75 °C 40 minút na degradáciu DNA na materiál rozpustný v kyseline. Bielkovina, v ktorej je.obsiahnutá metylovaná ATáza, sa potom získa centrifúgáciou a premyje sa 4 ml IM kyseliny chloristej pred resuspendovaním v 300 μΐ 0,01M hydroxidu sodného, rozpustením v 3 ml vodnej scintilačnej kvapaliny (Ecoscint A.: National Diagnostics) a meraním rádioaktivity. Obsah bielkoviny v bunkách bol stanovený použitím súpravy na stanovovanie bielkovín Biorad a bovinného sérového albumínu ako štandardu. Aktivita ATázy je vyjadrená ako fmol množstvo metylov prenesených do bielkoviny na 1 mg celkovej bielkoviny v extrakte.
Bunkové zadržanie [l4C]- označeného temozolomidu 8-Karbamoyl-3-[14C]-metylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5tetra-zín-4-(3H)-ón (špecifická aktivita 26,3 mCi/mmol) bol dodaný Dr. Johnom Slackom (Aston Molecules Ltd., Birmingham, Anglicko). Bunkové suspenzie (5 x 106/ml) boli dané do rovnováhy pri 4 °C a pôsobilo sa na nich 200 μΜ označeným liečivom. 106 buniek sa pipetovalo do Eppendorfových skúmaviek a centrifúgovalo sa cez 250 μΐ olejovej zmesi (4 : 1 Three-in-One/Dow Coming silikónový olej). Vodná vrstva bola odtiahnutá a olejová vrstva bola opatrne premytá ďalšími 300 μΐ soľného roztoku. Po centrifugácii boli odtiahnuté obidve vrstvy, bunková paleta bola rozpustená v solubilizátore buniek, akým je ProtosolR (kvartémy hydroxid amónny v toluéne) a pridaná do scintilačných fľaštičiek obsahujúcich OpfiphaseR (95 - 99 % diizopropylnaftalén).
Výsledky štúdií cytotoxicity
Údaje sú uvedené v nasledujúcej tabuľke I.
BÚRKOVÁ LÍRU | TEMOZOLOMID | CCMU | ATAia rbr-at-eihiAj | ||||
ICl· | ICl· | Fcetr’ | ICl· | ICl· | Poier1 | ||
[-BOJ (MM) | [♦BOJ (μΜ) | (-BOJ (UM) | [♦Ml (UM) | ||||
PM | |||||||
ZR-75-1 | 32 | 22 | 1,4 | 12 | 24 | 0,5 | <10 |
MCF-7 | 32S | 171 | 1.2 | 70 | 31 | 2.2 | 581,3 |
AST80- CYTOMA U87MO | 11í | 131 | 1,3 | 88 | «.4 | 3.2 | 21,9 |
«373 | 131 | 71 | M | 18 | 12 | 1.2 | 53,2 |
KOLOj iUIÄLÄl LS174T | 873 | 832 | 1.4 | 73 | 13 | 5.7 | 199,4 |
LOVO | 84« | 323 | 8.8 | Bl | 38 | 2,9 | 529,0 |
NAVI | 1113 | 339 | 3,8 | 133 | 30 | 4,4 | »92,3 |
XP LÍMIA | |||||||
>Z1> | 23· | - | - | (o,.)* | a _ | - | <2 |
phAT | 100· | • | (4,8)« | « « | • | 1240 |
Bunky boli vystavené v bunkovej kultúre +/- O6-benzylguanínu (BG) pred jednotlivou dávkou temozolomidu alebo CCNU
l.IC5o[-BG]/IC3O[+BG]
2. Výsledky získané MTT stanovenia Wassermana a kol., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 15:699 (1988).
3. Čísla v zátvorkách sa týkajú mitozolomidu
Údaje v tabuľke I, ktoré sú graficky znázornené v obr.
1, majú koreláciu medzi citlivosťou (meraná je koncentráciou, ktorá uvádza 50 % rastu alebo IC50) nádorovej bun4
SK 282452 Β6 kovej línie na temozolomid (r = korelačný koeficient = = 0,87) alebo CCNU (r = korelačný koeficient = 0,92) a ich obsahom ATázy. Sklony sú skoro rovnobežné, až na to, že CCNU je na molámom základe približne päťkrát toxickejšie. Jednou výnimkou bola línia MCF-7, ktorá je mierne citlivá na temozolomid a má relatívne vysokú aktivitu ATázy. Bunky, na ktoré sa vopred pôsobilo netoxickou dávkou BG, boli 3 až 5-krát, resp. šesťkrát citlivejšie na temozolomid alebo CCNU.
Kontrolné XP bunky (bunky xeroderma pigmentosa transfekované pZipneoSV(X)) [Fan a kol., Nucleic Acid Res., 18:5723 (1990)], ktoré exprimujú ťažko merateľné hladiny ATázy, sú 4-5-krát citlivejšie na temozolomid alebo CCNU-podobnému činidlu mitozolomidu ako ľudské bunky transfekované cDNA ATázou (pozri tabuľku I). V testoch tvorby kolónií použitých v cytotoxicite temozolomidu ( pozri obr. 2) vykazuje predchádzajúce pôsobenie BG podobný stupeň potenciácie na ľudské ATázou transfekované XP bunky ako na nádorové bunky, ale nemá žiadny merateľný účinok na kontrolné XP bunky, ktoré neexprimujú ATázu. Aj keď BG depletoval ATázou aktivitu ľudských ATázou transfekovaných XP buniek a nádorových buniek (pozri nižšie), tieto bunky ostali rezistentnejšie na temozolomid ako kontrolné pZip-transfekované fibroblasty.
Údaje rozvrhu opakovaných dávok sú uvedené v nasledujúcej tabuľke II.
Tabuľka II
Cytotoxicita opakovaných dávok temozolomidu [IC50 (μΜ)]
BUMÍOVÄ LÍMIA | —όϊΓϊ- | DII 1 | DM 3 | DI1 4 | DM 6 |
-M *BG | -BG +BG | -BG *BG | -BO +BG | -BG *BG | |
0373 | 51 18 | ||||
ΝΛΝΙ | 318 185 | 350 50 | 383 11 | 383 7»Ž | 32« 1,0 |
ÍCF-7 | 31S 18 | 318 51 | 375 11 |
Bunky boli vystavené v bunkovej kultúre +/- O6-benzylguanínu (BG) pred opakovanými dennými dávkami temozolomidu.
Rozvrh opakovaných dávok mal dramatickú potenciáciu toxicity tenozolonidu O6-benzylguanínom (BG) v bunkách MAWI a MCF-7 (pozri tiež obr. 3).
Po pôsobení piatich 24-hodinových dávok bola bunková línia MAWI 300-krát citlivejšia na temozolomid, keď bol prítomný BG. Opakované dávky temozolonidu nie sú samy o sebe toxickejšie ako jednotlivá 24-hodinová dávka v hociktorej bunkovej línii. V podobnom pokuse na bunkách U373, ktoré majú nízku hladinu ATázy, prítomnosť BG spôsobila len trojnásobnú potenciáciu po štyroch 24-hodinových dávkach.
Hladiny alkyltransferázy
Použité koncentrácie BG rýchlo znižovali na nemerateľnú úroveň pôvodne vysoký obsah ATázy v bunkách MAVII a v ľudských fibroblastoch transfekovaných cDNA ATázou. Analýza HPLC ukázala, že BG je v médiu pre pletivové kultúry stabilné najmenej 24 hodín pri 37 °C.
Bolo zistené, že temozolonid po trojhodinovej inkubácii spôsobuje pokles obsahu ATázy v bunkových líniách U373, MCF-7, LOVO a MAWI. Pri 50 - 100 μΜ koncentrácii bolo zníženie približne 50 % v každej línii (pozri obr. 4), aj napriek 3-4-násobnému rozdielu v cytotoxicite na jednotlivú dávku temozolomidu medzi MCF-7 a kolorektálnymi líniami (LOVO a MAWI). Podobné zníženie bolo zistené v citlivejšej línii U373, aj keď hladiny ATázy boli blízko detekčnej hranice testu.
Na elimináciu možnosti rozdielov v transporte temozolomidu bolo študované bunkové zadržanie [14C]označenej zlúčeniny v najcitlivejších a naj rezistentnej ších bunkových líniách (ZR-75-1, resp. MAWI). Výsledky uvedené na obr. 3 ukazujú, že zadržanie pri 4 °C bolo veľmi rýchle a úplné v priebehu 5 minút v obidvoch bunkových líniách. Podobné množstvá liečiva boli zistené v obidvoch bunkových líniách, s úpravou vzhľadom na koncentráciu bielkovín. Rýchle zadržanie pri 4 °C bolo konzistentné s pasívnou difúziou temozolomidu preukázanou skôr v dvoch lymfoidných líniách Bellom a kol., Biochem. Pharmacol., 36:3215 (1987).
Príklad 2
Orálny prostriedok_____________________mg na kapsulu
temozolomid | 100 |
laktóza, USP | 213 |
mikrokryštalická celulóza | 30 |
laurylsulfát sodný | 20 |
kukuričný škrob | 25 |
stearát horečnatý | 2 |
Spolu sa zmieša temozolomid a laktóza, mikrokryštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý, premieša a uzatvorí do dvojdielnych želatínových kapsúl pat- | |
ričnej veľkosti. | |
Príklad 3 | |
Orálny prostriedok | mg na kapsulu |
O6-benzylguanín | 100 |
laktóza, USP | 213 |
mikrokryštalická celulóza | 30 |
laurylsulfát sodný | 20 |
kukuričný škrob | 25 |
stearát horečnatý | 2 |
Spolu sa zmieša Os-benzylguanín | a laktóza, mikro- |
kryštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý, premieša a uzatvorí do dvojdielnych želatínových kapsúl | |
patričnej veľkosti. | |
Príklad 4 | |
Orálny prostriedok | mg na kapsulu |
temozolomid | 100 |
O5-benzylguanín | 100 |
laktóza, USP | 213 |
mikrokryštalická celulóza | 30 |
laurylsulfát sodný | 20 |
kukuričný škrob | 25 |
stearát horečnatý | 2 |
Spolu sa zmieša temozolomid a O6-benzylguanín, laktóza, mikrokryštalická celulóza, laurylsulfát sodný a kukuričný škrob. Preoseje sa cez sito číslo 80, pridá sa stearát horečnatý, premieša sa a uzatvorí do dvojdielnych želatínových kapsúl patričnej veľkosti.
SK 282452 Β6
Príklad 5
Intravenózny prostriedokmg/ml temozolomid100 hydrogensiričitan sodný, USP3,2
EDTA, dvojsodná soľ, USP0,1 voda pre injekcie, g. s. ad 1,0 ml
Príklad 6
Intravenózny prostriedokmg/ml temozolomid100
O6-benzylguanín100 hydrogensiričitan sodný, USP3,2
EDTA, dvojsodná sól, USP0,1 voda pre injekcie, g. s. ad 1,0 ml
Tento vynález môže byť uskutočnený aj v iných formách alebo môže byť uskutočňovaný aj inými spôsobmi bez toho, aby sa odklonil od svojej myšlienky alebo svojich základných charakteristík. Predkladané zverejnenie má byť preto považované vo všetkých ohľadoch za vysvetľujúce a nie obmedzujúce, pričom rozsah vynálezu je daný predloženými patentovými nárokmi, a zámerom bez ďalšieho je zahrnúť všetky zmeny, ktoré patria pod rovnaký význam alebo rozsah ekvivalencie.
Claims (6)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Kombinovaný farmaceutický prostriedok na simultánne, oddelené alebo postupné použitie na liečbu ľudských nádorových buniek, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo O6-benzylguanínu a účinné množstvo temozolomidu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi.
- 2. Kombinovaný farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok je na simultánne použitie na liečenie rakoviny ľudských buniek.
- 3. Kombinovaný farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok je na oddelené použitie na liečenie rakoviny ľudských buniek.
- 4. Kombinovaný farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že uvedený prostriedok je na následné použitie na liečenie rakoviny ľudských buniek.
- 5. Použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na prípravu farmaceutického prostriedku na simultánne, oddelené alebo postupné použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek.
- 6. Farmaceutický kit na použitie pri liečbe ľudských nádorových buniek, vyznačujúci sa tým, že obsahuje oddelene farmaceutický prostriedok temozolomid a oddelene farmaceutický prostriedok O6-benzylguanín.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US475493A | 1993-01-14 | 1993-01-14 | |
PCT/GB1994/000065 WO1994015615A1 (en) | 1993-01-14 | 1994-01-13 | Potentiation of temozolomide in human tumour cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SK89295A3 SK89295A3 (en) | 1996-06-05 |
SK282452B6 true SK282452B6 (sk) | 2002-02-05 |
Family
ID=21712364
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SK892-95A SK282452B6 (sk) | 1993-01-14 | 1994-01-13 | Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0922458A1 (sk) |
JP (1) | JPH08505615A (sk) |
KR (1) | KR100352046B1 (sk) |
CN (1) | CN1277541C (sk) |
AU (1) | AU5838494A (sk) |
CA (1) | CA2153775C (sk) |
CZ (1) | CZ286550B6 (sk) |
FI (1) | FI953423A (sk) |
HU (1) | HUT72665A (sk) |
IL (1) | IL108328A (sk) |
MX (1) | MX9400434A (sk) |
MY (1) | MY116474A (sk) |
NO (1) | NO952781L (sk) |
PL (1) | PL175842B1 (sk) |
RU (1) | RU2148401C1 (sk) |
SK (1) | SK282452B6 (sk) |
TW (1) | TW414710B (sk) |
UA (1) | UA29466C2 (sk) |
WO (1) | WO1994015615A1 (sk) |
ZA (1) | ZA94248B (sk) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5731304A (en) * | 1982-08-23 | 1998-03-24 | Cancer Research Campaign Technology | Potentiation of temozolomide in human tumour cells |
US5942247A (en) * | 1996-07-31 | 1999-08-24 | Schering Corporation | Method for treating pediatric high grade astrocytoma including brain stem glioma |
US5939098A (en) * | 1996-09-19 | 1999-08-17 | Schering Corporation | Cancer treatment with temozolomide |
US6251886B1 (en) | 1998-12-07 | 2001-06-26 | Schering Corporation | Methods of using temozolomide in the treatment of cancers |
AU2021700A (en) * | 1998-12-07 | 2000-06-26 | Schering Corporation | Methods of using temozolomide in the treatment of cancers |
US6635677B2 (en) | 1999-08-13 | 2003-10-21 | Case Western Reserve University | Methoxyamine combinations in the treatment of cancer |
US6465448B1 (en) * | 1999-08-13 | 2002-10-15 | Case Western Reserve University | Methoxyamine potentiation of temozolomide anti-cancer activity |
CN100346784C (zh) * | 2002-02-22 | 2007-11-07 | 先灵公司 | 抗肿瘤剂,特别是替莫唑胺的药物制剂,其制备方法和用途 |
EP1553962B1 (en) * | 2002-05-31 | 2010-02-24 | Transmolecular, Inc. | Combination chemotherapy with chlorotoxin |
CN100402091C (zh) * | 2005-02-03 | 2008-07-16 | 山东蓝金生物工程有限公司 | 一种抗癌药物组合物 |
CN100350974C (zh) * | 2005-02-03 | 2007-11-28 | 山东蓝金生物工程有限公司 | 一种抗癌药物组合物 |
CN100350975C (zh) * | 2005-02-03 | 2007-11-28 | 山东蓝金生物工程有限公司 | 抗癌药物组合物 |
CN100431605C (zh) * | 2005-02-03 | 2008-11-12 | 山东蓝金生物工程有限公司 | 一种抗癌药物组合物 |
GB0502573D0 (en) * | 2005-02-08 | 2005-03-16 | Topotarget As | Therapeutic compounds |
WO2008022535A1 (fr) * | 2006-08-09 | 2008-02-28 | Tian Jin Tasly Group Co., Ltd. | Composition pharmaceutique pour traiter le gliome du cerveau, son procédé et sa préparation pharmaceutique |
JP2011520914A (ja) | 2008-05-15 | 2011-07-21 | トランスモレキュラー, インコーポレイテッド | 転移腫瘍の処置 |
HUE034119T2 (en) | 2010-02-04 | 2018-01-29 | Morphotek Inc | Chlorotoxin polypeptides and conjugates and their use |
WO2011142858A2 (en) | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Chlorotoxin variants, conjugates, and methods for their use |
CN103169664B (zh) * | 2011-12-25 | 2015-04-22 | 复旦大学 | 一种rgd肽修饰的双层载药纳米粒及其制备方法 |
WO2014093403A1 (en) | 2012-12-10 | 2014-06-19 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Lipocalin fusion partners |
US11559580B1 (en) | 2013-09-17 | 2023-01-24 | Blaze Bioscience, Inc. | Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof |
-
1994
- 1994-01-13 RU RU95122792A patent/RU2148401C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 JP JP6515840A patent/JPH08505615A/ja active Pending
- 1994-01-13 EP EP98119295A patent/EP0922458A1/en not_active Withdrawn
- 1994-01-13 SK SK892-95A patent/SK282452B6/sk unknown
- 1994-01-13 UA UA95083801A patent/UA29466C2/uk unknown
- 1994-01-13 HU HU9502117A patent/HUT72665A/hu unknown
- 1994-01-13 PL PL94309915A patent/PL175842B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 AU AU58384/94A patent/AU5838494A/en not_active Abandoned
- 1994-01-13 CA CA002153775A patent/CA2153775C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-01-13 EP EP94904249A patent/EP0679086A1/en not_active Ceased
- 1994-01-13 TW TW083100235A patent/TW414710B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 CN CNB941911756A patent/CN1277541C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-01-13 MX MX9400434A patent/MX9400434A/es not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 IL IL108328A patent/IL108328A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 WO PCT/GB1994/000065 patent/WO1994015615A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-01-13 KR KR1019950702892A patent/KR100352046B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-01-13 MY MYPI94000083A patent/MY116474A/en unknown
- 1994-01-13 ZA ZA94248A patent/ZA94248B/xx unknown
- 1994-01-13 CZ CZ19951797A patent/CZ286550B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-07-13 NO NO952781A patent/NO952781L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-07-13 FI FI953423A patent/FI953423A/fi not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
MX9400434A (es) | 1994-07-29 |
CN1277541C (zh) | 2006-10-04 |
FI953423A (fi) | 1995-08-23 |
KR960700063A (ko) | 1996-01-19 |
JPH08505615A (ja) | 1996-06-18 |
CA2153775C (en) | 2000-11-14 |
EP0679086A1 (en) | 1995-11-02 |
MY116474A (en) | 2004-02-28 |
TW414710B (en) | 2000-12-11 |
NO952781D0 (no) | 1995-07-13 |
CN1117711A (zh) | 1996-02-28 |
HUT72665A (en) | 1996-05-28 |
CZ286550B6 (cs) | 2000-05-17 |
PL175842B1 (pl) | 1999-02-26 |
HU9502117D0 (en) | 1995-09-28 |
KR100352046B1 (ko) | 2003-09-03 |
FI953423A0 (fi) | 1995-07-13 |
WO1994015615A1 (en) | 1994-07-21 |
IL108328A (en) | 2010-05-31 |
IL108328A0 (en) | 1994-04-12 |
PL309915A1 (en) | 1995-11-13 |
CA2153775A1 (en) | 1994-07-21 |
UA29466C2 (uk) | 2000-11-15 |
RU2148401C1 (ru) | 2000-05-10 |
NO952781L (no) | 1995-09-13 |
AU5838494A (en) | 1994-08-15 |
ZA94248B (en) | 1994-07-13 |
EP0922458A1 (en) | 1999-06-16 |
SK89295A3 (en) | 1996-06-05 |
CZ179795A3 (en) | 1996-04-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SK282452B6 (sk) | Kombinovaný farmaceutický prostriedok na liečbu ľudských nádorových buniek, použitie O6-benzylguanínu a temozolomidu na jeho prípravu a farmaceutický kit | |
Ishikawa et al. | Positive correlation between the efficacy of capecitabine and doxifluridine and the ratio of thymidine phosphorylase to dihydropyrimidine dehydrogenase activities in tumors in human cancer xenografts | |
AU714057B2 (en) | A pharmaceutical composition containing N-phosphonoglycine derivatives for inhibiting the growth of viruses and cancers | |
US6552059B2 (en) | Pharmaceutical composition for and method of treating leukemia | |
EP0821586B1 (en) | A pharmaceutical composition containing benzimidazole for inhibiting the growth of cancers | |
US5731304A (en) | Potentiation of temozolomide in human tumour cells | |
EP2818170B1 (en) | N-(4-((3-(2-amino-4-pyrimidinyl)-2-pyridin yl)oxy)phenyl)-4-(4-methyl-2-thienyl)-1-phthalazinamine for use in the treatment of antimitotic agent resistant cancer | |
US20020156023A1 (en) | Lometrexol combination therapy | |
KR20080004495A (ko) | 암을 치료하기 위한 조합물, 방법 및 조성물 | |
US5576316A (en) | Method for inhibiting tumor growth rate using creatine or creatine analogs | |
US6906091B2 (en) | Method of cancer treatment | |
KR19990036138A (ko) | 암 성장을 억제하기 위한 플루코나졸의 용도 | |
WO1997004761A1 (en) | Methods and compositions for treating cell proliferative disorders | |
JPH11511136A (ja) | 癌の成長を阻害するためのグリセオフルビンの使用 | |
KR19990036136A (ko) | 암 성장을 억제하기 위한 1h-1,2,4-트리아졸 유도체의 용도 | |
MXPA98000944A (es) | Uso de derivados de 1h-1,2,4-triazol para inhibirel crecimiento de canceres | |
CZ323597A3 (cs) | Farmaceutický prostředek obsahující N-chlorfenylkarbamáty a N-chlorfenylthiocarbamaty pro inhibici růstu virů a karcinom | |
US6638914B1 (en) | Pharmaceutical administration of adenosine agonists | |
CA2672716C (fr) | Nouvelle utilisation therapeutique pour le traitement des leucemies | |
WO2009047752A1 (en) | Breast cancer therapy | |
AU721950B2 (en) | Potentiation of temozolomide in human tumour cells | |
CA2444334A1 (fr) | Associations pharmaceutiques a base de derives de pyridoindolone et d'agents anticancereux | |
EP2711008A1 (en) | N6,N6-dimethyladenosine for use in treating or preventing primary and metastatic breast cancer | |
Dhingra et al. | Expanding horizons in the treatment of mantle cell lymphoma: Ibrutinib a novel BTK-targeting inhibitor | |
EP2711009A1 (en) | Compounds for use in treating or preventing primary and metastatic breast and prostate cancer |