SK281692A3 - Peptides for production of preparations for diagnosis and therapie of system lupus - Google Patents
Peptides for production of preparations for diagnosis and therapie of system lupus Download PDFInfo
- Publication number
- SK281692A3 SK281692A3 SK2816-92A SK281692A SK281692A3 SK 281692 A3 SK281692 A3 SK 281692A3 SK 281692 A SK281692 A SK 281692A SK 281692 A3 SK281692 A3 SK 281692A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- histone
- peptides
- sequence
- autoantibodies
- sle
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims abstract description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 title claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 32
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 claims description 22
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims description 2
- 101710103773 Histone H2B Proteins 0.000 claims 8
- 102100021639 Histone H2B type 1-K Human genes 0.000 claims 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 abstract description 26
- 230000002583 anti-histone Effects 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 3
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039869 Histone H2B type F-S Human genes 0.000 description 1
- 101001035372 Homo sapiens Histone H2B type F-S Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000015266 SAP90-PSD95 Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064582 SAP90-PSD95 Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003460 anti-nuclear Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Vynález sa týka peptidov s antigénnymi alebo imunogénnymi determinantami, ktoré sú rozoznávané protilátkami v telesných tekutinách pacientov, ktorí ochoreli na systémový Lupus erythematodes (SLE).
Doterajší stav techniky
Choroby z okruhu reumatických foriem sú charakterizované množstvom klinických prejavov a širokým spektrom autoprotilátok. Tieto protilátky sú namierené proti rôznym súčastiam normálnych buniek. Medzi uvedené ochorenia patrí systémový Lupus erythematodes (SLE), ktorý sa môže vyskytovať spontánne alebo môže byť vyvolaný liekmi. Pri SLE sa obzvlášť vyskytujú protilátky proti súčastiam bunkového jadra (antinuclear antibodies, ANA-s), ku ktorým patrí medzi inými dvojzávitová deoxyribonukleová kyselina (OS-DNA) a histónové bielkoviny (históny), ribonukleová kyselina (RNA), komplexy DNA a histónov a enzými. Históny pozostávajú z viacerých druhov proteínov (bielkovín), tzv. core-histónov H2A, H2B, H3 a H4, ktoré je možné nájsť v nukleozómoch, a linker-histónov Hl a H5, ktorým sa pripisujú spojovacie funkcie pri výstavbe chromatínu. Mnohokrát sa skúšalo korelovať početnosť autoproti1átok proti špeciálnym antigénom, s určitými obrazmi reumatických ochorení.
Zistilo sa, že pri SLE sa hromadne vyskytujú autoprotilátky proti histónom (AHA-s, antihistonové autoproti1átky). Ako preukazná metóda slúži obvykle enzyme-linked immunosorbent assay.(ELI SA), pri ktorej sa testujú séra pacientov a zdravých porovnávacích osôb voči prečisteným bunkovým častiam (t.j. antigénom). Ako antigény sa pri teste použili pri SLE-sérach medzi inými čisté históny.
Doplnkovo sa ako antigény použili tiež syntetické peptidy alebo peptidy získané odbúraním prírodných histónov, pričom
- 2 tieto peptidy boli tvorené čiastočnými sekvenciami uvedených histónov.
Pritom sa ukázalo, že pri použití jednotlivých histónov a histónových peptidov nie je početnosť pozitívnej reakcie pri ELISA teste vyššia ako cca 50 % a že početnosť pozitívnej reakcie pri sérach pacientov s inými reumatickými ochoreniami je veľká (falošne pozitívne výsledky).
Tak bolo nedávno v jednej štúdii o prediktívnej hodnote identifikácie AHA-s pri pacientoch s SLE (pomocou LE-bunkového testu), Smeenk at al, Scand. J. Rheumatol. Suppl. 56, 78 - 92 (1985) konštatované: hoci 95 % pacientov s SLE bolo v LE-teste pozitívnych, je pravdepodobnosť, že pacient s pozitívnym LE-testom má skutočne SLE, len 27 %.
Podstata vynálezu
Uvedené nedostatky do značnej miery odstraňujú peptidy na výrobu preparátov na diagnostikovanie a terapiu systémového lupusu, ktorého podstata spočíva v tom, že sekvencie aminokyselín sú
| (D | K A | P P | K K | A K | A K, | K | P | K | A | A | K | P | K | A | A | K | P | K | K | A |
| (2) | P | E | P | A | K | S | A | P | A | P | K | K | G | S | K | K | A | V | T | K |
| A | Q | K | K | D | G | K | K | R | K | R | S | E | K | E, | ||||||
| (3) | S | Y | S | V | Y | V | Y | K | V | L | K | Q | V | H | P | D | T | G | I | S |
| S | K | A | M | G | I | M | N | S | F | V | N | D | I | F | E | R | I | A | G E . |
Výhodné uskutočnenia a ďalšie úpravy vyplývajú z ďalších nárokov a z nasledujúceho opisu.
Snahou je zlepšiť prediktívnu hodnotu diagnostických testov na SLE, t.zn. zvýšiť pomer percent skutočne pozitívnych voči falošne pozitívnym a tiež vedieť produkovať monoklonálne protilátky s antiidiotypovými protilátkami, ktoré svojou špecificitou presne odpovedajú autoprotilátkam pacientov s SLE, rovnako ako existuje ďalšia úloha - produkovať antiidiotypové protilátky (monoklonálne protilátky), ktoré účinkujú proti týmto monokloriálnym protilátkam pripadne proti autoprotilátkam pacientov so SLE.
Testovali sa nasledujúce prírodné a umelé peptidy:
Aminokyseliny boli označené skratkami podlá jednopísmenového kódu (one-letter-code): GLY^G, ALA=A, LEU=L, ILE=I, PHE-F, PRO=P, SER=S, THR=T, CES=C, HET=H, TYR=Y, ASN=N, GLN=Q, ASP=0, GLU=E, LYS=K, ARG-R, HIS=H.
podlá
VAL = V,
TRP=W,
Histónové Hl peptidy
Hl-N-koniec
A P A A P
A K K P A
Hl: 55 - 75
R S G V S L (terminus):
A A A P P
G A
Hl: 97 - 116
TKGTG ASGSF
Hl: 76 - 116
K N N S RIKLG
V E T K G TGASG
Hl: 66 - 116
A E K T P
| Hl: | 55 - 166 | |||||
| R S | G V S | L | A | A | Ľ | K |
| E K | N N S | R | I | K | L | G |
| V E | T K G | T | G | A | S | G |
| Hl- | C-terminus | : | 187 | - | 211 | |
| K P | K A A | K | P | K | A | A |
A P K K K
K A L A A
L K S L V
S F K L N K
K P K A A
Histónové H2B-peptidy
RIKLG
TGASG
| H2B : | 1 | - 35 | |||||||||
| P E | P A | K | S A | P | A P | K K G S K | K | A | V | T | K |
| A Q | K K | D | G K | K | R K | R S E K E | |||||
| H2B : | 36 | - 76 | |||||||||
| S Y | S V | Y | V Y | K | V L | K Q V H P | 0 | T | G | I | S |
| S K | A M | G | I M | N | S F | V N D I F | E | R | I | A | G |
I
Η2Β: 94 - 105
I Q T A V R L L L P GE
H2B: 106 - 113
LAK H A VSE
H2B: 113 - 125
G T K A V TKYTS SK
H2B: N - term. 1-21
PEPAK SAPAP
H2B: N - term. 4-11
AKSAPAPK
Histonový H2A-peptid
H2A-N-termínus
SGRGK Q G G K A
Histonové sekvencie:
H2A:
SGRGK A G L Q F E R V G A E L L E L R H L Q L T I A Q G E S H H K
Q G G K A P V G R V G A P V Y A G N A A A I R N 0 G V L P N A K G K .
R A K A K H R L L R L A A V L
R 0 N K K E E L N K I Q A V L
T R S S R K G N Y A E Y L T A T R I I P L L G K V L P K K T
Testom ELISA sa mapovali epitopy autoproti1átok zo 122 reumatických a SLE-sér s peptidmi Hl, H2B a H2A. 80 % sér so SLE a 68 % všetkých sér reagovalo pozitívne tak voči C-koncu Hl ako aj voči N-koncu H2B. Kombináciu obidvoch oblastí je týmto možné považovať za markerovú sekvenciu a preto ako rozlišovacie kritérium pre pacientov so SLE. Ako štruktúrne dáta tak výpočty antigenity a homologické epitopy autoprotilátok, produkovaných in vivo a in vitro, podčiarkujú dominantný antigénny charakter N-konca H2B a C-konca Hl.
Pre ELISA test (Enzyme-1inked-immuno-sorbent-assay) sa použili moduly F16 firmy Nunc so špeciálne vysoko aktivovaným povrchom. Podlá usporiadania testu boli na povrch mikrotitračnej doštičky viazané alebo testované protilátky (priamy test ELISA, prípadne sendvičový test) alebo antigén (nepriamy test ELISA). Antigény sa rozpustili v koncentrácii 50 μί/ml v 0,05 M karbonátovom pufri, pH 9,7. Roztoky protilátok, bunkové suspenzie a vzorky moču sa zriedili v pomere 1:3 v rovnakom pufri a po 100 μί pipetovali na mikrotitračné doštičky. K naviazaniu došlo za 24 hodín pri 4 °C. Po vyprázdnení jamiek nasledovalo budúci deň zablokovanie reaktívnych skupín mikrotitračnej doštičky pri 36 °C 250 μί roztoku blokátora na 1 jamku. Použili sa rôzne roztoky blokátora: 0,5% (hm./obj.) želatína v PBS/azide, 1% (hm./obj.) BSA v PBS/azide, 5% (hm./obj.) BSA v PBS/azide, 10% (obj./obj.) konské sérum v PBS/azide. Potom nasledovalo pridanie 100 μί suspenzie bunkovej kultúry (primárne protilátky) prípadne sér zriedených 1:250 a jednohodinová inkubácia pri izbovej teplote v tme. Po jednorázovom opláchnutí mikrotitračnéj doštičky roztokom Tweenu (pozostávajúceho z 0,1% obj. Tweenu 20 a 150 mM NaCl) sa pripipetovalo 100 μί konjugátu (0,3% obj. králi čí-anti(myší -1gG)IgG-HRP prípadne králi čí-anti(1udský-1gG)IgG-HRP) a inkubovalo 1 hodinu pri izbovej teplote. Nenaviazané protilátky sa odstránili päťnásobným opláchnutím roztokom Tweenu. Chrenová peroxidáza, naviazaná na králičie prípadne ovčie protilátky, katalyzovala po pridaní 100 μί Mcllvainovho pufru (116 mM dihydrogénfosforečnan sodný, 42 mM kyselina citrónová a 1,5 mM ortofenyléndiamín a 0,9 mM peroxid vodíka) za tmy farebnú reakciu, zastavenú pridaním 100 μί 2 M kyseliny sírovej. Extink6 cia v rôznych jamkách bola po kalibrácii proti slepému pokusu stanovená fotometrický pri 490 nm na prístroji Minireader II a vyjadrené boli takto získané hodnoty.
Testom ELISA sa na protilátky testovalo 122 sér so SLE. Testovacie pokusy ELISA ukázali, že N-terminálová oblasť (1 - 35) H2B a C-terminálová oblasť (187 - 211) Hl prednostne predstavovali epitopy protilátok SLE. Práve tak sa ukázalo ako zvlášť výhodné zriedenie 1:250 na obsiahnutie širokého spektra sér s vysokým alebo nízkym titrom v ELISA teste. Hlavný zreteľ sa pritom zo strany vynálezcov bral na IgG-autoproti1 átky.
Výsledky boli vyhodnotené nasledovne:
pacientov ELISA test bol len vtedy pozitívny, ak obidve extinkcie boli väčšie ako 0,2 (cutt off-0,2 z merania slepého pokusu a korekčný faktor pri prekročení väčšom ako 0,2) a boli zreteľne vyššie oproti všetkým ostatným peptidom.
Zo 122 sér bolo 68 % pozitívnych s ohľadom na peptidovú kombináciu. Týchto 122 sér sa rozdelilo na 80 SLE-sér a 42 reumatických sér. Z 80 pacientov s lupusom bolo 80 % pozitívnych na Hl-CT a El, zatiaľ čo zo 42 reumatických pacientov bolo ešte 45 % pozitívnych na Hl-CT a El. Preto N-terminálová oblasť H2B (1 - 31) a C-terminálová oblasť Hl (187 - 211) predstavujú hlavne zachytené antigénne determinanty autoprotilátok pacientov s lupusom. Kombinácia obidvoch týchto peptidov takto môže slúžiť ako rozlišovacie kritérium na klasifikáciu pacientov so SLE voči reumatickým pacientom.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Aby sa podľa tohoto vynálezu pripravili monoklonálne protilátky (antihistonové protilátky), účinkujúce proti autoprotilátkam v telesných tekutinách pacientov so SLE, postupovalo sa v tomto vynáleze nasledovne (schéma I):
(1) Analýza histonových sekvencií (matem. model) (2) Predpoveď antigénnych oblastí (3) Syntéza peptidov odpovedajúcich antigénnym oblastiam.
Peptidy boli pripravené čiastočne voľné, čiastočne viazané na nosič (TentaGel).
(4a) Imunizácia zvierat (myší) syntetickými peptidmi, odpovedajúcimi bodu (3); tieto peptidy sa musia použiť vo forme viazanej na nosič (napr. TentaGely).
| (4b) | Imunizácia buniek | sleziny | in | vitr o | syntetickými | |
| peptidmi, | odpovedajúcimi | bodu | (3). Tu | sa | môžu | použiť volné |
| alebo viazané peptidy. | ||||||
| (5) | Izolácia buniek | sleziny a fúzovanie s | rakovinovými | |||
| bunkami | na hybridómové | bunky, | selekcia | jednotlivých |
(pozitívnych) klonov.
| (6) | Izolácia | vylučovaných | antihistonových | protilátok |
| (AHA). (7) | Skúšky | špecificity a | aktivity umelých | AHA ELISA |
metódou so syntetickými peptidmi z bodu (3) ako antigénmi.
Aby sa pripravili antiidiotypové protilátky pre tento vynález, postupovalo sa podlá tohoto vynálezu nasledovne (schéma II):
(1.1) Výber antigénu:
Antigénom je napr. epitop na autoprotilátkach v sére pacientov so SLE proti histonovým peptidom Hl (187 - 211) a H28 (1 - 35) alebo (1.2) odpovedajúci epitop na monoklonálnych protilátkach, ktoré boli vyprodukované proti tejto peptid/peptidovej kombinácii .
(2) Získanie antigénu/antigénov (2.1) Frakcia protilátok zo SLE séra je zahustená obvyklými postupmi.
(2.2.1) Autoprotilátky, ktoré obsahujú epitopy definované podlá bodu (1), sa zo zahustených protilátkových frakcií selektívne izolujú afinitnochromatografickými postupmi. Na tento účel sú peptidy, definované v bode (1), chemicky alebo adsorbčne naviazané vhodnými postupmi na vhodné nosiče.
Alternatívne je tiež možné tieto peptidy na vhodných materiáloch, napr. TentaGeloch, syntetizovať. Je tiež možné najskôr nasadiť zahustenú frakciu protilátok SLE-séra na kolónu s konjugátom nosič-Hl(187-211), premyť a protilátky naviazané na konjugát eluovať vhodnou metódou. Táto autoproti1átková frakcia sa potom v druhom kroku vedie cez kolónu s konjugá tom nosič-H2B(1-35). Sledované protilátky s dvojakou špecificitou (alebo kríženou špecificitou) sú potom zadržané a môžu sa po premytí eluovať vhodnými metódami. Poradie afinitných krokov je tiež možné zameniť, teda najskôr nasadiť nosiČ-H2B(1-35) a potom nosič-HlC.
(2.2.2) Monoklonálne protilátky, ktoré obsahujú dvoj špecifický epitop, odpovedajúci bodu (1.2), sú izolované podlá schémy I (6) a prečistené.
(3) Imunizačný postup (3.1) Imunizácia in vivo
Autoprotilátky, získané podlá bodu (2), prípadne monoklonálne protilátky, sú použité obvyklým spôsobom na imunizáciu vhodných pokusných zvierat. Môžu sa použiť volné alebo naviazané na vhodných nosičoch, napr. TentaGeloch.
(3.2) Imunizácia in vitro
Autoprotilátky, získané podlá bodu (2), sa môžu použiť na imunizáciu buniek sleziny vhodných pokusných zvierat in vitro podlá známych postupov.
(4) Izolácia buniek sleziny, ktoré produkujú protilátky a ich fúzia s vhodnými rakovinovými bunkami za vzniku hybri domových buniek.
(5) Selekcia a vypestovanie jednotlivých klonov.
(6) Izolácia a čistenie monoklonálnych antiidiotypových protilátok.
Je tiež možné izolovať namiesto bodu (3) 8-lymfocyty z krvi pacientov so SLE (alebo zvierat s autoimunitnou chorobou), fúzovať ich s nádorovými bunkami a zo ziskanývh hybridómových buniek izolovať tie klony, ktoré majú špecificitu definovanú v bode (1). Identifikácia týchto klonov sa robí obvyklými testami, napr. technikou ELISA, s použitím podl’a tohoto patentu vhodnej kombinácie peptid/peptid.
Je jasné, že určenie koncentrácie autoprotilátok (antihistonových protilátok) pacientov so SLE nie je ohraničené len na techniku ELISA.
Koncentrácia AHA môže byť stanovená tiež technikou RIA (Radio-immuno-assay) s použitím rádioaktívne značených N-terminálových peptidov z Hl alebo fluorescenčným imunostano vením s použitím fluorescenčné značených N-terminálových peptidov z H2B a C-term i nálových peptidov z Hl. Odborníkovi je zrejmé, že dôkazy a stanovenie koncentrácie AHA je možné uskutočniť nielen v sérach, ale aj v ďalších telesných tekutinách a súčastiach, napr. v moči.
Podľa tohoto vynálezu sa ukazuje, že antigénne determinanty histónov Hl a H2 môžu byť charakterizované tak umelopripravenými monoklonálnymi protilátkami ako aj ľudskými patogénnymi autoprotilátkami. Aby sa zlepšila antigenita veľmi konzervatívnych a slabo imunogénnych histónov, naviazali sa prečistené triedy histónov, prípadne vybrané syntetické peptidy, na rozličné nosiče.
Z in vivo imunizácie histonovým komplexom, ktorý bol zosieťovaný glutaraldehydom, vznikla IgM-protilátka(1/A8/B1) proti konformačným antigénom. In vivo imunizácia pomocou histónu Hl, naviazaného na Eupergit C, poskytla tri ďalšie monoklonálne Igľí-protilátky 1/H4/C3(IgG2a) , 1/H4/C6(IgG2a) a l/H4/C10(IgG2a), všetky s kappa-špecificitou ľahkého reťazca. Epitop týchto troch monoklonálnych protilátok ležal na
C-konci Hl(187-211).
H2B(22-35) má terminálových použili dva Eupergi t.
Ako anigény boli a peptidy naviazané na jednu IgG2a-protilátku tiež C-koniec od Hl.
Krížová reakcia protilátok s T-koncom ukázať sekvenčnú a nábojovú homológiu obidvoch histonových oblastí. Na in vivo imunizáciu sa N-terminálové peptidy z H2B, naviazané na použité voľné históny, voľné peptidy nosiči. In vitro imunizácia poskytla s reťazcom kappa, ktorej epitopom je
Podľa tohoto vynálezu sa mohli TentaGely úspešne použiť ako nový syntetický nosič na in vitro imunizáciu. TentaGely predstavujú novú triedu naočkovaných kopolymérnych častíc, ktorých polystyrénové jadro je obklopené kefkovitým lemom z polyoxyetylénu. Tieto nosiče sa môžu použiť v jednokrokovom postupe ihneď po peptidovej syntéze na in vitro imunizáciu. TentaGely sa vyznačujú veľmi dobrou biokompatibilitou, chemickou inertnosťou, zlepšenou hyrofilnosťou a v neposlednom rade optimálnou expozíciou uniformných hapténových štruktúr na kontakt s imunokompetentnými bunkami.
Priemyselná využiteľnosť
Získané monoklonálne protilátky sa použili jednak v rôznych imunologických testovacích systémoch, ako je imunodifúzia, hemoaglutinácia, Dot Blot a rôzne varianty ELISA, jednak po naviazaní s fluoreskujúcim izotiokyanátom (FITC) a chrenovou peroxidázou (HRP) v prietokovej cytometrii a Western blottingu.
Claims (17)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Peptidy s antigénnymi alebo imunogénnymi determinantami, ktoré sú rozpoznávané autoproti1átkam i. obzvlášť v
telesných tekutinách pacientov chorých n a systémový Lupus er ythematodes, v y z n a č u . j ú c e s a t ý m , že obsahujú : sekvencie aminokyselín (D K P K A A K P K A A K P K A A K P K K A A P K K K, (2) P E P A K S A P A P K K G S K K A V T K A Q K K 0 G K K R K R S E K E, (3) S Y S V Y V Y K V L K Q V H P 0 T G I S S K A M G I M N S F V N D I F E R I A G E. - 2. Peptidy podlá nároku 1, vyznačujúce sa tým, že obsahujú modifikované peptidové väzby, ako-C0N(CH3)-, -CH2CH2-, -COCH2a/alebo peptidy, ktoré sú modifikované inzerciou a/alebo deléciou a/alebo substitúciou jednej alebo viacerých aminokyselín, pričom ich antigénne alebo imunogénne vlastnosti zostávajú v podstate vždy zachované bezo zmeny.
- 3. Peptidy podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že ich časti obsahujú aspoň jeden antigénny alebo imunogénny determinant (epitop).
- 4. Peptidy podlá nároku 1, vyznačujúce sa tým, že ich časti obsahujú sekvencie aminokyselín hlavne v C-terminálovej oblasti histónu Hl a/alebo v N-terminálovej oblasti histónu H2B.
- 5. Peptid podlá nároku 4, vyznačujúci satým, že obsahuje v podstate úsek sekvencie 187-211 histónu Hl alebo jeho časti s aspoň jedným antigénnym alebo imunogénnym detrminantom (epitopom).
- 6. Peptid podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje úsek sekvencie 1-35 histónu H2B alebo jeho časti s aspoň jedným antigénnym alebo imunogénnym determinantom (epitopom).
- 7. Peptid podlá nároku 4, vyznačujúci sa tým, že obsahuje úsek sekvencie 36-76 histónu H2B alebo jeho časti s aspoň jedným antigénnym alebo imunogénnym determinantom (epitopom).
- 8. Peptidy podlá nárokov 1 až 7, so sekvenčnými a nábojovými homológiami v terminálových oblastiach, vyznačujúce sa tým, že vykazujú krížovú reakciu s autoprotilátkami.
- 9. Peptidy podlá nároku 8, vyznačujúce sa tým, že obsahujú C-koniec histónu H2B a C-koniec histónu Hl.
- 10. Peptidy podlá nárokov 1 až 9, vyznačujúce sa tým, že slúžia ako diagnostické prostriedky na diagnózu SLE .
- 11. Peptidy podlá nároku 10, vyznačujúce sa tým, že slúžia na stanovenie koncentrácie autoprotilátok pacientov so SLE.
- 12. Peptidy podľa nároku 11, vyznačujúce sa tým, že slúžia na stanovenie koncentrácie autoprotilátok pacientov so SLE, pričom autoprotilátky vykazujú krížové reakcie s najmenej dvoma peptidmi.
- 13. Peptidy podľa nároku 12, vyznačujúce sa tým, že obsahujú kombináciu histónu Hl a histónu H2B alebo Hl a aspoň jedného úseku sekvencie N-konca histónu H2B alebo histónu H2B a aspoň jedného úseku sekvencie C-konca histónu Hl alebo aspoň jedného úseku sekvencie C-konca histónu Hl a aspoň jedného úseku sekvencie N-konca histónu H2B .
- 14. Peptidy podľa nároku 13, vyznaču júce s a t ý m , že C-koniec Hl obsahuje sekvenčný úsek 187-211 a N-koniec H2B obsahuje sekvenčný úsek 1-35 a/alebo 36-76.
- 15. Monoklonálna protilátka proti aspoň jednému peptidu podľa nárokov 1 až 12 alebo proti peptidom podľa peptidovej kombinácie podľa nároku 13 alebo 14, vyznačujúca satým, že rozoznáva antigénne alebo imunogénne determinaty (epitopy) tohoto peptidu, prípadne tejto peptidovej kombinácie.
- 16. Antiidiotypová protilátka proti autoprotilátke podľa nároku 1, prípadne proti monoklonálnej protilátke podľa nároku 15, vyznačujúca sa tým, že rozoznáva antiidiotypové protilátky v telesných tekutinách, najmä však autoprotilátky v sérach pacientov so SĽE.
- 17. Antiidiotypová protilátka podľa nároku 16, vyznačujúca sa t ý m, že slúži na diagnózu a/alebo terapiu SĽE.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4130786A DE4130786A1 (de) | 1991-09-16 | 1991-09-16 | Peptide zur herstellung von mitteln zur diagnose und therapie von systemischen lupus |
| US07/946,180 US6369203B1 (en) | 1991-09-16 | 1992-09-16 | Peptides for the production of preparations for the diagnosis and therapy of systemic lupus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK281692A3 true SK281692A3 (en) | 1995-02-08 |
| SK280176B6 SK280176B6 (sk) | 1999-09-10 |
Family
ID=25907381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK2816-92A SK280176B6 (sk) | 1991-09-16 | 1992-09-14 | Monoklonálne protilátky na výrobu prípravkov na di |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6369203B1 (sk) |
| EP (1) | EP0532979B1 (sk) |
| JP (1) | JPH05271281A (sk) |
| AT (1) | ATE155487T1 (sk) |
| CA (1) | CA2078373C (sk) |
| CZ (1) | CZ284114B6 (sk) |
| DE (2) | DE4130786A1 (sk) |
| SK (1) | SK280176B6 (sk) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030144473A1 (en) * | 1992-09-16 | 2003-07-31 | Michael Zeppezauer | Peptides for the production of preparations for the diagnosis and therapy of autoimmun diseases |
| EP0904031A4 (en) * | 1996-05-29 | 2002-05-02 | Cell Genesys Inc | CATIONIC POLYMERS / LIPIDS AS VEHICLES FOR PROVIDING NUCLEIC ACID |
| US20040219140A1 (en) * | 2001-02-22 | 2004-11-04 | Reiner Class | Compositions and methods for preventing platelet aggregation |
| DE10127712A1 (de) * | 2001-06-07 | 2002-12-19 | Torsten Witte | Anwendung von IgM-Antikörpern gegen dsDNA beim systemischen Lupus erythematodes mit Nephritis |
| US20040197838A1 (en) * | 2001-08-03 | 2004-10-07 | Allis C David | Phosphorylated histone h2b as apoptosis marker |
| JPWO2005040798A1 (ja) * | 2003-10-29 | 2007-05-17 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | アルツハイマー病の診断方法 |
| US10131709B2 (en) | 2011-12-28 | 2018-11-20 | Immunoqure Ag | Nucleic acid molecules encoding monoclonal antibodies specific for IL-22 |
| SI2797952T1 (sl) * | 2011-12-28 | 2019-07-31 | Immunoqure Ag | Postopek za pripravo monoklonskih avto-protiteles z želeno specifičnostjo |
| CN112745379A (zh) * | 2021-01-22 | 2021-05-04 | 浙江辉肽生命健康科技有限公司 | 具有氨基酸结构rdnkktriipr的生物活性肽及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2741653A (en) * | 1954-03-19 | 1956-04-10 | Univ California | Method of isolating nucleoproteins |
| US3065141A (en) * | 1960-08-24 | 1962-11-20 | Albert E Gessler | Separation of nucleoproteins and nucleic acids from aqueous protein mixtures |
| US4536479A (en) * | 1983-03-22 | 1985-08-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Use of anti-idiotype antibodies in immunoassays |
| US4818763A (en) * | 1984-01-12 | 1989-04-04 | Volker Rusch | Biologically active substance with hormonal properties, production process thereof and utilization of histones for medical purposes |
| US4699880A (en) * | 1984-09-25 | 1987-10-13 | Immunomedics, Inc. | Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody |
| US4701442A (en) * | 1985-06-13 | 1987-10-20 | Elena Avram | Treatment of symptoms of neoplastic diseases with nucleoproteins |
| JPS6335600A (ja) * | 1986-07-31 | 1988-02-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｔ細胞活性化因子 |
| US5034316A (en) * | 1987-03-30 | 1991-07-23 | The Regents Of The University Of California | In vitro human monoclonal IgG rheumatoid factor autoantibody |
| FR2646425B1 (fr) * | 1989-04-26 | 1991-08-30 | Neosystem Sa | Peptides synthetiques du conjugue de l'ubiquitine et de l'histone h2a |
-
1991
- 1991-09-16 DE DE4130786A patent/DE4130786A1/de not_active Withdrawn
-
1992
- 1992-09-02 DE DE59208706T patent/DE59208706D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-02 AT AT92114992T patent/ATE155487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-02 EP EP92114992A patent/EP0532979B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-14 SK SK2816-92A patent/SK280176B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1992-09-14 CZ CS922816A patent/CZ284114B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-16 CA CA002078373A patent/CA2078373C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-16 US US07/946,180 patent/US6369203B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-16 JP JP4272266A patent/JPH05271281A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2078373C (en) | 1999-01-05 |
| SK280176B6 (sk) | 1999-09-10 |
| JPH05271281A (ja) | 1993-10-19 |
| ATE155487T1 (de) | 1997-08-15 |
| CZ284114B6 (cs) | 1998-08-12 |
| CZ281692A3 (en) | 1993-04-14 |
| EP0532979B1 (de) | 1997-07-16 |
| CA2078373A1 (en) | 1992-12-17 |
| DE4130786A1 (de) | 1993-03-18 |
| DE59208706D1 (de) | 1997-08-21 |
| EP0532979A2 (de) | 1993-03-24 |
| EP0532979A3 (en) | 1994-08-24 |
| US6369203B1 (en) | 2002-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO1994017197A1 (en) | ANTIBODY AGAINST β-AMYLOID OR DERIVATIVE THEREOF AND USE THEREOF | |
| JP2002542157A5 (sk) | ||
| WO2004081047A1 (ja) | モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ | |
| JP4374316B2 (ja) | β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途 | |
| JP3360826B2 (ja) | コラーゲンまたはコラーゲンフラグメントの検出用のイムノアッセイ | |
| JP2988635B2 (ja) | ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体 | |
| JP3829226B2 (ja) | ビメンチンの切断産物に対する抗体 | |
| SK281692A3 (en) | Peptides for production of preparations for diagnosis and therapie of system lupus | |
| Rokeach et al. | Mapping of the immunoreactive domains of a small nuclear ribonucleoprotein-associated Sm-D autoantigen | |
| Farooqui et al. | Antibodies against synthetic peptides predicted from the nucleotide sequence of D2 receptor recognize native dopamine receptor protein in rat striatum | |
| JP2002537783A (ja) | Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための、化合物および方法 | |
| US6350854B1 (en) | Isolated 55 to 72 kDa protein which binds to prion proteins | |
| Fierabracci et al. | Osteopontin is an autoantigen of the somatostatin cells in human islets: identification by screening random peptide libraries with sera of patients with insulin-dependent diabetes mellitus | |
| JP2006008694A (ja) | 全身性エリテマトーデスの診断、治療製剤製造用ペプチド | |
| US20030144473A1 (en) | Peptides for the production of preparations for the diagnosis and therapy of autoimmun diseases | |
| US20210187085A1 (en) | Phospholipase a2 receptor antigens and their medical use | |
| JPH04252954A (ja) | タンパクの測定方法、試薬及びキット | |
| Henriksson et al. | Autoepitope-mapping of the U1-70K Protein with Human–DrosophilaChimeric Proteins | |
| JP2925479B2 (ja) | 肺小細胞癌検出薬及びその使用 | |
| Farooqui et al. | Production and characterization of a monoclonal antibody to dopamine D2 receptor: comparison with a polyclonal antibody to a different epitope | |
| JP4327436B2 (ja) | セミノジェリンの精子運動抑制因子（ｓｐｍｉ）部分を認識するモノクローナル抗体、及び、これを用いる検出方法 | |
| JP4838436B2 (ja) | 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体 | |
| JPH04252955A (ja) | 蛋白質の測定方法、試薬及びキット | |
| WO1996021862A1 (en) | A-protein as a diagnostic of cancer | |
| JP2010254682A (ja) | 抗フィブロネクチンフラグメントモノクローナル抗体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20130114 |