SK279794B6 - Spôsob fermentačnej výroby cefalosporínu c - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu fermentačnej výroby cefalosporínu.

Doterajší stav techniky

Spracovanie kultivačného prostredia obsahujúceho antibiotiká sa spravidla vykonáva až po dosiahnutí maximálneho obsahu antibiotík v kultivačnom prostredí. Väčšinou sa ako prvý spracovateľský stupeň uskutočňuje oddelenie buniek a pevného podielu filtráciou alebo odstredením. Potom sa vykonáva obohatenie kvapalného podielu kultivačného prostredia látkou alebo látkami, ktorá, prípadne ktoré sú cieľom kultivačného procesu, pričom toto obohatenie sa vykonáva extrakciou alebo adsorpciou. Takto vyčistený produkt sa potom spravidla ponechá vykryštalizovať a nato sa ďalej spracuje na polysyntetické antibiotiká

Pri tejto metóde spracovania zahŕňajúcej niekoľko následných spracovateľských stupňov sa nevýhodne uplatňuje nestabilita molekúl mnohých antibiotík, napríklad cefalosporínu C. Už v priebehu vlastnej fermentácie dochádza k odbúravaniu cefalosporínu C. K tomuto odbúravaniu môže dochádzať tak čisto chemicky a to napadnutím beta-laktámového kruhu vodou, ako aj enzymaticky, napríklad účinkom esteráz (Konečný a kol. ,1973, J. of Antib., 26, 3, 135-141). Ďalej sa pri fermentácii tvorí celý rad vedľajších produktov, ako sú deacetoxycefalosporín C a deacetylcefalosporín C, ktoré musia byť v priebehu čistenia cefalosporínu oddelené. To má za následok značné zníženie výťažku cefalosporínu C.

Filtračné systémy s priečnym tokom (filtračné systémy „cross-flow“) s polymémymi alebo keramickými membránami už boli pre spracovanie kultivačných prostredí s obsahom antibiotík použité (Harris a kol., J. Chem. Techn. Biotechnol., 1988, 42, 19-30). Až doposiaľ sa však nezistilo, že pri tomto spôsobe môže byť obmedzený rozklad cefalosporínu C.

Úlohou tohto vynálezu je nájsť spôsob, pri ktorom by bol obmedzený rozklad cefalosporínu C a zmenšená tvorba vedľajších produktov a ktorým by sa mohlo dosiahnuť zvýšenie výťažku cefalosporínu C, vztiahnuté na množstvo použitého substrátu.

S prekvapením sa teraz zistilo, že použitím filtračného modulu s priečnym tokom v priebehu fermentácie Acremonium chrysogenum sa zvýši výťažok cefalosporínu C, obmedzí sa tvorba deacetylcefalosporínu C a môže byť predĺžený produkčný čas. Touto filtráciou a malou tvorbou deacetylcefalosporínu C sa taktiež výrazne zjednoduší spracovanie cefalosporínu C.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob výroby cefalosporínu C, ktorého podstata spočíva v tom, že sa v priebehu fermentácie filtruje fermentačný roztok cez filtračný systém s priečnym tokom, pričom odobrané množstvo filtrátu môže byť vo fermentore nahradené.

Pokiaľ ide o výrobu derivátov cefalosporínu C, sú pri použití pri spôsobe podľa vynálezu vhodné Acremonium chrysogenum (Cephalospnrium acremonium), jeho mutanty a selektanty.

Živný roztok obsahuje zdroje uhlíka, akými sú sacharóza, kukuričný škrob, dextróza alebo melasa a zdroje dusíka, akými sú sójová múčka, podzemnicová múčka, sladový extrakt alebo octan amónny.

Živné prostredie obsahuje také anorganické soli, ako hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid vápenatý, síran vápenatý, uhličitan vápenatý, síran horečnatý alebo hydrogenfosforečnan draselný. Ďalej môže byť k živnému prostrediu pridaný taktiež tuk, napríklad metylester kyseliny olejovej alebo sójový olej. Okrem toho sa môžu pridať tiež stopové prvky, ako železo, mangán, meď, zinok, kobalt vo forme solí alebo soli ďalších kovov.

Kultivácia Acremonium chrysogenum (Cephalosporium acremonium), výhodne DSM 6473 sa vykonáva pri teplote 20 až 30 ^DC, výhodne pri teplote 25 °C a pri hodnote pH medzi 5 a 8, výhodne pri hodnote pH rovnajúcej sa 7. Táto kultivácia sa najprv vykonáva aeróbne vo vytrepávacej banke a potom vo fermentore za miešania a prevzdušňovania vzduchom alebo čistým kyslíkom. Kultivácia mikroorganizmov vo fermentore sa robí počas 120 až 240 hodín, výhodne počas 130 až 170 hodín.

Ako filtračné systémy s priečnym tokom môžu byť použité polyméme, uhľovodíkové alebo keramické moduly tvorené membránami z doštičiek, trubičiek, kapilár, zvitkov alebo dutých vlákien a majúce separačný prah zodpovedajúci separačnému prahu ultrafiltrácie až sterilizačnej filtrácie. Výhodne sa použijú filtračné moduly s veľkosťou pórov od 0,2 pm alebo 4 nm. Ako materiály na výrobu týchto membrán sa môžu použiť polysulfóny, polyamidy, acetát celulózy, oxid hlinitý alebo oxid zirkoničitý. Filtrácia sa môže vykonávať kontinuálne alebo diskontinuálne. S filtráciou sa začne asi 2 až 3 dni po zaočkovaní fermentora a môže sa v nej pokračovať až do konca fermentačného procesu. Prietoková rýchlosť fermentačného roztoku cez filtračnú plochu robí 0,5 až 20 m/s, výhodne 1 až 10 m/s.

Filtrát, ktorý sa v priebehu fermentácie z fermentora odstraňuje, môže sa nahradiť zodpovedajúcim množstvom kvapaliny alebo sa tento filtrát môže po oddelení požadovaného produktu, napríklad absorpciou, vrátiť späť do fermentora. K nemu sa môže pričerpať voda obohatená zodpovedajúcimi soľami alebo ďalšími zložkami živného prostredia.

Objem kvapaliny, ktorý nepermeoval cez membránu, sa taktiež zavedie naspäť do fermontora.

Fermentor a filtračný systém s priečnym tokom sú spojené zodpovedajúcimi rúrkami alebo hadicami, ktoré boli ešte pred vlastnou fermentáciou sterilizované. Pre fermentor s obsahom 100 1 je potreba asi 0,2 m² filtračnej plochy. Môžu sa však použiť aj väčšie a menšie filtračné plochy.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou príkladov jeho konkrétneho uskutočnenia, ktoré majú však iba ilustračný charakter a nijako neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý’ je jednoznačne vymedzený formuláciou patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

FermentáciaTcremort/úm chrysogenum DSM 6473

Táto fermentácia sa vykonáva v nasledujúcom živnom roztoku:
Predkultivačné prostredie	g/i
Kukuričný výluh	11,75
Octan amónny	4,5
Sacharóza	20,0

Dihydrát síranu vápenatého 0,5

Heptahydrát síranu horečnatého 0,5 pH 7,0 (upravené 15 % (hmotn.) NaOH)

Tabuľka 2

Fermentačné prostredie	g/i
Tuku-prostá podzemnicová múčka	100,0
Octan amónny	6,0
Monohydrát glukózy	5,0
Metyloleát	5,0
D,L-Metionín	3,0
Dihydrát síranu vápenatého	5,0
Heptahydrát síranu horečnatého	5,0
Uhličitan vápenatý	5,0
Odpeňovadlo	0,5

Cefalosporín Deacetylcefalosporin/ (t) cefalosporín (%)

A (142 hodín)

B (167 hodín)

100

129

100

Roztok na doplnenie fermentačného prostredia

Monohydrát glukózy 500,0

D,L-Metionín 24,75

Na zaočkovanie 100 ml predkultivačného prostredia sa použijú kultúry šikmého agaru (vytrepávacia banka s obsahom 500 ml so 4 šikanami). Tieto banky sa počas 48 hodín inkubujú pri 150 obrátkach za minútu a teplote 25 až 28 °C. Tieto kultúry sa potom použijú na zaočkovanie ďalšieho predkultivačného prostredia (1000 ml prostredia v banke s obsahom 5000 ml sa inkubuje pri 120 otáčkach za minútu a teplote 25 až 28 °C počas 58 až 60 hodín). Uvedeným druhým predkultivačným prostredím sa v miešanom fermente zaočkuje 60 litrov fermentačného prostredia. Táto fermentácia sa vykonáva pri teplote 25 °C. Prevzdušňovanie sa reguluje tak, že pO₂ vo fermentačnom živnom prostredí je vyššie ako 20 %.

Po 74 hodinách začne filtrácia cez keramický modul s priečnym tokom (komerčne dostupný vo firme Membraflow, alfa- AI2O3) majúcim filtračnú plochu 0,2 m² a veľkosť pórov 0,2 gm. Táto filtrácia sa vykonáva za nasledujúcich prevádzkových podmienok:

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob fermentačnej výroby cefalosporínu C, vyznačujúci sa tým, že sa fermentačný roztok v priebehu fermentácie filtruje cez filtračný systém s priečnym tokom, pričom odobrané množstvo filtrátu môže byť vo fermentore nahradené.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije Acremonium chrysogenum.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa ako filtračný systém s priečnym tokom použije polymémy alebo keramický filter.
4. 4. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že filter má veľkosť pórov medzi 4 a 200 nm.
5. 5. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že prietoková rýchlosť cez filtračnú plochu robí 1 až 10 m/s.
6. 6. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých z nárokov laž 5, vyznačujúci sa tým, že filtrát sa vo fermente nahradí vodou.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že filtrát sa nahradí živným roztokom.
8. 8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa filtrát po odstránení požadovaného produktu zavedie späť do fermentora.

   prietoková rýchlosť: 2 m/s, prečerpávacia rýchlosť: 500 1/h, filtračný výkon: 2 1/h a filtračný čas: 68 h.