SK281404B6

SK281404B6 - Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch

Info

Publication number: SK281404B6
Application number: SK1407-96A
Authority: SK
Inventors: Debart Pere Ristol
Original assignee: Grupo Grifols, S. A.
Priority date: 1995-11-03
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 2001-03-12
Also published as: ES2099678A1; JPH09187273A; ES2099678B1; US5932468A; HU9602914D0; DE69618536D1; ES2170845T3; ATE211928T1; HU221239B1; MX9605278A; UY24358A1; CZ321596A3; HUP9602914A3; SK140796A3; CZ292651B6; HUP9602914A2; JP3024073B2; AR004224A1; EP0771567B1; DE69618536T2

Abstract

Účinný priemyselne všeobecne využiteľný spôsob inaktivácie vírusov v médiách obsahujúcich proteíny na terapeutické využitie je uskutočňovaný tak, že tieto sa inkubujú pri extrémne alkalickom pH v stabilizovanom prostredí, a to bez denaturácie alebo významného zníženia biologickej aktivity proteínov.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka účinného priemyselne všeobecne využiteľného spôsobu inaktivácie vírusov v médiách obsahujúcich proteíny na terapeutické využitie tak, že sa tieto inkubujú pri extrémne alkalickom pH v stabilizovanom prostredí, a to bez denaturácie alebo významného zníženia biologickej aktivity proteínov.

Doterajší stav techniky

Terapeutické využitie derivátov ľudskej plazmy nie je nikdy úplne bez rizika prenosu vírusov, a to dokonca aj po zavedení metód umožňujúcich selekciu plazmy použitej ako počiatočný materiál. V mnohých prípadoch je prítomnosť vírusovej kontaminácie určovaná nepriamo prostredníctvom sérologických značiek (alanín aminotransferáza) alebo zisťovaním prítomnosti špecifických protilátok (HIV vírus: HIV typ 1 a 2; vírus hepatitídy C: HCV). Skôr ako sa objavia detekovatelné množstvá spomínaných nepriamych indikátorov je následne nutná inkubačná perióda. V priebehu tohto poinfekčného času (window periód) dochádza k výraznému namnoženiu vírusov. V závislosti od druhu vírusu môže táto fáza trvať 3 - 6 mesiacov po infikovaní.

Vďaka citlivosti existujúcich analytických metód môžu byť kontaminované jednotky detekované v priebehu prvých týždňov po infekcii (povrchový antigén vírusu hepatitídy B; HBsAg) alebo v priebehu niekoľkých týždňov (2 alebo 3) až mesiacov (1 alebo 2) pre vírus HIV alebo HCV.

Deriváty ľudskej krvnej plazmy sú pripravované z veľkého množstva plazmových odberov, obvykle oveľa viac ako 1000 jednotiek, takže štatistická pravdepodobnosť výskytu vzorky s vysokým obsahom vírusov (a pritom s negatívnou analytickou odozvou protilátok), a teda aj nebezpečenstva kontaminácie celej počiatočnej zásoby plazmy je veľmi vysoké (pozri Alegre Amor, A.: La transmisión de enfermedades virales por productos sanguíneos. Congreso Hematológia de Granada, Nov. 1994: 175 - 178).

Priame určenie vírusového genómu pomocou metódy znásobenia a detekcie špecifickej DNA, napr. radikálová reakcia polymerázy (PCR) je v súčasnosti používaná v hotových finálnych výrobkoch alebo v jednotlivých bankách počiatočnej plazmy. Aby boli vírusy preukázané, je v týchto prípadoch potrebný vysoký minimálny stupeň kontaminácie.

Následkom toho nemôže byť negatívna hodnota PCR interpretovaná ako úplná absencia vírusov, rovnako ako pozitívna hodnota neznamená nevyhnutne vírusovú infekčnosť.

Preto sú tu dobré dôvody pre špeciálne kroky, týkajúce sa inaktivácie alebo zoslabenia vírusov v priebehu procesu produkcie alebo purifikácie krvných derivátov.

Do dnešnej doby existuje bohatá literatúra týkajúca sa prenosu infekčných látok pomocou krvných derivátov, zároveň pokračuje rozsiahly výskum zameraný na monitorovanie spôsobu prípravy s cieľom dosiahnuť kontrolu vírusovej čistoty plazmových produktov.

Pretože úplná bezvírusovosť je nedosiahnuteľná (vzhľadom na možnosť výskytu neznámych vírusov) a vzhľadom na možné chyby či odchýlky od stanovených výrobných štandardov (GPS) v priebehu prípravy krvných produktov, je súčasným trendom (obzvlášť v určitých krokoch inaktivácie vírusov alebo ako výsledok cross-kontaminácie) zahrnutie zvláštneho dvojitého inaktivačného kroku vo výrobnom procese, čo významne redukuje riziko vírusového prenosu (ECC Guide (CPMP): III/8115/89).

Podobne sa súčasné doporučenia zdravotných úradov týkajúce sa bezvirusovosti usilujú všeobecne o zavedenie druhého inaktivačného kroku pre všetky druhy vírusov, a to ako s externým lipidovým obalom, tak aj bez neho.

Pokiaľ ide o známe vírusy prenášané plazmou, medzi najnebezpečnejšie druhy patria HIV vírusy a vírusy hepatitídy (obzvlášť B a C), ktoré môžu byť inaktivované pomocou známych metód.

Darovaná plazma môže byť tiež infikovaná vírusmi herpes (HSV a HHV) alebo cytomegalovírusmi (CMV), Epstein-Barr vírusmi (EBV), prípadne vírusom ľudskej imunoleucopatie (HTLV-I/II), aj keď pravdepodobnosť ich preniknutia do plazmy je veľmi malá vzhľadom na ich silnú viazanosť na bunky (leukocyty), ktoré sú predtým odseparované.

Ostatné vírusy, ako sú hepatitída A a obzvlášť ľudský parvovírus (PVH B19) môžu byť prítomné v plazme, pretože ich výskyt v populácii darcov je relatívne vysoký. Oba posledné menované vírusy, patria medzi tie vírusy prenášané plazmou, ktoré vykazujú najväčšiu odolnosť voči inaktivácii fyzikálnymi a chemickými činidlami, aj keď môžu byť považované za menej nebezpečné ako tie, ktoré vždy spôsobujú infekciu zdravého pacienta. Ľudský parvovírus je potenciálne nebezpečný pri osobách so zníženou imunitou alebo v priebehu liečenia tehotných žien (nebezpečný pre plod) (pozri Mosquet, N. et al.: Atteinte hématologigue severe lors dune infection a parvovírus B19: Des injections ďantithrombine III sont-elles a origine de la contamination? Therapie 1994; 49: 459 - 76).

V každom prípade by mal byť druhý inaktivačný krok doplnený ďalšími známymi spôsobmi inaktivácie, schopnými zničiť najodolnejšie vírusy bez lipidového obalu. Metódy vyžadujú monitorovanie s ohľadom na príslušné vírusy.

Doposiaľ opísané spôsoby eliminácie vírusov sú založené na fyzikálnych a chemických mechanizmoch, ktoré znižujú kontamináciu pomocou inaktivácie a/alebo fŕakcionácie. Dnes najčastejšie používané metódy môžu byť klasifikované v nasledujúcom poradí.

Chemické spracovanie s rozpúšťadlom (tri-n-butylfosfát a alkylderivátmi fosfátov alebo TNBP) a detergentom (Tween-80 alebo polysorbátom, triton x-100 alebo neiónových povrchovo aktívnych derivátov), symbol S/D (pozri Horowitz, B. et al.: Inactivation of viruses in labile blond derivatives: I. Disruption of lipid- enveloped viruses by Tri-(n-butyl)phosphate detergent combinations. Transfusion 1985; 25:516-522).

Pasterizácia kvapalín pri 60 °C počas 10 hodín v medzistupni alebo konečnom kroku, v prítomnosti stabilizátorov (pozri Ucmura, Y. et al.: Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation. Vox. Sang. 1989; 56: 155 - 61).

Tepelné spracovanie (suché HT) v medzistupni alebo na záver v liekovke (obvykle) pri teplotách vyšších ako 80 °C, s predĺženou expozíciou (pozri Knevelman, A. et al.: Effect of Monosaccharides during Severe Dry Heat Treatment of Coagulation Factor VIII Concentrates. Vox. Sang. 1994; 66:96- 103).

Nanofiltrácia alebo filtrácia vírusov cez membrány majúce jednotné póry menšie, ako je veľkosť vírusov (pozri Burnouf-Radosevich, M. et al., Nanofiltration, a Ncw Spccific Vírus Elimination Method Applied to High-Purity Factor IX and Factor XI Concentrates. Vox. Sang. 1994; 67:132- 138).

Nasledujúce metódy sú používané menej alebo už upadli do zabudnutia: tepelné spracovanie s organickými rozpúšťadlami, inaktivácia s β-propiolaktónom-UV (BPL2

SK 281404 Β6

-U V), metylénová U V modrá (pozri Wagner, S. I. et al.: Mammalian genotoxycity assessment of methylene blue in plasma: implications for vírus inactivation. Transfusion 1995; 35(5): 407 - 413), spracovanie pri stredne kyslom pH (aplikovateľné len na gamaglobulín) (pozri Kempf C. et al.: Vírus inactivation during production of intravenous immunoglobulin. Transfusion 1991; 31(5): 423 - 27).

Všeobecne povedané, tieto metódy sú schopné separovať vírusy alebo zoslabiť ich výskyt, ale nie všetky odstraňujú vírusy účinne. Žiadna z nich nie je schopná zaistiť úplné odstránenie alebo významné zníženie výskytu všetkých vírusových typov. Preto má každá metóda svoje výhody, prípadne nevýhody.

Stupeň vírusovej eliminácie by mal v ideálnom prípade spĺňať určité požiadavky, z ktorých niektoré nie sú dodržané ani súčasnými najrozšírenejšími inaktivačnými metódami. Týmito požiadavkami sú:

1. Ak je aplikovaných viac inaktivačných metód na rovnaký proces čistenia, mali by pôsobiť rôznymi fyzikálnymi mechanizmami. Napríklad fyzikálne metódy inaktivácie (inaktivácia alebo fŕakcionizácia) tvoria dobrú kombináciu s chemickými metódami (inaktivácia).

2. Metódy by mali byť aktívne proti všetkým vírusovým druhom. Spôsoby inaktivácie majú obmedzený alebo žiadny vplyv na vírusy majúce vyššiu fyzikálnu a chemickú odolnosť ako napríklad vírusy bez lipidového obalu (spracovanie s S/D je neúčinné proti takýmto vírusom; BPL-UV metóda a metóda s metylénovou UV modrou, rovnako ako tepelné spracovanie pri teplotách nižších, ako je 80 °C vykazujú len obmedzený účinok). V princípe, pasterizačný spôsob je účinnou inaktivačnou metódou proti všetkým vírusovým druhom, avšak jeho účinok je znehodnotený v prípade, že koncentrácia stabilizátorov alebo proteínov je príliš vysoká, vzhľadom na mechanizmus vírusovej ochrany. Potlačenie vírusov je teda nevýznamné v prípade najviac termorezistentných druhov v prostriedkoch s vysokými koncentráciami stabilizátorov alebo proteínov.

Filtrácia vírusov cez membrány redukuje výskyt všetkých druhov vírusov bez ohľadu na ich fyzikálnu a chemickú rezistenciu, avšak závisí od relatívnej veľkosti vírusov a pórov membrány. Následkom toho nemôžu byť najmenšie vírusy úplne eliminované, pričom nanešťastie väčšina z nich patrí medzi vírusy bez lipidového obalu (ľudský parvovírus, hepatitída A a poliovírus).

3. Metóda nesmie zahŕňať biologickú deaktiváciu alebo denaturáciu proteínov, prípadne tento efekt musí byť veľmi malý a v žiadnom prípade nesmie viesť ku vzniku materiálov s antigénovou odozvou. Niektoré spôsoby chemickej inaktivácie vedú k chemickým zmenám proteínov (BLPUV) a podobne aj tepelné spracovanie, za sucha alebo v kvapaline (pasterizácia), má takmer nevyhnutelne za následok denaturáciu proteínov (do určitej miery), a to, čí už molekuly, ktorá je predmetom záujmu alebo sprievodných kontaminujúcich proteínov.

4. Možnosť zavedenia inaktivácie v záverečnom kroku. Chemická inaktivácia je v záverečnom kroku problematická vzhľadom na nutnosť separácie použitých chemických činidiel (S/D, BPL, tiokyanáty), s výnimkou inaktivačných metód pomocou metylénovej modrej (Napriek tomu treba brať do úvahy, že vedľajšie produkty tejto reakcie nie sú úplne nevinné). Tiež niektoré pasterizačné spôsoby sú vykonávané ako medzistupeň vzhľadom na potrebu následného odstránenia denaturovaného materiálu a použitých stabilizátorov. Tepelné spracovanie za sucha sa často používa v konečnej fáze alebo až v liekovkách.

Nanofiltrácia sa obvykle uskutočňuje v záverečnej fáze v roztoku tak, že v určitých prípadoch nie sú nutné ďalšie následné manipulácie.

5. Pri inaktivačnom kroku nesmú byť prítomné žiadne toxické rezíduá (chemické činidlá). Väčšina chemických postupov vyžaduje následný krok na odstránenie činidiel. V závislosti od toxicity chemických kontaminantov a početnosti uskutočňovania by mal byť ustanovený maximálny povolený limit (ako je u spomínaných prípadov S/D, BPL a tiokyanátov). Spôsoby inaktivácie (tepelné) alebo frakcionácic (nanofiltrácia) sú však bez týchto nedostatkov.

6. Metóda by mala byť uskutočniteľná v priemyselnom meradle, proces by mal byť reprodukovateľný a mal by byť, schopný monitorovania prostredníctvom známych ľahko adjustovateľných parametrov. Chemická inaktivácia je ovplyvnená koncentráciou produktov (proteínov, solí, stabilizátorov a chemických činidiel) rovnako ako teplotou a pôsobením svetla. Občas však môžu niektoré nekontrolovateľné parametre ovplyvniť spotrebu spomínaných inaktivačných činidiel (ak dochádza k chemickej reakcii) alebo sa počiatočný roztok na inaktiváciu môže nachádzať v nereprodukovateľných podmienkach (prítomnosť častíc a sedimentov a pod.). Tepelná inaktivácia za sucha (v liekovkách) je závislá od zostatkovej vlhkosti obsahu liekoviek, ktorá sa môže líšiť od várky k várke, takže tento parameter nemôže byť monitorovaný zodpovedajúcim spôsobom.

7. Prednosť je dávaná jednoduchým metódam, ktoré nevyžadujú žiadne doplnkové čistiace kroky. Ako už bolo spomenuté v bode 5, chemická inaktivácia vyžaduje následné kroky na odstránenie toxických látok. Okrem toho sem je možné zahŕňať tiež pasterizačné metódy vyžadujúce vysokú stabilizáciu na ochránenie proteínov (pasterizácia FIX, FVIII, ΑΤΙΠ, al-PI, IM alebo IV gamaglobulinov- a pod.).

8. Inaktivačné metódy musia byť použiteľné v priemyselnom meradle a za prijateľnú cenu vzhľadom na materiály a použité činidlá. Nanofiltrácia je prípadom, kde je zariadenie vyradené po jednom použití, takže produktivita v gramoch proteínu za hodinu a na jednotku povrchu je malá, čo má za následok obmedzenú priemyselnú použiteľnosť na malovýroby proteínov.

Konečne, inaktivácia vírusov bez lipidového obalu je stále predmetom početných štúdii s cieľom preukázať účinnosť nových metód a bezpečnosť inaktivácie vzhľadom na možné alterácie spracovávaných proteínov (pozri Highsmith, F. A. et al.: Inactivation of lipid-enveloped model viruses in normál human plasma by crosslinked starch-iodide. Transfusion 1994; 34: 322 - 327).

Ako už bolo spomenuté, ľudský parvovírus (PVH B19) a vírus hepatitídy A sú hlavnými vírusmi bez lipidového obalu, prenikajúce do derivátov ľudskej plazmy alebo krvi. Preto by vývoj druhého inaktivačného kroku mal byť zameraný hlavne na zníženie obsahu týchto vírusov.

Prenos ľudského parvovírusu a vírusu hepatitídy A vďaka podávaniu AHF inaktivovaného len pomocou S/D bol detekovaný u hemofilných pacientov. Bola tiež opísaná nákaza ľudským parvovírusom prostredníctvom infúzie AHF inaktivovanej pasterizáciou. Tiež bolo ukázané, že pasterizácia proteínov v stabilizovaných médiách pri vysokých koncentráciách chráni vírusy, takže zníženie infekčnosti je nevýznamné pokiaľ ide o vírusy PVH B19 a HAV.

Nedávno boli opísané niektoré prípady komplikácii na plode po podávaní preparátov antitrombínu III tehotným matkám (pozri Mosquct, N. et. al.: Atteinte hématologique sévere lors dune infection á parvovírus B19: Des injections ďantithrombine III sont-elles á origine de la contamina3 tion? Therapie 1994; 49: 459 - 76). Tieto prípady nastali kvôli kontaminácii ľudskými parvovírusmi, čo je samo o sebe dôvod na kontraindikáciu, vzhľadom na pomer riziko/výhody a vzhľadom na možnosti alternatívnych postupov.

Predmetom vynálezu je účinný spôsob inaktivácic vírusov s lipidovým obalom alebo bez neho, v médiách obsahujúcich proteíny z biologických zdrojov pomocou spracovania pri extrémne alkalickom pH za podmienok, keď proteíny nie sú denaturované vďaka ochrane stabilizátormi.

Uvedený úvod na jednej strane vypočítava použitie špecifických spôsobov inaktivácie, ako je dvojnásobný inaktivačný krok na zníženie rizika prenosu vírusov. Tento úvod tiež ukazuje požiadavky na ideálny inaktivačný spôsob a zároveň dokazuje, že toto je stále ešte predmetom výskumu. Úvod tiež opisuje prípad špecifickej kontraindikácie, týkajúci sa podávania krvných derivátov (antitrombín III), ák nie je zahrnutý krok odstraňujúci vírusy bez lipidového obalu.

Súčasný stav techniky nedosahuje základné charakteristiky vynálezu, čo sa týka efektívneho lacného spôsobu odstránenia vírusov bez lipidového obalu, hlavne v prípadoch výrobkov kontraindikovaných na terapeutické použitie vďaka podozreniu na prítomnosť rezistentných vírusov (ľudský parvovírus) v konečnom produkte (antitrombín III) (pozri Mosquet, N. et. al.: Atteinte hématologique sévere lors ďune infection á parvovírus B19: Des injections d'antithrombine III sont-elles á origine de la contamination? Therapie 1994; 49: 459 - 76).

Pravdepodobne neexistuje žiadny predchádzajúci opis alebo dokumentácia spôsobu vírusovej inaktivácie pri vysoko alkalickom pH navrhnutom pre terapeuticky používané proteíny. Jedinou známou vecou je potenciálna schopnosť alkálií zabíjať niektoré vírusy, takže tento spôsob sa používa ako dezinfekčná metóda v chromatografických kolónach, ultrafiltroch a ďalších viacnásobne používaných zariadeniach, aby sa zabránilo cross-kontaminácii medzi jednotlivými dávkami. Tento spôsob sa však nikdy nepoužíval na vírusovú inaktiváciu proteínov plazmy používaných v intravenóznej terapii.

Možnosť inaktivácie v extrémne alkalickom pH je založená na stabilite proteínov a ochrannom efekte vďaka spôsobu opísanom v tomto vynáleze. Ako už bolo vysvetlené, tento spôsob, ktorý je založený na všeobecnom mechanizme pôsobenia na proteíny, je úplne novým a vykazuje charakteristiky, ktoré nedosahuje žiadny z doposiaľ opísaných spôsobov.

Predchádzajúce publikácie sa týkajú len vírusovej inaktivácie gamaglobulínu pri stredne kyslom pH (pH 4) a líšia sa teda od tohto vynálezu, s inkubáciou pri teplote 37 °C a synergickým efektom proteolytických enzýmov (pepsín), čo vedie k účinnej inaktivácii niektorých vírusov (pozri Kempf C. et. al.: Vírus inactivation during production of intravenous immunoglobulin. Transfusion 1991; 31 (5): 423 - 27).

Infekčnosť nestabilných vírusov sa účinne znižuje za iných podmienok, pri stredne kyslom pH (pH 4,25) a v konečnom produkte (gammaglobulín a maltóza) pri 21 °C v priebehu 20 dní inkubácie, avšak nedochádza tu k žiadnemu významnému zníženiu prítomnosti vírusov bez lipidového obalu.

Avšak hlavný predmet vynálezu, t. j. inaktivácia vírusov bez lipidového obalu, nebol zatiaľ do dnešného dňa uspokojivo vyriešený, rovnako ako spôsob využitý na jeho uskutočnenie (inaktivácia pri extrémne alkalickom pH v prítomnosti stabilizátorov), ktorý doposiaľ nebol na tento cieľ použitý. To všetko robí z vynálezu ako celku absolútnu novinku.

Vynález je založený na schopnosti inaktivácie vírusov (s alebo bez lipidového obalu) pri extrémnych pH podmienkach média.

Boli už publikované výsledky týkajúce sa vírusovej inaktivácie stredne silnou kyselinou v prítomnosti kyselinovzdorných proteínov (gamaglobulín) pridaním minerálnej (chlorovodíkovej) kyseliny alebo slabej kyseliny (citrónová, octová). Bolo opísané, že dochádza k významnej inaktivácii v prípadoch citlivejších vírusov, väčšinou tých s lipidovým obalom (ľudský vírus herpes a vírus myšej leukémie X-I). Avšak, aby bolo dosiahnuté významné redukovanie vírusov pri pH 4, je nevyhnutná inkubácia proteínového roztoku pri vyššej ako izbovej teplote (37 °C), čo úplne inaktivuje modelové vírusy s lipidovým obalom s výnimkou vírusov vesiculárnej stomatitídy, ktoré sú aj potom infekčné.

Inaktivácia v chlade (4 °C) je neúčinná pre väčšinu vírusov, takže inkubácia pri 37 °C účinkuje synergeticky s kyslým pH (pozri Kempf C. et. al.: Vírus inactivation during production of intravenous immunoglobulin. Transfusion 1991; 31 (5): 423 - 27).

Bola už tiež opísaná inaktivácia vírusov gamaglobulínu vo finálnych liekovkách pri pH 4,25 (s jeho maltózovým excipientom) pri 21 °C v priebehu 20-tich dní, L ktorá preukázala, že menej chemicky a fyzikálne odolné vírusy sú úplne inaktivované, čo však neplatí pri rezistentnejších vírusoch bez lipidového obalu (opičí vírus-40; Reovírus-3).

Tiež rezistencia niektorých vírusov, ako je vírus obmy alebo hepatitídy A, voči kyslému prostrediu je známa a bola už opísaná (pozri Roberts, Peter L. et al.: Removal and Inactivation of Enveloped and Non-enveloped Viruses during the Purification of a High-Purity FIX by Metal Chelate Affinity Chromatography. Vox. Sang. 1994; 67 (1): 69 - 71). V týchto prípadoch je zníženie infekčnosti prakticky nulové.

Pokiaľ ide o inaktiváciu vírusov v bázickom prostredí, bola už v literatúre opísaná dezinfekcia zariadenia s antivírusovou účinnosťou (kolóny, ultrafiltre) v alkalických roztokoch, zabraňujúca cross-kontaminácii medzi jednotlivými výrobnými dávkami (pozri Grun, Janet B. et al.: Viral Removal/Inactivation by Purification of Biopharmaceuticals. BioPharm 1992; 5(9): 22 - 30), aj keď táto metóda nebola nikdy použitá pri špecifickej inaktivácii proteínov na terapeutické využitie pri extrémnych pH podmienkach.

Podstata vynálezu

Podstata spôsobu inaktivácie vírusov v proteínoch, spočíva v tom, že počiatočný roztok proteínu je dostatočne stabilizovaný pomocou vhodného stabilizátora a za definovanej teploty spracovaný v alkalickom médiu pri extrémnom pH. Potom nasleduje fáza inkubácie, neutralizácie prídavkom kyseliny a eliminácie stabilizátorov dialýzou alebo diafíltráciou za vzniku adjustovaného inaktivovaného roztoku.

Výskum autorov vynálezu preukázal virostatický efekt alkalických hydroxidov pri extrémnych pH v neprítomnosti proteínov alebo ďalších stabilizátorov, prípadne excipientov. Pokiaľ ide o získané výsledky týkajúce sa vírusov s lipidovým obalom, prípadne bez neho, ukazujú vysokú virostatickú účinnosť proti obom typom vírusov. Takže vírus detskej obmy typu A (model pre hepatitídu A) a psí parvovírus (model pre jeho ľudský homológ) sú inaktivované.

Spôsob inaktivácie pri extrémnom pH podľa vynálezu je založený na inom mechanizme účinku, ako je to pri pasterizácii, takže oba spôsoby môžu byť pravdepodobne použité spoločne ako navzájom komplementárne.

Možnosť vírusovej inaktivácie v prítomnosti proteínov pri extrémnom pH bude do značnej miery závisieť od stability proteínov v médiu. Niektoré proteíny majú vyššiu štruktúrnu stabilitu v zásaditom pH prostredí, takže spôsob inaktivácie podľa vynálezu je väčšinou smerovaný voči tomuto typu stredne stabilných proteínov, takým ako inhibítory serínovej proteázy a príbuzné enzýmy, z ktorých získavame antitrombín (ATIII), al inhibítor proteázy (al-antitrypsín) a ľudský albumín (ktorý vykazuje určitú štruktúrnu podobnosť s molekulou inhibítora serínovej proteázy.

Na účely inaktivácie v extrémne alkalickom prostredí musíme zabezpečiť, aby proteíny nepodliehali denaturácii.

Všeobecne boli už opísané rôzne látky na stabilizáciu proteinov, ktorých úlohou je obvykle uchrániť molekulárnu integritu v priebehu deaktivačného kroku uskutočňovaného pomocou pasterizácie alebo tepelným spracovaním a tiež udržať biologickú aktivitu v konečnom produkte, a to ako v kvapalnom, tak aj v lyofilizovanom stave. Veľké množstvo použitých látok spadá do nasledujúcich hlavných skupín:

- cukry, alkoholické cukry a polyoly (sacharóza, maltóza, mannitol, sorbitol, dextríny, polyetylénglykol a pod.)

- aminokyseliny (lysín, glycin, histidín, arginín a pod.)

- proteíny (albumín)

- organické kyseliny alebo ich soli (kaprylát, citrát, EDTA a pod.).

Anorganické soli boli tiež použité ako excipienty pri fyziologických koncentráciách s cieľom dosiahnuť zodpovedajúcu izotonicitu a rozpustnosť (väčšinou v prípadoch lyofilizácie), pričom najdôležitejšie látky boli chlorid sodný a fosfát sodný.

Určité prípady stabilizácie proteínov pri extrémnom pH s cieľom vírusovej inaktivácie neboli doposiaľ pred týmto vynálezom vôbec kontaktované. Malo by sa teda predpokladať, že v minulosti opísané všeobecné metódy sú použiteľné. Avšak, tieto spôsoby nedostatočne chránia proteíny pred inaktiváciou.

Ako výsledok výskumu autorov vynálezu je možné pri inaktivácii pri alkalickom pH stabilizovať proteíny bez použitia externých činidiel, ktoré sú potenciálne toxické alebo ktoré sa problematicky odstraňujú.

Teória stabilizácie proteínov pri spracovaní pri extrémnom pH je založená na hypotetických hydrofóbnych interakciách proteínov a zmene veľkosti molekuly (skladanie) vďaka reverzibilnému pôsobeniu vysokých koncentrácií solí (ako je chlorid sodný) v roztoku. Táto molekulárna kontrakcia napomáha zachovať biologicky aktívne miesto vzhľadom na repulziu nábojov (rozpúšťadlá) vznikajúcich vďaka väčšej expozícii hydrofóbnejších zón.

Stabilizačnými činidlami môžu byť akékoľvek anorganické soli, obzvlášť polyiónové, ktoré sú schopné zabezpečiť prostredie s dostatočnou iónovou silou (t. j. sulfát amónny, chlorid sodný a pod.).

Na druhej strane, možnosť, že dôjde zároveň ku stabilizácii vírusov pri náraste iónovej sily bude menšia, pretože externý obal je tvorený rigidnými proteínovými alebo lipoproteínovými štruktúrami, takže vykazuje menšiu možnosť ochrániť sa pomocou kontrakcie a hydrofobicity.

Vynález opisuje spôsob inaktivácie vírusov pri extrémne bázickom pH v roztokoch proteínov, ktoré sú stabilné pre následné terapeutické použitie a sú živočíšneho, prípadne ľudského pôvodu alebo sú získané pomocou technológie rekombinantnej DNA.

Všeobecne, spôsob inaktivácie je používaný vo finálnej fáze výrobného procesu tak, aby sa vylúčilo prípadné riziko reziduálnej kontaminácie v predchádzajúcich krokoch. Je tiež lepšie použiť frakcie s dostatočnou čistotou, aby sa vylúčila zbytočná precipitácia alebo separácia po spracovaní.

Nasledujúce príklady použitia vynálezu sa vzťahujú na proteíny, ako sú antitrombín (ATIII), al inhibítor proteázy (al-PI) alebo séroalbumín.

Počiatočný solubilizovaný proteínový roztok alebo frakcia môžu byť získané z Cohn, Cohn-Oncley, KirstlerNischmannovej frakcionácie s etanolom za chladu, alebo s polyetylénglykolom, oktánovou kyselinou, iónovo-výmennou alebo afinitnou chromatografiou, alebo akoukoľvek inou metódou, ktorá poskytuje dostatočne čisté frakcie pre inaktivačné spracovanie pri extrémne alkalickom pH.

Prvým krokom je rozpustenie proteínu a najlepšie aj zníženie obsahu excipientov a solí, ak sú prítomné vo významných množstvách. Je tiež nevyhnutné eliminovať alebo do značnej miery zredukovať prítomnosť možných denaturujúcich činidiel v proteínovom roztoku (napr. etanol). To sa uskutočňuje pomocou gélovej filtrácie molekulárnymi exelusion polymérmi (komerčné značky: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultragel, Sephacel a pod.) alebo ešte lepšie pomocou metódy diafiltrácie proti vode cez ultrafiltračné membrány s veľkosťou pórov od 1 do 50 kD (Pellicon model od Millipore) podľa veľkosti proteínu. Alternatívnym spôsobom je konvenčná dialýza s nitrocelulózovými, celofánovými alebo cuprofánovými membránami (značky: I DEL M-11), najlepšie až do okamihu, keď dialyzovaný roztok má hodnoty osmolality menšej ako 300 mOsm/kg, aj keď táto hodnota nie je limitujúca, ak je hodnota iónovej sily proteínového roztoku odčítaná od potrebného množstva stabilizátora.

Roztok je potom vhodne nariedený vodou na koncentrácie proteínu medzi 25 až 0,001 % (čo záleží na rozpustnosti príslušného proteínu), prednostne medzi 5 % až 0,1 % v závislosti od inaktivovaného proteínu.

Roztok je adjustovaný pri teplote 0 až 45 °C, najlepšie medzi 2 až 4 °C v závislosti od proteínu.

K roztoku je pridané množstvo neutrálnej alebo iónovej soli v koncentráciách od 0,005 mol až do nasýtenia (chlorid alebo síran alkalického kovu alebo ich amónna soľ, alebo alkalické soli karboxylových kyselín), najlepšie spoločne s roztokom chloridu sodného s koncentráciou 1 až 4 móly na kg, či už samotného alebo v zmesi s ďalšími soľami, schopnými zabezpečiť dostatočnú iónovú silu roztoku. Excipienty alebo stabilizátory tvoriace súčasť finálneho zloženia produktu môžu byť pridané simultánne, ak je to potrebné, spoločne s ďalšími špecifickými látkami, avšak vždy za predpokladu, že sú rezistentné voči extrémnemu pH pri spracovaní.

Po stabilizovaní proteínového roztoku sa pridá za miešania roztok alkalického hydroxidu (obvykle v koncentráciách medzi 0,001 M až k saturácii) alebo akýkoľvek iný alkalický roztok, ktorý je kompatibilný s proteínmi a s médiom, zabezpečujúci dostatočnú koncentráciu hydroxylových iónov a udržujúci pH roztoku medzi 10,0 až 14,0 (prednostne medzi pH 12,0 až 13,0). Teplota roztoku je udržovaná medzi 0 a 45 °C, najlepšie medzi 2 až 4 °C.

pH proteínového roztoku môže byť adjustované pomocou akéhokoľvek komerčného pH-metru (vyrábaný Crison,

Hanna), ale správna adjustácia by sa mala vykonať dopredu s borátovým pufrom pri pH 10,00.

Expozičný čas v priebehu spracovania je minimálne možný, menši ako alebo rovný 100 h a dlhší ako 1 sekun5 dová inkubácia; obvykle medzi 1 až 60 minútami, čo zodpovedá spracovaniu pri extrémnom pH a krátkej expozícii.

Po ukončení presného inkubačného času sa roztok ihneď okyslí na pH 10 obvykle prídavkom kyseliny chlorovodíkovej alebo použitím ďalších silných, prípadne slabých minerálnych aj organických kyselín, prípadne akýmkoľvek iným systémom schopným zabezpečiť zníženie pH na požadované hodnoty blízke neutrálnemu pH.

Proteínový roztok je potom dialyzovaný a adjustovaný na záverečné zloženie, obvykle použitím sterilizovaných dialytických cartridge na jedno použitie (1 DEC M-ll alebo ekvivalent) alebo použitím ultrafiltračných membrán, obvykle 1 až 50 kD (Pellicon model od Millipore) s využitím dialýzy roztoku s vhodným zložením, aby sa zabezpečilo zodpovedajúce zníženie iónovej sily roztoku.

Adjustovaný roztok môže byť sterilizovaný filtráciou s 0,22 pm membránou a môže byť následne rozdelený do liekoviek na prezentáciu v kvapalnej forme alebo, ak je to potrebné, môže byť lyofylizovaný.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Účinnosť akalického spôsobu inaktivácie vírusov bola testovaná inokuláciou 1 ml vírusového koncentrátu do 19 ml 0,1 M roztoku hydroxidu sodného pri teplote 4 °C, zodpovedajúcej pH medzi 12,5 až 13.

V časoch špecifikovaných v tabuľke 1 boli odoberané vzorky na kultiváciu buniek po neutralizácii s kyselinou.

Analyzovanými vírusmi boli vírus hovädzieho oparu BHV (vírus s lipidovým obalom), psí parvovírus CPV a vírus ľudskej obmy typ 2 (oba vírusy bez lipidového obalu). Sčítanie bolo vykonané využitím cytopatického efektu v kultivovaných bunkách (TCID₅₀).

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Inaktivácie vírusov (s alebo bez lipidového obalu) hydroxi· dom sodným

Cas (oin.) CPV BHV POLIO

Xaoculusi	2.0	x	1O⁹	6.9	x	1O⁹	7.1	x	10«
0	1.9	x	10³	1.2	x	10²	3.6	x	10⁴
10	2.4	x	10³	1.2	x	10 ²	2.7	x	10³
20	9.6	x	10²	4.5	x	10^l	2.0	x	10*
60	6.0	x	10³	4.5	x	1O¹	2.1	x	10³
Inaktivácia:	5	.6		8	.2		5	.5

Redukčný faktor (log)

Alkalický spôsob inaktivácie viedol k významnému zníženiu počtu vírusov (> 4 log) pri troch analyzovaných vírusov a môže byť teda považovaný za špecifický inaktivačný krok.

Príklad 2

Monitorovanie vírusov v priebehu inaktivačného kroku prebiehalo spôsobom opísaným vo vynáleze. To bolo uskutočňované pomocou analýzy dvoch rôznych vírusov, menovite vírusu hovädzieho oparu a psieho parvovírusu.

Proteín určený na inaktiváciu bol finálne čistený antitrombín III (šarža č. 5139) so špecifickou aktivitou vyššou ako 7 IU/mg proteínu a koncentráciou proteínu 0,8 %. 45,1 g roztoku antitrombínu III bolo vzatých pre analýzu každého vírusu a bolo pridaných 8,7 g chloridu sodného ako stabilizátora potom 0,81 g dihydrátu citrátu trisodného a nakoniec 1,06 g mannitolu ako excipientu. Po každom prídavku bol spojený produkt solubilizovaný. Roztok bol potom ochladený v ľadovom kúpeli na 1,0 +/-0,5 °C, zatiaľ čo bolo pridaných 4,5 g inokula každého z vírusov a po zmiešaní bolo odobraných 10 g vzorky. K nej bolo pridaných 1,75 ml 2M hydroxidu, sodného, takže výsledné pH roztoku bolo 12,50 +/-0,05. Za týchto podmienok bola vzorka udržiavaná 1 h a potom neutralizovaná prídavkom 2M kyseliny chlorovodíkovej, pričom výsledné pH bolo kontrolované tak, aby bolo v rozmedzí 6,7 až 6,9.

Na záver boli vzorky každej analýzy kultivované v príslušnej rastovej cele, aby bolo kvantitatívne stanovené zníženie infekčnosti získanej opísaným spôsobom. Sčítanie bolo vykonané analýzou cytopatogenicity TCID_S0. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 2:

Tabuľka 2

Inaktivácia vírusov (s alebo bez lipidového obalu) v koncentrovanom, prečistenom antitrombíne III

vzorka	BHV	CPV
Inoeulua	1.4 X iď	2.4 x 10¹
Pilier
(poč.mater.)	2.2 x 10⁸	4.2 x 10'
Čas - «0 min.	<1.5 X 10³	B.O x 10'
Inaktivácia:
Redukčný faktor (log)	ŽL5.2	4.7

Obdržané hodnoty redukcie počtu vírusov sú významné (> 4 log) pre obidva študované vírusy. V prípade psieho parvovírusu je stupeň redukcie prakticky totožný s tým, ktorý bol dosiahnutý pri absencii proteínu a stabilizátorov (príklad 1), pričom zostatková infekčnosť je nižšia ako je limit merania (8,0 x 10² jednotiek).

Príklad 3

S cieľom charakterizovať inaktivovaný produkt pri spracovaní pri extrémnom pH bol spôsob inaktivácie podľa vynálezu uskutočnený až do získania konečného štádia lyofilizovaného produktu (antitrombín III).

Počiatočný koncentrát antitrombínu III s hmotnosťou 85,3 g, prečistený dvojnásobnou afinitnou chromatografiou (lot 0,5/1) s optickou hustotou (A₂₈onm) 4,20 a aktivitou 43,1 IU/ml bol stabilizovaný pridaním chloridu sodného v koncentrácii 3 móly na liter spomínaného roztoku.

Roztok bol potom adjustovaný s vhodnými excipientami v pomeroch 20 g dihydrátu citrátu trisodného a 20 g manitolu na liter počiatočného roztoku. Roztok bol potom ochladený v ľadovom kúpeli a teplota bola udržiavaná na 3 +/-1 °C v priebehu celého procesu. Potom bol pridaný 2M hydroxid sodný tak, aby výsledné pH bolo 12,50 +/-0,02 (pH-meter Crison, kalibrovaný borátovým pufrom pri pH 10,00). Jednohodinová inkubácia bola nasledovaná neutralizáciou s 2M kyselinou chlorovodíkovou až do pH blízkemu neutrálnemu.

Inaktivovaný roztok vírusov bol diafiltrovaný do konštantného objemu v aseptickej ultrafiltračnej cartridge kD molekulárnej sekcie (model TFF PrepScale, 2,5 sq.

ft. od Millipore) s využitím celkovo piatich objemov roztoku dialytického pufra obsahujúceho chlorid sodný; citrát sodný a mannitol. Vzniknutý roztok bol adjustovaný na požadovanú koncentráciu, sterilné filtrovaný cez 0,22 mm

SK 281404 Β6 membránu a rozptylom v liekovkách, ktoré potom boli lyofilizované.

Finálny hotový produkt bol charakterizovaný, aby sa ukázali prípadné molekulárne zmeny.

Ochranné pôsobenie stabilizátorov (chlorid sodný) pri alkalickom spracovaní bolo demonštrované meraním znovuobnovenej aktivity a špecifickej aktivity v priebehu inaktivačného kroku. Namerané hodnoty sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Obnovená aktivita a špecifická aktivita ATIII v priebehu inaktivačného kroku pri extrémnom pH (12,5)

VsMta ÁnnaklMti OptktíkMM* Jodnoky Sjactfktí

	OUM)	(Aaoim)	ATIII (TU)	aietivitjr	aktivita (IUAn$)
Striflswný rartok ΛΤΠΙ	43,1	MO	3332	100	8.1
Bob* ATB po imlBivfcu (l hod. psi 3+J-lC)	39,3	3,95	3143	97,0	7,9

Konečný produkt bol charakterizovaný na základe testu jeho funkčnosti:

Heparínová afinita: exklúzia (žiadna afinita) = 3 % (Heparinový polymér Sepharose 6FF) elúcia = 90 %

Imunoelektroforéza skrížená s heparínom: pomalé formy (nízka afinita) = 4,2 % Molekulárna distribúcia: agregécia (polyméry) = 3,6 %

Elektroforéza (acetát celulózy/amidová čierna): pás a₂ = 99,6 %

Špecifická aktivita: IU/mg všetkého proteínu = 7,9 (*) Molekulárna hmotnosť SDS-PAGE = 58 500 (jeden Pás)

Redukčné podmienky = 68 500 (jeden pás) (2ME) (*) Izoelektro fokus (izoelektrický bod) = 4,98 (hlavný pás)

4,90 (sekundárny pás) (*) Výsledky boli rovnaké pre ATIII čistený v konečných liekovkách, a to ako pre látku inaktivovanú spôsobom opísaným vo vynáleze, tak aj pre látku bez tejto inaktivácie.

Nasledujúca tabuľka 4 ukazuje komparatívnu stabilitu roztoku antitrombínu III z lyofilizovaných liekoviek rekonštruovaných vodou v rámci jednej šarže (s inaktiváciou alebo bez inaktivácie)

Tabuľka 4

Porovnanie stability roztokov ATIII pri 25 °C:

Produkt	Dd pri23°C
0	5	15	30
Iaaktŕwviný ATM	Aktivít» (io/*i)	17,3	17.4	14.4	11.4
Poärtoáié%	100	101	3	44
Neinaktivovaaý ΑΊΜΠ1	Aktivita (Π1/Λ1)	1«	20.9	11.4	1.2
Počiatočné %	1OO	114	43	44

Zhrnutie na záver: všetky analýzy ukázali, že v molekule proteínu nedošlo k žiadnym štruktúrnym alebo funkčným zmenám.

Príklad 4

Ochranné pôsobenie chloridu sodného a ďalších látok bolo dokázané inaktiváciou pri rôznych koncentráciách daného stabilizátor a v prítomnosti antitrombínu III určením obnovenej biologickej aktivity (chromogénna substrátová metóda).

Z roztoku prečisteného antitrombínu III (z jedinej šarže č. 3056900) boli odobrané 5 gramové vzorky a k nim bolo pridané vzrastajúce množstvo (podľa tabuľky 5) nasledujúcich stabilizátorov: chlorid sodný, citrát sodný a mannitol. Stabilizované roztoky boli ochladené v ľadovom kúpeli na teplotu 2 až 4 °C a potom bolo pridaním 2M hydroxidu sodného upravené pH na hodnoty 12,50 +/-0,05. Pri týchto podmienkach boli vzorky inkubované Íha potom neutralizované s 2M chlorovodíkovou kyselinou na pH 7,0 +/-0,2. Obnovenie aktivity antitrombínu III bolo určované vo vzorkách pred a po vykonaní inaktivácie.

Výsledky obnovenej aktivity sú ukázané v nasledujúcej tabuľke 5.

Tabuľka 5

Obnovená aktivita antitrombínu III v priebehu deaktivačného spracovania pri pH 12,5 počas 1 h

STABILIZÁTOR	Prídavok, stabilizátoru k roztoku ATIII (g/l)	t obnovenej ATIII
chlorid sodný	5.85	15.5
Chlorid sodný	29.3	21.5
Chlorid sodný	87.8	36.7
Chlorid sodný	175.5	9«.4
Citrát sodný	20	33.8
Citrát sodný	50	35.4
Citrát sodný	100	42.6
Citrát sodný	190	52.0
Mannitol	20	22.6
Mannitol	50	27.6
Mannitol	100	38.1
Mannitol	200	40.2
Chlorid sodný	175.5/ 20.0	97.6
Chlorid sodný	175.5/ 50.0	98.0
Chlorid sodný	175.5/100.0	96.5
Chlorid sodný	175.5/190.0	96.3
Chlorid sodný	175.5/250.0	95.4
Chlorid sodný	175.5/300.0	97.4

Výsledky ukazujú, že ochranný efekt chloridu sodného alebo jeho zmesí s menšími množstvami iných solí (ako je citrát sodný) je schopný zabezpečiť dostatočnú stabilitu proteínu. Optimálne zloženie stabilizátora bude také, ktoré zachová aktivitu antitrombínu III a zároveň bude mať minimálny ochranný vplyv na vírusy. To je dosiahnuté použitím najmenších možných koncentrácií stabilizátorov, ktoré už vírusy nechránia (chlorid sodný). Optimálne zloženie korešponduje s tým, ktoré bolo získané pridaním 175,5 g chloridu sodného k litru daného roztoku (3 moly soli) alebo ešte lepšie, pridaním spomínaného roztoku k 20,0 g dihydrátu citrátu trisodného (0,067 mólu na liter roztoku).

Príklad 5

Tento príklad ukazuje možnosti použitia rovnakého spôsobu inaktivácie na inaktiváciu ďalších proteínov v sku7

SK 281404 Β6 pine zahŕňajúcej inhibítory enzýmu serínovej proteázy ako napr. al anti-tripsín (al PI).

S týmto cieľom bol testovaný ochranný efekt chloridu sodného vzhľadom na inhibítor proteázy (al PI) monitorovaním obnovenej antielastázovej aktivity pri rôznych koncentráciách stabilizátorov.

Počiatočný prečistený roztok al PI (špecifická aktivita 1,05 IU/ml: A_{28O nm}) mal antielastázovú aktivitu 8,8 IU/ml. Z tohto roztoku boli odobrané 20 ml frakcie a stabilizované prídavkom narastajúceho množstva chloridu sodného. Po rozpustení bola látka ochladená na teplotu 2 až 4 °C a vírusy boli inaktivované prídavkom 2M hydroxidu sodného až do pH 12,50 +/-0,05. Po jednohodinovej inkubácii pri týchto podmienkach boli vzorky neutralizované prídavkom 2M kyseliny chlorovodíkovej. Boli odobrané vzorky inaktivovaných frakcií, v ktorých boli určené antielastázová aktivita, špecifická aktivita a obnovenie aktivity.

Tabuľka 6

Virálna inaktivácia al PI: 1 hodina pri pH 12,5 pri 2 - 4 °C
Mdnvk chloridu sodnete	•ktíviU (IUÄnl)	Špecifickí iktivita 9í (IUMiAm)	.obnovenej α 1H (u&dMtía)
(M)	(mól/1)
4	0	2,12	0,23	24
29,3	0,5	1®	0,29	28
584	1	2,66	044	32
117	2	9,13	1»Í7	112
234	4	Uí	1,10	103
	Chlorid sodný	má značný	ochranný efekt	(hodnoty

> 100 % obnovenia a špecifická aktivita > 1,5 IU/ml: A_28O) pri koncentráciách 2 až 4 móly na liter.

Príklad 6

Boli skúmané aj iné proteíny s molekulárnou štruktúrou podobnou inhibítorom serínovej proteázy. Albumín nie je jediným príkladom tejto skupiny proteínov.

Proces sa skladá z alkalického inaktivačného spracovania prečisteného stabilizovaného ľudského albumínu pre intravenózne injekcie. Dva roztoky s koncentráciami 2 a 5 % proteínu boli pripravené z rovnakého adjustovaného 5 % roztoku albumínu (kaprylát a tryptofanát) nariedeným fyziologickým roztokom soli (0,9 %). Dvojpercentný roztok bol rozdelený do dvoch frakcií a k jednej z nich boli pridané 3 mól/1 chloridu sodného. Roztoky boli potom ochladené v ľadovom kúpeli na teplotu 2 - 4 °C. Prídavkom 2M hydroxidu sodného bolo pH roztokov zvýšené na 12,50 +/-0,05, roztoky inkubované pri týchto podmienkach počas 1 h a potom neutralizované s 2M kyselinou chlorovodíkovou na pH 7,0 +/-0,2.

Vzorka majúca najvyššiu koncentráciu soli bola dialyzovaná v Cuprofan cartridge (1 DEL M-Il) proti roztoku stabilizátorov (kaprylát a tryptofanát) pri rovnakej koncentrácii obsahujúcej roztok albumínu, pričom iónová sila bola dostatočne znížená na fyziologické hodnoty. Po adjustovaní iónovej sily boli roztoky koncentrované ultrafiltráciou (TFF PrepScale od Millipore) s 10 kD membránou na 5 % proteínu. Readjustácia bola uskutočnená v koncentráciách stabilizátorov každej z analyzovaných vzoriek, proteín (5 %), izotonicita (0,15 M chlorid sodný) a pH 7,0 +/-0,2. Záverečným krokom bola filtrácia cez 0,22 pm sterilnú membránu (PVDF od Millipore) do 50 ml liekoviek, ktoré boli potom pasterizované 10 hodín pri teplote 60 +/-0,5 °C.

Vzorky roztokov a kontrolná vzorka (bez inaktivačného spracovania) boli odobrané na analýzu pri každej koncentrácii proteínu a soli. Molekulárne zloženie (molekulárna distribúcia HPLC) a stabilita konečného produktu boli vyhodnotené.

Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Virálna inaktivácia albumínu: 1 hodina pri pH 12,5 a teplote 2 - 4 °C

	KonceatraceNaCl	TuHditi (NTU)
	(atiUll
S	8,8	0.13	35
2	M	0,13	32
	IM/)	3.1S	Π.9
Kontrola		(bfy ioaktivide)	$.4

Acncace íHPCL) % Dctvaiétu	Aaalýza(I)
Priami	iarigMUi
12,40	4.71	10
9.65	3.K	10
0	C
14,56	5J»	0

(1) Test stability: meraný nárast turbidify albumínového roztoku spracovávaného 50 hodín pri 56 °C.

Príklad 7

Bol určovaný rozsah pH hodnôt, pri ktorých je možné uskutočňovať virálnu inaktiváciu a expozičný čas.

Počiatočný roztok prečisteného antitrombínu III (špecifická aktivita > 6 IU/mg proteínu) bol stabilizovaný chloridom sodným a citrátom a potom bol inaktivovaný prídavkom 2M hydroxidu sodného pri rôznych pH, rôznych teplotách a expozičných časoch. Roztoky boli potom neutralizované a boli odobrané vzorky na monitorovanie ATIII aktivity. Po každom spracovaní bolo vypočítané obnovenie aktivity.

Presné podmienky procesu a výsledky sú uvedené v tabuľke 8:

Tabuľka 8 % obnovenia ATIII aktivity pri rôznych pH, inkubačných časoch a teplotách

--------------------------------------------! f ^L*~li	AbiKritav (\|A)	Teplo·	Mahťný cu (bod.)	1«	Atŕrifr
					10.4	04.1
			₄	2«	11.4	«.1
	11. i				12.4	09.2
					>4.4	140.1
			21	20	11.4	»0.1
Chlorid nday					12.0	21.4
*				20		14.9
dtriŕ «odoý				n	12.0	»2.4
						04.2
	2<.l		<	1		»1.2
	114.0			4		01.1
			1	11.t	02.1
				1	11.0	44.2
	t.·· S.2*			20	l].o	4.)
	(liotdnlc tenwl·)
	24··» it.i	<	2	11.4	....
Chlorid wdny	aaa.H 24»	4		1).·	»1.4
«Mtiotoý	234.4* «.»* ao.o	•			•4.1
Mambol	111.14 11.4» 10.4	4	•	».4	47.»
	244.·« M. »♦				12. S	»7.»
	20.4				12 .M	οι.»

SK 281404 Β6

Priemyselná využiteľnosť

Spôsob inaktivácie za extrémnych pH podmienok podľa vynálezu je všeobecne použiteľný na inaktiváciu vírusov (vírusy s lipidovým obalom aj bez neho) v prostrediach proteínov určených na terapeutické použitie, a to bez toho, aby dochádzalo k ich denaturácii, prípadne k významnému zníženiu ich biologickej aktivity.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch, vyznačujúci sa tým, že počiatočný roztok proteínu je dostatočne stabilizovaný pomocou protektora a za teplotnej kontroly spracovaný v alkalickom médiu pri extrémnom pH, potom nasleduje fáza inkubácie, neutralizácie prídavkom kyseliny a eliminácia stabilizátorov dialýzou alebo diafiltráciou za vzniku adjustovaného inaktivovaného roztoku.
2. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že počiatočný materiál je najskôr prečistený a zbavený denaturujúcich látok.
3. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku la 2, vyznačujúci sa tým, že počiatočný roztok proteínového materiálu je nariedcný na koncentráciu proteinu medzi 0,001 až 25 % (m/V), prednostne na 0,1 až 5%.
4. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nárokov 1-3, vyznačujúci sa tým, že proteíny sú stabilizované prídavkom chloridu sodného alebo ďalšou neutrálnou alebo iónovou soľou, samotnou alebo v zmesi s chloridom sodným.
5. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým,že je pridaný chlorid sodný alebo iná iónová soľ v pomeroch od 0,005 mólu na liter roztoku až po roztok saturovaný, najlepšie od 1 do 4 mólov chloridu sodného na liter roztoku.
6. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nárokov 1-5, vyznačujúci sa tým, že stabilizovaný proteínový roztok je spracovávaný pri kontrolovanej teplote 0-45 °C, výhodne medzi 2 až 4 °C.
7. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že spracovanie v extrémne alkalickom médiu pozostáva z pridania alkalického roztoku s koncentráciou 0,001 M až saturačnou koncentráciou tak, že pH proteínového roztoku je medzi 10 až 14, prednostne medzi 12 -13.
8. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že alkalický roztok sa prednostne skladá z roztoku alkalického hydroxidu sodného, draselného alebo akejkoľvek inej látky, ktorá uvoľňuje dostatok hydroxylových iónov vo vodnom roztoku.
9. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že inkubačná fáza trvá medzi 1 sekundou až 100 h, obvykle medzi 1 - 60 min.
10. Spôsob inaktivácie vírusov v proteínoch podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že spracovanie je ukončené neutralizáciou prídavkom kyseliny chloro- vodíkovej alebo roztoku inej silnej alebo slabej minerálnej, organickej kyseliny tak, že pH je znížené pod hodnotu 10 a roztok je neutralizovaný alebo upravený na inú požadovanú hodnotu pH.