SK280742B6

SK280742B6 - R(+)-n-propargyl-1-aminoindán, spôsob jeho príprav

Info

Publication number: SK280742B6
Application number: SK6-91A
Authority: SK
Inventors: Moussa B. H. Youdim; John P. M. Finberg; Ruth Levy; Jeffrey Sterling; David Lerner; Tirtsah Berger-Paskin; Haim Yellin
Original assignee: Teva Pharmaceutical Industries Ltd.; Technion Research And Development Foundation Ltd
Priority date: 1990-01-03
Filing date: 1991-01-03
Publication date: 2000-07-11
Also published as: IL92952A; IE904376A1; IL92952A0; LU91195I2; HU908051D0; RO107552B1; US5786390A; US5532415A; ZA909997B; RU2001614C1; US5599991A; JPH03294248A; CZ288222B6; DE69102288D1; AU630772B2; AU6772490A; ES2057604T3; US5519061A; EP0436492A3; US5576353A

Description

Vynález sa týka selektívnych ireverzibilných inhibítorov enzýmu monoaminooxidázy (MAO), predovšetkým potom R(+) enantioméru N-propargyl-l-aminoindánu (PAI), ktorý je selektívnym ireverzibilným inhibítorom B-formy enzýmu monoaminooxidázy (MAO-B). Ďalej sa vynález týka spôsobu prípravy R(+)-PAI a farmaceutických prípravkov na jeho báze. R(+)-PAI je veľmi vhodný na liečenie Parkinsonovej choroby, porúch pamäti, demencie Alzheimerovho typu (DAT), depresie a hyperaktívneho syndrómu u detí.

Doterajší stav techniky

Parkinsonova choroby sa všeobecne považuje za následok degradácie presynaptických dopamínergických neurónov v mozgu s následnými zníženiami množstva neurotransmitera dopaminu, ktorý sa uvoľňuje. Nedostatočné uvoľňovanie dopaminu preto vedie k nástupu porúch samovoľnej svalovej kontroly symptomatických pre Parkinsonovu chorobu.

Rôzne postupy liečenia Parkinsonovej choroby boli vyvinuté a v širokom rozsahu sa bežne používajú, napr. podávanie levodopy spolu s inhibítorom dekarboxyláza, ako je L-karbidopa alebo benserazid. Inhibítor dekarboxylázy chráni molekulu levodopy pred periférnou dckarboxyláciou a tak zaisťuje príjem levodopy zvyšnými dopamínergnými neurónmi mozgovým striatom. Tu sa levodopa prevedie na dopamín, čo má za následok zvýšenie hladiny dopaminu v týchto neurónoch. Následkom fyziologických impulzov týchto neurónov jc preto schopnosť uvoľnenia väčšieho množstva dopaminu, ktoré sa blíži normálnym požadovaným hodnotám. Toto liečenie preto mierni symptómy tejto choroby a prispieva k dobrému stavu pacientov.

Ale liečenie levodopou má svoje nevýhody, hlavnou z nich je, že účinnosť liečenia je optimálna len v niekoľkých prvých rokoch po začatí liečenia. Po tejto úvodnej perióde klinická odpoveď zmizne a je sprevádzaná nežiaducimi vedľajšími účinkami, ktoré zahrnujú dyskinézu, výpadok účinnosti cez deň („efekt on-off ‘) a psychiatrické symptómy, ako sú stavy zmätenosti, paranoja a halucinácie. Tento výpadok účinku pri liečení levodopou sa pripočítava mnohým faktorom, zahrnujúcim prirodzenú progresiu choroby, zmenu dopaminových receptorov v dôsledku zvýšenia produkcie dopaminu alebo zvýšenej hladiny metabolitov a farmakokinetické problémy spojené s absorpciou levodopy (súhrn uvádza Youdim a spol., Progress in Mecidinal Chemistry, zv. 21, kapitola 4, str. 138 - 167 (1984), vyd. Ellis and West, Elsevier, Amsterdam).

Aby sa prekonali nevýhody liečenia levodopou, boli navrhnuté rôzne liečebné postupy, v ktorých je levodopa kombinovaná s inhibítormi MAO s cieľom metabolického rozrušenia novo vzniknutého dopaminu (pozri napr. patent US 4826875).

MAO existuje v dvoch formách známych ako MAO-A a MAO-B, ktoré sú selektívne pre rôzne substráty a inhibítory. Napr. MAO-B metabolizuje účinnejšie substráty ako je 2-fenyletylamín a je selektívne ireverzibilné inhibovaný (-)-deprenylom (ako je opísané).

Je však potrebné uviesť, že kombinácia levodopy s inhibítormi tak MAO-A, ako aj MAO-B, vedie k nežiaducim vedľajším účinkom, týkajúcich sa zvýšenia hladiny katecholamínu cez neuraxón. Ďalej jc kompletná inhibicia MAO tiež nežiaduca, pretože potenciuje účinok symptomimetických amínov, ako je tyramín, čo vedie k tzv. „syro vému efektu“ („chees-effect“). Súhrn pozri Youdim a spol., Handbook of Experimental Pharmacology, zv. 90, kap. 3 (1988), vyd. Trendelenburg and Weiner, Springer-Verlag). Keďže MAO-B sa ukázala byť predominantnou formou MAO v mozgu, považujú sa selektívne inhibítory tejto vzorky za možný spôsob dosiahnutia zníženia rozrušenia dopaminu na jednej strane, spoločne s minimalizáciou systemických účinkov celkovej inhibície MAO na strane druhej.

Jedným z týchto selektívnych inhibítorov MAO-B je (-)-deprenyl, ktorý bol v širokom rozsahu študovaný a bol použitý ako inhibítor MAO-B na doplnenie liečenia levodopou. Toto liečenie (-)-deprenylom je všeobecne výhodné, keďže nespôsobuje „syrový efekt“ pri dávkach spôsobujúcich takmer kompletnú inhibíciu MAO-B (Elsworth a spol., Psychopharmacology, 57, 33 (1978). Ďalej prídavok (-)-deprenylu ku kombinácii levodopy a inhibítora dekarboxylázy pacientom s Parkinsonovou chorobou vedie k zlepšeniu akinézy a celkovej funkčnej kapacity, takisto ako k eliminácii výpadkov typu „on-off“ (pozri Birkmayer and Riederer v „Parkinson's Disease“, str. 138 - 149, Springer-Verlag (1983)).

Tak teda (-)-deprenyl zvyšuje a prolonguje účinok levodopy a umožňuje zníženie dávok levodopy, čím sú obmedzené vedľajšie účinky liečenia levodopou.

Ale (-)-deprenyl má svoje vlastné nežiaduce účinky, ktoré zahrnujú aktiváciu preexistujúcich žalúdočných vredov a občasné hypertenzivne príhody. Ďalej (-)-deprenyl je derivátom amfetamínu a je metabolizovaný za tvorby amfetamínu a metamfetamínov, ktoré môžu viesť k nežiaducim vedľajším účinkom spojených s týmito látkami, ako je napr. zvýšená srdcová frekvencia (Simpson, Biochemical Pharmacology, 27, 1591 (1978); Finberg a spol., v „Monoamine Oxidase Inhibitors - The State of the Art“, str. 31 - 43, vyd. Youdim a Paykel, (1981) Wiley).

Ďalšie zlúčeniny, ktoré sú selektívnymi ireverzibilnými inhibítormi MAO-B, ktoré neobsahujú nežiaduce vedľajšie účinky spojené s (-)-deprenylom, už boli opísané. Jednou z takýchto zlúčenín je N-propargyl-l-aminoindán.HCl (racemický PAI-HC1) opísaný v patentoch GB 1003686, GB 1037014, US 351 3244. Je to účinný selektívny ireverzibilný inhibítor MAO-B, ktorý nie je metabolizovaný na amfetamíny a nevzniká pri ňom zvýšenie nežiaducich sympatomimetických účinkov.

V porovnávacích testoch na zvieratách sa dokázalo, že racemický PAI má značné výhodný v porovnaní s (-)-deprenylom, napr. racemický PAI nevyvoláva žiadnu významnú tachykardiu, nespôsobuje zvýšenie krvného tlaku (účinky vyvolané dávkami 5 mg/kg (-)-deprenylu), nevyvoláva kontrakcie viečok ani zvýšenie srdcovej frekvencie v dávkach až do 5 mg/kg (účinky spôsobené (-)-deprenylom v dávkach nad 0,5 mg/kg), ďalej racemický PAI-HC1 nepotenciuje kardiovaskulárne účinky tyramínu (Finberg a spol. v „Enzymcs and Ncurotransmitters in Mental Disease“, str. 205 - 219 (1980), vyd. Usdin a spol., pub. John Wiley and sons, NY; Finberg s spol. (1981) v „Monoamine Oxidase Inhibitors - The State of the Art“, ibid; Finberg a Youdim, British Journal Pharmacol., 85, 451 (1985)).

Jedným z cieľov predloženého vynálezu je separovať racemické zlúčeniny PAI a vyrobiť enantiomér s inhibičnou aktivitou MAO-B.

Keďže deprenyl má podobnú štruktúru ako PAI a je známe, že (-)-enantiomér deprenylu, to znamená (-)-deprenyl, je značne farmaceutický aktívnejší ako (+)-deprenyl, odborníci predpokladajú, že len (-)-enantiomér PAI by mohol byť účinným inhibítorom MAO-B.

SK 280742 Β6

Ale na rozdiel od týchto predpokladov bolo po rozštiepení obidvoch týchto enantiomérov zistené, v súlade s týmto vynálezom, že účinným inhibítorom MAO-B bol (+)-PAI enantiomér, zatiaľ čo (-)-enantiomér mal extrémne nízku inhibičnú účinnosť MAO-B. Ďalej (+)-PAI enantiomér mal tiež prekvapivo vyšší stupeň selektivity pre inhibíciu MAO-B ako zodpovedajúca racemická forma a môže tak mať menej nežiaducich vedľajších účinkov pri liečení indikovanej choroby. Tieto zistenia sú založené tak na in vitro, ako aj in vivo experimentoch a detailnejšie sú prezentované ďalej.

Následne sa zistilo, že (+)-PAI má absolútnu konfiguráciu R. To bolo tiež prekvapujúce vzhľadom na očakávanú štruktúrnu analógiu s deprenylom a amfetamínmi.

Vysoký stupeň stereoselektivity farmakologickej účinnosti medzi R(+).PAI a S(-)-enantiomérom je tiež pozoruhodný. Zlúčenina R(+)-PAI je takmer o štyri rady aktívnejšia ako S(-)-enantiomér pri inhibícii MAO-B. Tento pomer je významne vyšší, ako bol pozorovaný medzi dvoma enentiomérmi deprenylu (Knoll a Megyar, Adv. Biochem. Phsychopharmacol., 5, 393 (1972); Magyar a spol., Acta Physiol. Acad. Sci. Hung., 13, 377 (1967)). Ďalej v niektorých fyziologických testoch sa o (+)-deprenyle uvádza, že má rovnakú alebo dokonca vyššiu účinnosť ako (-)-enantiomér (Tekes a spol., Pol. J. Pharmacol. Pharm. 40, 653 (1988)).

N-Metyl-N-propargylaminoindán (MPAI) je účinnejší inhibítor MAO, ale s nižšou selektivitou pre MAO-3 oproti MAO-A (Tipton a spol., Biochem. Pharmacol., 3J_, 1250 (1982)). Prekvapivo v tomto prípade autori vynálezu zistili, že sú len malé rozdiely v relatívnych účinnostiach dvoch enantiomérov, čo ďalej zdôrazňuje pozoruhodnosť prípadu E(+)-PAI (pozri tabuľka I).

Ďalším cieľom predloženého vynálezu je poskytnúť prvýkrát použitie farmaceutický účinného PAI-enantioméru samotného (bez levodopy) na liečenie Parkinsonovej choroby, demencie a depresie (pozri Youdim a spol. v Handbook of Experimetnal Phaimacology, zv. 90/1, (1988), kap. 3, vyd. Trendelenberg and Wiener).

Ešte ďalším cieľom vynálezu je poskytnúť použitie farmaceutický účinného PAI enantioméru na predliečbu a to samotného alebo spolu so synergistickými látkami, pre Parkinsonovu chorobu tak, aby sa oddialila liečba levodopou a s ňou spojené nežiaduce vedľajšie účinky. Tento prístup bol študovaný vzhľadom na (-)-deprenyl, ktorý sa ukázal byť účinný podávaný samotný v skorých štádiách parkinsonizmu a môže mať tiež u týchto pacientov synergistický účinok pri spoločnom podaní s alfa-tokoferolom (derivátom vitamínu A) (The Parkinson's Sutdy Group, New England J. Med., 321 (20), 1346 - 1371 (1989)).

Okrem svojej vhodnosti pri liečení Parkinsonovej choroby sa (-)-deprenyl tiež ukázal byť veľmi vhodný na liečenie pacientov trpiacich demenciou Alzheimerovho typu (DAT) (Tariot a spol., Psychopharmacology, 91, 489 - 495, 1987) a pri liečení depresie (Mandelewicz a Youdim, Brit. J. Psychiat. 142, 508 - 511, 1983). Z toho vyplynulo použitie R(+)-PAI zlúčeniny, pri ktorej sa dokázala účinnosť pri obnovení pamäti, možnosti liečenia porúch pamäti a veľmi vhodné použitie na liečenie Alzheimerovej choroby a na liečenie hyperaktívneho syndrómu u detí.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je R(+)-N-propargyl-l-aminoindán so vzorcom (I) alebo jeho farmaceutický prijateľné adičné soli s kyselinami, sám osebe na použitie na liečenie Parkinsonovej choroby, porúch pamäti, demencie Alzheimerovho typu (DAT), depresie a hyperaktívneho syndrómu.

Predmetom vynálezu je aj použitie tejto zlúčeniny na výrobu farmaceutických prípravkov na liečenie uvedených chorôb a farmaceutický prípravok na liečenie uvedených chorôb, ktorý ako účinnú zložku obsahuje R(+)-N-propargyl-l-aminoindán. Tento farmaceutický prípravok môže mať napríklad podobu vhodnú na orálne podávanie, podobu injekčného roztoku alebo emulzie, podobu čapíkov na rektálne podávanie alebo podobu vhodnú na transdermálne podávanie a v dávkovacej jednotke môže obsahovať 2 až 20, výhodne 5 až 10, výhodnejšie 1 až 10 a najvýhodnejšie 2 až 5 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu. Ak má prípravok podobu injekčného roztoku alebo emulzie, môže obsahovať 1 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, vztiahnuté na 1 ml prípravku.

Do rozsahu vynálezu patrí aj realizácia, v ktorej tento farmaceutický prípravok okrem R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu obsahuje levodopu a inhibítor dekarboxylázy, pričom má podobu tabliet alebo tabliet alebo toboliek. Takýto prípravok môže obsahovať 2 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, 50 až 250 mg levodopa a 10 až 25 mg L-karbidopa alebo 2 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, 50 až 200 mg levodopa a 12,5 až 50 mg benserazidu.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob prípravy R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu a jeho adičných solí s kyselinami, ktorého podstata spočíva v tom, že sa nechá reagovať R(-)-enantiomér-l-aminoindánu s propargylbromidom alebo propargylchloridom za prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy, prípadne za prítomnosti vhodného rozpúšťadla a izoluje sa R(+)-N-enantiomér N-propargayl-1-aminoindánu chromatografiou, destiláciou, selektívnou extrakciou a ak je to žiaduce, prevedie sa voľná báza takto pripravená na svoje adičné soli s kyselinami.

Alternatívne sa pri tomto spôsobe namiesto R(-)-enantioméru používa racemický 1-aminoindán. V tomto prípade môže spôsob zahrnovať reakciu získanej voľnej bázy s opticky aktívnou kyselinou za vzniku dvoch diastereoizomérnych solí, oddelenie požadovanej soli R(+)-N-pro-pargyl-l-aminoindánu a ak je to žiaduce, regeneráciu voľnej bázy. Oddelenie soli R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu sa potom môže uskutočniť fŕakčnou kryštalizáciou.

Inak môže byť R(+)PAI získaný optickým rozštiepením racemickej zmesi R a S-enantioméru PAI. Toto rozšírenie môže byť uskutočnené akoukoľvek bežnou metódou rozštepovania, ktorá je dobre známa odborníkom, ako sú metódy opísané v „Enantiomers, Racemates and Resolutions“ J. Jasquesom, A. Colletom a S. Wilenom, Pub. John Wiley and Sons, NY, 1981. Napríklad rezolúcia môže byť uskutočnená preparatívnou chromatografiou na chirálnej kolóne. Iným príkladom vhodného spôsobu optického štiepenia je príprava diastereoizomémych solí s opticky aktívnymi kyselinami, ako je kyselina vínna, jablčná, mandľová alebo N-acetylderivátmi aminokyselín, ako je N-acetylleucín, s

SK 280742 Β6 nasledujúcou rekryštalizáciou s cieľom izolácie diastereoizomémej soli požadovaného R-enantioméru.

Racemická zmes R a S enantiomérov môže byť pripravená napr. ako je opísané v GB patentoch 1003676 a GB 1037014. Racemická zmes PAI môže byť tiež pripravená reakciou 1-chlórindánu alebo 1-brómindánu s propargylamínom. Alternatívne môže byť racemát pripravený reakciou propargylamínu s 1-indanónom za vzniku zodpovedajúceho imínu s nasledujúcou redukciou dvojitej väzby uhlík-dusík v imíne vhodným činidlom, ako je borohydrid sodný.

Ako je uvedené, podľa vynálezu môže byť R enantiomér PAI tiež pripravený priamo z opticky aktívneho R-enantioméru 1-aminoindánu reakciou s propargylbromidom alebo propargylchloridom za prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy a prípadne za prítomnosti vhodného rozpúšťadla.

Vhodnými organickými alebo anorganickými bázami na použitie v uvedenej reakcii sú napr. trietylamín, pyridín, uhličitany alebo hydrogenuhličitany alkalických kovov atď. Ak sa reakcia uskutočňuje za prítomnosti rozpúšťadla, môže byť toto odvodené zo skupiny zahrnujúcej napr. toluén, metylénchlorid a acetonitril. Výhodná metóda prípravy uvedených zlúčenín zahrnuje reakciu medzi R-l-aminoindánom a propargylchloridom pri použití hydrogenuhličitanu draselného ako bázy a acetonitrilu ako rozpúšťadla.

Uvedená reakcia 1-aminoindánu všeobecne vedie k zmesi nezreagovaného primárneho amínu, požadovaného sekundárneho amínu a terciámeho amínu N,N-bispropargylamínového produktu. Požadovaný sekundárny amin, to znamená N-propargyl-l-aminoindán, môže byť z tejto zmesi oddelený akoukoľvek obvyklou separačnou metódou, ako je chromatografia, destilácia, selektívna extrakcia atď.

Východiskový R-l-aminoindán môže byť pripravený spôsobmi známymi z literatúry, napr. ako uvádza Lawson a Rao, Biochemistry (1980) 19, 2133 a tu citované odkazy a európsky patent č. 235590.

R-l-Aminoindán môže tiež byť pripravený optickým rozštiepením racemickej zmesi R a S enantiomérov, napr. tvorbou diastereoizomémych solí a opticky aktívnymi kyselinami, alebo inou známou metódou, ako je metóda uvedená v citovanej publikácii „Enantiomers“, Racemates and Resolutions“ od J. Jacquese a spol., pub. John Wiley and Sons, NY, 1981. Alternatívne východiskový R-l-aminoindán môže byť pripravený reakciou 1-indanónu s opticky aktívnym amínom s nasledujúcou redukciou dvojitej väzby uhlík-dusík vo výslednom imíne hydrogenáciou nad vhodným katalyzátorom, ako je paládium na uhlík, oxid platičitý, Raneyov nikel a podobne. Výhodnými opticky aktívnymi amínmi sú napríklad jeden z antipódov fenetylamínu alebo ester aminokyseliny, ako je valin alebo fenylalanín. Benzylovú N-C väzba môže byť následne rozštiepená hydrogenáciou pri miernych podmienkach.

Ďalšími metódami prípravy R-1-aminoindánu sú hydrogenácia, ako je opísané, indán-l-onoximéterov, ktorých alkylová časť éteru obsahuje opticky čisté chirálne centrum. Alternatívne, nechirálne deriváty indan-l-ónu obsahujúce dvojitú väzbu uhlík-dusík, ako je imín alebo oxím, môžu byť redukované chirálnym redukčným činidlom, napr. komplexom lítiumalumíniumhydridu a efekrínu.

Na prípravu farmaceutický prijateľných adičných solí zlúčeniny R(+)PAI sa voľná báza nechá reagovať s požadovanými kyselinami za prítomnosti vhodného rozpúšťadla obvyklými metódami. Podobne adičné soli s kyselinami môžu byť prevedené na voľné bázy známymi metódami.

V súlade s predloženým vynálezom môže byť zlúčenina R(+)PAI spracovaná na farmaceutickú kompozíciu (prí pravok) predovšetkým vhodnú na liečenie Parkinsonovej choroby, demencie Alzheimerovho typu (DAT) alebo depresie. Takéto prípravky môžu obsahovať zlúčeninu R(+)PAI alebo farmaceutický prijateľné adičné soli s kyselinami týchto zlúčenín, spolu s farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo prísadami. Napríklad tieto prípravky môžu byť pripravené ako liečivá, ktoré môžu byť podávané orálne, parenterálne, rektálne alebo transdermálne. Vhodné formy orálneho podania zahrnujú tablety, lisované alebo potiahnuté pilulky, dražé, vrecká, tvrdé alebo mäkké želatínové tobolky, sublingválne tablety, sirupy a suspenzie; na parenterálne podanie vynález poskytuje ampulky alebo fľaštičky obsahujúce vodný alebo nevodný roztok alebo emulzie; na rektálne podanie sú určené čapíky s hydrofilnými alebo hydrofóbnymi vehikulami; a na topickú aplikáciu sú to masti a transdermálny prenos je uskutočnený vhodným transportným prenosom známym v odbore.

Uvedené prípravky môžu byť použité samotné na liečenie Parkinsonovej choroby, Alzheimerovej choroby alebo depresie, alebo alternatívne, v prípade Parkinsonovej choroby, môžu byť použité ako prídavok k obvyklej liečbe látkou levodopa.

Výhodné dávky účinnej zložky, to znamená R-PAI zlúčenín, v uvedených prípravkoch ležia v nasledujúcich rozmedziach: pre orálne alebo čapíkové prípravky 2 až 20 mg na dávkovú jednotku na deň a výhodne 5 až 10 mg na dávkovú jednotku na deň; pre injekčné 1 až 10 mg/ml dávkovej jednotky na deň a výhodnejšie 2 až 5 mg/ml na dávkovú jednotku na deň.

Prehľad obrázkov na výkrese

Obr. 1 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 19, ilustrujúce in vitro inhibičnú aktivitu MAO-A.

Obr. 2 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 19, ilustrujúce in vitro inhibičnú aktivitu MAO-B.

Obr. 3 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 19, ilustrujúce in vitro inhibíciu MAO z ľudského kortexu.

Obr. 4 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-A in vivo; ip/mozog.

Obr. 5 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-B in vivo; ip/mozog.

Obr. 6 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-A in vivo; ip/pečeň.

Obr. 7 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciou MAO-B in vivo; ip/pečeň.

Obr. 8 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-A in vivo; per os/mozog.

Obr. 9 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-B in vivo; per os/mozog.

Obr. 10 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-A in vivo; per os/pečeň.

Obr. 11 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 20, ilustrujúce akútnu inhibíciu MAO-B in vivo;

per os/pečeň.

Obr. 12 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 21, ilustrujúce chronickú inhibíciu MAO-A in vivo v mozgu.

SK 280742 Β6

Obr. 13 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 21, ilustrujúce chronickú inhibíciu MAO-B in vivo v mozgu.

Obr. 14 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 21, ilustrujúce chronickú inhibíciu MAO-A in vivo v pečeni.

Obr. 15 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 21, ilustrujúce chronickú inhibíciu MAO-B in vivo v pečeni.

Obr. 16 predstavuje grafické znázornenie výsledkov podľa príkladu 22, ilustrujúce aktivitu MAO-B v mozgu potkana v rôznom čase po i. p. injekcii R(+)PAI (1 mg/kg).

Vynález je bližšie detailnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch, tabuľkách a obrázkoch, ktoré ho však nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Racemický hydrochlorid N-propargyl-l-aminoindánu

Racemický 1-aminoindán (10,0 g) a 10,4 g uhličitanu draselného sa pridá k 75 ml acetonitrilu. Výsledná zmes sa zahrieva na 60 °C a po kvapkách sa pridá 4,5 g propargylchloridu.

Zmes sa mieša pri 60 °C počas 16 hodín, potom sa najprchavejšie látky odstránia destiláciou vo vákuu. Zvyšok sa rozdelí medzi 10 % vodný hydroxid sodný a metylénchlorid.

Organická fáza sa suší a rozpúšťadlo sa odstráni destiláciou, zvyšok sa podrobí rýchlej chromatografii na silikagéli s elúciou 40 % etylacetátom/60 % hexánom. Frakcie obsahujúce titulnú zlúčeninu ako voľnú bázu sa spoja a elučné činidlo sa nahradí éterom. Éterový roztok sa spracuje s plynným chlorovodíkom, vytvorená zrazenina sa izoluje odsatím a rekryštalizuje z izopropanolu, získa sa 7,3 g titulnej zlúčeniny, 1.1.182 až 184 °C.

Chromatografické a spektroskopické hodnoty sú v súlade s literatúrou /US 3513244) a autentickou vzorkou. NMR (δ, CDClj): 2,45 (2H, m), 2,60 (IH, t), 2,90 (IH, m), 3,45 (IH, m), 3,70 (2H, d), 4,95 (IH, t), 7,5 (4H, m) ppm.

Príklad 2

Hydrochlorid S-(-)-N-propargyl-1 -aminoindánu

Titulná zlúčenina vo forme voľnej bázy sa izoluje optickým rozštiepením racemickej zmesi voľnej bázy z príkladu 1 na preparatívnej HPLC kolóne Chiracelu OJ (celulóza tris/p-metylbenzoát) elúciou 10 % izopropanolu/90 % hexánu a zhromaždením prvého eluovaného hlavného piku. Výsledný olej sa prevedie na titulnú zlúčeninu (hydrochlorid) spracovaním s 10 % dietyléterového roztoku oleja plynným chlorovodíkom a odsatím výslednej zrazeniny. (a)_D -29,2° (1 %, etanol), 1.1. 182 až 184 °C. Ďalšie chromatografické a spektroskopické údaje sú identické s hydrochloridovou soľou z príkladu 1.

Príklad 3

Hydrochlorid R-(+)-N-propargyl-1 -aminoindánu

Titulná zlúčenina sa pripraví rovnako ako v uvedenom príklade 2, s tým rozdielom, že sa oddelí druhý eluovaný pík z preparatívnej HPLC: (a)_D + 29,1° (0,8 %, etanol), 1.1. 179 až 191 °C. Ďalšie chromatografické a spektroskopické údaje sú identické s hydrochloridovou soľou z príkladu 1.

Príklad 4

Hydrochlorid R-(+)-N-propargyl-1 -aminoindánu

R-(-)-l-Aminoindán (12,4 g) a 12,9 g uhličitanu draselného sa pridá k 95 ml acetonitrilu. Výsledná suspenzia sa zahrieva na 60 °C a prikvapká sa 5,6 g propargylchloridu. Zmes sa mieša pri 60 °C počas 16 hodín, odstránia sa najprchavejšie látky vo vákuu. Zvyšok sa rozdelí medzi 10 % vodný hydroxid sodný a metylénchlorid.

Organická fáza sa suší a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu, zvyšok sa chromatografuje rýchlou chromatografiou na silikagéli pri elúcii zmesou 40 % etylacetátu/60 % hexánu. Frakcie, obsahujúce voľnú bázu titulnej zlúčeniny sa spoja a rozpúšťadlo sa nahradí éterom. Éterový roztok sa spracuje s plynným chlorovodíkom a výsledná zrazenina sa izoluje odsatím a rekryštalizuje z izopropanolu. Získa sa 6,8 g titulnej zlúčeniny, t. t. 183 až 185 °C. (a)_D +30,90° (2 %, etanol). Spektrálne vlastnosti sú zhodné s vlastnosťami uvedenými pre zlúčeninu z príkladu 1.

Príklad 5

Hydrochlorid S-(-)-N-propargyl-1 -aminoindánu

Titulná zlúčenina sa pripraví metódou podľa príkladu 4 s tým rozdielom, že sa ako východisková látka použije S-(+)-1-sminoindán. Produkt má (a)_D -30,3° (2 %, etanol), t. t. 183 až 185 °C. Spektrálne vlastnosti sú identické s vlastnosťami uvedenými pre zlúčeninu z príkladu 1.

Príklad 6

Di (R-(+)-N-propargyl-1 -aminoindán)L-tartrát

K roztoku L-kyseliny vínnej (4,4 g) v 48 ml vriaceho metanolu sa pridá roztok R-(+)-N-propargyl-l-aminoindánovej voľnej bázy (5,0 g) v metanole (48 ml). Roztok sa zahrieva na teplotu spätného toku a počas 20 minút sa pridá 284 ml terc.butylmetyléteru. Zmes sa zahrieva ďalších 30 minút, ochladí a výsledná zrazenina sa odsaje, získa sa tak 6,7 g titulnej zlúčeniny, 1.1.175 až 177 °C.

(a)_D (1,5, H₂O) = +34,3; elementárna analýza pre C_2SH₃₂O₆N₂ vypočítané: 68,26 %, C, 6,56 % H, 5,69 % N, zistené: 68,76 % C, 6,57 % H, 5,61 % N.

Príklad 7

Hydrochlorid R-(+)-N-metyl-N-propargyl-1 -aminoindánu

Voľná báza R-(+)-N-propargyl-l-aminomdánu z príkladu 4 (1,2 g), uhličitanu draselného (0,97 g) a metyljodidu (1 g) sa pridá k 15 ml acetónu a výsledná suspenzia sa zahrieva na teplotu spätného toku pod atmosférou dusíka počas 8 hodín. Potom sa prchavé látky odstránia pri zníženom tlaku a zvyšok sa rozdelí medzi 10 % vodný hydroxid sodný (30 ml) a metylénchlorid (30 ml). Organická fáza sa suší a rozpúšťadlo sa odstráni vo vákuu. Zvyšok sa spracuje rýchlou chromatografiou na silikagéli s elúciou zmesou 40 % etylacetátu/60 % hexánu. Frakcie, obsahujúce titulnú zlúčeninu vo forme voľnej bázy, sa spoja a rozpúšťadlo sa nahradí dietyléterom. Éterový roztok sa spracuje s plynným chlorovodíkom, prchavé podiely sa odstránia vo vákuu a zvyšok sa rekryštalizuje z izopropanolu, získa sa 400 mg titulnej zlúčeniny vo forme bielej kryštalickej pevnej látky, 1.1. 134 až 136 °C, (ot)_D +31,40 (etanol). NMR (δ, CDClj): 2,55 (2H, m), 2,7 (III, šir.s), 2,8 (3H, s), 3,0 (IH, m), 3,4 (IH, m), 3,9 (2H, šir.s), 5,05 (IH, m), 7,7 (4H, m)ppm.

Príklad 8

Hydrochlorid S-(-)-N-metyl-N-propargyl-1 -aminoindánu

Pridá sa čistená voda podľa potreby do 1 ml.

Titulná zlúčenina sa pripraví ako v príklade 7, s tým rozdielom, že sa ako východisková látka použije S-(-)-N-propargyl-l-aminoindán (voľná báza) z príkladu 5. Všetky fyzikálne a spektrálne vlastnosti titulnej zlúčeniny sú zhodné s týmito vlastnosťami z príkladu 7 s výnimkou (a)_D-34,9° (etanol).

Príklad 9

Zloženie tabliet

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu 5,0 mg predželatínovaný škrob 47,0mg laktóza nesušená 66,0mg mikrokryštalická celulóza 20,0mg škrobový glykolát sodný 3,0mg mastenec 1,5mg stearát horečnatý 0,7mg

S cieľom granulácic sa pridá potrebné množstvo predčistenej vody.

Príklad 10

Zloženie tabliet

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l-aminoindán 1,0 mg laktóza nesušená 50,0mg predželatínovaný škrob 36,0mg mikrokryštalická celulóza 14,0 mg škrobový glykolát sodný 2,2mg mastenec 1,0mg stearát horečnatý 0,5mg

S cieľom granulácie sa pridá potrebné množstvo predčistenej vody.

Príklad 11

Zloženie toboliek

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-1 -aminoindán 5,0 mg predželatínovaný škrob 10,0mg mikrokryštalická celulóza 25,0mg škrob 44,0mg etylcelulóza 1,0mg mastenec 1,5mg

S cieľom granulácie sa pridá potrebné množstvo predčistenej vody.

Príklad 12

Zloženie injekcií

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu 5,0 mg bezvodá dextróza 44,0 mg

HC1 do pH 5

Pridá sa čistená voda v množstve potrebnom pre 1 ml.

Príklad 13

Zloženie injekcií

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-1 -aminoindánu 1,0 mg chlorid sodný 8,9 mg

HC1 do pH 5

Pridá sa čistená voda do 1 ml.

Príklad 15

Zloženie sirupu

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu 5,0 mg sacharóza 2250,0mg sodná soľ sacharínu 5,0mg metylparabén 6,0mg propylparabén 1,0mg chuťové prísady 20,0mg glycerín USP 500,0mg alkohol 200,0mg

Pridá sa čistená voda v množstve potrebnom do 5,0 ml.

Príklad 16

Sublingválne tablety

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-1 -aminoindánu	2,5 mg
mikrokryštalická celulóza	20,0 mg
nesušená laktóza	5,0 mg
predželatínovaný škrob	3,0 mg
Povidone	0,3 mg
farbiaca prísada	q.s.
ochuťovadlá	q.s.
sladidlá	q.s.
mastenec	0,3 mg

Zmes prísad a aktívnej látky sa granuluje s etanolovým roztokom Povidone. Po sušení a odvážení sa zmieša s mastencom a lisuje.

Príklad 17

PAI Sublingválne tablety

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-1 -aminoindánu 5,0mg mikrokryštalická celulóza 15,0mg predželatínovaný škrob 12,0mg etylcelulóza 0,3mg mastenec 0,3mg

Podľa potreby granulácie sa pridá čistená voda.

Príklad 18

Zloženie tabliet

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu 5,0 mg

levodopa	100,0 mg
karbidopa	25,0 mg
predželatínovaný škrob	24,0 mg
škrob	40,0 mg
mikrokryštalická celulóza	49,5 mg
farba D&C Yellowč. 10	0,5 mg
farba D&C Yellow č. 6	0,02 mg

Alkohol USP sa pridá podľa potrieb granulácie.

Nasledujúce príklady a pripojené tabuľky a obrázky sa vzťahujú na biologické pokusy uskutočnené v súlade s týmto vynálezom.

Príklad 19

Inhibícia aktivity MAO in vitro

Experimentálny protokol

Zdrojom MAO enzýmu bol homogenát mozgu potkana v 0,3M sacharóze, ktorý bol odstreďovaný pri 600 g počas minút. Supematant bol zriedený približne v 0,05M fosfátovom pufri a predinkubovaný so sériovými riedeniami

Príklad 14

Hydrochlorid R(+)-N-propargyl-l -aminoindánu 2,0 mg chlorid sodný 8,9 mg

HC1 do pH 5

SK 280742 Β6 zlúčenín so všeobecným vzorcom (I): R(+)-PAI, S(-)-PAI a racemický-PAI, (kde A znamená vodík) počas 20 minút pri 37 °C. Potom sa pridajú ^l4C-značené substráty (2-fenyletylamín, ďalej PEA, 5-hydroxytryptamín, ďalej 5-HT) a v inkubácii sa pokračuje ďalších 20 min. (PEA) alebo 30 - 45 min. (5-HT). Použité koncentrácie substrátu boli 50 μΜ (PEA) a 1 mM (5-HT). V prípade PEA bola koncentrácia enzýmu volená tak, že sa počas reakcie nametabolizuje viac ako 10 % substrátu. Reakcia sa potom ukončí prídavkom tranylcypromínu (do konečnej koncentrácie 1 mM) a inkubát sa prefiltruje cez malý stĺpec Amberlitu CG-50, pufrovaného na pH 6,3. Stĺpec sa premyje 1,5 ml vody, eluáty sa spoja a obsah rádioaktivity sa stanoví kvapalinovou scintilačnou spektrometriou. Pretože je amínový substrát úplne zachytený na stĺpci, dokladá rádioaktivita v eluáte produkciu neutrálnych a kyslých metabolitov vytvorených následkom MAO aktivity. Aktivita MAO vo vzorke bola vyjadrená ako percentá aktivity kontroly za neprítomnosti inhibítorov, po odčítaní príslušných hodnôt slepých pokusov. Aktivita stanovená pri použití PEA ako substrátu je označená ako MAO-B a pri použití 5-HT ako MAO-A.

Výsledky

Inhibičné aktivity R(+)-PAI, S(-)-PAI a racemických PAI zlúčenín so vzorcom (I) boli oddelene skúšané in vitro a výsledky typických pokusov sú uvedené na obr. 1 a 2. Pokus bol opakovaný trikrát. Koncentrácia inhibítora, majúca 50 % inhibíciu substrátového metabolizmu (IC-50), bola vypočítaná z inhibičných kriviek, ako je uvedené v tabuľke 1. Z týchto údajov je zrejmé, že:

a) R(+)-PAI je dvakrát aktívnejší ako racemát pre inhibíciu MAO-B,

b) R(+)-PAI je 29-krát aktívnejší pre inhibíciu MAO-B ako MAO-A,

c) S(-)-PAI má len 1/6800 aktivity R(+)-PAI pre inhibíciou MAO-B a má malú alebo žiadnu selektivitu medzi MAO-B a MAO-A.

Tabuľka 1

IC-50 (nM) hodnoty pre inhibíciu MAO-A a MAO-B racemickým PAI a jeho R(+) a S(-) enantimérmi v homogenáte potkaních mozgov in vitro

IC-50 <nM>

HAO-A MAO-B

ZlúCe— S(->PAI R<->PAI Rao S<-)PAI R(+>PAT Rac ntna 26 OOO 73 140 17 OOO 2.5 5 výsledky rovnakého pokusu pri použití R(+) a S(-)-MPAI (N-metyl-N-propargyl-l-aminoindán) sú uvedené v tabuľke IA. Každý z enantiomérov MPAI je menej selektívny medzi inhibíciou MAO-B a MAO-A ako R(+)PAI. Ďalej je R(+) len päťkrát aktívnejší ako S(-)MPAI ri MAO-B inhibícii, na rozdiel od R(+)PAI, ktorý je asi 7000-krát aktívnejší ako S(-)PAI v tomto pokuse.

Tabuľka IA

IC-50 (nM) hodnoty pre inhibíciu MAO-A a MAO-B R(+) a S(-) enantiomérmi MPAI v homogenáte potkaních mozgov in vitro

IC-50 <nH>

ΠΑΟ-Α ΠΑΟ-Β

Rovnaké pokusy boli uskutočnené s ľudským cerebrálnym kôrovým tkanivom, získaným 6 hodín po úmrtí a spracovaným opísaným spôsobom. Výsledky týchto pokusov sú uvedené na obr. 3 (kde R(+)PAI, S(-)PAI a racemický PAI zlúčeniny sú ekvivalentné vzorcu (I)).

Príklad 20

Inhibicia MAO aktivity in vivo: akútne liečenie Experimentálny protokol

Potkany (samci Sprague-Dawley) s hmotnosťou 250 ±20 g boli ošetrené jedným z enantiomérov alebo racemickou formou PAI intraperitoneálnou injekciou (ip) alebo orálnou sondou (po) a dekapitované 1 alebo 2 hodiny po podaní. Pre každú hodnotu dávky inhibítora boli použité skupiny troch potkanov a MAO aktivita bola stanovená v mozgu a pečeni pri použití všeobecnej techniky opísanej predtým. Množstvo proteínu v každej inkubácii bolo stanovené pri použití Folin-Lowryho metódy a aktivita enzýmu bola vypočítaná ako nmol substrátu metabolizovaného za hodinu inkubácie na každý mg proteínu. Aktivita MAO v živočíšnych tkanivách živočíchov ošetrených inhibitormi bola vyjadrená ako percentá enzýmovej aktivity v skupine kontrolných zvierat, ktorým bolo podané vehikulum (voda na orálne podanie, 0,9 % salinický roztok pre ip injekcie) a usmrteným uvedeným spôsobom.

Výsledky

Žiadna z použitých dávok použitá s inhibitomými liečivami nemá zrejmé zmeny chovania. Výsledky sú znázornené na obr. 4 až 11. Ip podanie zlúčeniny R(+)-PAI dosahuje 90 % inhibíciu mozgovej MAO-B aktivity pri dávke 0,5 mg/kg. Rovnaká dávka dosahuje len 20 % inhibíciu MAO-A aktivity. Pri orálnom podaní rovnaká dávka R(+)-PAI dosahuje 80 % inhibície MAO-B s nedetegovatcľnou inhibíciou MAO-A. V podstate rovnaké výsledky boli dosiahnuté pre inhibíciu pečeňového MAO ako pre mozgový MAO. Dávky dosahujúce 50 % inhibiciu MAO-A a MAO-B (IC-50) boli vypočítané z inhibičných kriviek a sú uvedené v tabuľke 2. Z týchto údajov je zrejmé, že:

a) inhibičná aktivita MAO zlúčenín R(+)-PAI je zachovaná in vivo pri potkanoch,

b) selektivita inhibície MAO-B vzhľadom na MAO-A pre R(+)-PAI in vivo je zachovaná,

c) oveľa väčšia aktivita (+)- je vzhľadom na (-)-enantiomér zachovaná in vivo,

d) zlúčeniny sú účinnejšie absorbované po orálnom podaní a

e) zlúčeniny účinnejšie prechádzajú cez bariéru krv-mozog a účinnejšie inhibujú mozgový MAO. Skutočnosť, že R(+)-PAI je asi dvakrát aktívnejší ako racemická zlúčenina pre inhibíciu MAO-B, je odrazom extrémne nízkej aktivity S(-)-PAI pre inhibíciu MAO-B.

Tabuľka 2

IC-50 hodnoty (mg/kg) pre inhibíciu MAO-A a MAO-B pomocou R(+)-PAI, S(-)-PAI alebo racemického PAI, pri potkanoch s nasledujúcim intraperitoneálnym (IP) injekčným alebo orálnym (PO) podaním ľldCe- S<-;nPAI Rt-OMPAI S<-7MPAI RC-OMPAI nlna 70 3 5D 10

IC-50 <ηΠ)

HAD-fi ΠΑΟ-Β

ZldCe- nlna	St-UPAI 25 OOO	RC+JPA1 73	Rac 140	SC-JPA1 17 OOO	RC+JPAI Rac
2, S	5
IP mozog	>50	1. 2	2.5	>10	0, 07	0. 22
IP peCeň	>10	5	5	>10	0.06	U. 11
PO mozog	>10	>5	>5	>10	0,17	0. 29
PO peCefi	>10	>5	>S	>10	0.05	0. 09
Príklad 21
Inhibícia MAO aktivity in vivo: chronické liečenie

Experimentálny protokol

Potkany (špecifikácia ako v príklade 20: 4 zvieratá na jednu hodnotu dávky) sa ošetria zlúčeninou R(+)-PAI alebo racemickou formou pri troch hladinách dávky (0,05, 0,1 a 0,5 mg/kg) orálnym podaním, jedna dávka denne počas 21 dní a potom sa dekapitujú 2 hodiny po poslednej dávke. Aktivita MAO typov A a B bola stanovená v mozgu a pečeni postupom v príklade 20.

Výsledky

Dávka 0,1 mg/kg denne zlúčeniny R(+)-PAI poskytuje dobrý stupeň selektívnej inhibície s viac ako 80 % inhibíciou mozgového MAO-B a 20 % alebo nižšou inhibíciou mozgového MAO-A. Pri vyššej dávke 0,5 mg/kg denne je MAO-A stále inhibovaný menej ako 50 % (obr. 12 a 13). Pečeňová MAO má rovnaký stupeň selektívnej inhibície (obr. 14 a obr. 15). Zlúčenina R(+)-PAI je vždy účinnejšia ako racemická forma inhibítora, s faktorom asi dvojnásobným. V prípade mozgového MAO má R(+)-PAI lepší stupeň selektivity pre inhibíciu MAO-B ako racemická forma.

Tieto výsledky ukazujú, že selektivita MAO-B inhibície môže byť udržiavaná nasledujúcim chronickým liečením pomocou uvedených zlúčenín. Ako pri iných ireverzibilných inhibítoroch je stupeň inhibície enzýmu vyšší pri chronickom ošetrovaní ako pri jednotlivej dávke liečiva. Zlúčenina R(+)-PAI má lepší stupeň selektivity inhibície mozgového MAO ako racemická zlúčenina.

Príklad 22

Ireverzibilný charakter MAO inhibície

Experimentálny protokol

Jednotlivá dávka zlúčeniny R(+)-PAI (1 mg/kg) bola podaná ip injekciou skupinám 4 potkanov a zvieratá boli usmrtené o 2, 6, 18, 24, 48 a 72 hodín neskôr. Aktivita MAO-B bola stanovená v celom mozgovom tkanive, ako je opísané.

Výsledky

Výsledky sú znázornené na obr. 16. Maximálna inhibícia MAO-B bola dosiahnutá 6 hodín po injekcii. MAO aktivita bola navrátená na 30 % aktivity kontroly po 72 hodinách po injekcii. Tento pokus dokladá ireverzibilný charakter MAO inhibície zlúčeniny R(+)-PAI.

Príklad 23

Zosilnenie vplyvu tyramínu na tlak potkanov pri vedomí Experimentálny protokol

Potkany boli anestetizované zmesou pentobarbitalu (30 mg/kg) a chloralhydrátu (120 mg/kg) intraperitoneálnou injekciou. Ľavá karotída a jugárna žila boli kanylované jemnou polyetylénovou rúrkou (artéria) alebo jemnou rúrkou zo silikónového kaučuku pripojenou k polyetylénovej rúrke (žila), ich vzdialenejší koniec bol zavedený pod kožu za krkom. Rúrky boli naplnené heparinizovaným soľným roztokom a uzatvorené zátkou zjemnej soli. Zvieratá boli ošetrené 20 mg chloramfenikolu intramuskulámou injekciou a ponechané cez noc v pokoji po operácii. Ďalší deň boli potkany umiestené do vysokostenového kontajnera umožňujúceho voľný pohyb. Arteriálny katéter bol spojený s tlakovým senzorom 100 cm dlhou, soľným roztokom naplnenou polyetylénovou rúrkou sjemnou svetlosťou a žilný katéter bol pripojený k 1 ml striekačke rúrkou s rovnakou dĺžkou, ktorá spolu so striekačkou obsahuje roztok hydrochloridu tyramínu v soľnom roztoku (1 mg/ml).

Nasleduje rovnovážna perióda 30 až 40 minút, podá sa injekcia tyramínu (50 alebo 100 pg) a zaznamenáva sa krvný tlak. Medzi injekciami sa udržiava interval aspoň 15 minút po návrate krvného tlaku na kontrolnú hodnotu. Kontrolné tlakové odpovede boli stanovené a potom bolo jedno liečivo injektované intraperitoneálne a tyramínová odpoveď bola opakovaná o ďalšie 4 hodiny. Bola vyhodnotená plocha pod krivkou tlakovej odpovede a pomer tejto plochy po ošetrení k ploche stanovenej pred ošetrením bol stanovený pri použití priemeru z 3 až 4 hodnôt získaných v kontrolnej perióde a 1 až 3 hodiny po injekcii zlúčenín.

Výsledky

Výsledky sú uvedené v tabuľke 3. Zlúčenina R(+)-PA] pri dávke 1 mg/kg (ktorá spôsobuje 40 až 50 % inhibíciu MAO-A v mozgu a pečeni a úplnú inhibíciu MAO-B v týchto tkanivách) nevyvoláva výrazné zosilnenie tyramínovej tlakovej odpovede. Pri vyššej dávke R(+)-PAI 5 mg/kg (ktorá vyvoláva extenzívnejšiu inhibíciu MAO-A v mozgu a periférii), výrazne zvyšuje odpoveď tlaku na tyramín, ktorá bola do istej miery rovnaká s odpoveďou vyvolanou rovnakou dávkou deprenylu a menšia ako odpoveď vyvolaná clorgylinom (pri dávke, ktorá inhibuje pečeňovú MAO-A aktivitu nad 85 %).

Tabuľka 3

Zvýšenie vplyvu tyramínu na tlak živých potkanov pôsobením MAO inhibítorov

Inhlbítor dávka	počet	pomer plochy pod SEF1
(mg/kg>	potkanov	krivkou odpovede
	<rô	tlakui po/pred

solný	12	1, 25	0,28
roztok
Clorgyllne	2	6	10, 39	2.13
(-)-de-	i	2	1.15
prenyl
<->-de-	5	3	2, 36	0. 16
prenyl
RC-OPAI	1	3	1, 38	0, 7
RC+JPAI	5	3	3, 49	0. 98

Z tohto pokusu vyplýva, že R(+)-PAI nevyvoláva zvýšenie účinku tyramínu na tlak v dávke, ktorá je účinná pre inhibíciu MAO-B.

Príklad 24

Potlačenie MPTP-indukovanej dopamínergmej toxicity R(+)-PAI l-Metyl-4-fenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridín (MPTP) je neurotoxínom preto, lebo poškodzuje nigrostriatálne dopamínergné neuróny pri niektorých druhoch cicavcov, zahr8

SK 280742 Β6 nujúcich myši a spôsobuje parkinsonický syndróm u ľudí a primátov. Rozhodujúci začiatočný krok v mechanizme jeho neurotoxicity vyvoláva konverzia MPTP na jeho toxický metabolit l-metyl-4-fenylpyridíniový ión (MPP+). Táto reakcia je katalyzovaná enzýmom MAO-B a pravdepodobne prebieha mimo dopamínergných neurónov, predovšetkým v gliu. Je známe, že MPTP je substrátom a ireverzibilným inhibítorom MAO-B. Predchádzajúce ošetrenie pokusných zvierat MAO-B inhibítormi, ako je deprenyl alebo pargylin, chráni pred MPTP-vyvolaným ohrozením nigrostritálnych neurónov, pretože je blokovaná oxidačná konverzia MPTP na MPP+. Jedna z hlavných všeobecných hypotéz predpokladá, že progresívna nigrostritálna degenerácia v parkinsonizme môže byť vyvolaná expozíciu MPTP-podobných neurotoxínov, odvodených zo životného prostredia. V takomto prípade je ďalšou silnou indikáciou na začatie udržiavacieho liečenia MAO-B inhibítorom už vo veľmi skorých štádiách Parkinsonovej choroby, kedy je nádej, že bude neutralizovať škodlivé účinky týchto doteraz ešte predpokladaných toxínov podobných MPTP a tým zamedzí alebo spomalí progresiu choroby. O úspešnom použití MAO-B inhibítora ako liečiva sa predpokladá, že je spôsobené jeho schopnosťou blokovať MPTP-indukované poškodenie nigrostritálnych dopamínergných neurónov in vivo. Preto boli testované (-) a (+) enantioméry PAI na ich účinnosť pri zabránení alebo obmedzení MPTP-indukovaných striatálnych dopamínových deplecií pri myšiach.

Experimentálny protokol

Samčekovia C57 čiernych myší (s 20 až 25 g hmotnosťou) boli injektované MPTP-HC1 (30 mg/kg, rozpustené v destilovanej vode, s. c.) alebo samotným vehikulom, alebo jednu hodinu pred ošetrením (-) alebo (+) izomérmi PAI (2,5 mg/kg, i. p.) alebo deprenylom (5 mg/kg, i. p.) a dekapitované o päť dní neskôr. Mozgy boli vybraté a teleso striata bolo vypitvané na ľadom chladenú sklenenú dosku a zmrazené suchým ľadom. Striatálne tkanivá boli homogenizované v O,1M kyseline chloristej a deproteinizované podielmi s obsahom dihydroxybenzylamínu ako vnútorný štandard boli analyzované na dopamín a jeho hlavný metabolit kyselinu 3,4-dihydroxyfenyloctovú (DOPAC) použitím HPLC s elektrochemickou detekciou.

Výsledky

Tabuľka 4 ukazuje výsledky z tohto pokusu. Ošetrenie MPTP samotným poskytuje značné dopamínové (DA) a DOPAC deplecie. Ošetrenie (-) a (+) enantiomérmi PAI alebo (-)deprenylom neovplyvňuje striatálne DA koncentrácie. Predchádzajúce ošetrenie (-) izomérom PAI neovplyvňuje MPTP-indukovné DA a DOPAC hladiny v striate. (+)-Izomér PAI podaný pred MPTP kompletne zamedzil redukcii striatálnych DA a DOPAC hladiny produkovanej toxínom. V dávke 2,5 mg/kg bol rovnako účinný ako (-)-deprenyl (5 mg/kg), pokiaľ ide o ochranný účinok.

Tabuľka 4

Vplyv predchádzajúceho ošetrenia (-) a (+) enantiomérmi

MAO-B inhibítora PAI na deplecie striatálnej DA a DOPAC vyvolané MPTP pri myšiach in vivo

	DA	DOPAC
	< ng/mg	proteínu)
kontrola	162. 8*7.2	8. 4+0. 5
(-)-PAI	174. 0±4. 8	7.5±0. 2
C-J-PAI * MPTP	53. 416, 9	7, O±O. 6
<+J-PAI	195. O±6.9	3. 3±0. 3
C-O-PAT + MPTP	177. 8+14. 4	6. 0*0. 3
C—Jcdeprenyl	170. 6±7.1	5. G+O, 3
(-)deprenyl + MPTP	197, 0+8. D	6. 4±0. 5
MPTP	53. 1±6, 2	3, 2±0, 3

Uvedené hodnoty DA a DOPAC sú vyjadrené ako hodnoty priemeru +S.E.M a počet potkanov n = 7 - 11 v každej skupine.

Z týchto výsledkov je zrejmé, že R(+)-PAI je vynikajúci MAO-B inhibítor in vivo a je mimoriadne účinný pri liečení Parkinsonovej choroby.

Aj keď bol vynález opísaný uvedenými príkladmi a súvisiacimi tabuľkami a obrázkami, nie je nimi obmedzený. Sú možné rôzne modifikácie a aplikácie vynálezu, napríklad zlúčeniny so všeobecným vzorcom (I) môžu byť kombinované synergickým spôsobom s α-tokoferolom (derivát vitamínu E) na liečenie Parkinsonovej choroby.

Príklad 25

Vplyv PAI enantiomérov na amfetamínom indukované chovanie senescentných potkanov

O amfetamíne sa vie, že indukuje stereotypné chovanie (Sulser F. a Sanders-Bush, E. Ann. Rev. Pharmacol. H.: 209 - 230 (1971)) mobilizáciou endogénneho dopamínu. Amfetamín nie je metabolizovaný MAO-B. Inhibícia MAO-B účinným inhibítorom a podanie amfetamínu vyvoláva uvoľnenie dopamínu, ktorý nebude prechádzať degradáciou inhibovaným MAO-B. Je tak očakávané zvýšenie synaptického dopamínu po podaní amfetamínu a účinného MAO-B inhibítora, ktoré vedie k zvýšeniu v stereotypnom chovaní - potanciácia amfetamínového účinku. Rozsah tohto chovania je hodnotený podľa počtu laterálnych pohybov hlavy počas 1 minúty.

Experimentálny protokol

Testovaná zlúčeniny bola podaná v dávke 0,5 mg/kg/deň v pitnej vode, 24 hodín pred vyvolaním hypoxie (92 % dusíka + 8 % kyslíka počas 6 hodín). Ďalej sa injektuje amfetamín s. c. v dávke 0,5 mg/kg o 45 min. neskôr, počítajú sa laterálne pohyby hlavy.

Výsledky

Výsledky týchto pokusov sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Vplyv PAI izomérov na amfetamínom indukované stereotypné chovanie senescentných potkanov (kontrolné a s vyvolanou hypoxiou)

Skupina	ošetrenie	stereotypné chovanie potkanov
kontrola (6)	-	97±10
kontrola (5)	C*)PAI	126116-
kontrola <4>	(-)PAI	94+18
vyvolaná hypoxla (5)	-	93*12
vyvolaná hypoxla (6)	(*)PAI	143+6-

SK 280742 Β6

Čísla v zátvorkách znamenajú počet testovaných zvierat P < 0,001 vzhľadom na neošetrenú skupinu s hypoxiou alebo neošetrenú skupinu kontrolnú

Výsledky v tabuľke 5 ukazujú, že (+) vyvoláva výrazné zvýšenie amfetamínom indukovaného stereotypného chovania pri potkanov s vyvolanou hypoxiou aj pri kontrolných zvieratách. (-)PAI bol z tohto hľadiska úplne neúčinný. Tieto výsledky chovania in vivo potvrdzujú predchádzajúce biochemické zistenia, že (+)PAI je účinným inhibítorom MAO-B v mozgu, zatiaľ čo (-) je z tohto hľadiska neúčinný.

Príklad 26

Vplyv R(+)-PAI na zlepšenie alebo obnovenie pamäti

Novonarodené potkanie mláďatá boli podrobené opísanému pokusu s anoxiou a potom im bolo umožnené pokračovanie vývoja normálnym spôsobom, pričom sa vyvinuli dlhodobé poruchy pamäti (Speiser a spol., Behav. Brain. Res. 30: 89 - 94, 1988). Táto porucha pamäti je vyjadrená ako zhoršenie priebehu pasívneho testu s prekážkami.

Vplyv R(+)PAI a S(-)PAI na zlepšenie alebo obnovenie pamäti bol hodnotený pomocou pasívneho testu s prekážkami. Ak je liečivo účinné, zvyšuje latentnú odpoveď na vstup do tmavého priestoru alebo priestoru, kde môžu testované potkany, tak ako predtým, dostať elektrický šok. Latencia maximálnej odpovede je 300 sekúnd.

Experimentálny protokol

Mladé potkany boli podrobené postnatálnej anoxii, ako je opísaná v príklade 27. R(+)PAI alebo S(-)PAI boli podané podľa jedného z nasledujúcich protokolov:

Protokol A

Dojčiacim matkám bola podaná dávka buď jedného, alebo druhého izoméru 1 až 1,5 mg/kg/deň v pitnej vode až do odstavenia po 21 dňoch. Potom bolo odstavené potomstvo priamo dávkované rovnakou dávkou počas 20 dní. Ošetrenie bolo ukončené 40. deň a test bol uskutočnený 60. deň, to znamená 20 dní po poslednej dávke liečiva.

Protokol B

Dávka podávaná dojčiacim matkám bola znížená na 0,5 mg/kg/deň až do odstavenia 21. deň a priamo potom podávaná mláďatám potkanov až do 60. dňa, kedy bol uskutočnený test.

Pasívny test s prekážkami

Zariadenie obsahuje svetlú komôrku s pripojenou tmavou komôrkou a posuvné dvierka, oddeľujúce tieto komôrky. Pri tréningu boli potkany umiestnené do osvetlenej komôrky na čas 30 sekúnd a potom boli dvierka otvorené. Potkany potom presídlili do tmavej komôrky s oneskorením, ktoré bolo zaznamenané. Po vstupe potkanov do tmavého priestoru boli dvierka uzatvorené a potkany dostali šok do labky počas 3 s 0,3 m A.

Retencia (pamäť) po 48 hodinách bola stanovená opakovaním testu a zaznamenaním oneskorenia prechodu zo svetlej do tmavej komôrky maximálnej odpovede 300 s.

Výsledky

Výsledky týchto pokusov sú uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Vplyv PAI izomérov na pasívnu odpoveď prekonania prekážok pri mladých potkanoch (starých 60 dní)

Protokol A

Skupina	ošetrenie	pred elektrošokom	po elektrošoku
kontrola	-	49+13	2011111
kontrola	<*>PAI	49119	220+100( 9X5·
kontrola	(-5PAT	49113	1921116
vyvolaná	anoxia -	45+11	1831109
vyvolaná	anoxia C*)PAI	49+10	239199(+19X5
vyvolaná	anoxia C-5PAI	55127	1791123
	Protokol B
Skupina	ošetrenie	pred	PO
		elektrošokom	elektrošoku
kontrola	-	53120	1041101
kontrola	(♦5PAI	48111	128±119C231)·
vyvolaná	anoxia	45+Θ	1191105
uyvolaná	anoxia <*>PAI	52112	1371126C+15X)·*
vyvolaná	anoxia (-5PAI	48119	1121112

- Obrázky predstavujú oneskorenie v sekundách pred vstupom do tmavej komôrky, kde testované potkany už mali prvú skúsenosť s elektrošokom * Uvedené percentá zvýšenia sú vztiahnuté na skupinu potkanov s anoxiou alebo kontrolnú skupinu

Experimentálne výsledky ukazujú, že (+)PAI nie (-)PAI je účinný pri zlepšení pamäti potkanov s anoxiou a kontrolných potkanov. Liečivá v tomto teste aktívne je možné pokladať za účinné pri liečení rôznych porúch pamäti, demencie a predovšetkým senilnej demencie Alzheimerovho typu.

Príklad 27

Vplyv R(+)PAI na anoxiou indukovaný hyperaktívny syndróm mladých potkanov

Potkany boli vystavené postnatálnej anoxii a potom ponechané vyvíjať sa pri normálnych podmienkach, kde tento vývoj ukázal zvýšenú motorickú aktivitu v otvorenom priestore vo veku 10 až 42 dní (Hertshkowitz a spol., Dev. Brain Res. 7: 145- 155(1983)).

Vplyv R(+)PAI na tento hyperaktivny syndróm bol sledovaný.

Experimentálny protokol

Anoxia bola vyvolaná pri potkaních mláďatách prvý postnatálny deň. Boli umiestnené do sklenenej komôrky a pôsobilo sa na ne 100 % dusíkom počas 25 minút. Potom boli potkany resuscitované občasnou masážou jemne aplikovanou na hrudník a potom navrátené príslušným matkám. Kontrolné potkany boli ošetrené rovnako, s tým rozdielom, že bol použitý namiesto dusíka vzduch.

Dojčiacim matkám bol podaný R(+)PA1 alebo S(-)PAI (0,5 mg/kg/deň) v pitnej vode tak, aby došlo k prevodu mliekom dojčeným mláďatám.

Lokomócia bola meraná v šiestich úplne kompjuterizovaných klietkach (28 x 28 cm) zaznamenávaním počtu prechodov za daný čas. Prerušenie mriežky infračervených lú

SK 280742 Β6 čov v 4 cm intervaloch iniciuje elektrické impulzy prenášané do počítača. Záznamy motorickej aktivity boli uskutočnené vo veku 15 až 20 dní počas 15 minút.

Výsledky

Experimentálne výsledky sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Vplyv jednotlivých izomérov na anexiou vyvolaný hyperaktívny syndróm

Skupina	ošetrenie	potkany staré 15 dní	potkany staré 20 dní
kontrola	-	4141192(11)	8081212(12)
kontrola	(*)PAI	2541149(ll)c	7191110(13)
vyvolaná anoxla	-	4821119(7)	858196(9)
vyvolaná anoxla	(+)PAI	2761186(15)a	7371150(16)e
vyvolaná anoxla	(-)PAI	3341196(5)	7781232(6)

Čísla v zátvorkách znamenajú počet testovaných zvierat.

- Obrázky predstavujú počet prerušení mriežky infračervených lúčov v klietke na meranie aktivity počas 15 minút

a) P < 0.001 v porovnaní s neošetrenou skupinou s anoxiou

b) P < 0,05 v porovnaní s neošetrenou skupinou s anoxiou

c) P < 0,05 v porovnaní s kontrolnou skupinou

Tieto výsledky ukazujú, že chronické orálne ošetrenie R(+)PAI v dávke 0,5 mg/kg podávané dojčiacim matkám a mliečnou potravou aj kojeným mláďatám výrazne zlepšuje hyperaktívny syndróm. Z toho vyplýva, že R(+)PAI je potenciálnym účinným liečivom na liečenie hyperaktívneho syndrómu u detí.

Claims

1. R(+)-N-Propargyl-1 -aminoindán so vzorcom (I) alebo jeho farmaceutický prijateľné adičné soli s kyselinami.

2. R(+)-N-Propargyl-l-aminoindán so vzorcom (I) na použitie na liečenie Parkinsonovcj choroby, porúch pamäti, demencie Alzheimerovho typu, DAT, depresie a hyperaktívneho syndrómu.

3. Použitie R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu so vzorcom (I) na výrobu farmaceutických prípravkov na liečenie Parkinsonovej choroby, porúch pamäti, demencie Alzheimerovho typu, DAT, depresie a hyperaktívneho syndrómu.

4. Farmaceutický prípravok na liečenie Parkinsonovej choroby, porúch pamäti, demencie Alzheimerovho typu, DAT, depresie a hyperaktívneho syndrómu, vyznačujúci sa tým, že ako účinnú zložku obsahuje R(+)-N-propargyl-l-aminoindán so vzorcom (I).

5. Farmaceutický prípravok podľa nároku 4, vyzná č u j ú c i sa tým, že má podobu vhodnú na orálne podávanie.

6. Farmaceutický prípravok podľa nároku 4, vyzná í u j ú c i sa tým, že má podobu injekčného roztoku alebo emulzie.

7. Farmaceutický prípravok podľa nároku 4, v y značujúci sa tým, že má podobu čapíkov na rektálne podávanie.

8. Farmaceutický prípravok podľa nároku 4, vyzná í u j ú c i sa tým, že má podobu vhodnú na transdermálne podávanie.

9. Farmaceutický prípravok podľa nároku 5 alebo 7, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 2 až 20 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, vztiahnuté na dávkovaciu jednotku.

10. Farmaceutický prípravok podľa nároku 9, v y značujúci sa tým, že obsahuje 5 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, vztiahnuté na dávkovaciu jednotku.

11. Farmaceutický prípravok podľa nároku 6, v y značujúci sa tým, že v dávkovacej jednotke obsahuje 1 až 10 mg R(+)-N-propargy!-l-aminoindánu, vztiahnuté na 1 ml prípravku.

12. Farmaceutický prípravok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že v dávkovacej jednotke obsahuje 2 až 5 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, vztiahnuté na 1 ml prípravku.

13. Farmaceutický prípravok podľa nároku 4, v y značujúci sa tým, že ako účinnú zložku, okrem R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, obsahuje levodopu a inhibítor dekarboxylázy, pričom má podobu tabliet alebo toboliek.

14. Farmaceutický prípravok podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že obsahuje 2 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, 50 až 250 mg levodopy a 10 až 25 mg L-karbidopa.

15. Farmaceutický prípravok podľa nároku 13, vyzná č u j ú c i sa tým, že obsahuje 2 až 10 mg R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu, 50 až 200 mg levodopy a 12,5 až 50 mg benserazidu.

16. Spôsob prípravy R(+)-N-propargyl-l-aminoindánu a jeho adičných solí s kyselinami podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa nechá reagovať R(-)-enantiomér 1-aminoindánu s propargylbromidom alebo propargylchloridom za prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy, prípadne za prítomnosti vhodného rozpúšťadla a izoluje sa R(+)-enantiomér N-propargyl-l-aminoindánu chromatografiou, destiláciou, selektívnou extakciou a ak je to žiaduce, prevedie sa voľná báza takto pripravená na svoje adičné soli s kyselinami.

17. Spôsob prípravy R(+)-N-propargyl-1-aminoindánu a jeho adičných solí s kyselinami podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa nechá reagovať racemický 1-aminoindán s propargylbromidom alebo propargylchloridom za prítomnosti organickej alebo anorganickej bázy, pripadne za prítomnosti vhodného rozpúšťadla a izoluje sa R(+)-enantiomér N-propargyl-1-aminoindánu chromatografiou, destiláciou, selektívnou extrakciou a ak je to žiaduce, prevedie sa voľná báza takto pripravená na svoje adičné soli s kyselinami.

18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa t ý m , že zahrnuje reakciu získanej voľnej bázy s opticky aktívnou kyselinou za vzniku dvoch diastereoizomémych solí, oddelenie požadovanej soli R(+)-N-propargyl-1-aminoindánu a ak je to žiaduce, regeneráciu voľnej bázy.

19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa t ý m , že oddelenie soli R(+)-N-propargyl-1-aminoindánu sa uskutoční frakčnou kryštalizáciou.