HUT72665A

HUT72665A - Potentiation of temezolomide in human tumor cells

Info

Publication number: HUT72665A
Application number: HU9502117A
Authority: HU
Inventors: John Colin Baer; Azadeh Alison Freeman; Geoffrey Paul Margison; Edward Stuart Newlands; Joseph Anthony Rafferty; Amanda Jean Watson
Original assignee: Cancer Res Campaign Tech
Priority date: 1993-01-14
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1996-05-28
Also published as: PL175842B1; EP0922458A1; SK89295A3; CA2153775A1; EP0679086A1; KR100352046B1; UA29466C2; RU2148401C1; JPH08505615A; NO952781L; FI953423A; FI953423A0; MY116474A; CN1117711A; IL108328A0; IL108328A; PL309915A1; CN1277541C; CZ286550B6; NO952781D0

Description

A találmány tárgya eljárás temozolomid! toxicitásának fokozá sára emberi ráksejtekben, amely abból áll, hogy ilyen kezelésére szoruló beteget ATase inhibitor ATase-t inhibiáló mennyiségével és hatásos mennyiségű temozolomiddal kezelnek.

A találmány tárgyát képezi továbbá ATase inhibitor felhasználása emberi ráksejtek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására, valamint az így előállított gyógyszerkészítmények, és szűrőmódszer a temozolomid toxicitás ATase inhibitorral történő potenciálásának meghatározására.

SB.G.&K

Nemzetközi Szabadalmi Iroda H-1062 Telefon:

Budapest, Andrássy út 113,

34-24-950, Fax: 34-24-323 ♦ · · • · · ·

60.979/BE

Eljárás temozolomid hatásfokozására emberi daganat ^sejtekben

CANCER RESEARCH CAMPAIGN TECHNOLOGY, LTD., LONDON, GB

Feltalálók:

BAER John Colin, ISLINGTON, LONDON, GB

FREEMAN Azadeh Alison, MITCHAM, CROYDON, GB

NEWLANDS Edward Stuart, LONDON, GB

WATSON Amanda Jean, GODLEY HYDE, CHESHIRE, GB

RAFFERTY Joseph Anthony, EDGELEY STOCKPORT, CHESHIRE, GB

MARGISON Geoffrey Paul, POYNTON CHESHIRE, GB

A bejelentés napja: 1994. 01. 13.

Elsőbbsége: 1993. 01. 14. (08/004,754) US

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/GB94/00065

A nemzetközi közzététel száma: WO 94/15615

A találmány előzményei

Úgy találták, hogy a temozolomid vagy 8-karbamoil-3-metil-imidazo[5,1-d]1,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-on (CCRG 81045, NSC 36856) értékes daganatellenes tulajdonságokkal rendelkezik, lásd Newlands és mások közleményét [Br. J. Cancer, 65, 287.

(1992)] . A klinikai gyakorlat során a temozolomid astrocytomával, gliomákkal, rosszindulatú melanomával és mycosis fungoidesszel szemben mutatott aktivitást. A gyógyszer akkor a leghatásosabb, ha azt ismételt dózisprogram szerint adagolják.

Például MTIC-vel (a temozolomid aktív, metilező fajtája) végzett reakcióból származó metilezett 0^-alkil-guanint megjavítja az 0^-alkil-guanin DNS alkiltranszferáz (ATase). Az ATase-t kibocsátó sejtek metilezőszerekkel (például Zlotogoski és mások, Carcinogenesis, 5. köt., 83. old., (1984); Gibbson és mások, Cancer Rés. 46. köt., 4995. old. (1986)), 0^-metil-guaninnal végzett kezelése (például Dolan és mások, Biophys. Rés. Commun., 132. köt., 178. old., 1985)) vagy 0^-benzil-guaninnal (O⁶-BG; Dolan és mások, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87. köt., 5386. old., (1990)) végzett kezelése ily módon a klór-etilező szerek citotoxikus hatásainak növekedését mutatta, miközben ATase-t ki nem bocsátó sejtekben érzékeny!tést nem, vagy csak kis mértékben figyeltek meg.

Az 5 091 430 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Moschel, Dolan és Pegg megemlítik, hogy a klór-etilező szerek hatásfokának növelésére ATase aktivitásnak csupán átmeneti csökkenésére van szükség ahhoz, hogy a klór-etilező szerek hatás fokát javítsuk. A WO 91/13898 számon közzétett nemzetközi szabadalmi leírás például azt említi meg, hogy SF 767 sejtekben az 0^-benzil-guaninnal kombinált Me CCNU esetében, az Me CCNU ED₅₀értéke 3,8-szorosával csökken. így Moschel és mások azt mutatják ki, hogy az alkilezőszer anti-neoplasztikus aktivitása általában fokozódik, ha azt egy alkil-transzferáz-fogyasztóval együtt alkalmazzuk .

A bejelentőnek a technika állásához képest meglepő és nem várt találmánya abban áll, hogy a temozolomid kemoterápiás hatása drámai módon (a MAWI sejt esetében a 300-szorosig terjedő mértékben) fokozható, ha olyan speciális adagolási módot alkalmazunk, amely valamely ATase-inhibítor adagolását foglalja magába. Ily módon az olyan emberi sejt- rákmegbetegedések, amelyek ezideig ellenálltak vagy csak kismértékben reagáltak a temozolomid terápiára, a temozolomid valamely ATase-inhibítorral történő kombinálása útján kezelhetővé válnak.

Ennek megfelelően, a jelen találmány legfontosabb tárgya olyan készítmények és módszerek szolgáltatása a temozolomid, mint anti-neoplasztikus szer gyógyhatásának javítására és kiterjesztésére, amelyek azt egy olyan serkentőszerrel kombinált terápia formájában alkalmazzák, mely serkentőszer az Οθ-alkil-guanin DNS alkiltranszferáz (ATase) enzim egy inhibitora.

A jelen találmány további tárgya olyan terápiás módszerek szolgáltatása, amelyek e készítmények és módszerek a temozolidnak az emberi ráksejtekre gyakorolt optimális toxicitás-serkentését biztosítják.

A találmány még további tárgya olyan, ismétlődő temozolomid adagolási módszer szolgáltatása, amely temozolomidot megelőzően vagy egyidejűén valamely ATase inhibitor adagolásával serkent.

A jelen találmány még további tárgya módszer szolgáltatása a temozolomid toxicitásának egy adott emberi ráksejt ATase inhibitora relatív serkentésének meghatározására azáltal, hogy meggyőződünk arról, milyen mennyiségű ATase-t termel a nevezett ráksej t.

A találmány összefoglalása

A jelen találmány tárgyát a temozolomid toxicitás emberi ráksejtekben Οθ-alkil-guanin DNS alkiltranszferáz (ATase) inhibitorokkal történő serkentése képezi. Továbbá adagolási módszert adunk meg optimális terápiára, és módszereket a potenciálisan temozolomid-érzékeny emberi ráksejtek azonosítására.

A rajzok rövid leírása

Az 1. ábra a temozolomid () és CCNU (x) citotoxicitásának ábrázolása az emberi ráksejt ATase tartalmának függvényében (a növekvő ATase tartalmak sorrendjében): ZR-75-1, U87MG, U373, LS174T, LOVO, MCF-7 és MAWI.

A 2. ábra a temozolomid citotoxicitásának ábrázolása pZipneoSV(X)1-transzfektált (o, ) vagy phAT-transzfektált (▼,<) XP-származék sejtekben 10 μΜ BG jelenlétében (, A) vagy távollétében (o,< ). A szórást jelző vonalak +/- 1 s.d.-t mutatnak.

A 3. ábra ismételt napi temozolomid dózisok citotoxicitási arányának grafikonja MAWI (x), MCF-7 (f) vagy U373 (#) emberi ráksejtekben csak a hatóanyag, IC₅₀ (-BG) esetében, BG, IC₅₀(+BG) esetében, BG, IC₅₀ (+BG) előinkubálással összehasonlítva.

A 4. ábra növekvő temozolomid-koncentrációk LOVO (), MAXI (x), MCF-7 (▼), (U373 (#) emberi ráksejtek ATase szintjére gyakorolt hatásának grafikonja.

Az 5. ábra ¹⁴C-temozolomiddal kezelt MAWI (), ZR-75-1 (x) sejtek radioaktív izotópfelvételének grafikonja.

A találmány részletes leírása

A temozolomidnak, mint emberi rákbetegségek kezelésére használható tumor elleni szernek toxicitása nagymértékben fokozható, ha azt egy olyan potenciát növelő szerrel együtt alkalmazzuk, amely az 0⁶-alkil-guanin DNS alkiltranszferáz (ATase) enzim inhibitora. Közelebbről, az ATase inhibitorok, mint az O^-benzil-guanin (B) használata a temozolomid toxicitását például MAWA sejtekben a 300-szorosáig terjedő mértékben képes fokozni, ha azt a jelen találmány szerinti adagolási módon alkalmazzuk, és lehetővé teszi a temozolomid felhasználását olyan emberi rákmegbetegedések kemoterápiás kezelésére, amelyek eddig ilyen terápiára nem vagy csak kismértékben reagáltak.

A temozolomidnak és a lomusztinnek (CCNU) 1 órás gyógyszeres kezelés utáni hasonló toxicitása egy sor, az ATase tartalommal összefüggő emberi rákos sejttel mutatható ki. A DNS-ben lévő guanin -helyzetének temozolomiddal végzett metilezése ily módon egy citotoxikus károsodást eredményez. Az emberi ráksejtek relatív ATase termelésének vizsgálatával meghatározható a temozolomiddal szembeni érzékenység. Egy nagymennyiségű ATase-t termelő sejt csak temozolomiddal szemben kevésbé lesz érzékeny, mint az olyan, amelyik minimális ATase mennyiségeket termel.

A sejtek egyetlen BG dózissal végzett előkezelése a temozozolomid toxicitás csak kismértékű (4-szeresnél kisebb) növekedését idézi elő. A temozolomid és lomusztin (CCNU) fokozó hatása egymáshoz hasonló nagyságrendű. Egy sejtkolónia vizsgálat során BG-vel előkezelt, cDNS-sel transzfektált, fibroblasztok ellnállóbbak maradtak temozolomiddal szemben, mint a kontroll transzfektált fibroblasztok, noha az ATase fehérjét eltávolítottuk. Nem valószínű, hogy ez a temozolomid-transzférnék tudható be, egyszerűen az ATase-nak a phAT-fibroblasztok újra-szintetizálását tükrözi annak érdekében, hogy csökkentse az inhibitorral végzett előkezelés hatását.

Igen meglepő módon azonban, a temozolomid igen nagy (3 00szorosáig terjedő mértékű) toxicitási potencia növekedését tapasztaltuk a MAWI sejtekben öt napos kezelés után. Hasonló hatásfokozódást tapasztaltunk MCF-7 sejtekben is, amelyek szintén nagymennyiségű ATase-t tartalmaznak, de csak kismértékű hatást U373 sejtekben, amelyek kevés ATase-t tartalmaznak.A MAWI és MCF-7 sejtek vizsgálati eredményei arra utalnak, hogy az ATase inhibitor folyamatos jelenléte DNS károsodás kifejlődését teszi lehetővé.

Ily módon a jelen találmány módszert szolgáltat temozolomid emberi ráksejtekre kifejtett toxicitásának növelésére azáltal, hogy egy ATase inhibitor ATase-t inhibiáló mennyiségét, valamint egy olyan, temozolomidot és egy ATase inhibitort tartalmazó terméket adagol kombinált készítmény alakjában emberi ráksejtekbe szimultán, külön-külön vagy egymás után történő adagolásra.

Az ATase inhibitort előnyös módon több vagy sok napon át, és a temozolomid-dózisok adagolása előtt ismételten adagoljuk. Az ismételt dózisokat 1, 2, 3, 4 vagy 5 napon át, előnyösen a 4. vagy 5. napon át adagoljuk a terápia során.

Továbbá, és legelőnyösebben a temozolomidot néhány napos időtartamon át ismételten adagoljuk és az ATase inhibitor ATase-t inhibiáló mennyiségét mindegyik temozolomid dózis előtt adagoljuk, ami a temozolomid emberi ráksejtekre gyakorolt (például a MAWI sejtek esetében 300-szorosig terjedő) jelentős toxicitásnövekedését eredményezi.

Egy előnyös foganatosítási mód esetében az ATase inhibitort ATase-t inhibiáló, vagyis olyan mennyiségben adagoljuk, amely elegendő a tumor in vivő érzékenyítésére anélkül, hogy a normál szövet túlzott érzékenyítését idézné elő akkor, amikor az ATase inhibitort temozolomiddal együtt alkalmazzuk.

Az ATase inhibitor jelen találmány szerint használandó mennyisége aszerint változik, hogy mekkora a tumorsejtek kezeléséhez szükséges hatásos mennyiség. Megfelelő az az adagolás, ami az ATase inhibitornak koncentrálódását idézi elő a kezelendő tumorsejtekben, ami az ATase aktivitás kimerülését eredményezi, ez például körülbelül 1-2000 mg/kg és előnyösen 10-800 mg/kg mennyiség adagolását jelenti a kemoterápiás kezelést megelőzően.

Az olyan neoplazmidok közé, melyek esetében a temozolomidos kezelés különösen előnyös, tartoznak a karcinómák, melanómák, szarkómák, lymphomák és leukémiák, különösen az astrocytoma, gliomák, rosszindulatú melanómák, és a mycosis fungoides, az Ewing szarkóma, a krónikus lymphocitás leukémia, a tüdő- és melltumorok. Az ATase inhibitoros temozolomid-aktívitás különösen drámai fokozását tapasztaltuk mell-, astrocytoma- és colorektális tumorsej tekben.

Tipikus temozolomid dózisszint általában a 0,1-200, előnyösen 1-20 mg/kg testtömeg/nap vagy testfelület-egységben kifejezve körülbelül 40-400, előnyösen körülbelül 150-300 mg/m²/nap.

Az ATase inhibitoros potenciálás mértéke függ az adott ráksejt-típusban normális körülmények között jelenlévő ATase mennyiségétől. A nagyobb mennyiségű ATase-t tartalmazó ráksejt erőteljesebben potenciálódik előzetes ATase-inhibitor adagolás hatására.

A találmány szerint használható ATase inhibitorok azok az anyagok, amelyekről ismert, hogy ilyen hatásuk van, mint például az 0⁶-alkil-guaninok, mint az O⁶-metil-guanin, az alkenil-guaninok, mit az O⁶-allil-guanin és az 0⁶-aril-guaninok, mint az O⁶-benzil-guanin, és az -benzilezett guanin, guanozin- és a 2'-dezoxi-guanozin vegyületek, melyeket a WO 91/13898 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés ír le. Különösen alkalmas a jelen találmány szerinti felhasználásra az 0⁶-benzil-guanin.

Az ATase-inhibítor adagolása függ a kezelendő ráksejtben normális körülmények között található ATase mennyiségtől, a beteg életkorától és állapotától, és az adott, alkalmazandó ATase inhibitortól.

Úgy találtuk, hogy a temozolomidot legelőnyösebben egymást követő napokon ismételt dózisokban adagolhatjuk és a jelen találmány szerinti, erőteljes potenciáló hatás legelelőnyösebben akkor valósítható meg, ha minden beadott temozolomid dózist megelőzően adjuk be az ATase inhibitornak egy ATase-t inhibiáló dózisát vagy azt a temozolomid dózissal együtt adjuk be. Előnyös módon ATase- inhibitorként 0^-benzil-guanint használunk a négy vagy öt, egymást követő napon, négy vagy öt elosztott dózisba elosztott 150-300 mg/m^ napi mennyiségben adagolt temozolomiddal párhuzamosan. Minden ATase inhibitor dózist előnyös módon mindegyik temozolomid dózist 2-8 órával megelőzően adjuk be. Ez lehetővé teszi a temozolomid toxicitás legnagyobb mértékű potenciálását, és a beteg adott neoplazmájának leghatásosabb kezelését eredményezi. Ezt az adagolási rezsimet legelőnyösebb módon körülbelül négy (4) hét elteltével ismételjük.

A temozolomidnak 0^-benzil-guaninnal történő egy alternatív adagolási módszere a folyamatos adagolási módszer, melynek során a két gyógyszert naponta, négy (4) vagy több napos időtartamon át adagoljuk. Ez a kombinált terápia szükség szerint, folyamatos módon addig hosszabbítható meg, míg javulást el nem érünk.

Ezen túlmenően, egy adott emberi ráksejt ATase-termelése szűrőmódszerként használható a temozolomid nevezett sejtre gyakorolt toxicitásának potenciálására. Egy előnyös módszer szerint az adott szövetek ATase tartalmát például Lee és mások [Cancer Rés.,

51., 619 (1991)] módszere szerint megvizsgáljuk, és meghatározzuk temozolomiddal szembeni potenciális érzékenységüket. Ez a meghatározás azután lehetővé teszi azt, hogy megfelelően kombináljuk egy terápiás rezsimen belül a temozolomidot és az ATase inhibiálását.

A jelen találmányban leírt vegyületekből történő gyógyszerkészítmény előállítása használt iners, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagok lehetnek szilárdak vagy folyékonyak. A szilárd készítmények közé tartoznak a porok, tabletták, diszpergálható granulátumok, kapszulák, ostyák és kúpok. A porok és tabletták körülbelül 5-70 % hatóanyagok tartalmazhatnak. Alkalmas, a szakterületen ismert hordozóanyagok például a magnézium-karbonát, magnézium-sztearát, talkum, cukor, tejcukor szilárd adagolási formaként, orális adagolásra alkalmas formaként a tabletták,porok ostyák és kapszulák használhatók.

Kúpok előállítása céljából valamely olvadáspontú viaszt,

- mint zsírsav-glicerid keveréket vagy kakóvajat először megolvasztunk és ebben homogénen diszpergáljuk keveréssel a hatóanyagot, a megolvadt homogén keveréket ezután megfelelő alakú formákba öntjük és lehűlni hagyva megdermesztjük.

Folyékony alakú készítmények közé az oldatok, szuszpenziók és emulziók tartoznak. Példaként a parenterális injekciók céljára szolgáló vizes vagy víz-propilénglikolos oldatokat említhetjük.

Ide tartoznak az olyan, szilárd halmazállapotú készítmények is, amelyeket közvetlenül a felhasználás előtt orális vagy parenterális adagolásra szánt folyékony készítménnyé kívánunk átalakí tani. Ilyen folyékony készítmények közé tartoznak az oldatok, szuszpenziók és emulziók.

A találmány szerinti vegyületek transzdermálisan is alkalmazhatók. Az ilyen transzdermális készítmények lehetnek krém, lotion, aeroszol és/vagy emulzió alakúak és az erre a célra szolgáló szakterületen szokásos matrixtapasz- vagy -tartálytípusúak lehetnek.

A gyógyszerkészítménynek előnyösen dózisegység alakja van. Ilyen formában a készítmény a hatóanyag megfelelő, vagyis a kívánt cél elérésére alkalmas mennyiségét tartalmazó dózisegységekre van elosztva.

A készítmény egységnyi dózisában jelenlévő aktív vegyület mennyisége változtatható vagy körülbelül 0,1-1000 mg-ra, előnyösebben körülbelül 1-500 mg-ra állítható be az adott alkalmazási körülményeknek megfelelően.

Az adott, alkalmazott dózis a beteg igényétől és a kezelendő állapot súlyosságától függően variálható. Az egy, speciális esetben alkalmazandó megfelelő dózist a megfelelő gyakorlattal rendelkező szakember határozza meg. Kívánt esetben az összes napi dózis a nap folyamán részletekben adható be.

A temozolomid a szokásos, mint például a Wasserman és mások [Cancer, 36, 1258-1268. (1975)] közleményében leírt módszerekkel adagolható. Ahol ez megfelelő, a napi 40-400 mg/m², előnyösen a napi 150-300 mg/m² mennyiségű, 1-5, és legelőnyösen 4-5 egymást követő napon át történő adagolás célszerű. Folyamatos adagolással történő terápia esetében a napi 25-250 mg/m² dózisban történő intravénás adagolás az előnyös. Az orális adagolás ismételt dózismódok esetében alkalmazható.

Az ATase inhibitor a temozolomid beadását megelőzően külön vagy annak beadásával együtt történhet. Ahol ez kívánatos, ott az ATase inhibitor és a temozolomid egymással egy dózisegységbe kombinálható a betegnek történő beadás céljából. Az ilyen kombinált adagolási formák bármilyen, a fentiekben említett adagolási formák lehetnek, de mint fentebb említettük, ezek előnyösen orális vagy intravénás formák.

A temozolomid és az ATase-inhibítor készlet alakban csomagolható. Az ilyen készletben a temozolomidot és az ATase inhibitort külön-külön recepturálhatjuk az adott adagolási módnak megfelelő speciális dózisformákká, és a készlet a beszedésre vonatkozó utasítást tartalmaz. Egy tipikus orális receptúra kiviteli alak esetében ez a készlet tasak alakú lehet, amelyben a temozolomid és az ATase inhibitor orális dózisformái külön-külön vannak recepturálva.

A dózist a beteg kemoterápiás kezelési követelményeinek megfelelően a gyakorlattal rendelkező orvos szükség szerint állíthatja be.

Az itt ismertetett találmányt az alábbi preparatív kiviteli példákkal szemléltetjük, amelyek azonban nem tekinthetők az oltalmi kör korlátozásának.

1. példa

Anyagok és módszerek

- 13 Anyagok

A szövettenyészet közeget az ICN Biomedicals Ltd. (High Wycombe, Egyesült Királyság) cégtől, a borjúmagzat szérumot a Gibco Ltd. (Paisley, Egyesült Királyság) cégtől szereztük be. Az O^-benzil-guanint (BG) Dr. R.C. Moschel (NCI-Frederick Cancer Research & Development Center, Frederick, Maryland) bocsátotta rendelkezésünkre. A temozolomidot és klór-etil-analőgját a mitozolomidot [8-karbamoil-3 -(2-klór-etil)-imidazo[5,1-d] 1,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-ont] a May and Baker Ltd. (Dagenham, Egyesült Királyság) szintetizálta és tárolta dimetil-szulfoxidos oldatban -70°C-on. Minden további vegyszert a Sigma Chemical Co. Ltd. (Poole, Egyesült Királyság) cégtől szereztünk be.

Citotoxicitási tanulmányok

A sejttenyészeteket 10 % borjúmagzat-szérummal, 25 mMol HEPES-sel, glutaminnal és penicillinnel/sztreptomicinnel kiegészített DMEM monorétegekként növesztettük. A citotoxicitási vizsgálatokat HEPES-mentes közegben 5 %-os C0₂-atmoszférában végeztük. 96 kutas lemezek mindegyik kútjában 750-1000 sejtet helyeztünk el és éjszakán át végzett inkubálás után azokat 2 órán át 33 μΜοΙ BG-vel kezeltük vagy ily módon nem kezeltük. 1 óra múlva temozolomidot vagy CCNU-t adtunk hozzájuk, mimellett a DMSO koncentráció az 1 %-ot nem haladta meg. A sejteket friss közegben további 7 napon át tenyésztettük és fehérje tartalmukat a Skehan és mások [J. Natl. Cancer Inst., 82, 1107 (1990)] szerinti NCI szulfo-rodamin vizsgálattal megvizsgáltuk; a tenyésztési • ·

- 14 vizsgálatok azt mutatták, hogy a sejtek a vizsgálati időtartam alatt log-növekedési fázisban voltak. Az ismételt temozolomid adagolási ütemterv szerint a sejteket 24 órás egymás utáni kezeléseknek vetettük alá, minden egyes napon új közegben. A vizsgálatokat minden esetben legalább egy párhuzamossal végeztük.

Emberi ATase cDNS-transzfektált vagy kontroll XP sejteket [Fan és mások, Nucleic Acid Rés., 18, 5723 (1990)] növesztettünk

MEM-ben, a lemez mindegyik kútjában 1000 sejtet helyeztünk el. 3 óra inkubálás után a sejtekhez temozolomidot adtunk MEM-ben frissen hígított állapotban és a lemezeket 5 napig inkubáltuk. A túlélő sejteket Morten és mások [Carcinogenesis, 13, 483 (1992)] által leírt módszerrel vizsgáltuk. A BG kísérletekben 3 párhuzamos minta alakjában 300 sejtet helyeztünk 9 cm-es lemezeken, és azokat 5 órán át hagytuk kapcsolódni. A temozolomidos kezelés előtt 10 μΜοΙ BG-t adtunk hozzá MEM-ben frissen hígított állapotban. 7 nap eltelte után a tenyészeteket Giemsaval festettük meg és megszámoltuk.

C>6-alkil-guanin-DNS alkiltranszferáz vizsgálat

Ezt a vizsgálatot a Lee és mások [Cancer Rés., 51, 619 (1991)] által leírt módon végeztük. így változó mennyiségű sejtkivonatot inkubáltunk olyan DNS-sel, amely a metilcsoportjában [³H] izotóppal jelzett O⁶-metil-guanint tartalmazott, előnyösen 37°C hőmérsékleten 2 órán át 300 μΐ 1 pufferben, amely 1 mg/ml szarvasmarha szérumalbumint tartalmazott. Az inkubálás után 100 μ,Ι 10 mg/ml 1 puffért tartalmazó oldatot és 100 μΐ 4 molos perk15 klórsav oldatot adtunk hozzá gyors egymásutánban. További 2 ml 1 molos perklórsavat adtunk hozzá és az elegyet a DNS savban oldható anyaggá történő lebontása céljából 40 percig 75°C-on melegítettük. A metilezett ATase-t tartalmazó fehérjét ezután centrifugálással összegyűjtöttük, 4 ml 1 molos perklórsavval mostuk, majd 300 ml 0,01 molos nátrium-hidroxid oldatban újraszuszpendáltuk és 3 ml vizes szcintillációs oldatban (Ecoscint A, a National Diagnostics cég gyártmánya), majd megszámoltuk. A sejtek fehérje tartalmát egy BioRad protein vizsgáló készlettel határoztuk meg, szarvasmarha szérumalbumin, mint sztenderd felhasználása mellett. Az ATase aktivitást fmol fehérjére átvitt metilcsoport/mg extraktumban lévő összes fehérje egységben fejezzük ki.

A sejtekr¹⁴C]- izotóppal jelzett temozolomid felvétele

A 8-karbamoil-3 -[⁴⁴C]metil-imidazo[5,1-d]1,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-ont (fajlagos aktivitás 26,3 mCi/mmol) Dr. John Slack (Aston Molecules Ltd., Birmingham, Egyesült Királyság) volt szíves rendelkezésünkre bocsátani. A sejtszuszpenziókat (5xl0⁶/ml) 4°C hőmérséleten egyensúlyoztattuk ki és az izotóppal jelzett gyógyszer 200 μΜ-jával kezeltük. 10θ számú sejtet pipettáztunk eppendorf csövekbe és azokat 250 μΐ olaj keveréken át (4:1 three-in-one; Dow Corning gyártmányú szilikonolaj) centrifuráltuk. A vizes réteget felszívattuk és az olaj réteget óvatosan mostuk további 300 μΐ sóoldattal. Centrifugálás után mindkét réteget p felszívattuk, a sejtszemcsét szövetoldo oldatban mint PROTOSOL bán (kvaterner ammónium-hidroxid toluolos oldata) feloldottuk és

OPTIPHASE^-t (95-99 % diizopropil-naftalint) tartalmazó szcintillációs fiolákba töltöttük.

A citotoxicitási vizsgálatok eredményei

Az adatokat az alábbi 1. táblázat tartalmazza.

1. Táblázat

Egyszeri dózisú citotoxicitás

sej tvonal	temozolomid	CCNU	Atase (fmol/mg protein
	^IC50	^IC50	arányi	^IC50	IC5Q arányi
	[-BG]	[+BG]		[-BG]	[+BG]
	(μΜ)	(μΜ)		(μΜ)	(μΜ)
mell
ZR-75-1	32	23	14	12	25 0,5	<10
MCF-7	325	171	1,9	70	31 2,2	581,3

asztrocitoma

U8 7MG	172	131	1,3	28	8,8	3,2	21,9
U373	131	78	1,7	15	12	1,2	53,2
colorektál	is
LS174T	873	632	1,4	73	13	5,7	199,6
LOVO	848	323	2,6	92	32	2,9	529,0
MAWI	1173	335	3,5	133	30	4,4	992,2

XP sejtvonalak

pZip
phAT	21²	-	-	(0,8)	2,3 _	-	<2
	100²	-	-	(4,2)	,2,3 _	-	1240

·» · * · · · • ·· ··· · ·

A sejteket szövettenyészetekben +/- Οθ-benzil-guanin (BG) hatásának tettük ki az egy temozolomid vagy CCNU dózist megelőzően .

¹ IC₅₀ [-BG]/IC₅₀ [+BG].

A Wasserman es masok szerinti MTT vizsgálat eredményei [Int. J.

Radiat. Oncol. Bioi. Phys., 15, 699 (1988)] .

A zárójelben lévő számok mitozolomidra vonatkoznak.

Az 1. táblázat adatai, melyeket grafikusan az 1. ábra ábrázol, ésszerű összefüggést mutatnak a tumorsejt-fajták temozolomiddal szembeni érzékenységével (amelyet azzal a koncentrációval mértünk, amely 50 %-os növekedést vagy IC₅Q-t eredményez), (r = korrelációs koefficiens = 0,87) vagy CCNU (r = korrelációs koefficiens [ 0,92) és ATase tartalmuk között. A dőlésszögek csaknem párhuzamosak, azzal a különbséggel, hogy moláris alapon a CCNU körülbelül ötször toxikusabb. Egy kivétel az volt, hogy a temozolomidra mérsékelten érzékenyek az MCF-7 sejtek, és ezeknek viszonylag nagy az ATase aktivitása. A nem toxikus BG-dózissal kezelt sejtek 3,5 - 6 - szorosan érzékenyebbek temozolomidra, illetve CCNU-ra.

Az XP kontroli-sejtek a pZipneo SV(X)l-gyel transzfektált xeroderma pigmentosa sejtek [Fan és mások, Nucleic Acids Rés., 18, 5723 (1990)], amelyek alig kimutatható ATase szinteket mutatnak, 4-5-szörösen érzékenyebbek a temozolomidra vagy a CCNU-viszonylatú mitozolomid ágensre, mint a cDNS-transzfektált emberi ATase sejtek (lásd az 1. táblázatot). A temozolomid citotoxicitását illető egyik tenyészetkialakító vizsgálat során (lásd * · ·

- 18 a 2. ábrát), a BG előkezelés az emberi ATase-transzfektált XP sejtek hasonló mértékű potenciálási fokát mutatta, mint a tumorsejtek, de nem volt mérhető hatása a kontroll XP sejtekre, amelyek nem bocsátanak ki ATase-t. Bár a BG az előbbi sejtekben (lásd alább) legyengíti az ATase aktivitást, azok temozolomiddal szemben rezisztensebbek maradtak, mint a pZip-pel transzfektált kontroll fibroblasztok.

Az ismételt adagolási program adatait az alábbi 2 . táblázat tartalmazza.

2. Táblázat

Ismételt dózisú temozolomid citotoxicitás se j t vonal 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap 5. nap

	-BG	+BG	-BG	+BG	-BG	+BG	-BG	+BG	-BG	+BG
U373							51	18
MAWI	319	196	350	59	383	21	383	7,2	326	1,0
MCF	319	89	319	51	375	11

A sejteket szövettenyészetben +/- 0^-benzil-guanin (BG) hatásának tettük ki az ismételt napi temozolomid dózisok alkalmazását megelőzően.

Az ismételt adagolási program a temozolomid toxicitás BG által előidézett drámai potenciálódását mutatta MAWI és MCF-7 sejtekben (lásd a 3. ábrát is).

• ·

- 19 Öt, 24 órás dózissal végzett kezelés után a MAWI sejtkultúra 300-szorosan érzékenyebb volt temozolomidra, ha BG volt jelen. A többszörös temozolomid dózis önmagában nem tolt toxikusabb egyik sejtkultúrában sem, mint egy egyszeri 24 órás dózis. Egy hasonló, U373 sejtekkel végzett vizsgálatnál, melyeknek kis ATase szintje van, a BG jelenléte csak egy 3-szoros potenciálódást mutatott négy 24 órás dózis után.

Alkiltranszferáz szintek

Az alkalmazott BG koncentrációk gyorsan, ki nem mutatható szintre csökkentették MAWI sejtek és emberi ATase transzfektált XP fibroblasztok kezdetben magas ATase tartalmát. A HPLC analízis azt mutatta, hogy a BG stabilis volt a szövettenyészet közegben legalább 24 órán át 37°C hőmérsékleten. Azt találtuk, hogy a temozolomid három órás inkubálás után az UV373, MCF-7, LOV és MAWI sejtekben az ATase tartalom csökkenését idézte elő. 50 %-os csökkenést tapasztaltunk, 50-100 μΜ-nál, mindegyik sejtkultúra esetében (lásd a 4. ábrát), annak ellenére, hogy az MCF-7, és a colorektális (LOVO és MAWI) sejtkultúrák között egyetlen temozolomid-dőzis esetében citotoxicitás értékben 3-4-szeres különbség volt. Hasonló csökkenést tapasztaltunk az érzékenyebb U373 kultúra esetében is, bár az ATase mennyiségek a kimutatási határhoz közeliek voltak.

Annak érdekében, hogy kiküszöböljük a temozolomid-transzportbeli különbségeket, a [¹⁴C] izotóppal jelzett vegyületfelvételt a legérzékenyebb és legellenállóbb sejtkultúrákkal ··· · ·

- 20 (ZR-75-1, illetve MAWI) tanulmányoztuk. Az 5. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy 4°C hőmérsékleten a felvétel igen gyors és mindkét sejtkultúra esetében 5 percen belül befejeződik. Hasonló gyógyszermennyiségeket találtunk mindkét sejtkultúrában, ha azok fehérje-koncentrációját beállítottuk. A gyors felvétel 4°C hőmérsékleten megegyezett a Bull és mások [Biochem.

Pharmacol., 36, 3215 (1987)] által előzetesen kimutatott passzív temozolomid diffúzióval.

2. példa

Orális receptúra mg/kapszula

temozolomid	100
tejcukor, USP	213
mikrokristályos cellulóz	30
nátrium-lauril-szulfát	20
búzakeményítő	25
magnézium-sztearát	2

A temozolomidot és laktózt, mikrokristályos cellulózt, nátrium-lauril-szulfátot és búzakeményítőt összekeverjük, a keveréket 80-as számú szitán átszitáljuk. Hozzáadjuk a magnézium-sztearátot, összekeverjük és megfelelő méretű kétrészes zselatin kapszulákba töltjük.

··«· «

•*· ·

3. példa Orális receptúra	mg/kap;
O⁶-benzil-guanin	100
tejcukor, USP	213
mikrokristályos cellulóz	30
nátrium-lauril-szulfát	20
búzakeményítő	25
magnézium-sztearát	2

Az O^-benzil-guanint, tejcukrot, mikrokristályos cellulózt, nátrium-lauril-szulfátot és búzakeményítőt összekeverjük. A keveréket 80-as szitán átszitáljuk. Hozzáadjuk a magnézium-sztearátot, összekeverjük és a keveréket megfelelő méretű, kétrészes zselatin kapszulákba töltjük.

4. példa

Orális receptúra mg/kapszula

temozolomid	100
0^-benzil-guanin	100
tejcukor, USP	213
mikrokristályos cellulóz	30
nátrium-lauril-szülfát	20
búzakeményítő	25
magnézium-sztearát	2

A temozolomidot, 0 -benzil-guanint, tejcukrot, mikrokrisa ·*·····»·· ····«·*· • · · · · ···· ·· ·· ·· «

- 22 tályos cellulózt, nátrium-lauril-szulfátot és búzakeményítőt összekeverjük. A keveréket 80-as szitán átszitáljuk. Hozzáadjuk magnézium-sztearátot, összekeverjük és a keveréket megfelelő méretű, kétrészes zselatin kapszulákba töltjük.

5. példa

Intravénás receptúramg/ml temozolomid100 nátrium-biszulfit, USP3,2 dinátrium-edetát, USP0,1 injekciós célra alkalmas víz, ad 1,0 ml.

6. példa

Intravénás receptúramg/ml temozolomid100

Οθ-benzil-guanin100 nátrium-biszulfit, USP3,2 dinátrium-edetát, USP0,1 injekciós célra alkalmas víz, ad 1,0 ml.

A jelen találmány egyéb kiviteli alakok formájában és más utakon is megvalósítható anélkül, hogy annak szellemétől és lényegi jellemzőitől eltérnénk. A jelen leírás ezért minden tekintetben szemléltetőnek és nem korlátozó jellegűnek tekintendő.

····

Ρ · *

• « «·<·

- 23 A találmány oltalmi körét a mellékelt igénypontjaink határozzák meg, és oltalmunk minden ezekkel kapcsolatos értelemszerű és egyenértékű változtatásra kiterjed.

··«· • ·· ♦·· 9 9 • · · · · ·»·· ♦· ·· ·· ·

- 24 SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás temozolomid toxicitásának fokozására, azzal j ellemezve, hogy ilyen kezelésre szoruló beteget valamely ATase-inhibítor ATase-t inhibiáló mennyiségével és hatásos mennyiségű temozolomiddal kezelünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitort a temozolomid adagolását megelőzően adagol- j uk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitor valamely 0⁶-alkil-guanin, O⁶-alkenil-guanin, Οθ-aril-guanin, 0^-benzilezett-guanin, guanozin vagy 2'-deoxi-guanozin vegyület.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitor O^-benzil-guanin.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor adagolt mennyisége körülbelül 1-2000 mg/beteg testtömeg-kg.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inhibitor adagolt mennyisége 10-800 mg/beteg testtömeg-kg.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a temozolomidot 150-300 mg/m² testfelület/nap mennyiségben adagoljuk .
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitort és temozolomidot elosztott dózisokban, egymást követő napokon adagoljuk.

·· «
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitort 10-800 mg/beteg testtömeg-kg dózisban a temozolomid beadását megelőzően adagoljuk, a temozolomidot 150-300 mg/m² testfelület/nap mennyiségben adagoljuk, és az ATase inhibitort, valamint a temozolomidot megosztott dózisokban, egymást követő napokon adagoljuk.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitor 0⁶-benzil-guanin.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a temozolomid összdózist legalább négy egyedi dózisra osztjuk el, amelyeket legalább négy, egymást követő napon adagoljuk .
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ATase inhibitort a temozolomid adagolást 2-8 órával megelőzően adagoljuk.
13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azt mellrák-tumor, astrocytoma-tumor, colorektális-tumor, melanoma-tumor, mycosis fungoides-tumor vagy glioma-tumor emberi ráksejtek kezelésére használjuk.
14. ATase inhibitor felhasználása emberi ráksejtek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények gyártására, azzal jellemezve, hogy olyan kombinált gyógymódot alkalmazunk, amely először a nevezett ATase inhibitor, majd ezt követően a temozolomid adagolásából áll.
15. Temozolomid felhasználása emberi ráksejtek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények gyártására, azzal jellemezve, hogy olyan kombinált gyógymódot alkalmazunk, amely először a nevezett ATase inhibitor, majd ezt követően a temozolomid adagolásából áll.
16. Valamely ATase inhibitor és temozolomid alkalmazása ilyen kezelésre szoruló beteg emberi ráksejtjeinek kezelésére.
17. Valamely ATase inhibitor és temozolomid felhasználása ilyen kezelésre szoruló beteg emberi ráksejtjeinek kezelésére szolgáló gyógyszer gyártásánál.
18. Olyan kezelésre szoruló beteg emberi ráksejtjeinek keze lésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amelyre jellemző, hogy hatásos mennyiségű ATase inhibitort és hatásos mennyiségű temo zolomidot tartalmaz.
19. Készlet, melyre jellemző, hogy ilyen kezelésre szoruló beteg emberi ráksejtjeinek kezelésére szolgáló temozolomid gyógyszerészeti dózisformát és egy különálló, ATase inhibitor gyógyszerészeti dózisformát tartalmaz.
20. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy temozolomidot és ATase inhibitort egy vagy több, gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal keverünk össze.
21. Temozolomidot és ATase inhibitort kombinált készítmény alakjában tartalmazó, a hatóanyagok szimultán, külön-külön vagy egymás utáni adagolására szolgáló termék, ilyen kezelésre szoruló beteg emberi ráksejtjeinek kezelésére.
22. Szűrőmódszer temozolomid toxicitásának ATase inhibitorral történő potenciálására emberi ráksejtekben, azzal • » ··· ·· «

- 27 jellemezve, hogy a sejt ATase tartalmát megvizsgáljuk; és meghatározzuk, hogy ez az ATase tartalom elegendő-e ahhoz, hogy ATase inhibitor előzetes adagolásával csökkenthető legyen.