SK153599A3

SK153599A3 - Gene construct encoding a heterologous prodrug-activating enzyme and a cell targeting moiety

Info

Publication number: SK153599A3
Application number: SK1535-99A
Authority: SK
Inventors: Stephen Charles Emery; David Charles Blakey
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1997-05-10
Filing date: 1998-05-05
Publication date: 2000-06-12
Also published as: HUP0001931A3; ES2314990T3; DE69840165D1; GB9709421D0; AU7225498A; EP0979292A2; JP2001526539A; GB2338484B; KR100508136B1; ZA983931B; NZ500014A; BR9808769A; IL132348A0; PL337007A1; WO1998051787A3; CA2286875A1; GB9922815D0; MY140975A; AU734915B2; GB2338484A

Description

Génový konštrukt, ktorý kóduje časť zacieľujúcu na bunku a enzým aktivujúci predliek na použitie ako liečivo

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka génom riadenej enzýmovej predliekovej terapie (GDEPT), ktorá využíva tvorbu protilátok in situ, aby sa zvýšila selektivita liečby, osobitne pri použití na liečenie rakoviny.

Doterajší stav techniky

K doteraz známym liečebným postupom používajúcim predliek (prodrug), ktoré sú založené na génovej terapii, patrí vírusom riadená enzýmová predlieková terapia (VDEPT) a génom riadená enzýmová predlieková terapia (GDEPT), pričom druhá metóda zahrňuje tak VDEPT ako aj iné ako vírusové systémy prenosu génov. Metóda VDEPT zahrňuje zacielenie nádorových buniek vírusovým vektorom, ktorý nesie gén kódujúci enzým, ktorý je schopný aktivovať predliek. Vírusová vektor vstúpi do nádorovej bunky a z génu sa vo vnútri bunky exprimuje enzým. V metóde GDEPT sa na prenos génu kódujúceho enzým používajú alternatívne prístupy, ako sú mikroinjekcie, prenos lipozómami, príjem DNA sprostredkovaný receptormi, ale tiež prenos pomocou vírusov.

Ako pri VDEPT, tak aj pri GDEPT sa môže gén pre enzým môže regulovať sekvenciami DNA, ktoré sú schopné selektívnej aktivácie v cicavčích bunkách, napr. špecificky v nádorových bunkách (EP 415 731, Wellcome, Huber a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043, 1991) . Aj napriek určitému stupňu selektivity sa génová expresia môže objaviť aj v iných ako cieľových bunkách, čo je jasne nežiaduce, pokiaľ sa tento postup používa na aktiváciu predlieku na vysoko účinné cytotoxické činidlo. Okrem toho tieto regulačné sekvencie spôsobujú všeobecne zníženie expresie enzýmu v porovnaní s vírusovými promótormi a teda k zníženej schopnosti konvertovať predliek v cieľovom tkanive.

Expresia a lokalizácia enzýmy aktivujúceho predliek vo vnútri bunky je nevýhodná. Návrh predlieku sa tým velmi obmedzí, pretože predliek musí byť schopný prejsť cez bunkovú membránu, pritom nesmie byť toxický kým nie je konvertovaný na liek aktivujúcim enzýmom vo vnútri bunky. Pre väčšinu predliekov sa používajú hydrofilné skupiny na to, aby sa zabránilo vstupu do bunky a tým sa znížila cytotoxicita. Aktivácia predlieku aktivujúcim enzýmom spôsobuje vznik menej hydrofilného lieku, ktorý vstupuje do bunky a prejavuje protirakovinový účinok. Ale tento prístup sa nemôže využiť, pokiaľ sa aktivujúci enzým exprimuje vo vnútri bunky. Ďalšou nevýhodou je, že cieľové bunky, ktoré neobsahujú intracelulárne aktivujúci enzým, budú iba ťažko zasiahnuté terapiou, pretože nie sú schopné generovať aktívny liek. Aby sa mohla dosiahnuť žiaduca aktivita pôsobiaca na susedné bunky (bystander alebo neighbouring celí kill aktivita), aktívny liek musí byť schopný difúzie z bunky obsahujúcej aktivujúci enzým, aby prenikol aj do cieľovej bunky, ktorá neobsahuje expresiu aktivujúceho enzýmu. Mnoho aktívnych liekov, ak sú produkované vo vnútri bunky, nie je schopných úniku z bunky, aby sa dosiahol uvedený účinok na susedné bunky.

Modifikácie GDEPT pokročili tak, že prekonali niektoré z uvedených opísaných problémov. Ako prvé sa opísali vektory, ktoré exprimujú aktivujúci enzým na povrchu cieľových buniek (WO 96/03515), v ktorých sa k aktivujúcemu enzýmu pripojil signálny peptid a transmembránová doména. Tento prístup, ak by bol životaschopný, odstráni problém, že aktivujúci enzým je vo vnútri bunky, ale stále je nutné spoliehať sa na transkripčné regulačné sekvencie schopné selektívnej expresie v delových bunkách, aby sa expresia obmedzila iba na cieľové bunky. Ale ako už uviedlo, použitie takýchto sekvencií má nevýhody. Ako ďalšie sa opísali vektory, ktoré spôsobujú to, že enzým sa secernuje z cieľových buniek (WO 96/16179). Podlá tohto prístupu je enzým schopný difundovať z miesta vzniku, pretože je extracelulárny a nie je prichytený na bunkový povrch. Enzým schopný difundovať z miesta vzniku je schopný aktivovať predliek aj v iných ako iba delových bunkách, čo však spôsobuje nežiaducu toxicitu. Na dosiahnutie určitej selektivity sa navrhlo, aby sa použil taký enzýmový prekurzor, ktorý sa štiepi proteázami, ktoré sa vyskytujú iba pri danom patologickom stave a vytvára sa tak aktívny enzým. Týmto spôsobom sa môže dosiahnuť určitá miera selektivity, ale je málo pravdepodobné, že aktivácia nastane iba v cieľových bunkách. Okrem toho, keď je už raz aktivovaný, enzým bude difundovať z cieľového miesta a teda sa prejavia rovnaké nevýhody, ako už boli uvedené.

Pri postupe GDEPT existujú tri úrovne selektivity. Prvá je selektivita v štádiu infekcie bunky, to znamená, že sa zasiahne iba špecifický bunkový typ. Takéto bunkové selektivity sa môžu získať napr. použitím určitého systému prenosu génov per se. Príklad tohto druhu selektivity je opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške WO 95/26412 (UAB Research Foundation), ktorá opisuje použitie modifikovaných vláknitých proteínov adenovírusov obsahujúcich bunkové špecifické ligandy. K iným príkladom bunkovo špecifického zacielovania génov patrí génový prenos ex vivo do špecifickej bunkovej populácie, ako sú napr. lymfocyty a/alebo priama injekcia DNA do svalového tkaniva.

Druhou úrovňou selektivity je riadenie génovej expresie po infekcii bunky napr. použitím bunkovo alebo tkanivovo špecifických promótorov. Pokial sa gén prenáša do bunky selektívnym spôsobom, je dôležité, aby sa vybral taký promótor, ktorý kompatibilný s aktivitou v danom bunkovom type.

Za tretiu úroveň selektivity sa môže považovať selektivita exprimovaného génového konštruktu. Selektivite tohto typu sa doteraz venovala iba malá pozornosť. V medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/16179 (Wellcome Foundation) sa navrhlo, aby sa použil taký enzýmový prekurzor, ktorý sa odštiepi z prekurzora proteázami, ktoré sa vyskytujú iba pri danom patologickom stave a vytvára tak aktívny enzým. Týmto spôsobom sa môže dosiahnuť istá miera selektivity, ale je len málo pravdepodobné, že aktivácia nastane iba v cieľových bunkách. Okrem toho, keď sa raz aktivuje, enzým sa bude voľne aktivovať a difundovať z cieľového miesta, takže je tu rovnaká nevýhoda aktivácie predlieku v iných cieľových miestach, čo spôsobuje nežiaducu toxicitu.

Existuje teda potreba systémov ADEPT s vyššou selektivitou, v ktorých by sa znížili nežiaduce účinky na normálne tkanivá, ktoré sú dôsledkom nesprávnej aktivácie predlieku.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález je založený na zistení, že génový konštrukt protilátka-heterologický enzým sa môže exprimovať intracelulárne a použiť v systéme ADEPT (alebo iných systémoch ako je AMIRACS - pozri ďalej) na bunkové zacielenie založené na špecificite protilátok, konkrétne na selektívnom podávaní enzýmu dostupného na povrchu bunky. Tento prístup sa môže prípadne použiť v kombinácii s akoukolvek inou technikou zvyšujúcou špecificitu ako je napr. cielená bunková infekcia a/alebo tkanivovo špecifická expresia.

Prvý aspekt predkladaného vynálezu poskytuje génový konštrukt, ktorý kóduje protilátku zacieľujúcu bunku a heterologický enzým aktivujúci predliek na použitie ako liečiva pre cicavce, pričom génový konštrukt je schopný exprimovať protilátku a heterologický enzým ako konjugát vo vnútri cieľovej bunky v cicavčom hostitelovi a konjugát opustí bunku a selektívne sa lokalizuje na antigén na bunkovom povrchu, ktorý je rozpoznávaný protilátkou zacielujúcou bunku.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje génový konštrukt, ktorý kóduje časť zacieľujúcu bunku a heterologický enzým aktivujúci predliek na použitie ako liečivo pre cicavca, pričom génový konštrukt je schopný exprimovať protilátku a heterologický enzým ako konjugát vo vnútri cieľovej bunky v cicavčom hostitelovi a je riadený tak, že po expresii opustí bunku a selektívne sa lokalizuje na antigén na bunkovom povrchu, ktorý je rozpoznávaný časťou zacielujúcou bunku.

Časť zacieľujúca bunku je definovaná ako akýkoľvek polypeptid alebo fragment polypeptidu, ktorý sa selektívne viaže na určitý bunkový typ v hostitelovi tým, že rozpoznáva antigén na bunkovom povrchu. Výhodne je časťou zacielujúcou bunku protilátka. Časti zacieľujúce bunku iné ako protilátky sú napr. ligandy, ako sa opísali na použitie v ligandom riadenej enzýmovej predliekovej terapii v medzinárodnej patentovej prihláške WO 97/26918 (Cancer Research Campaign Technology Limited), epidermálny rastový faktor, heregulin, c-erbB2 a výhodne vaskulárny endotelový rastový faktor.

Protilátka zacielujúca bunku je definovaná ako akákoľvek protilátka alebo fragment protilátky, ktorá sa selektívne viaže na určitý bunkový typ v hostitelovi tým, že rozpoznáva antigén na bunkovom povrchu. Výhodné protilátky zacieľujúce bunku sú napr. protilátky špecifické pre pevné nádory, výhodnejšie pre kolorektálne nádory, najvýhodnejšie je to protilátka anti-CEA, A5B7 alebo ešte výhodnejšie 806.077. Hybridom 806.077 produkujúci protilátku bol v súlade s Budapeštianskou zmluvou uložený 29. februára 1996 v European Collection of Animal celí cultures (ECACC), PHLS Center for Applied Microbiology, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK, ako položka č. 96022936.

Protilátka A5B7 sa viaže na ľudský karcinoembryonálny antigén (CEA) a je osobitne vhodná na zacielenie na kolorektálny karcinóm, A5B7 je možné získať z firmy DÁKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hudgenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, Anglicko. Všeobecne konjugát protilátky (alebo jej fragmentu) s enzýmom by mal byť schopný viazať sa aspoň k dvom antigénom asociovaným s nádorom (môžu byť zhodné alebo rozdielne). Molekula protilátky sa môže humanizovať známymi spôsobmi ako je napr. CDR štepenie, ktoré je opísané v dokumente EP 239400 alebo štepením celých variabilných úsekov napr. z myšacej protilátky do ľudských konštantných úsekov (čím vznikajú chimérne protilátky), čo sa opísalo v patente US 4816567. Humanizované protilátky môžu byť užitočné na zníženie imunogenicity protilátky alebo jej fragmentu). Humanizovaná verzia protilátky A5B7 sa opísala v patentovej prihláške WO 92/01059 (Celltech).

Hybridom produkujúci monoklonálnu protilátku A5B7 bol 14. júla v súlade s Budapeštianskou zmluvou uložený v European Collection of Animal celí cultures (ECACC), PHLS Center for Applied Microbiology, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK, ako položka č. 93071411. Protilátku A5B7 možno získať použitím štandardných postupov známych odborníkovi, ako je opísané napr. v Fenge, C., Fraune, E., Schuegerl, K., in: Production of Biologicals from Animal Celí in Culture, Spier, R.E., Griffith, J.R., Meignier, B., eds. , Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265, Anderson, B.L., Gruenberg, M.L. in Commercial Production of Monoclonal Antibodies, Seaver, S., Ed. Marcel Dekker, 1987, 175-195. Bunky môžu vyžadovať občasné reklonovanie limitným riedením, aby sa udržala dobrá hladina produkcie protilátok.

Heterologický enzým je definovaný ako enzým, ktorý pôsobí na substrát, ktorý sa podal hostiteľskej bunke, pričom tento enzým nie je normálne v prírode prítomný v zodpovedajúcom kompartmente hostiteľa. Enzým môže byť cudzorodý pre cicavčieho hostiteľa (napr. to môže byť bakteriálny enzým ako CPG2) alebo to môže byť enzým, ktorý sa prirodzene nevyskytuje v danom relevantnom kompartmente hostiteľa (napr. použitie lyzozýmu ako enzýmu pre ADEPT, pozri ďalej, pretože lyzozým sa normálne nevyskytuje v krvnom obehu, pozri tiež patent US 5433955, Akzo NV) . Relevantný kompartment hostiteľa je tá časť cicavčieho hostiteľa, v ktorom je distribuovaný substrát. Výhodné enzýmy sú enzýmy vhodné pre ADEPT alebo AMIRACS (antimetabolit s inaktiváciou pomocného činidla v miestach rakoviny, pozri Bagshawe, 1994, Celí Biophys. 24/25, 83-91), ale výhodné sú ADEPT enzýmy. Protilátkami riadená enzýmová predlieková terapia (ADEPT) je známym prístupom v liečení rakoviny. ADEPT využíva nádorovo selektívnu protilátku konjugovanú s enzýmom. Konjugát je podávaný pacientovi (spravidla intravenózne) a ponechá sa, aby sa lokalizoval do miesta nádoru a súčasne zmizol z krvného obehu a ostatných normálnych tkanív. Potom sa pacientovi podá predliek, ktorý je enzýmom (lokalizovaným v mieste nádoru) konvertovaný na cytotoxický liek, ktorý usmrtí nádorové bunky.

Ί

V medzinárodnej patentovej prihláške WO 96/20011, publikovanej 4. júla 1996, sme navrhli systém ADEPT s obrátenou polaritou, založený na mutovaných ľudských enzýmoch, ktoré mali výhodu nízkej imunogenicity v porovnaní napr. s bakteriálnymi enzýmami. Konkrétnym hostitelovým enzýmom bola ľudská CPB (pozri príklad 15, [D253K] ľudská CPB a príklad 16, [D253R] ľudská CPB a vhodný predliek (pozri príklady 18 a 19). Hostiteľský enzým bol mutovaný, aby sa v porovnaní s natívnym enzýmom zmenil spôsob interakcie medzi enzýmom a predliekom v zmysle rozpoznávania substrátu. V našej následnej medzinárodnej patentovej prihláške PCT/GB96/01975, publikovanej 6. marca 1997 ako WO 97/07797 sa opísal ďalší postup práce na kombináciu mutanty enzýmu CPB/predlieku pre ADEPT. Výhodné enzýmy vhodné pre ADPET sú ktorékoľvek CPG2 alebo enzýmy CPB s obrátenou polaritou, napr. ktorýkoľvek z enzýmov [D253K]HCPB, [G251,D253K]HCPB alebo [A248S,G251,D253K]HCPB. Výhodná forma CPG2 je forma, kde sa mutovalo jedno miesto glykozylácie, aby sa odstránila alebo znížila glykozylácia pri expresii v cicavčích bunkách (pozri WO 96/03515, Cancer Research Campaign Technology), čo zlepšuje enzýmovú aktivitu. Ďalšie úvahy sa týkali enzýmov ako je napr. CPB, ktorá vyžaduje prodoménu, aby sa umožnilo správne zostavenie štruktúry, prodoména sa môže buď exprimovať separátne (v trans) alebo ako súčasť fúzneho proteínu a následne sa odstráni.

Purifikáciu CPG2 z Pseudomonas RS-16 vo veľkej mierke opísali Sherwood a kol., 1985, Eur.J.Biochem., 148, 447-453. CPG2 je možné získať z Center for Applied Microbiology, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK. CPG2 sa tiež môže získať rekombinantným spôsobom. Nukleotidová kódujúca sekvencia pre CPG2 bola opísaná v Minton a kol., Gene 31, 1984, 31-38. Bola opísaná expresia tejto kódujúcej sekvencie v E. coli (Chambers, S.P. a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, 29, 572-578) a v Saccharomyces cerevisiae (Čiarke, L.E. a kol., J. Gen. Microbiol., 1985, 131, 897-904). Celková syntéza génu bola opísaná v M. Edwards, Biotech. Lab., 1987, 5, 38-44. Expresia heterologických proteínov v E. coli sa prehľadne opisuje v F.A.O. Marston, DNA Cloning, Voľ. III, Practical Approach Šerieš, IRL

Press, D.M.Glover, ed., 1987, 59-88. Expresia proteínov v kvasinkách bola prehľadne opísaná v Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, 1991, C. Guthrie, G.R. Fink, Eds.

Výhodnou oblasťou využitia vynálezu je oblast liečenia rakoviny, ale vynález sa môže využiť aj v iných terapeutických oblastiach, ak sa môže vybrať cieľový antigén a pripraviť vhodná kombinácia enzým/predliek, Napríklad zápalové choroby ako reumatoidná artritída sa môžu liečiť napr. pomocou protilátky selektívnej pre synoviálne bunky fúzované s enzýmom schopným konvertovať protizápalový liek z formy predlieku do formy protizápalového lieku. Použitie protilátok cielene proti reumatoidnej artritíde sa opísalo v Blakey a kol., 1988, Scand.

J. Rheumatology, Suppl. 76, 279-287.

Konjugát protilátky a enzýmu môže byť fúzny proteín (ide o kovalentnú väzbu) alebo to môže byť konjugát vytvorený nekovalentnou väzbou medzi protilátkou a enzýmom in situ. Výhodne je konjugát vo forme fúzneho proteínu, výhodnejšie je protilátková zložka takejto fúzie aspoň divalentná (na zlepšenie väzbovej avidity v porovnaní s monovalentnou protilátkou). Protilátkové konštrukty neobsahujúce úsek Fc sú výhodné, menovite fragmenty Fab a F(ab')2- Pre fúzie CPG2 (alebo fúzie s akýmkoľvek iným monomérnym enzýmom) platia zvláštne úvahy, pretože CPG2 je dimérny enzým a protilátka je výhodne divalentná, takže tu existuje potenciál pre nežiaducu kompetitívnu dimerizáciu medzi molekulami dvoch druhov. Preto výhodná fúzia CPG2 je taká, kde fúzny proteín je vytvorený spojením C-konca protilátkového ťažkého reťazca Fab (neobsahujúceho kĺbovú oblasť) k N-koncu molekuly CPG2, dve takéto Fab-CPG2 molekuly dimerizujú prostredníctvom dimerizačnej domény CPG2 a vytvorí sa konjugát (Fab-CPG)2- Pre protilátkové konštrukty s monomérnymi enzýmami sú výhodné fragmenty F(ab')z s kĺbovým úsekom z ľudského IgG3. Fúzia protilátky a enzýmu sa môže prípadne získať prostredníctvom krátkej peptidovej spojky (linkera) ako je napr. (G4S)3. Výhodné fúzne konštrukty sú také, kde enzým je fúzovaný k C-koncu protilátky prostredníctvom jej ťažkého alebo ľahkého reťazca, pričom výhodná je fúzia s ťažkým reťazcom protilátky. Teda výhodným génovým konštruktom podľa predkladaného vynálezu je génový konštrukt na použitie ako liečivo, kde konjugát protilátka-enzým CPG2 je fúzny proteín., kde enzým je fúzovaný k C-koncu protilátky prostredníctvom jej ťažkého alebo ľahkého reťazca, pričom ak je kódovaný konjugát exprimovaný, nastane dimerizácia prostredníctvom dimerizačnej domény CPG2. Výhodnejším génovým konštruktom podlá predkladaného vynálezu je génový konštrukt na použitie ako liečivo, kde fúzny proteín Fab-CPG2 je vytvorený prostredníctvom väzby C-konca ťažkého reťazca protilátkového Fab k N-koncu molekuly CPG2, pričom dve molekuly Fab-CPG2, keď sú exprimované, dimerizujú prostredníctvom CPG2 a vytvorí konjugát (Fab-CPG2)2· V inom uskutočnení vynálezu je výhodný génový konštrukt na použitie ako liečivo konštrukt, kde karboxypeptidáza je vybraná z [D253K]HCPB, [G251,D253K]HCPB alebo [A248S,G251,D253K]HCPB.

Uvažuje sa o tom, že pokial by bolo možné získať prirodzene multimérny enzým v monomérnej forme, pričom si zachová podstatnú enzýmovú aktivitu, potom monomérna forma enzýmu by sa mohla použiť na prípravu konjugátu podlá predkladaného vynálezu. Podobne sa dá uvažovať o tom, že pokial by bolo možné získať prirodzene monomérny enzým v multimérnej forme, pričom by si zachoval podstatnú enzýmovú aktivitu, potom by sa takáto multimérna forma enzýmu mohla použiť na prípravu konjugátu podľa predkladaného vynálezu.

Konjugát je nasmerovaný na to, aby opustil bunku po expresii tak, že sa použije sekrečná vedúca sekvencia, ktorá sa odštiepi, keď konjugát predchádza bunkovou membránou. Výhodne je sekrečná vedúca sekvencia taká vedúca sekvencia, ktorá sa vyskytuje prirodzene s protilátkou.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje použitie génového konštruktu kódujúceho protilátku zacielujúcu bunku a heterologický enzým pre prípravu lieku vhodného ba terapiu rakoviny v cicavčom hostiteľovi, kde génový konštrukt je schopný exprimovať protilátku a enzým ako konjugát v cieľovej bunke v cicavčom hostitelovi, pričom konjugát môže potom opustiť bunku pre selektívnu lokalizáciu na antigéne bunkového povrchu, rozpoznanom protilátkou.

Na prenos génového konštruktu podľa predkladaného vynálezu je možné použiť akýkoľvek systém vhodný na prenos, vrátane vírusových a nevírusových systémov. K vírusovým systémom patria retrovírusové vektory, adenovírusové vektory, adenoasociované vektory, vaccinia vírus, vírus Herpes simplex, HIV, leukemický vírus myší, vírus hepatitídy B a vírus chrípky. K nevírusovým systémom patrí čistá, nekomplexovaná DNA, DNA-lipozómové komplexy, DNA-proteínové komplexy a DNA pokryté čiastočky zlata.

Retrovírusové vektory neobsahujú imunogénne proteíny a neexistuje žiadna dopredu vzniknutá imunita hostiteľa, ale infekcia je obmedzená na deliace sa bunky. Retrovírusy sa už použili v klinických pokusoch (Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 1990, 323, 570-578). Retrovírusy sú tvorené genómom RNA, ktorý je zabalený v obálke pochádzajúcej z bunkovej membrány hostiteľskej bunky a vírusových proteínov. A expresiu svojich génov musí najskôr reverzne transkribovať svoj pozitívny RNA reťazec do dvojitého DNA reťazca, ktorý sa potom integruje do DNA hostiteľa pomocou reverznej transkriptázy a integrázy, čo sú proteíny nachádzajúce sa vo vírusovej častici. Integrovaný provírus je potom schopný využiť bunkový mechanizmus hostiteľské bunky na expresiu svojich génov.

Myšací leukemický vírus sa široko využíva (Miller a kol., Methods Enzymol. 1993, 217: 581-599). Retrovírusové vektory sú konštruované tak, že sa odstránia gény gag, pol a env, aby sa tak vytvoril priestor pre zodpovedajúci vložený náklad, aby sa odstránila replikatívna schopnosť vírusu. Vírusom kódované mRNA sa eliminujú a to odstraňuje tiež akúkoľvek potenciálnu imunitnú reakciu na transdukovanú bunku. Často sú ako selekčné prostriedky vložené gény kódujúce rezistenciu na antibiotiká. Môže sa tiež vložiť promótorová a zosilňovacia (enhancerová) funkcia, napr. na dosiahnutie tkanivovo špecifickej expresie po podaní in vivo. Promótorová a zosilňovacia nachádzajúca sa v dlhej terminálnej repetícii retrovírusu sa tiež môže použiť.

Tieto vírusy sa môžu produkovať iba v enkapsidačných bunkových líniách. Enkapsidačné línie sa môžu skonštruovať tak, že sa deletované vírusové gény (gag, pol, env) stabilné inzertujú do buniek tak, že sú umiestnené na rôznych chromozómoch, aby sa zabránilo rekombinácii. Enkapsidačná línia sa použije na prípravu produkčnej línie, ktorá tvorí replikačne defektný retrovírus obsahujúci relevantný vložený gén tým, že sa do nej vnesie rekombinantná provírusová DNA. Plazmidová DNA, ktorá obsahuje sekvencie dlhej terminálnej repetície ohraničujúce malý úsek génu gag obsahujúceho enkapsidačnú sekvenciu a požadovaný gén (gény) sa transfekuje do enkapsidačnej línie štandardným spôsobom na prenos DNA (elektroporácia, precipitácia vápnikom a pod.). Varianty tohto prístupu sa použili, aby sa znížila pravdepodobnosť vzniku replikačne kompetentného vírusu (Jolly, D., Cancer Gene Therapy, 1994, 1, 51-64). Spektrum hostiteľských buniek vírusu je určené génom obalového proteínu (env) a je možné použiť substitúciu génu env s rôznou bunkovou špecificitou. Na zacieľovanie sa môže tiež využiť inkorporácia vhodných ligandov do obalového proteínu.

Podávanie sa môže uskutočňovať akoukoľvek dostupnou technikou, napr. expresia in vivo transdukciou buniek pacienta, priamou injekciou vírusu do tkaniva a/alebo podávaním buniek produkujúcich retrovírus.

Prístup expresie in vivo má nevýhodu, že vyžaduje izoláciu a udržiavanie pacientových buniek v tkanivovej kultúre, ale má tiež výhodu, že je možné ľahko kvantifikovať rozsah génového prenosu a je možné zacieliť špecifickú populáciu buniek. Okrem toho je možné dosiahnuť vysoký pomer vírusových častíc a cieľových buniek a tak zlepšiť účinnosť transdukcie (Anderson a kol., Hum. Gen. Ther., 1990, 1: 331-341; Rosenberg a kol., N. Engl. J. Med., 1990, 323: 570-578; Culver a kol., Hum. Gen. Ther., 1991, 2: 107-109; Nienhuis a kol., Cancer, 1991, 67: 27002704; Anderson a kol., Hum. Gene Ther., 1990, 1: 331-341; Grossman a kol., Nat. Genet., 1994, 6: 335-341, Lotze a kol., Hum. Gene Ther., 1992, 3: 167-177; Lotze , M.T., Celí Transplant., 1993, 2: 33-47; Lotze a kol., Hum. Gene Ther..,

1994, 5: 41-55 a patent US 5399346 (Anderson)). V niektorých prípadoch je nevyhnutné priame vloženie vírusu in vivo. Retrovírusy sa použili na liečenie mozgových nádorov, kde schopnosť retrovírusov infikovať iba deliace sa bunky (t.j. nádorové) je osobitne výhodná.

Na zvýšenie účinnosti Oldfield a kol. (Hum. Gene Ther., 1993, 4: 39-69) navrhli podávanie retrovírusovej produkčnej línie priamo do mozgového nádoru pacienta. Myšacie produkčné bunky by prežili v nádore mozgu niekoľko dní a secernovali by retrovírus schopný transdukovať okolité bunky mozgového nádoru. Vírus nesúci gén tymidínkinázy z herpetického vírusu poskytuje bunky, ktoré sa potom môžu usmrtiť ganciclovirom, ktorý je tymidínkinázou metabolizovaný na toxickú zlúčeninu. Retrovírusov sa týkajú patentové dokumenty EP 334301, WO 91/02805 a WO 92/05266 (Viagene) a US 4650764 (University of Wisconsin).

V odbornej literatúre sa opísali ludské adenovírusové infekcie (pozri Horwitz, M.S., In Virology, 2^nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1723-1740). Väčšina dospelej populácie sa exponovala adenovírusom a má preto antiadenovírusové protilátky. Adenovírusy obsahujú genóm z dvojvláknovej DNA a replikujú sa nezávisle na bunkovom delení hostiteľa.

Adenovírusové vektory majú výhodné vlastnosti. Sú schopné transdukovať bunky zo širokého spektra ludských tkanív a môže sa nimi dosiahnuť vysoká hladina expresie tak v deliacich sa ako aj v nedeliacich sa bunkách. Môžu sa použiť rôzne spôsoby podávanie, vrátane intravenóznej, intrabiliárnej, intraperitoneálnej, intravezikulárnej, intrakraniálnej a intratekálnej injekcie a tiež priamej injekcie do cielového orgánu. Zacielovanie založené na anatomických hraniciach je teda možné.

Adenovírusový genóm kóduje 15 proteínov, infekcie sa zúčastňuje vláknitý proteín, ktorý sa viaže na receptor na povrchu bunky. Pentonová základňa vírusového kapsidu sa viaže na integrínové receptorové domény (α3β3 alebo α3β5) na bunkovom povrchu, čo spôsobuje internalizáciu vírusu. Vírusová DNA vstupuje do jadra a nezávisle na bunkovom delení začína transkripciu. Expresia a replikácia sú kontrolované génmi E1A a E1B (pozri Horwitz, M.S., In Virology, 2^nd ed. Raven Press, New York, 1990, pp. 1723-1740) . Odstránenie génu E1 spôsobí vznik replikačne nekompetentného vírusu. Expresia adenovírusových proteínov spôsobuje vyvolanie imunitnej reakcie, ktorá môže osobitne ovplyvniť účinnosť pri opakovanom podávaní. Avšak súčasné prístupy, keď je tiež odstránený z genómu vírusu ďalší gén, ako je napr. E2a (ktorý kontroluje expresiu jedného z obalových proteínov a rad ďalších vírusových proteínov), môže odstrániť alebo aspoň značne znížiť expresiu mnohých týchto vírusových proteínov v cieľovej bunke.

Na konštrukcie vektorov sa často používali sérotypy 2 a 5. Bett a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91: 8802-8806 použili vektorový systém z adenovírusu typ 5 s deléciami génov E1 a E3. Bunková línia 293 ľudských embryonálnych obličkových buniek sa génovo upravila tak, aby exprimovala proteín E1 a mohla tak transkomplementovať vírusový genóm deficitný na El. Z média buniek 293 sa potom môže izolovať vírus a purifikuje sa z plakov postupom limitného riedenia (Graham , F.L. and Prevek, L., In Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press 1991, pp. 109-128).

Rekombinantný vírus sa môže pestovať v bunkách v bunkových kultúrach línie 293 a izolovať lýzou infikovaných buniek a purifikovať pomocou centrifugácie v hustotnom gradiente chloridu cézneho. Jeden problém použitia buniek 293 na prípravu rekombinantného adenovírusu je to, že vďaka dodatočným krajným úsekom génu El môže vzniknúť replikačne kompetentný vírus (RCA) počas produkcie vírusových častíc. Aj keď je tento materiál iba adenovírus divého typu a nie replikačne kompetentný rekombinantný vírus, môže významne ovplyvniť prípadný výťažok požadovaného adenovírusového materiálu, zvyšuje náklady na prípravu a komplikuje kontrolu kvality jednotlivých výrobných cyklov a pripustenie jednotlivých šarží na klinické použitie. Vyvinuli sa alternatívne bunkové línie, napr. PER.C6, ktoré majú lepšie definovanú integráciu El ako bunky 293 (neobsahujú okolité sekvencie vírusu), a ktoré neumožňujú rekombináciu, ktorou vznikajú RCA a majú teda potenciál prekonať uvedené problémy produkcie vírusu.

Adenovírusové vektory majú nevýhodu relatívne krátkeho trvania expresie transgénu vďaka clearance imunitného systému a vďaka stratám riedením pri delení cieľových buniek, ale môže sa očakávať zlepšenie adenovírusových vektorov. Patentové dokumenty týkajúce sa adenovírusov sú WO 96/035517 (Boehringer), WO 96/13596 (Rhône Poulenc Rorer), WO 95/29993 (University of Michigan) a WO 96/34969 (Canji). Súčasné pokroky v adenovírusových vektoroch na použitie v génovej terapii nádorov zahrňujú vývoj stratégií na zníženie imunogenicity, chimérne vektory adenovírus/retrovírus a podmienečne (obmedzene) replikativne adenovírusové systémy, ako uvádzajú v prehľade Bilbao a kol. Exp. Opin. Ther. Patents, 1997, 7(12): 1427-1446.

Adeno-asociované vírusy (AAV) (Kotin, R.M., Hum. Gene Ther., 1994, 5: 793-801) obsahujúce jednovláknovú DNA, sú neautonómne parvovírusy schopné integrovať sa do genómu nedeliacej sa bunky so širokým hostiteľským spektrom. Nedokázalo sa, že by AAV boli spojené s akoukolvek ľudskou chorobou a je známe, že nevyvolajú žiadnu imunitnú odpoveď.

AAV majú v životnom cykle dve zreteľne odlišné fázy. Vírus divého typu infikuje hostiteľskú bunku, integruje sa a zostáva latentný. V prítomnosti adenovírusu sa indukuje lytická fáza životného cyklu adenovírusu, ktorá je závislá na expresii skorých adenovírusových génov a spôsobuje aktívnu replikáciu vírusu. Genóm AAV je tvorený z dvoch otvorených čítacích rámcov (zvaných rep a cap) obklopených sekvenciami invertovanej terminálnej repetície (ITR). Úsek rep kóduje štyri proteíny, ktoré sprostredkovávajú replikácii AAV, transkripciu vírusovej DNA majú endonukleázovú funkciu, potrebnú na a

do integráciu hostiteľského genómu. Gény rep sú jediné gény zo sekvencie AAV nutné na replikáciu vírusu. Sekvencia cap kóduje štruktúrne proteíny, ktoré tvoria vírusový kapsid. Sekvencie ITR obsahujú vírusový replikačný počiatok, poskytujú enkapsidačné signály a podieľa sa na integrácii vírusovej DNA. Rekombinantné replikačne defektné vírusy, ktoré sa vyvinuli na génovú terapiu, neobsahujú sekvencie rep a cap. Replikačne defektný AAV sa môžu produkovať kotransfekciou separovaných elementov nevyhnutných pre replikáciu AAV do permisívnych buniek línie 293. K patentovým dokumentom týkajúcich sa AAV patrí WO 94/13788 (University of Pittsburgh) a US 4797368 (US Department of Health).

Vektory na génovú terapiu odvodené z pox vírusu (vírus kiahní) boli tiež opísané (Moss, B., Flexner, C., Annu. Rev. Immunol. 1987, 5: 305-324, Moss, B., Virology, 1990, 2079-2111). Vaccinia vírus je velký DNA vírus s obalom, ktorý sa replikuje v cytoplazme infikovaných buniek. Infikuje deliace sa aj nedeliace sa bunky mnohých tkanív a môže sa pozorovať génová expresia z neintegrovaného vírusového genómu. Rekombinantný vírus sa môže pripraviť tak, že sa transgén vloží do vektora odvodeného z vaccinia vírusu a táto DNA sa transfekuje do buniek infikovaných vacciniou, kde potom homologická rekombinácia spôsobí produkciu vírusu. Významnou nevýhodou je, že vírus vyvoláva imunitnú reakciu hostiteľa na 150 až 200 vírusom kódovaných proteínov, čo značne komplikuje opakované podávanie.

Vírus herpes simplex je veľký vírus obsahujúci dvojvláknovú DNA, ktorý sa replikuje v jadre infikovaných buniek a ktorý je vhodný na prenos génov (pozri Kennedy, P.G.E., Steiner, I., Q.J. Med. 1993, 86: 697-702). K výhodám patrí značný hostiteľský rozsah infekcie tak deliacich sa ako aj nedeliacich sa buniek a možnosť vložiť rozsiahlu sekvenciu cudzej DNA do vírusového genómu prostredníctvom homologickej rekombinácie. Nevýhodou je ťažké získanie vírusového preparátu bez replikačne kompetentného vírusu a tiež silná imunitná odpoveď. Delécia vírusového génu pre tymidínkinázu spôsobuje vznik replikačne defektného vírusu v bunkách s nízkou hladinou tymidínkinázy. Bunky, ktoré sa intenzívne delia (práve napr. nádorové bunky) majú dostatočnú tymidínkinázovú aktivitu, aby umožnila replikáciu. Publikovala sa patentová prihláška týkajúca sa herpetického vírusu (WO 92/05263, Cantab Pharmaceuticals) .

Uvažovalo sa tiež o rade iných vírusov, napr. HIV, vírusoch myšacej leukémie, víruse hepatitídy B a víruse chrípky, ako o potenciálnych vektoroch na prenos génov (pozri Jolly, D., Cancer Gene Therapy, 1994, 1: 51-64).

Tiež sa navrhlo použitie atenuovaných baktérií Salmonella typhimurium, ktorá sa špecificky zacieluje a replikuje c hypoxickom prostredí (aké sa vyskytuje v nekrotických centrách nádoru), ako vektora na prenos génov v terapii založenej na enzýme ako predlieku, TAPET™ (Tumor Amplified Prodrug Enzýme Therapy) firmy Vion Pharmaceuticals. Tento systém poskytuje na prenos génov ďalšiu alternatívu k skôr uvedeným vírusovým a nevírusovým spôsobom prenosu génov.

Môže sa tiež použiť stratégia nevírusového prenosu DNA. Takéto prenosové systémy využívajú nekomplexovanú DNA, DNAlipozómové komplexy, DNA-proteínové komplexy a zlaté mikročastice pokryté s DNA.

Purifikovaná nukleová kyselina sa môže injikovať priamo do tkaniva a spôsobuje prechodnú génovú expresiu napr. v svalovom tkanive, čo je osobitne účinné v regenerujúcom sa svalstve (Wolff a kol., Science, 1990, 247: 1465-1468). Davis a kol. (Hum. Gene Ther., 1993, 4: 733-740) publikovali informáciu o priamej injekcii do zrelého svalu. Všeobecne sú výhodné kostrové svaly a sval srdca. Zodpovedajúce patentové dokumenty sú WO 90/11092; US 5589466 (Vical) a WO 97/05185 (biodegradovatelné hydrogély impregnované s DNA na injekciu, Focal).

Plazmidová DNA na zlatých mikročasticiach môže byť nastrelená do buniek (napr. epidermis alebo melanómu) pomocou tzv. génového dela. DNA sa koprecipituje na častice zlata a potom sa vystrelí pomocou elektrického výboja alebo stlačeného plynu ako propelentu (Fynan a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 11478-11482). Elektroporácia sa tiež použila na uľahčenie prenosu DNA so pevných (solídnych) nádorov s použitím elektroporačnej sondy používajúcej viacihlové usporiadanie a pulzné rotujúce elektrické pole (Nishi a kol., Cancer Res., 1996, 56: 1050-1055). Dosiahol sa tak vysoko účinný prenos génov do podkožných nádorov s významným zvýšením transfekcie buniek a lepšími distribučnými charakteristikami ako pri intratumorovej injekčnej aplikácii.

Lipozómy účinkujú tak, že obklopujú hydrofilnú molekulu hydrofóbnymi molekulami a tým uľahčujú vstup do bunky. Lipozómy sú jednovrstvové (unilamelárne) alebo viacvrstvové (multilamelárne) sféry (vrecká) vytvorené z lipidov. Zloženie lipidov a spôsob prípravy ovplyvňujú štruktúru lipozómov. Do lipidových membrán sa môžu inkorporovať aj iné molekuly. Lipozómy môžu byť buď katiónové alebo aniónové. Nicolau a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80: 1068-1072) publikovali expresiu inzulínu z aniónových lipozómov injikovaných do potkanov. Aniónové lipozómy zacieľujú hlavne retikuloendotelové bunky pečene, pokiaľ nie sú špecificky zacielené iným spôsobom. Na povrch lipozómov sa môžu inkorporovať iné molekuly, aby zmenili správanie lipozómov, napr. bunkovú špecificitu prenosu (Wu, G.Y. a Wu, C.H., J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432).

Felgner a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84: 74137417) opísali katiónové lipozómy a ukázali, že viažu nukleové kyseliny elektrostatickými interakciami a vstupujú do bunky. Intravenózna injekcia katiónových lipozómov spôsobila expresiu transgénu vo väčšine orgánov, ak sa injekcia aplikovala do aferetnej cievy orgánu. Katiónové lipozómy sa môžu podávať tiež vo forme aerosólu, pokiaľ je cieľom pľúcny epitel (Brigham a kol., Am. J. Med. Sci., 1989, 298: 278-281). Patentové dokumenty týkajúce sa lipozómov sú WO 90/11092, WO 91/17424, WO 91/16024, WO 93/14788 (Vical) a WO 90/01543 (Intracel).

Štúdie in vivo s prenosom génov pomocou katiónových lipozómov publikovali Nabel a kol., Rev. Hum. Ther. 1994, 5: 7992, Hyde a kol., Náture, 1993, 362: 250-255 a Conary a kol., J. Clin. Invest. 1994, 93: 1834-1840.

Mikročastice sa tiež skúmali ako systémy vhodné na prenos

DNA do fagocytujúcich buniek. Tento prístup použila firma Pangea

Pharmaceuticals v systéme ENDOSPHERE™, čo je mikrokapsulový prenosový systém DNA, ktorý sa použil na zvýšenie transdukcie fagocytujúcich buniek ako sú makrofágy, ktoré pohltia mikrosféry. Mikrosféry obalia plazmidovú DNA, ktorá kóduje potenciálne imunogénne peptidy, ktoré po expresii spôsobujú prezentáciu peptidov prostredníctvom molekúl MHC na povrchu buniek, čo môže stimulovať imunitnú odpoveď proti takýmto peptidom a proteínovým sekvenciám, ktoré obsahujú rovnaký epitop. Tento prístup sa dnes zameriava na vývoj protinádorových vakcín a vakcín proti patogénom, aj keď sa môže potenciálne využiť tiež v génovej terapii.

Rovnako ako sa použili syntetické polyméry na zabalenie DNA, tak sa tiež použili aj prirodzené obalové proteiny vírusov, ktoré sú schopné sa homogénne samousporiadať do častíc podobných vírusom (VLP). Hlavný štruktúrny obalový proteín VPI ludského polyomavírusu sa môže exprimovať ako rekombinantný proteín a je schopný zabaliť plazmidovú DNA počas samousporiadania do VLP. Výsledné častice sa potom môžu použiť na transdukciu rôznych bunkových línií, pričom predbežné imunologické štúdie ukázali iba slabú imunogénnu reakciu na VLP založenú na VPI. Takéto systémy poskytujú atraktívny medzistupeň medzi syntetickými polymérnymi nevírusovými vektormi a alternatívnym vírusovým prenosovým systémom, pretože kombinujú výhody, t. j. jednoduchosť prípravy a vysokú účinnosť transdukcie.

Aby sa zlepšila špecificita prenosu génov a expresia u terapeutických génov, skúmalo sa vloženie zacielovacích prvkov do prenosových vektorov a použitie regulačných prvkov expresie, či už samostatne alebo v kombinácii v mnohých prenosových systémoch, ktoré už boli opísané.

Tiež sa dosiahlo zlepšenie DNA vektorov a môže sa tiež využiť pre všetky nevírusové prenosové systémy. Ide o použitie nadzávitnicových minikruhových molekúl (supercoiled minicircle), ktoré publikovala firma RPR Gencell (tieto molekuly nie sú bakteriálneho pôvodu a neobsahujú počiatok replikácie, ani gény rezistencie na antibiotiká, a tak sú bezpečnejšie, pretože nemajú značnú mieru biologického obmedzenia), epizomálnych expresných vektorov vyvinutých firmou Copernicus Gene Systems

Inc. (replikujúci sa epizomálny expresný systém, kde plazmid sa amplifikuje síce vo vnútri jadra, ale mimo chromozómu, a teda sa eliminuje integrácia do genómu) a systémy T7 vyvinuté firmou Progenitor (striktne cytoplazmatický expresný vektor, kde vektor sám exprimuje T7 RNA polymerázu z fága T7 a terapeutický gén je riadený druhým promótorom T7, ktorý využíva polymerázu tvorenú prvým promótorom). K ďalším, všeobecnejším zlepšeniam technológie DNA vektorov patrí použitie cis-pôsobiacich prvkov na dosiahnutie vysokej hladiny expresie (Vical), použitie sekvencií odvodených z alfa-opakovania DNA na poskytnutie regulácie replikácie raz za bunkový cyklus a použitie jadrových zacielovacích sekvencií (z génu EBNA-1, calos v Stanforde a Megabios), skorého promótora SV40/enhanceru alebo peptidových sekvencií pripojených k DNA.

Zacielovací systém založený na rozpoznávaní bunkových receptorov ligandom pripojeným k DNA sa opísal v práci Michael, S.I. a Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232. Pomocou ligandu, ktorý je rozpoznaný takýmto receptorom, sa DNA selektívne viaže na cieľovú bunku a potom je ňou internalizovaná (Wu, G.Y. a Wu, C.H., J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432) Polykatión poly-L-Lyzín (PLL) sa použil na spojenie radu proteínových ligandov k DNA metódou chemického zosieťovania. DNA sa elektroforeticky viaže na molekuly ligandu PLL. Zacielovací systém s využitím transferínového receptora publikovali Zenke a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 3655-3659), Wu, G.Y. a Wu, C.H. (J. Biol. Chem. 1987, 262: 4429-4432) použili asialoorosomukoidný receptor a Batra a kol. (Gen Therapy, 1994, 1: 255-260) použili sacharidy na bunkovom povrchu. Činidlá ako chlorokin alebo kolokalizované adenovírusy sa môžu použiť na zníženie degradácie DNA v lyzozómoch (pozri Fischer, K.J. a Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299: 49-58). Cristiano a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993, 90: 11548-11552) skonštruovali komplex adenovírus-DNA-ligand. Patentové dokumenty týkajúce sa receptormi sprostredkovanej endocytózy sú WO 92/05250 (asialoglykoproteíny, University of Connecticut) a US 5354844 (transferínový receptor, Boehringer) .

DNA a ligand sa môžu naniesť na povrch adenovírusu a môže tak vzniknúť tzv. obalený adenovírus (Fischer, K. J. a Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299: 49-58). Avšak prítomnosť dvoch receptorových dráh pre vstup DNA (receptor pre ligand a receptor pre adenovírus) znižuje špecificitu tohto prenosového systému, ale adenovírusová dráha sa môže eliminovať použitím protilátky proti vláknitému proteínu adenovírusu, ktorý je spájadlom s DNA (Michael, S.I. a Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232).

Použitie purifikovaných endosomalytických proteínov namiesto intaktných vírusových častíc je ďalšou možnosťou (Seth, P., J. Virol., 1994, 68: 1204-1206).

Expresia génového konštruktu podľa predkladaného vynálezu v jeho cieľovom mieste je výhodne riadená transkripčnou regulačnou sekvenciou (TRS). TRS je promótor prípadne kombinovaný s enhancerom a/alebo kontrolným prvkom ako je napr. genetický prepínač, ktorý bude opísaný ďalej.

Jedným z príkladov TRS je genetický prepínač, ktorý sa môže využiť na kontrolu expresie génového konštruktu podlá predkladaného vynálezu, keď sa raz vnesie do cieľovej bunky. Kontrola génovej expresie v bunkách vyšších eukaryotov prokaryotickými regulačnými prvkami (ktoré sú výhodné podľa vynálezu) sa opísala v prehľade Gossen a kol., TIBS, 18. Decembra, 1993, 471-475. Vhodný systém zahrňuje lac operón z E. coli a osobitne výhodne operón tetracyklínovej rezistencie z E. coli. K publikáciám o tetracyklínovej rezistencii patrí Gossen a kol. (1995) Science 268, 1766; Damke a kol. (1985), Methods in Enzymology 257, Academic Press; Tin a kol. (1996) Anál. Biochem. 235, 19S a patenty US 5464758, US 5589362, WO 96/01313 a WO 94/29442 (Bujard). Ďalšou možnosťou je prepínač založený na ekdyzóne (medzinárodná patentová prihláška PCT/GB96/20218) opísali syntetický indukovateľný eukaryotický promótor obsahujúci aspoň dve odlišné triedy indukovateľných prvkov. Rhône Poulenc Rorer (WO 96/30512) opísali systém podmienenej génovej expresie založený na tetracyklíne. Ariad (WO 94/18317) opísali systém založený na dimerizácii proteínov, ktorého aktivita sa dokázala in vivo. Bert O'Malley z Baylor College of Medicíne (WO 93/23431 a US 5364791) opisuje molekulárny prepínač založený na použití modifikovaných steroidných receptorov. Whitehead Inštitúte publikoval indukovatelný génový expresný systém založený na NF-KB (WO 88/05083). Batelle Memoriál opísali stresom indukovatelný promótor (európsky patent EP 263908).

K príkladom TRS, ktorý nie je závislý na type buniek, patria nasledovné prvky: cytomegalovírusový promótor/enhancer, SV40 promótor/enhancer, a promótor/enhancer z dlhej terminálnej repetície retrovírusu. Ako príklad TRS, ktorý je závislý na type buniek (čo dodáva ďalší stupeň na zacielovanie) sa môžu uviesť nasledovné: karcinoembryonálny antigén (CEA) na zacielovanie buniek hrubého čreva a konečníka, pľúc a prsníka, alfafetoproteín (AFP) na zacielovanie transformovaných hepatocytov, tyrozínhydroxyláza, cholínacetyltransferáza alebo neurónovo špecifická enoláza na zacielovanie neuroblastómov, inzulín na zacielovanie pankreasu a gliový kyslý fibroproteín na zacielovanie glioblastómov. Môžu sa tiež využiť niektoré onkogény, ktoré sú selektívne exprimované v niektorých nádoroch, napr. HER-2/neu alebo c-erbB2 v nádore prsníka alebo N-myc v neuroblastómoch.

Výhodný génový produkt na použitie ako liečivo je teda konštrukt, ktorý obsahuje transkripčnú regulačnú sekvenciu obsahujúcu promótor a kontrolný prvok, ktorým je genetický vypínač, ktorý riadi expresiu génového konštruktu. Výhodný regulačný prvok s genetickým vypínačom je regulovaný prítomnosťou tetracyklínu alebo ekdyzónu. Výhodný promótor je závislý na bunkovom type a je vybraný z nasledovných promótorov: promótor (CEA), alfa-fetoproteínu (AFP), cholínacetyltransferázy, neurónovo špecifickej enolázy, inzulínu a gliového kyslého fibroproteínu, HER-2/neu, c-erbB2 a N-Myc. Podía predkladaného vynálezu je génový konštrukt na použitie ako liečivo podávaný cicavčiemu hostiteľovi výhodne zabalený vo vnútri adenovírusu. Všeobecný prehľad o cielenej génovej terapii publikovali Douglas a kol., Tumor Targetting, 1995, 1: 67-84.

karcinoembryonálneho antigénu tyrozínhydroxylázy,

Protilátka kódovaná génovým konštruktom podlá vynálezu môže byť vo forme protilátkového konštruktu ako je napr. F(ab')2. F(ab'), Fab, Fv, jednoreťazcový Fv a V-min. Patrí tu akýkoľvek protilátkový konštrukt, ako je napr. nedávno opísaný protilátkový fragment L-F(ab)2 podľa Zapata, 1995, Protein Engineering, 8, 1057-1062. Môže sa tiež uvažovať o Fv s disulfidickými väzbami. Pre konštrukty založené na enzýme CPG2 je výhodná dimerizácia Fab fragmentov konštruktu prostredníctvom enzýmovej dimerizácie. Protilátky iné ako ľudské sa môžu humanizovať na použitie pre človeka, aby sa znížila imunitná reakcia hostiteľa. Humanizovaná protilátka, príbuzný fragment alebo protilátková väzbová štruktúra je polypeptid zložený z väčšej časti štruktúrneho rámca sekvencii odvodených z ľudského imunoglobulínu, ktorý nesie aminokyselinové sekvencie iné ako ľudské vo väzbovom mieste pre antigén a jeho okolie (komplementaritu určujúce úseky, CDR) . Vhodná metodológia sa opísala podrobne napr. v dokumentoch WO 91/09967, EP 0328404, Queen a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029, Mountain a Adair, 1989, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1, 1992, ale môže sa uvažovať aj o ďalších alternatívnych spôsoboch humanizácie, ako je napr. tzv. obkladanie povrchových zvyškov (pozri EP 519596, Merck/NIH, Padlan a kol.).

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje párový dvojzložkový systém na použitie v cicavčom hostitelovi, kde zložky tvoria: I) prvú zložku, ktorá obsahuje génový konštrukt kódujúci protilátku a enzým ako konjugát vo vnútri cieľovej bunky v cicavčom hostitelovi a kde konjugát môže potom opustiť cieľovú bunku pre selektívnu lokalizáciu na antigéne bunkového povrchu rozpoznávanom protilátkou, a II) druhú zložku, ktorá obsahuje predliek, ktorý sa môže konvertovať enzýmom na aktívny liek.

Protilátkou riadená enzýmová predlieková terapia (ADEPT) je známym spôsobom v liečení rakoviny. ADEPT využíva nádorové selektívne protilátky konjugované s enzýmom. Konjugát sa podáva pacientovi (zvyčajne intravenózne) a ponechá sa, aby sa lokalizoval do miesta (miest) nádoru a odstránil z krvného obehu a normálnych tkanív. Potom sa podá pacientovi predliek, ktorý sa konvertuje enzýmom (lokalizovaným v mieste nádoru) na cytotoxický liek, ktorý zabíja nádorové bunky.

Predkladaný vynález sa môže použiť v akomkoľvek systéme ADEPT. K vhodným príkladom systému ADEPT patria také, ktorú sú založené na niektorom z nasledovným enzýmov: karboxypeptidáza G2; karboxypeptidáza Ä; aminopeptidáza; alkalická fosfatáza; glykozidáza, β-glukuronidáza; penicilínamidáza; β-laktamáza; cytozíndeamináza; nitrátreduktáza; alebo na mutovaných hostiteľských enzýmoch ako je karboxypeptidáza A, karboxypeptidáza B a ribonukleáza. Vhodné systémy ADPET opísali napr. Melton, R.G., 1996, J. National Cancer Inštitúte 88, 1; Niculescu-Duvaz, I.,

1995, Current Medicinal Chemistry 2, 687; Knox, R.J., Clin. Immunother. 3, 136; WO 88/07378 (CRCT); Blakey a kol., Cancer Res. 56. 3287-92, 1996; US 5587161 (CRCT a Zeneca); WO 97/07769 (Zeneca) a WO 95/13095 (Wellcome). Heterologický enzým môže byť vo forme katalytickej protilátky, pozri napr. EP 745673 (Zeneca). K ďalším prehladným článkom o systémoch ADEPT patria Hay a Denný,

1996, Drugs of the Future, 21 (9) , 917-931 a Blakey, 1997, Exp. Opin. Ther. Patents, 7 (9), 956-977.

Výhodný prispôsobený dvojzložkový systém podľa predkladaného vynálezu je taký, kde:

Prvá zložka obsahuje gén kódujúci heterologický enzým CPG2; a predliek druhej zložky sa vyberie zo skupiny obsahujúcej N—(4 — - [N, N-bis(2-jodoetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-[4-[N, N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovej a N-{4-[N,N-bis(2-chloroetyl) amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu alebo ich farmaceutický prijateľné soli. Výhodné predlieky na použitie s CPG2 sú opísané v nasledovných patentoch firmy Zeneca Limited a Cancer Research Campaign Technology Limited: US 5714148, US 5405990, 5587161 a 5660829.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu poskytuje spôsob podania cytotoxického lieku na požadované miesto, ktorý obsahuje krok, keď sa hostiteľovi podá prvá zložka, ktorá obsahuje génový konštrukt podľa vynálezu a potom nasleduje podanie druhej zložky, ktorá obsahuje predliek, ktorý sa môže konvertovať na cytotoxický liek heterologickým enzýmom kódovaným prvou zložkou. Výhodný spôsob podania cytotoxického lieku na miesto podľa predkladaného vynálezu je taký spôsob, kde prvá zložka obsahuje gén kódujúci heterologický enzým CPG2 a predliek druhej zložky sa vyberie zo skupiny obsahujúcej N- (4- [N,N-bis(2-jodoetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N- [4- [N, N-bis (2-chloroetyl) amino] -fenoxykarbonyl) -L-glutámovej a N-{ 4- [N, N-bis (2-chloroetyl) amino] -fenoxykarbonyl) -L-glutámovú kyselinu alebo ich farmaceutický prijatelné soli.

Skratky použité v opise vynálezu

AAV

ADEPT

AFP

AMIRACS

APS bp

BPB

CDR

CEA

CL

CPB

CPG2

CPG2 R6

DAB

Adeno-asociovaný vírus protilátkou riadená enzýmová predlieková terapia alfa-fetoproteín

Antimetabolit s inaktiváciou pomocného činidla v mieste nádoru peroxodvojsíran amónny bázový pár brómfenolová modrá úsek(-y) určujúce komplementaritu karcioembryonálny antigén konštantná doména ľahkého reťazca protilátky karboxypeptidáza B karboxypeptidáza G2 karboxypeptidáza G2 mutovaná tak, aby sa zabránilo glykozylácii po expresii v eukaryotickej bunke, pozri príklad 1 d substrát 3,3'-diaminobenzidínétertetrahydrochlorid

DEPC	dietylpyrokarbonát
DMEM	Dulbeccove médium modifikované Eaglom
ECÄCC	Európska zbierka bunkových kultúr živočíchov
EIA	enzýmový imunotest
ELISA	test s enzýmom viazaným na imunosorbent
FAS	médium s prídavkom folinovej kyseliny
FCS	teľacie fetálne sérum
Fd	ťažký reťazec Fab, Fab' alebo F(ab')2 prípadne
GDEPT	obsahujúci kĺbovú oblasť génom riadená enzýmová predlieková terapia
HAMA	ľudská anti-myšacia protilátka
HCPB	ľudská karboxypeptidáza B, výhodne pankreatická
kĺbová oblasť	(IgG) krátky peptid bohatý na prolín, ktorý obsahuje cysteíny vytvárajúce mostíky spájajúce 2 ťažké reťazce

HRPO alebo HRP chrenová peroxidáza

IRES	vnútorné ribozómové vstupné miesto
MTX	metotrexát
NCA	nešpecifický krížovo reagujúci antigén
NCIMB	Národná zbierka priemyselných a morských baktérií
OPD	orto-fenyldiamín
PBS	fosfátom pufrovaný soľný (fyziologický) roztok
PCR	polymerázové reťazová reakcia
PGP	N-(4-[N,N-bis(2-jodoetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L- -glutámová kyselina
preproCPB	proCPB s N-koncovou vedúcou sekvenciou

proCB

CPB s N-koncovou prodoménou scFv

SDS-PAGE

SSC

TBS

Temed

TFA

TRS

VDEPT

VH

VK jednoreťazcový Fv elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným roztok soli s citrátom sodným

Trisom pufrovaný solný roztok

N, N, N', N'-tetrametyletyléndiamín trifluóroctová kyselina transkripčná regulačná sekvencia vírusom riadená predlieková terapia variabilný úsek ťažkého reťazca protilátky variabilný úsek lahkého reťazca protilátky

V opise predkladaného vynálezu sa uvažuje tiež o konzervatívnych náhradách v špecifických sekvenciách DNA okyselín, ktoré si uchovávajú relevantné biologické vlastnosti zložky predkladaného vynálezu, ale líšia sa v sekvencii jednou alebo niekoľkými substitúciami, deléciami alebo adíciami aminokyselín. Výhodné sú tu konkrétne uvedené aminokyselinové sekvencie. Typické konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú uvedené v nasledovnej tabuľke.

Pôvodná aminokyselina Príklady substitúcií Výhodná substitúcia

Ala	(A)	Val; Leu; íle	Val
Arg	(R)	Lys; Gin; Asn	Lys
Asn	(N)	Gin; His; Lys; Arg	Gin
Asp	(D)	Glu	Glu
Cys	(C)	Ser	Ser
Gin	(Q)	Asn	Asn

Glu	(E)	Asp	Asp
Gly	(G)	Pro	Pro
His	(H)	Asn; Gin; Lys; Arg	Arg
íle	(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucín	Leu
Leu	(L)	Norleucín; íle; Val; Met; Ala; Phe	íle
Lys	(K)	Arg; Gin; Phe	Arg
Met	(M)	Leu; Phe; íle	Leu
Phe	(F)	Leu; Val; íle; Ala	Leu
Pro	(P)	Gly	Gly
Ser	(S)	Thr	Thr
Thr	(T)	Ser	Ser
Trp	(W)	Tyr	Tyr
Tyr	(Y)	Trp; Phe, Thr, Ser	Phe
Val	(V)	íle; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucín	Leu

Nomenklatúra aminokyselín je uvedená v nasledovnej tabuľke

Alanín Ala A

Arginín Arg R

Asparagín Asn N

Asparágová kyselina Asp D

Cysteín Cys C

Glutámová kyselina Glu E

Glutamín Gin Q

Glycín	Gly	G
Histidín	His	H
Izoleucín	íle	I
Leucín	Leu	L
Lyzín	Lys	K
Metionín	Met	M
Fenylalanín	Phe	F
Prolín	Pro	P
Serín	Ser	S
Treonín	Thr	T
Tryptofán	Trp	W
Tyrozín	Tyr	Y
Valín	Val	v
ľubovoľná aminokyselina Xaa	x
V opise predkladaného nukleových kyselín (delécie, sekvencii, ktoré uchovávajú	vynálezu sa uvažujú variácie substitúcie a adície) špecifických ich schopnosť hybridizovať pri

stringentných podmienkach so špecifickou sekvenciou podlá vynálezu. Pritom stringentné podmienky sú tu definované ako 6 x SSC, 0,1% SDS a 60 °C počas 5 minút. Avšak výhodné sú špecifické sekvencie uvedené v zozname sekvencii. Chemické analógy prirodzených nukleových kyselín, ako sú napr. peptidové nukleové kyseliny (PNA), považujeme za prijatelné ekvivalenty, osobitne na účely, keď sa nevyžaduje translácia do proteínu (Wittung, 1994, Náture, 368, 561).

Predkladaný vynález bude ďalej ilustrovaný pomocou nasledovných príkladov a obrázkov, ktoré vynález nijako neobmedzujú. Údaje o teplote sú uvádzané v stupňoch Celzia.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 Predstavuje reprezentatívny konštrukt fúzneho génu obsahujúci fragment Fd ťažkého reťazca protilátky A5B7 spojený na svojom C-konci prostredníctvom flexibilného peptidového linkera (G4S)3 s N-koncom polypeptidu CPG2. SS reprezentuje signálnu sekvenciu, L reprezentuje sekvenciu linkera (spojky). CPG2/R6 reprezentuje CPG2 so zrušeným glykozylačným miestom vďaka mutácii, ako je podrobnejšie vysvetlené v texte.

Obr. 2a ukazuje fúzny proteín (Fab-CPG2)2 s dimerizáciou uskutočnenou prostredníctvom nekovalentných väzieb medzi dvoma molekulami CPG2.

Obr. 2b ukazuje protilátkový fragment F(ab')2·

Obr. 3 Ukazuje test ELISA založený na bunkami secernovanom fúznom proteíne. Iba línia pozitívne na CEA zvýšila hladinu väzby sp zvyšujúcim sa množstvom pridaného fúzneho proteínu, zatiaľ čo bunkové línie negatívne na CEA mali stále konštantné základnú hladinu väzby. Vertikálna os reprezentuje hodnoty s optickou hustoty meranej pri 490 nm a horizontálna os predstavuje množstvo pridaného fúzneho proteínu vyjadrené v ng proteínu. Graf ukazuje hodnoty získané v pokuse, kde bol rad bunkových línií spolu s negatívnou kontrolou (bez buniek) inkubovaná s rastúcim množstvom fúzneho proteínu pomocou bunkového testu opísaného v príklade 6. Výsledky ukazujú, že iba bunky LoVo (CEA pozitívne) prejavili zvýšenie OD₄₉₀ zodpovedajúce zvýšenému množstvu pridaného fúzneho proteínu. Všetky ostatné bunkové línie (CEA negatívne) a kontrola (bez buniek) vykazovali iba základnú hladinu OD490, ktorá sa nezvyšovala po pridaní fúzneho proteínu. Tieto výsledky poskytujú dôkaz, že fúzny proteín sa viaže špecificky na CEA pozitívnu bunkovú líniu spôsobom závislým na dávke a naopak sa neviaže na bunky negatívne na CEA.

Obr. 4. Ukazuje retenciu (zadržanie) secernovaného fúzneho proteínu na rekombinantných bunkách LoVo. Vertikálna os reprezentuje optickú hustotu meranú pri 490 nm a horizontálna os množstvo pridanej protilátky anti-CEA (IIE6) vyjadrené v ng/ml proteínu. Pokus sa uskutočnil tak, ako je opísané v príklade 7 s použitím 3 rôznych bunkových línií, rekombinantné línia LoVo a Colo320DM (ktoré sami secernujú fúzny proteín) a kontrolná rodičovská LoVo línia, ktorá nesecernuje fúzny proteín. Najskôr sa bunky fixovali a opláchli, aby sa odstránil supernatant a všetok nenaviazaný materiál a potom sa pridávala rastúca koncentrácia protilátky anti-CEA (IIE6) k fixovaným bunkám. Test sa vyvolal ako je opísané v texte, aby sa stanovila hladina retencie secernovaného materiálu a aby sa stanovilo, či ďalšie pridanie protilátky zvyšuje signál. Výsledky ukázali, že bez pridania protilátky zvyšuje signál. Výsledky ukázali, že bez pridania protilátky anti-CEA kontrolná rodičovská línia LoVo vykazovala iba základnú hladinu hustoty pri 490 nm (ako sa očakávalo), zatial čo rekombinantné línia LoVo dávala silný signál OD pri 490 nm, čo ukazovalo, že materiál fúzneho proteínu sa zadržal na CEA pozitívnych LoVo bunkách. CEA-negatívne rekombinantné bunky Colo320DM dávali omnoho slabší signál ako LoVo bunky, ale pritom signál silnejší ako základné pozadie (pravdepodobne vďaka nezafixovaniu secernovanej protilátky na začiatku testu). Zvyšovanie koncentrácie protilátky anti-CEA (IIE6) pridávané k fixovaným bunkám ukázalo odpoveď závislú na dávke v prípade rodičovských buniek LoVo, čo ukazuje, že sú CEA pozitívne a že môžu viazať materiál viažuci sa na CEA (ako je napr. fúzny proteín, pokial sa pridá). Rekombinantné Colo320DM a LoVo bunky ukázali iba malé zvýšenie signálu OD₄₉o so zvyšujúcim množstvom pridanej protilátky s výnimkou buniek LoVo, ktoré vykazovali slabú odpoveď pri najvyššej dávke protilátky. Keďže rekombinantné bunky Colo320DM sú CEA negatívne, žiadne zvýšenie signálu vďaka anti-CEA protilátke sa nedalo očakávať. V prípade rekombinantných buniek LoVo nie je zvýšenie signálu vďaka zvýšenému množstvu protilátky jednoducho hodnotitelné, okrem najvyššej hodnoty protilátky, vďaka relatívne vysokému počiatočnému signálu.

Obr. 5 ukazuje retenciu secernovaného fúzneho proteínu na rekombinantných nádorových bunkách LoVo. Vertikálna os reprezentuje medián objemu nádoru (cm³) a horizontálna os predstavuje čas v dňoch po podaní dávky predlieku. Pokus sa uskutočnil tak, ako je opísané v príklade 12 s použitím dávky predlieku 60 mg/kg. Výsledky ukázali, že kontrolné nádory GAD(c) (bez predlieku) sa zväčšili na 6-násobok pôvodnej veľkosti za 11 dní (dni po dávke), keď sa nádory odobrali. Nádory opracované predliekom GAD(d) mali významne pomalší rast a do 16. dňa (dni po dávke) dosiahli iba 3-násobok počiatočnej veľkosti. Tieto údaje ukazujú aspoň na 11 denné oneskorenie v raste nádoru.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch, pokiaľ nebude uvedené inak, sa použili nasledovné metódy a materiál.

DNA sa izolovala a purifikovala pomocou súpravy GENECLEAN™ II (Stratech Scientific Ltd. Nebo Bio 101 Inc.) Súprava obsahovala: 1) 6M jodid sodný, 2) koncentrovaný roztok chloridy sodného, Tris a EDTA na prípravu premývacieho roztoku chlorid sodný/etanol/voda, 3) Glassmilk, čo je 1,5 ml fľaštička obsahujúca špeciálne pripravený matrix oxidu kremičitého vo vode. Toto je technika izolácie DNA založená na spôsobe, ktorý opísali Vogelstein a Gillespie v Proceedings of the National Academy of Science USA (1979) Vol S 76, p 61 S. Stručne, postup so súpravou je nasledovný: k jednému objemu vyrezaného gélu sa pridá 3násobok roztoku jodidu sodného zo súpravy. Agaróza sa rozpustí zahriatím na 55 °C 10 minút a potom sa pridá suspenzia Glassmilk (5 až 10 μΐ), všetko sa dobre premieša a nechá stáť pri teplote miestnosti 10 minút. Glassmilk sa scentrifuguje a 3x sa prepláchne roztokom NEW WASH™ (0,5 ml) zo súpravy. Premývací pufor sa potom odstráni a DNA sa eluuje tak, že sa Glassmilk inkubuje s vodou (5 až 10 μΐ) pri 55 °C 10 minút. Vodný supernatant obsahuje DNA, ktorá sa potom získa centrifugáciou. Elučný krok sa môže opakovať a supernatanty sa potom spoja.

Kompetentné bunky E. coli DH5a sa získali z firmy Life

Technologies Ltd. (kompetentné bunky DH5a MAX™ efficiency).

Minipreparácie dvojvláknovej plazmidovej DNA sa uskutočňovali pomocou súpravy na izoláciu DNA RPMT™ DNA preparation kit z firmy Bio 101 Inc. (katalóg, č. 2070-400) alebo inej podobnej súpravy. Súprava obsahuje alkalický lytický roztok na uvoľnenie plazmidovej DNA z bakteriálnych buniek a Glassmilk v špeciálnom filtri pre centrifugačné mikroskúmavky, ktorý absorbuje uvoľnenú DNA, ktorá sa potom eluuje sterilnou vodou alebo lOmM Tris-HCl, lmM EDTA pH 7,5.

Štandardná polymerázová reťazová reakcia (PCR) obsahovala 100 ng plazmidovej DNA (pokial sa neuvádza inak), 5 μΐ 10X Enzýmový pufor (500mM KC1, lOOmM Tris pH 8,3, 15mM MgCl2 a 0,1% želatína), 1 μΐ základného 25 ρΜ/μΙ roztoku každého priméru, 0,5 μΐ termostabilnej DNA polymerázy a vodu do celkového objemu 50 μΐ. Štandardné podmienky cyklovania PCR boli: 15 cyklov PCR 94 ’C 90s, 55 ’C - 60 s, 72 ’C - 120 s, posledný cyklus končil ďalšou inkubáciou pri 72 °C 10 minút.

Použila sa termostabilná DNA polymeráza AMPLITAQ™ od formy Perkin-Elmer Cetus.

Všeobecné postupy molekulovej biológie, ktoré sa použili, sú opísané v príručke Molecular Cloning - A Laboratory Manual Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Použité médium bez séra bolo médium OPTIMEM™ I Reduced Sérum Médium z firmy GibcoBRL (katalóg, č. 31985). Je to modifikované médium Eagles's Minimum Essential Médium pufrované s Hepes a hydrogenuhličitanom sodným, doplnené hypoxantínom, tymidinom, pyruvátom sodným, L-glutamínom, stopovými prvkami a rastovými faktormi.

Činidlo LIPOFECTIN™ (GibcoBRL, katalóg, č. 18292-011) je lipozómový prípravok 1:1 (hm./hm.) katiónového lipidu N-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-n,n,n-trimetylamoniumchlorid (DOTMA) a dioeloylfosfatidylaetanolamín (DOPE) vo filtrovanej vode. Spontánne sa viaže s DNA a vytvára DNA-lipidové komplexy, pozri Felgner a kol. v Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7431.

G418 (sulfát) je GENETICIN™, GibcoBRL (katalóg, č. 11811), čo je aminoglykozidové antibiotikum príbuzné gentamycínu, ktoré sa používa ako selekčné činidlo v molekulovo genetických pokusoch.

V testoch CEA ELISA bola každá jamka 96-jamkovéj mikrodoštičky (NUNC MAXISORB™) obalená s 50 ng CEA v obaľovacom uhličitan/hydrogenuhličitanovom pufri pH 9,6 (pufrové tobolky Sigma C3041) a doštička sa inkubovala pri 4 °C cez noc. Potom sa doštička 3x opláchla PBS-TWEEN™ (PBS + 0,05% TWEEN™ 20) a potom sa blokovala so 150 μΐ 1% BSA v PBS-TWEEN™ do každej jamky 1 hodinu pri teplote miestnosti. Doštička sa potom opäť 3x opláchla s PBS-TWEEN™, pridalo sa do každej jamky 100 μΐ testovanej vzorky a doštička sa inkuboval 2 hodiny pri teplote miestnosti. Potom sa opäť 3x opláchla s PBS-TWEEN™ a pridalo sa do každej jamky 100 μΐ riedenia 1/500 kozej anti-Iudskej kappa protilátky značnej s HRPO (Sigma A 7164) v 1% BSA v PBS-TWEEN™ a doštička sa inkubovala pri teplote miestnosti na výkyvnej plošinke minimálne 1 hodinu. Potom sa doštička 3x opláchla s PBS-TWEEN™ a nakoniec ešte raz v PBS. Na detekciu väzby sa pridalo do každej jamky 100 μΐ vyvíjacieho roztoku (jedna tobolka fosfát-citrátového pufru Sigma P4922 rozpustená v 100 ml vody, s prídavkom jednej 30 mg tablety o-fenyléndiamindihydrochloridu Sigma P4812) a doštička sa ďalej inkubovala 15 minút. Reakcia sa zastavila pridaním 75 μΐ 2M H2SO4 a merala sa absorbancia pri 490 nm.

Test CEA ELISA používajúci anti-CPG2 reportérovú protilátku bol v podstate zhodný s opísaným postupom, ale namiesto kozej anti-Iudskej kappa protilátky značenej s HRPO sa použila králičie anti-CPG2 polyklonálne sérum riedené 1/1000 v 1% BSA v PBS-TWEEN™ a doštička sa inkubovala pri teplote miestnosti na výkyvnej plošinke 2 hodiny. Potom sa doštička 3x opláchla s PBS-TWEEN™, pridala sa kozia anti-králičia protilátka značená s HRPO (Sigma A-6154) a doštička sa inkubovala pri teplote miestnosti na výkyvnej doštičke 1 hodinu a potom sa doštička 3x opláchla s PBSTWEEN™ a nakoniec ešte raz v PBS. Na detekciu väzby sa pridalo do každej jamky 100 μΐ vyvíjacieho roztoku (jedna tobolka fosfát34 citrátového pufru Sigma P4922 rozpustená v 100 ml vody, s prídavkom jednej 30 mg tablety o-fenyléndiamindihydrochloridu Sigma P4812) a doštička sa ďalej inkubovala 15 minút. Reakcia sa zastavila pridaním 75 μΐ 2M H2SO4 a merala sa absorbancia pri 490 nm.

Analýza westernových prenosov transfekčných supernatantov sa uskutočňovala nasledovným spôsobom.

10% minigély na analýzu transfekcie fúznym proteínom sa pripravili pomocou vhodného systému pre minigély (HOEFER MIGHTY SMALL™) . 10% deliaci gél (running gel) má zloženie: 20 ml akrylamid, 6 ml lOx pufor pre deliaci gél, 34 ml H₂O; 300 ml 20% SDS; 600 μΐ APS, 30 μΐ Temed. lOx pufor pre deliaci gél je 3,75M Tris pH 8,6. 6% vyrovnávací gél (stacking gel) má zloženie: 9 ml akrylamid, 4,5 ml 10X pufor pre vyrovnávací gél, 31,5 ml H₂O, 225 μΐ 20% SDS, 450 μΐ 10% APS, 24 μΐ Temed) . lOx pufor pre porovnávací gél je 1,5M Tris pH 6,8. 5x elektroforetický pufor pre SDS/PAGE bol 249mM Tris, 799mM glycín, 0,6% (hmotnosť/objem) SDS (pH sa neupravovalo).

Príprava vzoriek: 2x Laemmliho pufor je 0,125M Tris; 4% SDS, 30% glycerol; 4M močovina; 0,002% BPB a prípadne 5% βmerkaptoetanol.

Supernatanty: 25 μΐ vzorky + 25 μΐ 2 x Laemmliho pufra, nanesené 40 μΐ.

Štandardy F(ab' )2 a CPG2: 2 μΐ 10 ng/ml štandardu; 8 μΐ H₂O; 10 μΐ 2x Laemmliho pufra (- β-merkaptoetanol); nanesené 20 μΐ.

Markery (štandardy) molekulovej hmotnosti: využil sa komerčný marker RAINBOW™ firmy Amersham, 8 μΐ vzorky, 8 μΐ 2xLaemmliho pufra (+3-merkaptoetanol); nanesené 16 μΐ.

Podmienky elektroforézy: 30 mA dokial farba nedosiahla spodný okraj gélu (približne 1 hodinu).

Prenos na membránu (blotting): pomocou polosuchého prenosového zariadenia firmy LKB na nitrocelulózovú membránu; mA =0,7 x cm², počas 45 minút.

Blokovanie membrány: 5% sušené odstredené mlieko v PBSTWEEN™ počas 40 minút.

Detekcia F(ab')₂: pomocou ľahkého reťazca kozej anti-ludskej kappa protilátky značenej s HRPO, riedenej 1/2500 v 0,5% sušenom odstredenom mlieku v PBS-TWEEN™, inkubované cez noc.

Detekcia CPG2: myšacia anti-CPG2 monoklonálna protilátka (riedenie 1/2000 v 0,5% sušenom odstredenom mlieku v PBS-TWEEN™, inkubované cez noc), kozia anti-myšacia kappa protilátka značená s HRPO, Sigma 674301, riedená 1/10000 v 0,5% sušenom odstredenom mlieku v PBS-TWEEN™, inkubované minimálne 2 hodiny.

Vyvíjanie blotov (prenesených membrán): Chemiluminiscenčná detekcia HRPO založená na luminole ako substráte v prítomnosti zosilňovača (Pierce SUPERSIGNAL™ Substráte). Pracovný roztok substrátu sa pripravil nasledovne: odporučený objem roztoku luminol/zosilňovač a stabilného peroxidu, membrána sa inkubovala 5 až 10 minút v pracovnom roztoku, roztok sa odstránila membrána sa umiestnila do kazety a exponovala na autorádiografický film (zvyčajne 30 s až 5 minút).

Uloženie mikroorganizmov: Plazmid pNG3-Vkss-HuCk sa v súlade s Budapeštianskou zmluvou uložený 11. apríla 1996 v Národnej zbierke priemyselných a morských baktérií (National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB, 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom) ako položka č. NCIMB 40798. Plazmid pNG4-VHss-HuCk-NEO sa tiež uložil v NCIMB 11. apríla 1996 ako položka č. NCIMB 40799. Plazmid pICI266 sa uložil v NCIMB (23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom) 11. októbra 1993 ako položka č. NCIMB 40589.

Trypsinizácia: Trypsín EDTA (Gibco BRL, katalóg, č. 45300019) a Hanksov vyvážený soľný roztok (HBSS; Gibco BRL, katalóg, č. 14170-088) sa predhriali na 37 °C vo vodnom kúpeli. Prítomné médiá sa z kultúr odstránili a nahradili sa objemom HBSS, ktorý bol polovicou pôvodného objemu média, a vrstva buniek sa opatrne premyla tým, že sa miska alebo kultivačná fľaška jemne kývala, aby sa odstránili všetky zvyšky média obsahujúce sérum. HBSS sa odstránilo a pridal sa objem trypsínového roztoku (štvrtina objemu média) a fiaska sa jemne kývala, aby sa zistilo úplné pokrytie celej vrstvy buniek a ponechalo sa stáť 5 minút. Trypsín sa inaktivoval pridaním normálneho kultivačného média (2x objem trypsínového roztoku). Získaná bunková suspenzia sa potom buď kvantifikovala vzhľadom na počet buniek alebo sa riedila pre ďalšiu kultiváciu, v závislosti na zamýšľaných ďalších krokoch.

Tepelná inaktivácia fetálneho teľacieho séra (FCS): FCS (Viralex A15-651, akreditovaná šarža neeurópskeho pôvodu) sa uskladnilo pri -20 °C. Pred použitím sa ponechalo cez noc pri 4 °C úplne roztopiť. Nasledujúci deň sa inkubovalo vo vodnom kúpeli 37 °C 15 minút a potom sa prenieslo do vodného kúpeľa 56 °C na 5 minút. Potom sa sérum vybralo a ponechalo chladnúť na teplotu miestnosti, potom sa rozdelilo do 50 ml alikvotných častí a uskladnilo pri -20 °C.

Normálne DMEM médium (s použitím zložiek firmy Gibco BRL): k 500 ml DMEM (katalóg, č. 41966086) sa pridalo 12,5 ml Hepes (15630-056); 5 ml NEAA (1150-035); 5 ml pen/strep (10378-016) a 50 ml tepelne inaktivovaného FCS.

FAS médium (s použitím zložiek firmy GibcoBRL, pokiaľ nie je uvedené inak): 490 ml DMEM (41966-086); 12,5 ml Hepes (15630— 056); 5 ml neesenciálnych aminokyselín (11140-035); 5 ml pen/strep (10378-016); 5 ml vitamínov (I 1120-037); 5 ml bázických aminokyselín (51051-019); folinová kyselina (Sigma F8259) vo finálnej koncentrácii v médiu 10 pg/ml, 50 ml tepelne inaktivovaného FCS; 5 ml zmesi dNTP a G418 (50 mg/ml zásobný roztok na prípravu vhodnej selekčnej koncentrácie).

Zmes dNTP: 35 mg G (Sigma G6264, 35 mg C (Sigma C4654), 35 mg A (Sigma A4036), 35 mg U (Sigma U3033), 125 mg T (Sigma T1895) sa rozpustili v 100 ml vody, sterilizovali filtráciou a uschovávali pri -20 °C.

Selekcia G418: Selekcia buniek LoVo (ATCC CCL 229) sa uskutočňovala v koncentrácii 1,25 mg/ml, buniek HCT 116 (ATCC CCL 247) a buniek Colo320DM (ATCC CCL 220) v koncentrácii 1,5 mg/ml, pokiaľ nie je uvedené inak.

Vektory BLUESCRIPT™ sa získali z firmy Stratagene Cloning Systems.

Expresné vektory s génom Tet-On sa získali z firmy Clontech (Palo Alto, California), položka s katalóg, č. K1621-1.

Pokiaľ nie je uvedené inak a alebo to nie je zrejmé zo súvislostí, fúzny konštrukt protilátka-CPG2, o ktorom sa píše v príkladoch, využíva mutovanú formu CPG2, aby sa zabránilo glykozylácii.

Príklad 1

Konštrukcia fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)₂

Konštrukcia fúzneho enzýmu (A5B7 Fab-CPG2)₂ sa plánovala s cieľom získať bivalentnú molekulu viažucu ľudský karcinoembryonálny antigén (EA), ktorá má súčasne enzýmovú aktivitu CPG2. S týmto cieľom sa navrhol počiatočný konštrukt, ktorý obsahoval Fd fragment ťažkého reťazca protilátky A5B7 naviazaný svojím C-koncom prostredníctvom flexibilnej peptidovej spojky (G4S)3 k N-koncu polypeptidu CPG2 (obr. 1).

Protilátka A5B7 sa viaže na karcinoembryonálny antigén (CEA) a je osobitne vhodná na zacielenie kolorektálneho karcinómu alebo iných buniek nesúcich CEA antigén (význam CEA ako antigénu asociovaného s rakovinou opísali prehľadne Shively, J. E. a Beatty, J.D., CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology, vol. 2, p 355-399, 1994).

Enzým CPG2 je prirodzený dimér, obsahuje asociované dve identické polypeptidové jednotky. Každá podjednotka tohto diméru obsahuje veľkú katalytickú doménu a druhú menšiu doménu, ktorá sprostredkuje dimerizáciu.

Všeobecne povedané, konjugát protilátka-enzým alebo protilátkový fragment-enzým) alebo fúzny proteín by mal byť aspoň divalentný, inými slovami mal by byť schopný viazať aspoň 2 antigény asociované s nádormi (ktoré môžu byť zhodné alebo rôzne). V prípade fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)2 dochádza po expresii k dimerizácii zložiek rovnako ako u natívneho enzýmu, takže vznikne enzýmová molekula obsahujúca dva protilátkové fragmenty Fab (a je teda bivalentná z hľadiska protilátkových väzbových miest) a dve molekuly CPG2 (or. 2a) .

a) Klonovanie génov pre protilátku A5B7

Spôsoby prípravy, izolácia a charakterizácia rekombinantnéj myšacej protilátky A5B7 F(ab')2 sa publikovali (medzinárodná patentová prihláška Zeneca Limited, WO 96/20011, príklad 5) . V príklade 5 uvedené referencie, v odseku F, boli gény pre protilátku A5B7 klonované do vektorov GS-SYSTEM™ (Celltech), pozri patentové dokumenty WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 a WO 89/10404, kde Fd protilátky A5B7 sa klonoval do pEE6 a lahký reťazec do pEE12. Tieto vektory boli zdrojom génov protilátky A5B7 pre konštrukciu fúzneho proteínu A5B7 Fab-CPG2.

b) Konštrukcia chimérneho vektora A5B7

Variabilné úseky myšacej protilátky sa pomocou PCR amplifikovali z plazmidových vektorov pEE6 a pEE12 použitím vhodných primerov, ktoré obsahujú nevyhnutné reštrikčné miesta na priame klonovanie variabilných úsekov ťažkého a ľahkého reťazca do čítacieho rámca vektorov pNG4-VHss-HuľgG2CHľ (NCIMB č. 40797) a pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB č. 40799). Výsledné vektory sa nazvali pNG4/A5B7VH-IgG2CHľ (A5B7 chimérny ťažký reťazec Fd') a pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO (A5B7 chimérny ľahký reťazec).

c) Klonovanie génu CPG2

Gén kódujúci CPG2 sa môže získať z Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom. CPG2 sa môže tiež získať rekombinantným spôsobom. Nukleotidovú sekvenciu kódujúcu CPG2 publikoval Minton, N. P. a kol., Gene (1984) 31, 31-38. Expresia kódujúcej sekvencie sa opísala v E. coli (Chambers, S. P. a kol., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, 29: 572-578 a v Saccharomyces cerevisiae (Čiarke, L.E. a kol., Gen. Microbiol., 1985, 131, 897904) . Okrem toho gén CPG2 sa môže pripraviť ako syntetický DNA konštrukt rôznymi metódami a použiť ako východiskový materiál pre ďalšie pokusy. Úplnú génovú syntézu opísal M. Edwards, Am. Biotech. Lab., 1987, 5, 38-44, Jayamaran a kol., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088, Foguet a Lubbert, Biotechniques 13, 674-675 a Pierce, 1994, Biotechniques 16, 708.

Ako príprava na klonovanie génu CPG2 sa skonštruoval vektor pNG3-Vkss, čo je derivát plazmidu pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB č. 40799). Tento vektor sa skonštruoval tak, že sa odstránil neomycínový gén (pretože obsahuje miesto pre reštrikčný enzým EcoRI) štiepením reštrikčným enzýmom Xbal, potom s izoloval fragment a znovu ligoval, čím sa vytvoril plazmid pNG3/Vkss-HuCk. Tento medziprodukt sa štiepil enzýmami Sací a EcoRI, ktoré vystrihli génový fragment HuCk. Štiepená DNA sa potom naniesla na 1% agarózový gél a vystrihnutý fragment oddelený od zvyšnej časti vektora sa vyrezal z gélu a purifikoval. Dva oligonukleotidy CME00261 a CME00262 (sekvencie SEQ ID NO: 1 a NO: 2). sa navrhli a syntetizovali. Oligonukleotidy sa hybridizovali pridaním 200 pmol každého oligonukleotidu do celkového objemu 30 μΐ H₂O, zahriali na 90 °C a nechali pomaly chladnúť na 30 °C. 100 pmol produktu, t.j. spojené DNA, sa ligovalo priamo do predtým pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. V takto získanom klone vnesená kazeta DNA vytvorila nový polylinker (viacnásobné klonovacie miesto) na následné klonovanie génu CPG2 pri tvorbe vektora pNG3-Vkss.

Štruktúrny gén CPG2 kódujúci aminokyselinové zvyšky Q26 až K415 vrátane sa amplifikoval pomocou PCR z príslušnej DNA pomocou oligonukleotidových primerov pri štandardných reakčných podmienkach PCR. Výsledný PCR produkt sa analyzoval na 1% agarózovom géli, pás s očakávanou veľkosťou (približne 1200 bp) sa vyrezal, purifikoval a DNA sa eluovala do 20 μΐ H₂O. Tento materiál sa potom štiepil so SacII a potom sa reakcia opäť analyzovala v 1% agarózovom géli a pás s očakávanou veľkosťou (približne 250 bp) sa vyrezal a purifikoval. Tento fragment sa ligoval do plazmidového vektora pNG3Vkss, ktorý sa predtým štiepil so SacII, defosforyloval a rozdelil v 1% agarózovom géli, pás s linearizovaným vektorom sa vyrezal a purifikoval a ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Výsledné klony sa analyzovali na prítomnosť a orientáciu fragmentu CPG2 SacII reštrikčnou analýzou s enzýmami BglII a Fsel. Klony, ktoré mali fragment so správnou veľkosťou a orientáciou sa ešte potvrdili sekvenovaním DNA. Tento plazmidový medziprodukt sa nazval pNG3Vkss-SacIICPG2frag. Tento plazmid sa potom ďalej štiepil reštrikčnými enzýmami Agel a EcoRI, defosforyloval a vektorový fragment sa potom izoloval. Pôvodný PCR produkt génu CPG2 sa potom tiež štiepil s enzýmami Agel a EcoRI, fragment s veľkosťou asi 1000 bp sa izoloval, ligoval a transformovala sa ním E. coli. Výsledné klony sa analyzovali na prítomnosť plnej dĺžky génu CPG3 (asi 1200 bp) pomocou reštrikčných enzýmov HindlII a EcoRI, klony so správnou veľkosťou sa potom na potvrdenie identity sekvenovali. Nakoniec sa tento plazmid (pNG3-Vkss-CPG2) štiepil s

Xbal, defosforyloval, vektorový fragment sa izoloval a Xbal fragment neomycínového génu (približne 1000 bp, ktorý sa izoloval v predchádzajúcich štádiách) vložil do plazmidu a transformovala sa ním E. coli. Výsledné klony sa testovali na prítomnosť a orientáciu neomycínového génu štiepením enzýmami Xbal a EcoRI. Výsledný vektor sa označil pNG3-Vkss-CPG2-NEO.

d) Konštrukcia variantu CPG2 R6

Plazmid pNG3-Vkss-CPG2-NEO sa použil ako templát pre PCR mutagenézu CPG2, aby sa mutovali 33 potenciálne glykozylačné miesta, ktoré sa identifikovali v sekvencii bakteriálneho enzýmu divého typu. Potenciálne glykozylačné miesta (N-X-T/S) sa našli v pozíciách 22 (N-I-T), 264 (N-W-T) a 272 (N-V-S) , pričom číslovanie pozícií je podía publikácie Minton, N.P. a kol., Gene, 1984, 31, 31-38. Asparagínový zvyšok (N) všetkých 3 glykozylačných miest sa mutoval na glutamín (Q) , takže glykozylačné miesta sa zrušili, čím sa zabránilo akejkoľvek glykozylácii, ktorá by mohla ovplyvniť expresiu CPG2 alebo enzýmovú aktivitu CPG2.

Na vytvorenie variantu CPG2 R6 sa použila taká technika PCR mutagenézy, keď sa mutovali všetky 3 miesta v jedinej reakcii. Plazmid pNG3-Vkss-CPG2-NEO sa použil ako templát na počiatočné tri PCR. V reakcii Rl sa použili syntetické oligonukleotidové primery CME 00395 a CME 00397 (sekvencie SEQ ID NO: 3 a NO: 4), v reakcii R2 sa použili syntetické oligonukleotidové primery CME 00395 a CME 00399 (sekvencie SEQ ID NO: 3 a NO: 5) a v reakcii R3 sa použili syntetické oligonukleotidové primery CME 00396 a CME 00400 (sekvencie SEQ ID NO: 6 a NO: 7) . Produkty reakcie Rl a R2 obsahovali mutované miesta 222 a 264 + 272 (v uvedenom poradí) a R3 produkt bol kópiou C-koncového segmentu génu CPG2. Produkty R2 a R3 (R2 je približne 750 bp, R3 je približne 360 bp) , po separácii na agaróze a purifikácii, sa spojili v ďalšej PCR reakcii. Pripravili sa zmesi rôznych množstiev produktov R2 a R3 uskutočnili sa ďalšie PCR so syntetickými oligonukleotidmi CME 00395 a CME 00396 (sekvencie SEQ ID NO: 3 a NO: 6)). Výsledný produkt R4 (s približnou veľkosťou 1200 bp) sa opäť amplifikoval pomocou PCR s oligonukleotidmi CME 00398 a CME 00396 (sekvencie SEQ ID NO: 8 a NO: 6) . Výsledný produkt R5 (s približnou veľkosťou 600 bp) sa spojil s produktom R5 (s približnou veľkosťou 620 bp) v poslednej PCR reakcii uskutočnenej s oligonukleotidmi CME 00395 a CME 00396 (sekvencie SEQ ID NO: 3 a NO: 6) . Výsledný produkt R6 (s približnou veľkosťou 1200 bp), ktorý teraz obsahoval všetky tri mutované glykozylačné miesta, sa mohol klonovať do (po štiepení s reštrikčnými enzýmami Agel a BsrGI a izolácii výsledného fragmentu) do vektora pNG3/Vkss-CPG2NEO (ktorý sa predtým štiepil s reštrikčnými enzýmami Agel a BsgRI a potom sa izoloval). Tak sa pripravila požadovaná DNA (sekvencia SEQ ID NO: 9) kódujúca proteínovú sekvenciu CPG2/R6 (sekvencia SEQ ID NO: 10) v expresnom vektore pNG3/Vkss-CPG2R6Neo.

e) Konštrukcia génu fúzneho proteínu Fd ťažkého reťazca A5B7CPG2

Gény pre fragment ťažkého reťazca protilátky a enzýmu CPG2 sa získali pomocou PCR amplifikácie plazmidového templátu. Plazmid pNG4/A5B7VH-IgG2CHľ sa amplifikoval s primermi CME 00966 (sekvencia SEQ ID NO: 11) a CME 00969 (sekvencia SEQ ID NO: 12) , aby sa získala zložka A5B7 Fd (s približnou veľkosťou 300 bp) a plazmid pNG3/Vkss-CPG2R6-neo sa amplifikoval s primermi CME 00967 (sekvencia SEQ ID NO: 13) a CME 00968 (sekvencia SEQ ID NO: 14) na získanie enzýmovej zložky (s približnou veľkosťou 1350 bp) . V každom prípade sa reakčný produkt naniesol na 1% agarózový gél, pás so správnou veľkosťou sa vyrezal, purifikoval a DNA sa eluovala do 20 μΐ HžO.

Ďalšia PCR sa uskutočnila, aby sa spojili dva reakčné produkty spolu. PCR sa uskutočnila pri štandardných podmienkach s rôznym množstvom (medzi 0,5 až 2 μΐ) každého z PCR produktov v 25 cykloch (namiesto zvyčajných 15 cyklov). Reakčný produkt sa analyzoval v 1% agarózovom géli a pás s očakávanou veľkosťou (približne 1650 bp) sa vyrezal, purifikoval a eluoval do 20 μΐ H₂O. Tento materiál sa potom štiepil s reštrikčnými enzýmami NheI a BamHI, potom sa pás s očakávanou velkosťou (približne 1650 bp) izoloval a purifikoval. Vektor pNG4/A5B7VH-IgG2CHľ sa pripravil štiepením NheI a BamHI po prijatí uvedeného produktu PCR, DNA vektora sa po štiepení defosforylovala a väčší pás vektorovej DNA sa separoval od menšieho Nhel/BamHI fragmentu. Vektorový pás sa izoloval a purifikoval a potom sa podobne štiepený PCR produkt ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa pripravila DNA a sekvenovaním sa overilo, či obsahuje sekvenciu fúzneho génu. Našiel sa rad správnych klonov a jeden z nich (označený R2.8) sa premenoval na pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (sekvencia SEQ ID NO: 15 a NO: 16).

f) Kontransfekcia a tranzientná (prechodná) expresia

Plazmid pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódujúci fúzny protilátkový chimérny proteín Fd-CPG2) a pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (kódujúci chimérny lahký reťazec protilátky, sekvencie SEQ ID NO: 17 a NO: 18) sa kotransfekovali (spoločne transfekovali) postupom s využitím činidla LIPOFECTIN™ do COS-7 buniek, ako bude opísané ďalej. Bunky COS-7 sa vysiali na 6-jamkové kultivačné doštičky po 2 x 10⁵ buniek/2 ml/jamku zo subkonfluentnej kultúry a inkubovali cez noc pri 37 °C a 5% CO₂. Médium bez séra obsahujúce LIPOFECTIN™ sa pripravilo nasledovným postupom: 12 ml

LIPOFECTINU™ a 200 ml média bez séra sa inkuboval 30 minút pri teplote miestnosti. Zmes DNA a média bez séra sa pripravila nasledovne: 4 mg DNA (2 mg každého konštruktu) do 200 ml média bez séra sa pridalo k zmesi s DNA a inkubovalo pri teplote miestnosti 15 minút. Ku každej vzorke sa potom pridalo 600 ml média bez séra. Bunky sa raz opláchli s 2 ml média bez séra a potom sa k bunkám pridal 1 ml zmesi LIPOFECTIN™/DNA a bunky sa inkubovali 5 hodín pri 37 °C a 5% CO₂. Zmes LIPOFECTIN™/DNA sa odstránila a pridalo sa normálne kultivačné médium, v ktorom sa potom bunky inkubovali 72 hodín pri 37 °C a 5% CO2. Bunkový supernatant sa potom zozbieral.

g) Analýza funkčného proteínu protilátka-enzým

Supernatant sa analyzoval na prítomnosť fúzneho proteínu pomocou CEA väzbového ELISA testu s použitím ľudského kappa ľahkého reťazca ako reportérovej protilátky (na prítomnosť protilátky), ELISA testu s použitím anti-CPG2 reportérovej protilátky (na prítomnosť CPG2 fúzneho proteínu viazaného na CEA) , HPLC testu CPG2 enzýmovej aktivity (na zmeranie špecifickej aktivity CPG2) a SDS/PAGE s westernovým prenosom (s použitím tak ľudského kappa ľahkého reťazca ako aj anti-CPG2 ako reportérovej protilátky) na detekciu exprimovaného materiálu.

HPLC test enzýmovej aktivity jasne dokázal, že je prítomná CPG2 enzýmová aktivita v bunkovom supernatante a obidva väzbové testy CEA-ELISA ukázali väzbu proteínu v zhode s bivalentnou molekulou protilátky A5B7. Skutočnosť, že anti-CEA ELISA detegovaná s anti-CPG2 reportérovou protilátkou jasne ukázala väzbu CEA, dokázala, že nielen protilátka, ale aj fúzny proteín protilátka-CPG2 viaže CEA.

Westernový prenos s obidvoma reportérovými protilátkami jasne ukázal podjednotky fúzneho proteínu s očakávanou veľkosťou 90 kDa bez pozorovateľnej degradácie na menšie produkty (ako samostatný Fab alebo enzým).

Keďže CPG2 je známa tým, že vykazuje enzýmovú aktivitu iba ako dimér a keďže bol prítomný iba fúzny proteín protilátkaenzým, bolo zrejmé, že fúzny proteín s veľkosťou 90 kDa (podľa SDS/PAGE) dimerizuje prostredníctvom prirodzeného dimerizačného mechanizmu CPG2 a tvorí molekulu dimérneho fúzneho proteínu protilátka-enzým s veľkosťou 180 kDa (obr. 2a) pri natívnych podmienkach pufra. Táto molekula vykazuje tak enzýmovú aktivitu ako aj väzbové vlastnosti k CEA antigénu, ktoré sa nijako významne nelíšia medzi fúznym proteínom a samostatným enzýmom a protilátkou.

h) Použitie exprimovaného fúzneho proteínu a CPG2 predlieku v teste cytotoxicity in vitro

Uskutočnil sa test bunkovej toxicity in vitro, v ktorom sa porovnal fúzny proteín (A5B7-CPG2R6)2 s konvenčným konjugátom A5B7F(ab')2-CPG2 vytvoreným spojením A5B7 F (Ab')2 s CPG2 chemickým heterobifunkčným činidlom. V každom prípade sa materiál vykazujúci rovnakú hladinu CPG2 enzýmovej aktivity inkuboval s bunkami LoVo, čo sú nádorové bunky nesúce CEA. Bunky sa potom opláchli, aby sa odstránil nenaviazaný materiál a potom sa resuspendovali v médiu obsahujúcom CPG2 fenolový predliek (PGP, pozri príklad 2) 1 hodinu, potom sa bunky opäť opláchli, resuspendovali v čerstvom médiu a ponechali volne sa deliť 4 dni. Nakoniec sa bunky opracovali farbivom SRB a stanovil sa ich počet.

Získané výsledky jasne ukázali, že fúzny proteín (A5B7CPG2R6)2 spoločne s predliekom spôsobil minimálne rovnako úhyn buniek a spôsoboval prítomnosť nižšieho počtu buniek na konci testu ako rovnaké množstvo konjugátu A5B7F(ab')-CPG2 (s rovnakým predliekom). Odumieranie buniek (vyššie ako bazálna hladina kontroly) sa objavovalo keď sa predliek konvertoval na aktívny liek enzýmom CPG2 (a keďže bunky sa opláchli, aby sa odstránil nenaviazaný proteín, iba enzým viazaný na bunky zostal v štádiu, keď sa pridal predliek). Takže pokus jasne ukázal, že minimálne rovnako zostal naviazaný tak fúzny proteín A5B7-CPG2 ako aj konvenčný konjugát A5B7F(ab')2-CPG2, keď dochádza k vyššiemu stupňu odumretia buniek (pravdepodobne vďaka vyššej miere konverzie predlieku na liek).

i) Konštrukcia koexpresného vektora fúzneho proteínu na použitie v tranzientnej a trvalej expresii v bunkových líniách

Na jednoduchší spôsob transfekcie a priame spojenie obidvoch expresných kaziet s jedným selekčným markerom sa skonštruoval koexpresný vektor na expresiu fúzneho proteínu z existujúcich vektorov pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódujúceho fúzny protilátkový Fd-CPG2) a pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (kódujúceho lahký reťazec protilátky). Plazmid pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 sa najskôr štiepil s reštrikčným enzýmom Seal, reakcia sa naniesla na 1% agarózový gél a pás s lnearizovaným vektorom sa vyrezal a purifikoval. Vektorová DNA sa potom štiepila s reštrikčnými enzýmami BglII a BamHI, reakcia sa naniesla na 1% agarózový gél a požadovaný pás (približne 2700 bp) sa vyrezal a purifikoval. Plazmid pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO sa štiepil s reštrikčným enzýmom BamHI a potom sa vektor vyrezal a purifikoval. Plazmid pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO sa štiepil s reštrikčným enzýmom BamHI a potom sa vektor vyrezal z gélu a purifikoval. Fragment expresnej kazety ťažkého reťazca sa potom ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Orientácia sa overila štiepením s rôznymi reštrikčnými enzýmami a vybrali sa klony s kazetou ťažkého reťazca s rovnakou orientáciou ako kazeta pre ľahký reťazec. Tieto plazmidy sa nazvali pNG3/A5B7VK-CPG2/R6coexp-NEO.

j) Génové vypínače na expresiu proteinov

Dá sa predpokladať, že expresia in vitro CPG2 a fúzneho proteínu s CPG2 spôsobí degradáciu folátov v médiu, čo môže spôsobiť spomalenie rastu buniek alebo smrť buniek. Vysoká aktivita enzýmy CPG2 pravdepodobne spôsobí taký deficit folátu, ktorý sa dá velmi ťažko prekonať doplnením folátu do média. Avšak predpokladá sa, že v prípade expresie CPG2 alebo fúzneho proteínu s CPG2 v cicavčích bunkách in vivo je nepravdepodobné, že nastanú takéto problémy, pretože bunky sú normálne zásobované všetkými látkami potrebnými pre rast normálnymi obehovými a bunkovými mechanizmami.

Zvažoval sa rad možností, ako in vitro zabrániť možnému vyčerpaniu kyseliny listovej. Jedna z možností je použitie prísne kontrolovaného vypínacieho systému ako sú napr. TET vypínače TET on a TET off (pozri Gossen a kol., 1995, Science 268: 17661769) alebo vypínač ekdyson/muristeron A (No, D. a kol., 1996,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351). Takéto systémy umožňujú presne kontrolovať expresiu požadovaného génu a umožňujú trvalú transformáciu cicavčích buniek génmi, ktoré kódujú toxické alebo potenciálne škodlivé produkty expresie. Génový vypínač umožní, že sa stabilné rekombinantné bunkové línie obsahujúce fúzne gény CPG2 ľahšie založia, budú udržiavať a rozmnožovať na využitie na expresiu proteínu a ako očkovacie kultúry pre ďalšie pokusy in vivo.

Príklad 2

Nádorové bunky HCT116 exprimujúce fúzny proteín protilátka-enzým in vitro selektívne ničené predliekom

HCT116 bunky kolorektálneho nádoru (ATCC CCL 247) transfekované génom fúzneho proteínu protilátka-enzým podľa príkladu 1 sa môžu selektívne zabíjať predliekom, ktorý sa konvertuje enzýmom na aktívny liek.

Aby sa toto dokázalo, kontrolné netransfekované bunky HCT116 a bunky HCT116 transfekované génom fúzneho proteínu protilátkaenzým sa inkubovali buď s predliekom, 4-[N,N-bis(2-chloroetyl) amino]-fenoxykarbonyl) -L-glutámovou kyselinou (PGP, Blakey a kol., Br. J. Cancer 72: 1083, 1995) alebo zodpovedajúcim liekom uvoľňovaným CPG2, 4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenolom.

Predliek PGP a liek v koncentráciách 5 x 10“⁴ až 5 x 10⁸ M sa pridali na 1 hodinu pri 37 °C na 96-jamkové mikrodoštičky obsahujúce 1000 až 2500 buniek HCT116 na jamku. Bunky sa potom opláchli a inkubovali pri 37 °C ďalšie tri dni. Po opláchnutí, ktorým sa odstránili odumreté bunky, sa pridala TCA a množstvo bunkového proteínu adherujúceho k doštičkám sa stanovilo pomocou farbenia so SRB, ako opísali Skehan a kol. (J. Natl. Cancer Inst., 1107, 1990) Sila lieku a predlieku sa hodnotili podľa koncentrácie potrebnej ma dosiahnutie 50% inhibície rastu buniek (IC₅₀) .

Pôsobenie lieku na netransfekované a transfekované bunky HCT116 spôsobilo hodnotu IC50 asi ΙμΜ. Oproti tomu predliek PGP mal hodnotu IC₅₀ 200 μΜ pre netransfekované a 1 μΜ pre transfekované buky. Tieto výsledky ukazujú, že transfekované bunky, ktoré exprimovali fúzny proteín protilátka-CPG2, konvertovali predliek PGP na omnoho účinnejší aktívny liek, zatiaľ čo netransfekované bunky HCT116 neboli konvertovať predliek. Teda transfekované bunky HCT116 boli viac ako lOOx citlivejšie na PGP predliek z hľadiska odumierania buniek v porovnaní s netransfekovanými bunkami HCT116 (pozri príklad 1) týkajúce sa možného vyčerpania folátu v bunkách).

Táto štúdia ukazuje, že transfekcia nádorových buniek s génom pre fúzny proteín protilátka-enzým môže spôsobovať selektívne zabitie nádorových buniek.

Príklad 3

Protinádorová aktivita predlieku PGP v nádorových bunkách HCT116 exprimujúcich fúzny proteín protilátka-CPG2

Protinádorová aktivita in vivo predlieku PGP v nádorových bunkách HCT116 exprimujúcich fúzny proteín protilátka-CPG2 sa demonštrovala nasledovným spôsobom. Kontrolné netransfekované bunky HCT116 a bunky HCT116 transfekované génom fúzneho proteínu protilátka-enzým sa injikovali do nahých beztýmusových myší (s dávkou 1 x 10⁷ buniek na myš). Keď boli nádory s veľkosťou 5 až 7 mm v priemere, bol i.p. injikovaný PGP (3 dávky po 5 až 25 mg/kg v 1 hodinových intervaloch) . Protinádorový účinok sa posudzoval podľa velkosti nádoru meraním priemeru v dvoch smeroch a vyrátaným objemom podlá vzorca objem = π/6 x D² x d, kde D je väčší priemer a d je menší priemer.

Objem nádoru sa potom vyjadril relatívne k objemu nádoru na začiatku terapie predliekom. Protinádorová aktivita sa porovnala s kontrolnými skupinami, ktorým sa podal PBS (solný roztok pufrovaný fosfátom, 170mM NaCl, 3,4mM KC1, 12mM Na₂HPO₄, l,8mM

KH₂PO₄, pH 7,2) namiesto PGP predlieku.

Podávanie PGP do nádorov HCT116 vzniknutých z transfekovaných buniek HCT116 malo významný protinádorový účinok, ako sa dalo usúdiť podlá zmenšujúcej sa velkosti nádorov liečených s PGP v porovnaní s nádormi, ktoré dostávali PBS a tiež podlá toho, že nádory liečení s PGP v porovnaní s nádormi liečenými s PBS potrebovali dlhší čas na dosiahnutie štvornásobku počiatočnej velkosti. Oproti tomu podávanie PGP do nádorov vzniknutých z netransfekovaných buniek HCT 116 nespôsobovalo žiadny významný protinádorový účinok.

Podobné štúdie sa môžu použiť na dokázanie toho, že gén protilátka-enzým vnesený pomocou vhodného vektora do nádoru vzniknutého z netransfekovaných buniek HCT116, pokial sa použije v kombinácii s PGP predliekom, spôsobuje významnú protinádorovú aktivitu. Netransfekované bunky HCT116 sa injikovali do nahých beztýmusových myší (s dávkou 1 x 10⁷ buniek na myš) . Keď boli nádory s veľkosťou 5 až 7 mm v priemere, injikoval sa do nádoru vektor obsahujúci gén fúzneho proteínu protilátka-enzým. Po 1 až 3 dňoch, ktoré sa ponechali na expresiu a naviazanie fúzneho proteínu protilátka-enzým na nádorové bunky HCT116, sa podal PGP predliek rovnako ako je uvedené vyššie. To spôsobilo významnú protinádorovú aktivitu v porovnaní s kontrolnými myšami, ktoré dostávali PBS namiesto PGP predlieku.

Príklad 4

Zlepšená transfekcia adherujúcich buniek s použitím doplneného média FAS a/alebo feeder buniek V-79

Dá sa predpokladať, že expresia in vitro CPG2 a fúzneho proteínu CPG2 spôsobí degradáciu folátu v médiu, čo môže zapríčiniť spomalenie rastu buniek alebo smrť buniek. Médium FAS (doplnené s kyselinou folinovou) tu opísané sa vyvinulo práve pre bunkové línie exprimujúce CPG2 alebo fúzny proteín s CPG2, aby sa lepšie podporoval rast takýchto línií.

Pri príprave na transfekciu sa adherentné bunkové línie kultivovali v normálnom médiu DMEM a pasážovali sa najmenej trikrát pred transfekciou. Bunky V-79 (fibroblasty z pľúc) škrečka, získané z MRS radiobiology Unit. Harwell, Oxford, United Kingdom) sa kultivovali v normálnom médiu DMEM a pasážovali trikrát pred použitím. Pred transfekciou sa zrátali v adherentných bunkách živé bunky (pomocou hemocytometra a farbenia trypanovou modrou) a vysiali sa na 6-jamkové doštičky (Costar 3516) v množstve 2 x 10⁵ buniek na jamku a nechali 18 až 24 hodín, aby sa bunky znovu adherovali.

Pre každú jednotlivú transfekciu sa pridalo 20 μΐ LIPOFECTINU™ k 80 μΐ média bez séra a nechalo sa inkubovať 30 minút pri teplote miestnosti. Plazmidová DNA (2 μg) sa pridala do 100 μΐ média bez séra, potom sa pridala zmes LIPOFECTINU™ a nechala sa pri teplote miestnosti 15 minút. Jednotlivé 6-jamkové doštičky sa opláchli s 2 ml média bez séra v každej jamke, aby sa odstránilo všetko sérum, a potom sa médium nahradilo s 800 μΐ čerstvého média bez séra. 200 μΐ zmesi LIPOFECTIN™/DNA/médium bez séra, ktorá sa dopredu pripravila, sa pridalo do každej jamky s bunkami. Doštičky sa potom inkubovali 5 hodín pri 37 °C, zmes LIPOFECTIN™/DNA sa odstránila a pridali 2 ml čerstvého normálneho kultivačného média, v ktorom sa potom bunky inkubovali ďalších 48 hodín. Transfekované bunky v 6-jamkových doštičkách sa zoškrabali uvoľnili, bunková suspenzia sa odsala a centrifugovala. Odstránil sa celý supernatant a sediment buniek sa resuspendoval v 20 ml vhodného kultivačného média (t.j. média FAS) obsahujúceho vhodné selekčné činidlo pre transfekovanú DNA (napr. G418). Alikvoty (200 μΐ) sa vysiali na 96-jamkovú doštičku (1,25 x 10⁴buniek/jamku).

Aby sa zvýšila klonálna expanzia, môžu sa pridať k transfekovaným bunkách výživné (feeder) fibroblastové bunky. Semikonfluentné výživné buky V-79 sa trypsinizovali a zrátali sa živé bunky. Bunky sa potom resuspendovali v sterilnej sklenenej nádobe na 1 x 10⁶ buniek/ml a ožiarili sa céziovým zdrojom s dávkou 5000 rad za 12 minút. Bunky sa potom uložili na 24 až 48 hodín pri 4 °C (ožiarené bunky sú metabolický aktívne, ale nedelia sa, takže môžu pôsobiť ako výživné bunky pre ostatné bunky, pričom nekontaminujú kultúru). Výživné bunky sa vysiali na 96-jamkovú doštičku, 4 x 10⁴ buniek/jamku, aby sa vytvorila konfluentná vrstva pre vznikajúce rekombinantné klony. Výživné bunky spočiatku tiež adherujú k doštičke, ale postupne sa uvoľňujú a vznášajú sa v médiu, v jamke zostávajú adherované iba rekombinantné klony. Výmena média (200 μΐ) sa uskutočňovala dvakrát týždenne, aby sa odstránili uvoľnené bunky a doplnilo sa médium. Kolónie sa ponechali vyvíjať sa lé až 14 dní, potom sa supernatant testoval na sekréciu fúzneho proteínu štandardným testom ELISA.

Na zmeranie rýchlosti expresie v prípade génového konštruktu fúzneho proteínu (A5B7-CPG2)₂ sa rekombinantné bunky vysiali v množstve 1 x 10⁶ do 10 ml čerstvého normálneho kultivačného média a kultivovali sa presne 24 hodín. Supernatant sa potom zozbieral, centrifugoval, aby sa odstránili zvyšky buniek a potom sa testoval na enzýmovú aktivitu testom ELISA a pomocou HPLC, ako bolo opísané vyššie. Výsledky pre rad rekombinantných bunkových línií fúzneho proteínu (A5B7-CPG2)₂ sú uvedené v nasledovnej tabuľke.

Bunková línia	Kloň	ng/10⁶ buniek/24 hodín
HCT116	F7	6550
	C12	3210
	F6	11560
	Cl	6151
	B3	4502
	A8	4650
	D5	630
	H9	610
	Gll	2081
	H4	2380
	A4	1634
LoVo	B9	8370
	Cl	7350
	F12	2983
	C7	10770
	G10	4140
Colo320DM	B3	10540
	G4	4720
	B9	885
	B10	3090
	F12	35660

Príklad 5

Konštrukcia nádorovej bunkovej línie so stabilnou indukovatelnou expresiou fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)2

a) Konštrukcia indukovatelného expresného vektora fúzneho proteínu

Aby sa uľahčila expresia z jedného indukovatelného cicavčieho promótora, skonštruovala sa verzia fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)₂ obsahujúceho IRES (vnútorné ribozómové vstupné miesto, pozri Sugimoto a kol., Biotechnology, 1994, 12, 694-8). Konštrukt pNG3/A5B7VK-HuCk-NEO (chimérny reťazec A5B7, pozri príklad 1) sa použil ako templát na amplifikáciu génu ľahkého reťazca. Gén sa amplifikoval pomocou oligonukleotidov CME 3153 a CME 3231 (sekvencie SEQ ID NO: 19 a NO: 20) . Produkt PCR s očakávanou veľkosťou (približne 700 bp) sa purifikoval. Tento produkt sa potom štiepil s reštrikčnými enzýmami EcoRI a BamHl a potom sa purifikoval. Získaný fragment sa klonoval do vektora pBluescript™ KS+ (pripraveného štiepením rovnakými reštrikčnými enzýmami, aby sa mohol prijať fragment a potom defosforyláciou a purifikáciou väčšieho pásu). Ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony sa sekvenovali, aby sa overila sekvencia. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z týchto klonov sa nazval A5B7Bluescript.

Podobným spôsobom sa amplifikoval chimérny ťažký reťazec pomocou PCR z plazmidu pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (pozri príklad 1) a oligonukleotidov CME 3151 a CME 3152 (sekvencie SEQ ID NO: 21 a NO: 22) . Produkt PCR s očakávanou veľkosťou (približne 1800 bp) sa purifikoval) . Tento produkt sa potom štiepil reštrikčnými enzýmami BamHl a Xbaľ a potom sa purifikoval.

Získaný fragment sa klonoval do vektora pBluescript™ KS+ (pripraveného štiepením s rovnakými reštrikčnými enzýmami, aby sa mohol prijať fragment a potom defosforyláciou a purifikáciou väčšieho pásu. Ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala sa reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony sa sekvenovali aby sa overila sekvencia. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jedene z týchto klonov sa nazval BluescriptFdCPG2R6.

Sekvencia IRES tu použitá pochádzala z plazmidu pSXLC (opísaného v Y. Sugimoto a kol., Biotechnology, 1994, 12, 694-8, plazmid sa získal od týchto autorov). Sekvencia IRES sa vystrihla reštrikčnými enzýmami BamHI a Ncol. Pás s očakávanou veľkosťou (približne 500 bp) sa purifikoval a ligoval do vektora Bluescript™ Fd-CPG2R6 (pripraveného štiepením rovnakými reštrikčnými enzýmami). Ligačnou zmesou sa potom transformoval E. coli. Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu a vhodné klony sa sekvenovali na overenie sekvencie. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z týchto klonov sa nazval Bluescript™IRES Fd-CPG2R6.

Na uľahčenie ďalších klonovacích krokov bolo nutné odstrániť miesto Xbal, ktoré sa prenieslo vo fragmente IRES. To sa uskutočnilo mutagenézou PCR s oligonukleotidovými primermi CME 3322 a CME 3306 (sekvencie SEQ ID NO: 23 a NO: 24) a plazmidom Bluescript™IRES Fd-CPG2R6 ako templátovou DNA. Produkt PCR s očakávanou veľkosťou (približne 500 bp) sa purifikoval, štiepil reštrikčnými enzýmami BamHI a Ncol a potom sa ligoval do vektora Bluescript™IRES Fd-CPG2R6 (pripraveného štiepením rovnakými reštrikčnými enzýmami). Ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony sa sekvenovali aby sa overila sekvencia génu. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z týchto klonov sa nazval.

Fragment chimérneho ľahkého reťazca A5B7 sa vystrihol z plazmidu A5B7Bluescript™ reštrikčnými enzýmami EcoRI a BamHI. Pás s očakávanou veľkosťou (približne 700 bp) sa purifikoval a potom sa ligoval do vhodne pripraveného vektora Bluescript™IRES FdCPG2R6-Xbadel a ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli.

Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony sa sekvenovali, aby sa overila sekvencia génu. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z týchto klonov sa nazval Bluescript™A5B7IRES Fd-CPG2R6-Xbadel. Úplná sekvencia chimérneho fúzneho proteínu A5B7 s IERS je tu uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 52.

Gén chimérneho fúzneho proteínu A5B7 s IRES sa potom preniesol do expresného vektora regulovaného tetracyklínom. Vektory s expresným systémom TET-on sa získali od firmy Clontech. Tetracyklínový vypínateľný expresný vektor pTRE (inak známy ako pHUD10-3, pozri Gossen a kol., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-51) sa pripravil na prijatie fragmentu štiepením reštrikčnými enzýmami EcoRl a Xbal, defosforylovaný a veľký pás vektora sa purifikoval. Génová kazeta IRES sa vystrihla z plazmidu Bluescript™IRES Fd-CPG2R6-Xba del pomocou rovnakých enzýmov. Získaný fragment s približnou veľkosťou 3000 bp sa ligoval do dopredu pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Z klonov sa pripravila DNA a analyzovala sa reštrikciami na prítomnosť vloženého fragmentu PCR. Vhodné klony sa sekvenovali aby sa overila sekvencia génu. Získal sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z týchto klonov sa nazval pHUD10-3/A5B7IRES Fd-CPG2R6.

b) Konštrukcia bunkovej línie so stabilnou indukovateľnou expresiou fúzneho proteínu

Na prípravu rekombinantnej línie nádorových buniek HCT116 sa použil štandardný spôsob transfekcie s lipofektínovým činidlom (ako už bolo opísané, avšak bez výživných buniek). Uskutočnila sa kotransfekcia 1 pg plazmidu pHUD10-3/A5B7IRES Fd-CPG2R6 a 1 pg transaktivátorového expresného plazmidu pTet-on (zo súpravy firmy Clontech) a pozitívne klony sa selektovali pomocou FAS média obsahujúceho 750 pg G418/ml.

c) Indukčná štúdia rekombinantných indukovateľných línií HCT116

Získané klony sa rozdelili v duplikáte na 48-jamkové misky, x 10⁶ buniek na jamku. Bunky sa kultivovali 48 hodín s tým, že jedna miska sa indukovala 2 gg/ml doxycyklinu a druhá bola neindukovaná kontrola. Expresia fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)₂sa testovala v bunkovom supernatante testom ELISA a westernovým prenosom, ako sa opísalo v príklade lg. Výsledky jasne ukázali, že pomocou doxycyklinu, napr. pre jeden zo získaných klonov Fll, indukované bunky produkovali 120 ng/ml fúzneho proteínu v supernatante, zatial čo neindukované bunky produkovali iba základnú hladinu fúzneho proteínu zodpovedajúcu pozadí (pod 1 ng/ml).

Príklad 6

Bunkový ELISA test na secernovaný fúzny proteín

Bunky sa vysiali na 96-jamkové obalené doštičky (Becton Dickinson Biocoat™ poly-D-lyzín, katalóg, č. 35-6461) s hustotou x 104 buniek/jamka v 100 μΐ normálneho média a nechali sa 40 hodín pri 37 °C. 100 μΐ 6% formaldehydu sa nariedilo s DMEM a nechalo 1 hodinu pri 4 °C. Doštičky sa odstredili a 3x opláchli ponorením v PBS obsahujúcom 0,05% Tween™ (prvé dve opláchnutia po minútach a posledné 5 minút).

100 μΐ z dvojkového riedenia supernatantu bunkovej kultúry obsahujúceho fúzny proteín alebo chimérnu A5B7 anti-CEA sa pridalo do každej jamky a doštičky sa inkubovali cez noc pri 4 °C. Doštičky sa potom opláchli, ako sa už uviedlo, a v prípade chimérneho fúzneho proteínu sa pridalo 100 μΐ kozej anti-Iudskej kappa protilátky značenej HRPO (Sigma A 7164) a doštička sa inkubovala 2 hodiny pri teplote miestnosti (detekcia pomocou anti-CPG2 sa použila v prípade myšacieho fúzneho proteínu scFv). Doštičky sa opláchli tak ako je už uvedené a HRP sa detegovala pomocou substrátu OPD (Sigma P-8412). Zafarbenie sa vyvíjalo 5 minút a potom sa vyvíjanie zastavilo 75 μΐ 2M H₂SO₄ a zmerala sa hodnota OD pri 490 nm.

V prípade fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)2» materiál sa produkoval z rekombinantných nádorových buniek Colo320DM (CEAve) . Obsah fúzneho proteínu sa meral pomocou testu CEA ELISA ako už bolo opísané. Zvyšujúce sa množstvo fúzneho proteínu sa pridávalo k radu bukových línií negatívnych na CEA a na CEA pozitívnych parentálnych línií LoVo. Výsledky uvedené na obr. 3 jasne ukazujú, že iba CEA pozitívne línie mali zvýšenú úroveň väzby s rastúcim množstvom pridaného fúzneho proteínu, zatial čo CEA negatívne bunky javili iba väzbu zodpovedajúcu základnej úrovni pozadia. To jasne ukazuje, že sa fúzny proteín špecificky viaže a udržuje sa na CEA pozitívnych LoVo bunkách.

Príklad 7

Rekombinantné nádorové bunky LoVo exprimujúce fúzny proteín protilátka-enzým vykazujú retenciu fúzneho proteínu na bunkovom povrchu

Ukázalo sa, že bunky kolorektálneho nádoru LoVo transfekované génom fúzneho proteínu (A5B7 Fab-CPG2)2 na jednej strane secernujú a na druhej strane tiež zadržujú proteín na svojom povrchu.

Demonštrovalo sa to porovnaním parentálnych buniek LoVo a LoVo buniek secernujúcich fúzny proteín v podmienkach vhodných pre bunkový test ELISA secernovaného fúzneho proteínu (pozri obr. 4) . Podía vývoja zafarbenia sa môže pozorovať, že rekombinantné LoVo bunky zadržujú exprimovaný fúzny proteín (čo sa ukazuje ako vysoká miera zafarbenia). V kontrolnom pokuse s bunkami ColoDM320 exprimujúcimi fúzny proteín test ukázal istú nízku retenciu exprimovaného fúzneho proteínu (pravdepodobne nešpecifickú) a parentálne LoVo bunky mali základnú aktivitu. Pozitívne kontroly, kde sa protilátky viažuce CEA pridali k testovaným bunkám exprimujúcim fúzny proteín a k parentálnym LoVo bunkám, spôsobili pozitívny signál u parentálnych LoVo buniek (čo demonštruje, že CEA je prítomný na parentálnych bunkách), ale žiadny zvýšený signál sa nepozoroval u buniek Colo320DM (ktoré sú CEA negatívne). Rekombinantné LoVo bunky dávali tak silný signál, že pridanie protilátky spôsobilo tak malý rozdiel vzhladom na celkový signál, ktorý bol podstatne vyšší ako v ktoromkoľvek z kontrolných pokusov. Takže sa zdá, že fúzny proteín anti-CEA protilátka-enzým CPG2 secernovaný CEA pozitívnymi nádorovými bunkami sa viaže na povrchu buniek (prostredníctvom CEA), zatiaľ čo ten istý proteín exprimovaný CEA negatívnymi nádorovými bunkami nemá žiadnu takúto väzbu.

Príklad 8

Rekombinantné nádorové bunky LoVo exprimujúce fúzny proteín protilátka-enzým sú in vitro selektívne ničené predliekom

Nádorové bunky HCT116 exprimujúce fúzny proteín protilátkaenzým sú in vitro selektívne ničené predliekom, ktorý je konvertovaný enzýmom na aktívny liek.

Aby sa toto dokázalo, kontrolné netransfekované bunky LoVo a bunky LoVo transfekované génom fúzneho proteínu protilátka-enzým CPG2 inkubované buď s predliekom, 4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutámovou kyselinou (PGP, Blakey a kol., Br. J. Cancer 72: 1083, 1995) alebo zodpovedajúcim liekom uvoľňovaným CPG2, 4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenolom, rovnako ako bolo opísané v príklade 2 pre bunky HCT116.

Transfekované bunky, ktoré exprimovali fúzny proteín protilátka-CPG2, konvertovali predliek PGP na omnoho účinnejší aktívny liek, zatiaľ čo netransfekované bunky LoVo neboli schopné konvertovať predliek.

Táto štúdia ukázala, že transfekcia nádorových buniek s génom pre fúzny proteín protilátka-enzým môže spôsobiť selektívne zabitie nádorových buniek predliekom.

Príklad 9

Založenie xenoštepov nádorov LoVo exprimujúcich fúzny proteín v beztýmusových myšiach

Nádorové rekombinantné bunky LoVo exprimujúce fúzny proteín (A5B7 Fab-CPG2)₂ alebo rekombinantných a parentálnych buniek LoVo sa injikovali subkutánne do beztýmusových nahých myší (10⁷ buniek na myš). Rýchlosti rastu nádorov tak pre 100% rekombinantné ako aj pre zmes 20%:80% rekombinantné:parentálne bunky LoVo sa porovnali s nádormi iba z parentálnych buniek. Nepozorovali sa žiadne významné rozdiely v rastových krivkách jednotlivých bunkových línií, takže sa nemuseli uskutočňovať žiadne korekcie pri porovnávaní týchto bunkových línií. Pozorované rýchlosti rastu nádorov ukázali, že v každom prípade trvalo 12 dní pred tým ako xenoštepový nádor dosiahol veľkosť 10 x 10 mm.

Príklad 10

Stanovenie enzýmovej aktivity vo vzorkách nádorových xenoštepov

Aby bola k dispozícii ako štandard pre testy, pripravila sa štandardná krivka enzýmu CPG2 v 20% homogenáte z normálneho nádoru (nádorové parentálne bunky). Uskutočnilo sa následné riedenie vzoriek 20% homogenátu z normálneho nádoru.

Vyrezané nádorové tkanivo sa vybralo z -80 °C, kde sa uskladnilo (predtým sa ihneď zmrazilo v tekutom dusíku) a ponechalo roztopiť. Odstránili sa všetky zvyšky kože a nádor sa potom skalpelom rozrezal na malé kúsky. Potom sa nádorové tkanivo prenieslo do dopredu zváženej skúmavky a určila sa hmotnosť nádorového tkaniva. K vzorke sa pridal 0,2mM ZnCl₂ tak, aby vnikla 20% (hm./obj.) zmes, tá sa potom homogenizovala a uložila a uložila na ľad. Potom sa pripravilo riedenie vzoriek nádoru (20% homogenátu), t.j. rad neriedený, 1/10, 1/20 a 1/40.

Pre štandardnú krivku sa riedil enzým CPG2 na nasledovné koncentrácie vo výslednom objeme 400 μΐ z každej vzorky rekombinantného nádoru. Po vyrovnaní teplôt na 30 °C sa pridalo k vzorkám 4 μΐ lOmM metotrexátu (MTX). Reakcia sa zastavila presne po 10 minútach pridaním 600 μΐ ľadového metanolu + 0,2% TFA, centrifugovala a supernatant sa odobral. Substrát a produkt v supernatante sa separovali pomocou HPLC (s použitím katexovej kolóny HICROM™ S5SCX-100A, mobilná fáza = 60% metanol, 40% 60mM mravčan amónny/0,1% TFA, detekcia pri 300 nm). Na výpočet enzýmovej aktivity v nádorovom tkanive sa vyniesla štandardná krivka v jednotkách plochy metotrexátového metabolitu (štandardná je, že iba 20 až 30% substrátu sa metabolizuje, aby sa zistilo, že rýchlosť nie je limitovaná substrátom). Testované vzorky sa analyzovali porovnaním jednotkovej plochy riediacim faktorom. Nakoniec prijatím pracovného predpokladu, že 1 ml = 1 g sa výsledky vynásobili 5 (pretože pôvodné riedenie vzoriek bolo na 20% homogenát).

Výsledky získané zo zmesi 20% : 80% rekombinantné : parentálne bunky LoVo exprimujúce fúzny proteín (A5B7 Fab-CPG2)2 ukázali nasledovné: Nádory odobraté 5. Deň mali priemernú enzýmovú aktivitu 0,26 U/g (rozsah 0,18 až 0,36 U/g) a nádory odobraté 12. Deň mali priemernú enzýmovú aktivitu 0,65 U/g (rozsah 0,19 až 11,1 U/g).

Príklad 11

Stanovenie enzýmovej aktivity vo vzorkách plazmy

Aby bola k dispozícii ako štandard pre testy, pripravila sa štandardná krivka enzýmu CPG2 v 20% normálnej plazme s nasledovnými koncentráciami: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 a 1,0 U/ml.

Podobne všetky testované vzorky sa nariedili na 20% plazmu. Ďalšie riedenie týchto vzoriek, t.j. 1/10, 1/20, 1/50, sa uskutočnila s použitím normálneho 20% séra. 200 μΐ alikvoty každého CPG2 štandardu a príslušného riedenia testovanej vzorky sa ekvilibrovali na 30 °C. 2 μΐ lOmM MTX sa pridali ku každej vzorke a dobre premiešali. Reakcia sa zastavila presne po 10 minútach (aby sa zvýšila citlivosť testu, inkubačný čas sa môže predĺžiť na 30 minút) pridaním 500 μΐ ľadového metanolu + 0,2% TFA a produkt sa detegoval pomocou HPLC, ako bolo opísané v príklade 10.

V plazme nebola zjavná žiadna aktivita, okrem výnimočných prípadov, keď hladina enzýmovej aktivity v nádore presiahla 2,0 U/g, pričom v takomto prípade sa plazmatická hladina enzýmu detegovala v rozsahu 0,013 až 0,045 U/ml.

Príklad 12

Protinádorová aktivita PGP predlieku v LoVo nádoroch exprimujúcich fúzny proteín protilátka-CPG2

Rekombinantné nádorové bunky LoVo exprimujúce fúzny proteín (A5B7 Fab-CPG2)2 alebo zmes rekombinantných a parentálnych buniek LoVo sa injikovali do nahých beztýmusových myší ako bolo opísané v príklade 9.

Keď sa nádory s velkosťou 5 až 7 mm v priebehu, bol i.p. injikovaný predliek PGP (3 dávky, v DMSO/0,15M hydrogenuhličitanový pufor, po 40 až 89 mg/kg v 1 hodinových intervaloch).

Protinádorový účinok sa posudzoval podlá veľkosti nádoru meraním primeru v dvoch smeroch a výpočtom objemu nádoru podlá vzorca

Objem = π/6 x D² x d kde D je väčší priemer a d je menší priemer.

Objem nádoru sa potom vyjadril relatívne vzhľadom na objem nádoru na začiatku, keď sa podal predliek, alebo sa môže alternatívne počítať medián objemu nádoru. Protinádorová aktivita sa porovnala s kontrolnými skupinami s transfekovanými alebo netransfekovanými bunkami, ktorým sa podal pufor bez PGP predlieku.

Podávanie PGP do nádorov LoVo vzniknutých z rekombinantných

LoVo buniek alebo zmesi rekombinantných a parentálnych LoVo buniek malo významný protinádorový účinok, ako sa dalo usúdiť podlá zmenšujúcej sa velkosti nádorov liečených s PGP v porovnaní s kontrolami, a tiež podľa toho, že nádory liečené s PGP v porovnaní s nádormi liečenými s PBS potrebovali dlhší čas na dosiahnutie štvornásobku počiatočnej velkosti (obr. 5) .

Oproti tomu podávanie PGP do LoVo nádorov vzniknutých z netransfekovaných buniek nespôsobovalo žiadny významný protinádorový účinok.

Podobné štúdie sa môžu použiť na dokázanie toho, že gén protilátka-enzým vnesený pomocou vhodného vektora do LoVo nádoru vzniknutého z netransfekovaných parentálnych LoVo buniek, pokial sa použije v kombinácii s PGP predliekom, zapríčiňuje významnú protinádorovú aktivitu. Netransfekované bunky LoVo sa injikovali do nahých beztýmusových myší (s dávkou 1 x 10⁷ buniek na myš) . Keď boli nádory s velkosťou 5 až 7 mm v priemere, injikoval sa do nádoru vektor obsahujúci gén fúzneho proteínu protilátka-enzým. Po 1 až 3 dňoch, ktoré sa ponechali na expresiu a naviazanie fúzneho proteínu protilátka-enzým na nádorové LoVo bunky, sa podal PGP predliek rovnako ako už bolo opísané. To zapríčinilo významnú protinádorovú aktivitu v porovnaní s kontrolami.

Príklad 13

Konštrukcia fúzneho proteínu (806.077 Fab-CPG2)₂

Konštrukcie enzýmovej fúzie (806.077 Fab-CPG2)₂ sa plánovala molekulu ktorá má viažucu ľudský súčasne enzýmovú počiatočný konštrukt, ktorý reťazca protilátky 806.077 s cieľom získať bivalentnú karcinoembryonálny antigén (CEA), aktivitu CPG2. Navrhol sa preto obsahoval Fd fragment ťažkého naviazaný svojím C-koncom prostredníctvom flexibilnej peptidovej spojky (G4S)3 k N-koncu polypeptidu CPG2 (obr. 1, ale A5B7 je nahradená 806.077).

Protilátka 806.077 (opísaná v medzinárodnej patentovej prihláške WO 97/42329, Zeneca Ltd.) sa viaže na ľudský karcinoembryonálny antigén (CEA) s veľmi vysokou špecificity. Takže protilátka 806.077 je osobitne vhodná na zacielenie kolorektálneho karcinómu alebo iných buniek nesúcich CEA antigén.

Všeobecne povedané, konjugát protilátka-enzým (alebo protilátkový fragment-enzým) alebo fúzny proteín by mal byť aspoň divalentný, inými slovami by mal byť schopný viazať aspoň 2 antigény asociované s nádormi (ktoré môžu byť zhodné alebo rôzne). V prípade fúzneho proteínu (806.077 Fab-CPG2)2 dochádza po expresii k dimerizácii zložiek rovnako ako u natívneho enzýmu, takže vznikne enzýmová molekula obsahujúca dva protilátkové fragmenty Fab (a je teda bivalentná z hľadiska väzbových miest) a dve molekuly CPG2 (obr. 2a) .

a) Klonovanie génov pre protilátku 806.077

Spôsoby prípravy, izolácia a charakterizácia rekombinantnej myšacej protilátky 806.077F(ab')2 sa publikovali (medzinárodná patentová prihláška WO 97/42329, príklad 7). V príklade 7.5 v uvedenej referencii sa opisuje klonovanie génu pre variabilný úsek protilátky 806.077 do vektorov pBluescript™ KS+. Tieto vektory boli potom zdrojmi génov variabilného úseku protilátky 806.077 pre konštrukciu génov chimérneho ťažkého a lahkého reťazca Fd.

b) Konštrukcia vektorov chimérnej 806.077 protilátky

Medzinárodná patentová prihláška WO 97/42329 v príklade 8 opisuje klonovanie génov chimér ťažkého a ľahkého reťazca Fd protilátky 806.077 do vektorov pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB depozit č. 40799) a pNG4-VHss-HuIgG2CHľ (NCIMB č. 40797). Výsledné vektory sa pomenovali pNG4/Vhss 806.077VH-IgG2CHľ (806.077 chimérny ťažký reťazec Fd') a pNG3/VKss806.077VK-HuCk-NEO (806.077 chimérny ľahký reťazec). Tieto vektory boli zdrojom génov protilátky 806.077 pre konštrukciu fúzneho proteínu 806.077Fab-CPG2.

c) Konštrukcia génu fúzneho proteínu ťažký reťazec 806.077Fd-CPG2

Klonovanie a konštrukcia génu CPG2 sa opísali v príklade 1, v časti c a d. Podobne konštrukcia vektora pNG4/A5B7VHIgG2CNl/CPG2R6, ktorý sa použil pre konštrukciu ťažký reťazec 806.077Fd-CPG2, sa opísala v príklade 1, časti e. Gén pre variabilný úsek ťažkého reťazca 806.077 sa vybral z vektora pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHľ štiepením reštrikčnými enzýmami HindlII a NheI a pás s očakávanou veľkosťou (približne 300 bp) obsahujúci variabilný génový úsek s vyrezal, purifikoval., Rovnaké reštrikčné enzýmy sa použili na štiepenie vektora pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6, aby sa variabilný úsek protilátky A5B7 nahradil 806.077. Po štiepení sa DNA defosforylovala a väčší vektorový pás sa izoloval a purifikoval. Podobne štiepené fragmenty variabilných génových úsekov sa potom ligovali do tohto pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa potom transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa izolovala DNA a klony sa analyzovali reštrikčnými enzýmami na prítomnosť a orientáciu fragmentu a potom sa ešte gén pre fúzny proteín potvrdil sekvenovaním DNA. Našiel sa rad zodpovedajúcich klonov a jeden z nich, nazvaný pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2 sa vybral pre ďalšiu prácu. Sekvencia fúzneho proteínu ťažký reťazec 806.077 Fd-CPG2, ktorá sa takto vytvorila, je uvedená ako sekvencie SEQ ID NO: 25 a NO:

26.

d) Kotransfekcia, tranzientná expresia a analýza fúzneho proteínu

Plazmid pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl/CPG2R6 (kódujúci fúzny proteín protilátkový chimérny Fd - CPG2) a pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (kódujúci protilátkový chimérny lahký reťazec sa kotransfekovali postupom s využitím činidla LIPOFECTIN™ do COS-7 buniek, ako sa opísalo v príklade 1. Analýza fúzneho proteínu protilátka-enzým sa uskutočnila tak isto ako v príklade 1.

HPLC test enzýmovej aktivity jasne dokázal, že je prítomná CPG2 enzýmová aktivita v bunkovom supernatante a obidva väzbové testy CEA-ELISA ukázali väzbu proteínu v zhode s bivalentnou molekulou protilátky 806.077. Skutočnosť, že anti-CEA ELISA detegovaná s anti-CPG2 reportérovou protilátkou jasne vykázal väzbu CEA, čo ukázalo, že nielen protilátka, ale ja fúzny protein protilátka-CPG2 viaže CEA.

Westernový prenos (western blot) s obidvoma reportérovými protilátkami jasne ukázal podjednotky fúzneho proteínu (806.077Fab-CPG2)2 s očakávanou veľkosťou 90 kDa iba s malým stupňom degradácie na menšie produkty (ako je samostatný Fab alebo enzým).

Keďže CPG2 je známy tým, že vykazuje enzýmovú aktivitu iba ako dimér a keďže bol prítomný iba fúzny protein protilátkaenzým, bolo zrejmé, že fúzny protein s veľkosťou 90 kDa (podľa SDS/PAGE) dimerizuje prostredníctvom prirodzeného dimerizačného mechanizmu CPG2 a tvorí molekulu dimérneho fúzneho proteínu protilátka-enzým s veľkosťou 180 kDa (obr. 2a) v natívnych podmienkach pufra. Táto molekula vykazuje tak enzýmovú aktivitu CPG2 ako aj väzbové vlastnosti vzhľadom na CEA antigén, ktoré sa nijako významne nelíšia medzi fúznym proteínom a samostatným enzýmom a protilátkou.

e) Konštrukcia koexpresného vektora fúzneho proteínu (806.077FabCPG2)₂ na použitie na tranzientnú a stabilnú expresiu v bunkových líniách

Pre jednoduchší spôsob transfekcie a priame spojenie obidvoch expresných kaziet s jedným selekčným markerom sa skonštruoval koexpresný vektor pre expresiu fúzneho proteínu z existujúcich vektorov pNG4/VHss806.077VH-IgGCHl/CPG2R6 (kódujúceho fúzny protein protilátkový Fd-CPG2) a pNG3/VKss 806.077VK-HuCK-NEO (kódujúceho ľahký protilátkový reťazec). Plazmid pNG4/VHss806.077VH-IgGCHl/CPG2R6 sa najskôr štiepil reštrikčným enzýmom Seal a pás s linearizovaným vektorom sa vyrezal a purifikoval. Vektorová DNA sa potom štiepila s reštrikčnými enzýmami BglII a BamHI a požadovaný pás (približne

2700 bp) sa vyrezal a purifikoval. Plazmid pNG3/VKss 806.077VHHuCk-NEO sa štiepil s reštrikčným enzýmom BamHI a potom sa DNA defosforylovala a vektorový pás sa purifikoval. Fragment expresnej kazety ťažkého reťazca sa potom ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Orientácia sa overila štiepením s rôznymi reštrikčnými enzýmami a vybrali sa klony s kazetou ťažkého reťazca v rovnakej orientácii ako ľahký reťazec. Tento plazmid sa nazval pNG3-806.077-CPG2/R6-coexp-NEO.

Príklad 14

Konštrukcia fúzneho proteínu (55.lscFv-CPG2)2

Protilátka 55.1 opísaná v Patente US 5665357 rozpoznáva antigén asociovaný s nádorom CA55.1, ktorý je exprimovaný vo väčšine kolorektálnych nádorov a v normálnom tkanive hrubého čreva buď vôbec nie je, alebo je exprimovaný iba veľmi slabo.

Stanovenie sekvencie cDNA ťažkého a Iahkého reťazca protilátky 55.1 sa opísalo v príklade 3 uvedeného patentu. Plazmidový expresný vektor, ktorý umožňuje sekréciu protilátkových fragmentov do periplazmy E. coli používajúci vedúcu sekvenciu pelB (pICI266) sa uložil v súlade s Budapeštianskou zmluvou 11. októbra 1993 v Národnej zbierke s priemyselných a morských baktérií (National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom) ako položka č. NCIMB 40589. Tento vektor sa modifikoval, ako je opísané v Patente US 5665357 a vytvoril sa pICI1646, a tento plazmid sa použil na klonovanie rôznych fragmentov protilátky 55.1, ako sa ďalej opísalo v uvedenom príklade 3, vrátane prípravy konštruktu 55.1scFv, ktorý sa označil pICI1657.

Konštrukt pICI1657 inak známy ako pICI-55.IscFv sa použil ako východiskový materiál na konštrukciu fúzneho proteínu (55.lscFv-CPG2)₂. Gén 55.IScFv sa amplifikoval pomocou oligonukleotidov CME 3270 a CME 3272 (sekvencie SEQ ID NO: 27 a ¢1

NO: 28) z plazmidu pICI1657 ako templátu. Produkt PCR s očakávanou veľkosťou (približne 790 bp) sa purifikoval.

Podobným spôsobom sa amplifikoval gén CPG2 v štandardnej PCR z plazmidu pNG4/A5B7VH-IgG2CHl/CPG2R6 (pozri príklad 1) a oligonukleotidov CME 3274 a CME 3275 (sekvencie SEQ ID NO: 29 a NO: 30) . Produkt PCR s očakávanou veľkosťou (približne 1200 bp) sa purifikoval.

Ďalšia reakcia PCR sa uskutočnila, aby sa spojili dva purifikované PCR produkty. PCR sa uskutočnila pri štandardných podmienkach s rôznym množstvom (medzi 0,5 až 2 μΐ) každého z PCR produktov v 25 cykloch (namiesto zvyčajných 15 cyklov) s oligonukleotidmi CME3270 a CME3275 (sekvencie SEQ ID NO: 27 a NO: 30) . Reakčný produkt s očakávanou veľkosťou (približne 2000 bp) sa vyrezal, purifikoval a eluoval do 20 μΐ H₂O. Tento materiál sa potom štiepil s reštrikčným enzýmom EcoRI a potom sa purifikoval. Vektor pNG4/Vhss806.077VH-IgG2CHl/CPG2 sa pripravil štiepením EcoRI na prijatie uvedeného produktu PCR, DNA vektora sa po štiepení defosforylovala a väčší pás vektorovej DNA sa separoval od menšieho fragmentu. Vektorový pás sa izoloval a purifikoval a potom sa podobne štiepený PCR produkt ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa pripravila DNA, analyzovala sa správna orientácia reštrikčnými enzýmami HindlII/NotI a sekvenovaním sa overilo, či obsahujú sekvenciu fúzneho génu. Našiel sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z nich sa označil pNG4/55.lscFv/CPG2R6. DNA a aminokyselinová sekvencia tohto fúzneho proteínu sú tu ukázané ako sekvencie SEQ ID NO: 31 a NO: 32.

Príklad 15

Modifikácia plazmidu pNG4/55-lscFv/CPG2R6 na uľahčenie výmeny scFv

Počas konštrukcie plazmidu pNG4/55-lscFv/CPG2R6 sa vnieslo jedinečné miesto BspEI (izoschizomér AccIII) zo sekvencie linkera (G3S)3, ktorý je medzi génom pre protilátku a CPG2. Na uľahčenie

klonovania alternatívnych scFv konštruktov sa odstránilo EcoRI miesto na 3' konci génu CPG2 v plazmide pNG4/55-lscFv/CPG2R6, aby sa uľahčilo vkladanie alternatívnych génov scFv protilátky v zhode s čítacím rámcom, tak za plazmidovú signálnu sekvenciu ako aj na 5' koniec CPG2 génu, prostredníctvom klonovania fragmentu EcoRI/BspEI. Táto modifikácia sa dosiahla PCR mutagenézou, kde sa najskôr amplifikoval pNG4/55-lscFv/CPG2R6 s oligonukleotidmi CME 3903 a CME 3906 (sekvencie SEQ ID NO: 33 a NO: 34) . Potom sa pNG4/55-lscFv/CPG2R6 opäť amplifikoval, ale s oligonukleotidmi CME 4040 a CME 3905 (sekvencie SEQ ID NO: 35 a NO: 36) . Prvý PCR pás s očakávanou veľkosťou 420 bp sa purifikoval. Druhá reakcia sa uskutočnila podobne a očakávaný PCR produkt 450 bp sa purifikoval.

Ďalšia reakcia PCR sa uskutočnila, aby sa spojili dva purifikované PCR produkty. PCR sa uskutočnila pri štandardných podmienkach v 15 až 25 cykloch s oligonukleotidmi CME 3905 a CME 3906 (sekvencie SEQ ID NO: 36 a NO: 34) . Reakčný produkt s očakávanou veľkosťou (približne 840 bp) sa purifikoval a potom štiepil s reštrikčnými enzýmami Nôti a Xbal a fragment s očakávanou veľkosťou asi 460 bp sa purifikoval.

Vektor pNG4/55.lscFv/CPG2R6 sa pripravil štiepením s reštrikčnými enzýmami Nôti a Xbal na prijatie uvedeného produktu PCR, DNA vektora sa po štiepení defosforylovala a väčší pás vektorovej DNA sa separoval od menšieho fragmentu. Vektorový pás sa izoloval a purifikoval a potom sa podobne štiepený PCR produkt ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa pripravila DNA analyzovaná na správnu orientáciu reštrikčným enzýmom EcoRI a sekvenovaním sa overilo, či obsahujú sekvenciu modifikovaného fragmentu fúzneho génu. Našiel sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z nich sa označil pNG4/55.lscFv/CPG2R6/delEcoRI. Táto mutácia odstránila miesto EcoRI, ktoré bolo na 3' konci génu CPG3 a súčasne vniesla ďalší stop kodón. DNA sekvencia génu fúzneho proteín až po, a vrátane oboch stop kodónov, je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 37.

Príklad 16

Konštrukcia génu protilátky 806.077scFv

806.077scFv sa vytvoril pomocou vektorov pNG4/VHss806.077VHIgG2CHľ a pNG3/VKss806.77VK-HuCK-NEO, ktoré boli zdrojmi génov variabilných úsekov 806.077 VH a VK. Gén 806.077VH sa amplifikoval z pNG4/VHss806.077VH-IgG2CHl pri štandardných podmienkach PCR s oligonukleotidmi CME 3260 a CME 3266 (sekvencie SEQ ID NO: 39 a NO: 40). 806.077VK sa amplifikoval z pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO s oligonukleotidmi CME 3262 a CME 3267 (sekvencie SEQ ID. No: 41 a NO: 42). PCR produkty VH a VK sa purifikovali.

Ďalšia reakcia PCR sa uskutočnila, aby sa spojili dva purifikované PCR produkty. PCR sa uskutočnila pri štandardných podmienkach s rôznym množstvom (medzi 0,5 až 2 μΐ) každého z PCR produktov v 15 až 25 cykloch (namiesto zvyčajných 15 cyklov) s oligonukleotidmi CME3260 a CME 3262 (sekvencie SEQ ID NO: 39 a NO: 41) . Reakčný produkt očakávanej veľkosti (približne 730 bp) sa vyrezal, purifikoval a štiepil reštrikčnými enzýmami Ncol a Xhol a potom sa pás s fragmentom očakávanej veľkosti 720 bp purifikoval.

Plazmid pICI1657 (inak známy ako pICI-55.IscFv) sa ďalej modifikoval vložením dvojvláknovej DNA kazety vytvorenej z dvoch oligonukleotidov CME3143 (sekvencie SEQ ID NO:: 45 a No.: 46) medzi existujúce dve reštrikčné miesta Xhol a EcoRI štandardným klonovacím postupom, čím sa vytvoril vektor pICI26655.IscFvtag/his (DNA sekvencia výsledného génu 55.IscFvtag/his je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 47) . Vektor sa pripravil štiepením reštrikčnými enzýmami Ncol a Xhol pre prijatie uvedeného produktu PCR, DNA vektora sa po štiepení defosforylovala a väčší pás vektorovej DNA sa separoval od menšieho fragmentu. Vektorový pás sa izoloval a purifikoval a potom sa podobne naštiepený PCR produkt ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa pripravená DNA analyzovala reštrikčným enzýmom EcoRI, či obsahujú vložený modifikovaný fragment a vhodné klony sa potom sekvenovali, aby sa overili sekvenčné zmeny. Našiel sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z nich bol označený pICI266/806.077scFvtag/his (alternatívne známy ako pICl266806.077VH/VLscFvtag/his). DNA a proteínová sekvencia sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 25 a NO: 26.

Príklad 17

Konštrukcia fúzneho proteínu (806.077scFv-CPG2)

Plazmid pICl266/806.077scFvtag/his sa použil ako zdroj 806scFv. Gén sa amplifikoval pomocou oligonukleotidov CME 3907 a CME 3908 (sekvencie SEQ ID NO: 48 a NO: 49) a pás očakávanej veľkosti sa purifikoval. Fragment sa naštiepil reštrikčnými enzýmami EcoRI a BspEI a potom sa pás očakávanej veľkosti 760 bp purifikoval.

Plazmid pNG4/55.lscFv/CPGR6/delEcoRI sa pripravil štiepením reštrikčnými enzýmami EcoRI a BspEI na prijatie uvedeného produktu PCR, DNA vektora sa po štiepení defosforylovala a väčší pás vektorovej DNA sa separovala od menšieho fragmentu. Vektorový pás sa izoloval a purifikoval a potom sa podobne ako naštiepený PCR produkt ligoval do pripraveného vektora a ligačnou zmesou sa transformovala E. coli. Zo získaných klonov sa pripravená DNA analyzovala reštrikčným enzýmom EcoRI, či obsahujú vložený modifikovaný fragment. Vhodné klony sa potom sekvenovali, aby sa overili génové sekvencie. Našiel sa rad klonov so správnou sekvenciou a jeden z nich sa označil pNG4/806lscFv/CPG2R6/delEcoRI. DNA a proteínová sekvencia génu fúzneho proteínu 806IscFvtag/CPG2R6 sú uvedené ako sekvencie SEQ ID NO: 50 a NO: 51.

Príklad 18

Kontransfekcia a tranzientná expresia fúznych proteínov protilátka-CPG2

Ako sa už opísalo v príklade 1, plazmidy kódujúce iné fúzne proteíny sa môžu transfekovať štandardným spôsobom, aby sa získala tranzientná expresia kódovaného fúzneho proteínu v bunkách COS-7. V prípade fúznych proteínov (Fab-CPG2)2 sa môže použiť kotransfekcia vhodných plazmidov alebo transfekciu koexprimujúcich proteínov. Podobne samotné expresné plazmidy fúznych proteínov (scFv-CPG2)2 sa môžu transfekovať rovnakým spôsobom. V každom prípade pre jednotlivú transfekciu je treba použiť 4mg príslušnej DNA.

Príklad 19

Génový vypínač proteínovej expresie

Ako sa už opísalo v príklade 1, na expresiu fúznych proteínov sa môže použiť prísne kontrolovaný, ale indukovatelný vypínací systém, ako sú napr. TET on alebo TET off (pozri Grossen a kol., 1995, Science 268: 1766-1769) alebo vypínač ekdyzon/muristeron A (No, D. a kol., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3346-3351). Vhodné spôsoby a klonovacie stratégie opísané v príklade 5 sa môžu použiť na fúzie protilátkový Fab-enzým vyžadujúci pre expresiu sekvenciu IRES. Vloženie vhodnej génovej kazety do vypínateľného expresného vektora sa môže použiť, ak je produktom fúzie jediný polypeptidový reťazec ako je to napr. v konštruktoch scFv-enzým.

Príklad 20

Stanovenie vlastnosti fúznych proteínov protilátka-enzým vylučovaných bunkami COS7

Supernatant buniek COS7 sa môže analyzovať na prítomnosť protilátkových fúznych proteínov postupom, ktorý sa opísal v príklade lg. Podobne sa môže použiť exprimovaný fúzny proteín a CPG2 predliek v in vitro teste cytotoxicity, ako sa opísalo v príklade lh.

HPLC test enzýmovej aktivity CPG2 jasne určí, či je prítomná CPG2 enzýmová aktivita v bunkovom supernatante a obidva väzbové testy CEA-ELISA s anti-CPG2 reportérovou protilátkou potvrdia väzbu proteínu v zhode s bivalentnou molekulou protilátky A5B7 a ukážu, že fúzny proteín protilátka-CPG2 (nielen samotná protilátková zložka) viaže CEA.

Westernový prenos (Western blot) s obidvoma reportérovými protilátkami jasne ukáže podjednotky fúzneho proteínu v očakávanej velkosti. Keďže CPG2 je známy tým, že vykazuje enzýmovú aktivitu iba ako dimér a keďže je prítomný iba fúzny proteín protilátka-enzým, je zrejmé, že fúzny proteín dimerizuje prostredníctvom prirodzeného dimerizačného mechanizmu CPG2 a tvorí molekulu dimérneho fúzneho proteínu v natívnych podmienkach pufra. Navyše potom molekula vykazuje tak enzýmovú aktivitu CPG2, ako aj väzbové vlastnosti k CEA antigénu, ktoré sa nijako významne nelíšia medzi fúznym proteínom a samostatným enzýmom a protilátkou. Výsledky získané v teste cytotoxicity ukazujú, že fúzny proteín spoločne s predliekom spôsobil minimálne rovnaký úhyn buniek a viedol k nižšiemu počtu buniek na konci testu než rovnaké množstvo konjugátu A5B7F(ab') 2-CPG2 (s rovnakým predliekom). Odumieranie buniek (vyššie ako bazálna hladina kontroly) sa objavuje iba keď sa predliek konvertuje na aktívny liek enzýmom CPG2 (a keďže bunky boli opláchnuté, aby sa odstránil nenaviazaný proteín, iba enzým viazaný na bunky ostal v štádiu, keď sa pridal predliek). Takže taký test jasne ukazuje, že minimálne rovnako ostáva naviazané tak fúzneho proteínu (A5B7CPG2R6)2 ako aj konvenčného konjugátu A5B7F(ab')2-cpg2, keď dochádza k vyššiemu stupňu odumretia buniek (pravdepodobne kvôli vyššej miere konverzie predlieku na liek).

Príklad 21

Stanovenie in vitro a in vivo vlastností fúznych proteínov protilátka-enzým exprimovaných rekombinantnými nádorovými bunkami

Príprava línií nádorových buniek exprimujúcich fúzne proteíny sa môže uskutočniť tak, ako bola opísaná v príklade 4.

Retencia (zadržanie) rekombinantných nádorových proteín protilátka-enzým sa príklade 7. Selektívne transfekovaných fúznym fúzneho proteínu na povrchu buniek LoVo exprimujúcich fúzny dá dokázať spôsobmi opísanými v zabíjanie nádorových buniek LoVo proteínom protilátka-enzým CPG2 predliekom, ktorý je konvertovaný enzýmom na aktívny liek, sa môže demonštrovať postupom opísaným v príklade 8. Založenie xenoštepov nádorov LoVo exprimujúcich fúzny proteín u beztýmusových myší sa môže uskutočniť podlá príkladu 9. Stanovenie enzýmovej aktivity vo vzorkách nádorových xenoštepov sa môže uskutočniť tak, ako je opísané v príklade 10.

Stanovenie enzýmovej aktivity vo vzorkách plazmy sa uskutočňuje postupom opísaným v príklade 11. Protinádorová aktivita PGP predlieku v LoVo nádoroch exprimujúcich fúzny proteín protilátka-CPG2 sa môže hodnotiť postupom podlá príkladu 12.

Výsledky z týchto experimentov slúžia na dôkaz toho, že fúzny proteín anti-CEA protilátka-enzým CPG2 secernovaný CEA pozitívnymi nádorovými bunkami sa viaže na povrch buniek (prostredníctvom CEA), zatial čo ten istý proteín exprimovaný CEA negatívnymi nádorovými bunkami nevykazuje žiadnu takú väzbu.

Výsledky tiež dokazujú, že transfekované bunky, ktoré exprimovali fúzny proteín protilátka-CPG2, konvertovali predliek PGP na omnoho účinnejší liek, zatial čo netransfekované bunky LoVo neboli schopné konvertovať predliek. Takže transfekované LoVo bunky sú viac ako 100 x citlivejšie k PGP predlieku v zmysle usmrtenia buniek než netransfekované bunky LoVo, čo ukazuje, že transfekcia nádorových buniek génom pre fúzny proteín protilátkaenzým môže spôsobiť selektívne zabitie nádorových buniek predliekom.

Ί4

Podanie PGP do LoVo nádorov založených z rekombinantných LoVo buniek alebo zmesi rekombinantných LoVo buniek s parentálnymi LoVo bunkami môže zapríčiniť významné protinádorové pôsobenie, ako sa môže usúdiť podía zmenšujúcej sa veľkosti nádorov liečených PGP v porovnaní s nádormi, do ktorých sa podával samotný pufor, a význame dlhšieho času, ktorý potrebujú nádory liečené PGP na dosiahnutiu 4-násobku svojej pôvodnej veľkosti. Oproti tomu podanie PGP do LoVo nádorov vytvorených z netransformovaných buniek nespôsobuje žiadny protinádorový účinok.

Podobné štúdie sa môžu uskutočňovať na demonštráciu toho, že gén protilátka-enzým vnesený prostredníctvom vhodného vektora do nádoru LoVo vyvinutého z netransformovaných parentálnych buniek, pokiaľ sa použije v kombinácii s PGP predliekom, zapríčiňuje významnú protinádorovú aktivitu. Takže netransfekované LoVo bunky sa injikujú do beztýmusových nahých myší (lxlO⁷ buniek na myš) a hneď ako nádor dosiahne veľkosť 5 až 7 mm v priemere, injikuje sa do nádoru vektor obsahujúci gén fúzneho proteínu protilátkaenzým. Po 1 až 7 dňoch, ktoré sú potrebné na to, aby sa fúzny protein protilátka-enzým exprimoval a naviazal na nádorové LoVo bunky, podá sa PGP predliek, ako sa už opísalo. To zapríčiňuje významný protinádorový účinok v porovnaní s kontrolnými myšami, ktoré dostali iba pufor PGP predlieku.

Príklad 22

Príprava fúzneho proteínu (myši A5B7Fab-CPG2)2

Myšací fúzny protein (myší A5B7Fab-CPG2)2) sa exprimoval z buniek COS-7 a CHO v podstate rovnako, ako sa opísalo v časti D) príkladu 48 medzinárodnej patentovej prihlášky WO 97/42329 (Zeneca Ltd., publikovaná 13. novembra 1997) tak, že sa klonovali gény pre ľahký reťazec A5B7 a Fd A5B7 spojené cez svoj C-koniec prostredníctvom spojky (G4S)3 k CPG2 v koexpresnom vektore pEE14.

Myšací ľahký reťazec A5B7 sa izoloval z pAF8 (opísaný v časti g) príkladu 5 Medzinárodnej patentovej vyhlášky WO

96/20011, Zeneca Ltd.). Plazmid pAF8 sa štiepil EcoRI a výsledný fragment s veľkosťou 732 bp sa izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli. Tento fragment sa klonoval do pEE14 (opísal Bebbington v Methods: Companion to Methods in Enzymology, 1991, 2, 136-145) podobne naštiepeného EcoRI a výsledným plazmidom sa transformovali bunky E. coli DH5a. Transformované bunky sa vysiali na misky s L agarom a ampicilínom (100 pg/ml). Kloň obsahujúci plazmid so správnou sekvenciou a správnou orientáciou fragmentu sa ešte potvrdil sekvenovaním DNA (sekvencia SEQ ID NO: 57) a tento plazmid sa nazval pEE14/A5B7muVkMuCk. Aminokyselinová sekvencia kódovanej signálnej sekvencie (aminokyselinové zvyšky 1 až 22) a myšací lahký reťazec (aminokyselinové zvyšky 23 až 235) sú uvedené ako sekvencia SEQ ID NO: 58.

Myšací gén Fd-CPG2 sa pripravil z variantu R6 génu CPG2 (opísané v príklade 1 tejto prihlášky) a myšacia A5B7fd sekvencia z pAFl (opísané v časti d) príkladu 5 medzinárodnej patentovej prihlášky WO 96/20011, Zeneca Ltd.). PCR reakcia s oligonukleotidmi so sekvenciou SEQ ID NO: 53 a NO: 54 na PpAFl poskytla fragment velký 247 bp. Ten sa štiepil s HindlII a BamHI a klonoval sa do rovnako štiepeného pUC19. Výsledným plazmidom sa transformovali bunky E. coli DH5a. Transformované bunky sa vysiali na misky s L agarom a ampicilínom (100 pg/ml). Kloň obsahujúci plazmid so správnou sekvenciou sa nazval pUC19/muCHl/NcoI-AccIII(Fd). Druhá PCR s oligonukleotidmi so sekvenciou SEQ ID NO: 55 a NO: 56 na plazmide pNG/VKss/CPG2/R6neo (pozri príklad 1) amplifikovala fragment velký 265 bp, ktorý sa štiepil s HindlII a EcoRI a klonoval sa do rovnako štiepeného plazmidu pUC19, čím vznikol plazmid pUC19/muCHl-spojkaCPG2/AccIII-SacII.

Plazmid pUC19/muCHl-spojka-CPG2/AccIII(Fd) sa štiepil s HindlII a AccIII a výsledný fragment velký 258 bp sa izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli. Tento fragment sa klonoval do plazmidu pUC19/muCHl-spojka-CPG2/AccIII-SacII štiepeného s HindlII a AccIII, čím vznikol plazmid pUC19/muCHl-spojkaCPG2/NcoI-SacII. Fragment velký 956 bp sa izoloval z pNG/VkSS/CPG2/R6-neo štiepením so Sací a EcoRI. Ten sa potom klonoval do rovnako štiepeného pUC19/muCHl-spojka-CPG2/NcoISacII, čím vznikol plazmid pUC19/muCHl-spojka-RC/CPG2(R6). Úplný génový konštrukt sa pripravil izoláciou fragmentu HindlII a Ncol štiepeného pUCl9/muCHl-spojka-RC/CPG2(R6) . Výsledným plazmidom sa transformovali bunky E. coli DH5a. Transformované bunky sa vysiali na misky s L agarom a ampicilínom (100 gg/ml). Kloň obsahujúci plazmid so správnou sekvenciou a správnou orientáciou fragmentu sa ešte potvrdil sekvenovaním DNA (sekvencia SEQ ID NO: 59) a tento plazmid sa nazval pUCl9/muA5B7RC/CPG2(R6). Aminokyselinová sekvencia kódovanej signálnej sekvencie (aminokyselinové zvyšky 1 až 19) a myšacia fd-spojka-CPG2 aminokyselinové zvyšky 20 až 647) sú tu ukázané ako sekvencia SEQ ID NO: 60. Alternatívne sa môže sekvencia CPG2 opísaná v príklade 1 získať úplnou syntézou génu a konvertovať na variant R6 spôsobom opísaným v časti d) príkladu 1 tejto prihlášky. V takomto prípade sa báza C v polohe 933 v sekvencii SEQ ID NO: 59 zmení na G, pritom aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 60 zostane nezmenená.

Na expresiu vo vektore pEE14 sa gén najskôr klonuje do pEE6 (to je derivát pEE6.hCMV - pozri Stephens a Cockett, 1989, Nucleic Acids Research 17, 7110, kde miesto HindlII proti smeru transkripcie od CMV promótora sa zmenilo na miesto BglII). Plazmid pUC19/muA5B7RC/CPG2(R6) sa štiepil s HindlII a EcoRI a výsledný fragment veľký 1974 bp sa izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli. Tento fragment sa potom klonoval do HindlII a EcoRI štiepeného pEE16 a transformovali sa ním bunky E. coli DH5a, čím vznikol plazmid pEE6/muA5B7RC/CPG2(R6) . Koexpresný vektor pEE14 sa pripravil tak, že sa najskôr štiepil pEE6/muA5B7RC/CPG2(R6) s BglII a BamHI a fragment veľký 4320 bp sa izoloval elektroforézou v 1% agarózovom géli. Tento fragment sa potom klonoval do BglII a BamHI štiepeného s pEE14/A5B7muVkmuCk. Výsledným plazmidom sa transformovali bunky E. coli DH5a, čím vznikol plazmid pEE6/muA5B7RC/CPG2(R6). Transformované bunky sa vysiali na misky s L agarom a ampicilínom (100 gg/ml). Kloň obsahujúci plazmid s správnou sekvenciou a správnou orientáciou fragmentu sa ešte potvrdil sekvenovaním DNA (sekvencia SEQ ID NO: 59) a tento plazmid sa nazval pEE14/muA5B7RC/CPG2(R6).

Na expresiu myšacej (A5B7Fab-CPG2)2 sa použil plazmid pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6) na transfekciu buniek COS-7 a CHO, ako je opísané v príklade 48 medzinárodnej patentovej prihlášky WO 97/42329 (Zeneca Ltd., publikovanej 13. novembra 1997). Supernatanty z kultivovaných buniek COS-T a CHO sa testovali na aktivitu ako sa opísalo v príklade 1 tejto prihlášky a vykazovali väzbovú aktivitu CEA a enzýmovú aktivitu CPG2.

Príklad 23

Farmaceutický prípravok

Nasledovný príklad ilustruje výhodnú farmaceutickú liekovú formu obsahujúcu génový konštrukt podía predkladaného vynálezu, ktorá sa môže použiť na terapiu v kombinácii s vhodným predliekom.

Ide o sterilný vodný roztok, pre parentálnu injekciu alebo priamu injekciu do nádorového tkaniva, obsahujúcu 10⁷ až 10¹¹adenovírusových častíc, ktoré obsahujú génový konštrukt opísaný v príklade 1. Po 3 až 7 dňoch sa podajú tri dávky predlieku po 1 g vo forme sterilného roztoku v hodinových intervaloch. Predliek sa vybral zo skupiny obsahujúcej N-(4-[Ν,Ν-bis(2-jodoetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-[4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovej a N-{4- [Ν,Ν-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu alebo ich farmaceutický prijateľné soli.

Zoznam sekvencii (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 1:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 1:

GGGAATTCCT CGAGGAGCTC 21 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 2:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 27 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 2:

CCGGGGAGCT CCTCGCGGAA TTCCCGC 27 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 3:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 3:

CAGAAGCCG ACAACGTG 18 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 4:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 4:

CGAGGCCTTG CCGGTGATCT GGACCTGCAC GTAGGCGAT 39 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO:5:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 63 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 5:

GGGGATGATG TTCGAGACCT GGCCGGCCTT GGCGATGGTC CACTGGAAGC 50

GCAGGTTCTT CGC 63 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 6:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 6:

CTTGCCGGCG CCCAGATC 18 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 7:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 7:

GTCTCGAACA TCATCCCC 18 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 8:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 8:

ATCACCGGCA AGGCCTCG 18 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 9:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1236 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 9:

ATGGATTTTC	AAGTGCAGAT	TTTCAGCTTC	CTGCTAATCA	GTGCTTCAGT	CATAATGTCC	60
CGCGGGCAGA	AGCGCGACAA	CGTGCTGTTC	CAGGCAGCTA	CCGACGAGCA	gccggccgtg	120
ATCAAGACGC	TGGAGAAGCT	GGTCAACATC	GAGACCGGCA	CCGGTGACGC	CGAGGGCATC	180
GCCGCTGCGG	GCAACTTCCT	CGAGGCCGAG	CTCAAGAACC	TCGGCTTCAC	ggtcacgcga	240
AGCAAGTCGG	CCGGCCTGGT	GGTGGGCGAC	AACATCGTGG	GCAAGATCAA	GGGCCGCGGC	300
GGCAAGAACC	TGCTGCTGAT	GTCGCACATG	GACACCGTCT	ACCTCAAGGG	CATTCTCGCG	360
AAGGCCCCGT	TCCGCGTCGA	AGGCGACAAG	GCCTACGGCC	CGGGCATCGC	CGACGACAAG	420
GGCGGCAACG	CGGTCATCCT	GCACACGCTC	AAGCTGCTGA	aggaatacgg	CGTGCGCGAC	480
TACGGCACCA	TCACCGTGCT	GTTCAACACC	GACGAGGAAA	agggttcctt	CGGCTCGCGC	540
GACCTGATCC	AGGAAGAAGC	CAAGCTGGCC	GACTACGTGC	TCTCCTTCGA	GCCCACCAGC	600
GCAGGCGACG	AAAAACTCTC	GCTGGGCACC	TCGGGCATCG	CCTACGTGCA	GGTCCAGATC	660
ACCGGCAAGG	CCTCGCATGC	CGGCGCCGCG	CCCGAGCTGG	GCGTGAACGC	GCTGGTCGAG	720
GCTTCCGACC	TCGTGCTGCG	CACGATGAAC	ATCGACGACA	AGGCGAAGAA	CCTGCGCTTC	780
CAGTGGACCA	TCGCCAAGGC	CGGCCAGGTC	TCGAACATCÄ	TCCCCGCCAG	CGCCACGCTG	840
AACGCCGACG	TGCGCTACGC	GCGCAACGAG	GACTTCGACG	CCGCCATGAA	GACGCTGGAA	900
GAGCGCGCGC	AGCAGAAGAA	GCTGCCCGA6	GCCGACGTGA	AGGTGATCGT	CACGCGCGGC	960
CGCCCGGCCT	TCAATGCCGG	CGÄAGGCGGC	AAGAAGCTGG	TCGACAAGGC	GGTGGCCTAC	1020
TACAAGGAAG	CCGGCGGCAC	GCTGGGCGTG	GAAGAGCGCA	CCGGCGGCGG	CACCGACGCG	1080
GCCTACGCCG	CGCTCTCAGG	CAAGCCAGTG	ATCGAGAGCC	TGGGCCTGCC	GGGCTTCGGC	1140
TACCACAGCG	ACAAGGCCGA	GTACGTGGAC	ATCAGCGCGA	TTCCGCGCCG	CCTGTACATG	1200
GCTGCGCGCC	TGATCATGGA	TCTGGGCGCC	GGCAAG			1236

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 10: (i) charakteristika sekvencie:

	(A) (B) (C) (D)	dĺžka: 412 aminokyselín typ: aminokyselina typ vlákna: jednoduché topológia: lineárna
(ii)	typ	molekuly: proteín
(xi)	opis sekvencie SEQ ID NO: 10:

Met

Asp

Phe

Gin

Val

Gin

íle

Phe

Ser

Phe

Leu

íle

Ser

Ala

Ser

1

5

10

1S

Val

íle

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Lys

Arg

Asp

Asn

Val

Leu

Phe

Gin

Ala

20

25

30

Ala

Thr

Asp

Glu

Gin

Pro

Ala

Val

íle

Lys

Thr

Leu

Glu

Lys

Leu

Val

35

40

45

Asn

íle

Glu

Thr

Gly

Thr

Gly

Asp

Ala

Glu

Gly

íle

Ala

Gly

50

55

60

Asn

Phe

Leu

Glu

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

Leu

Gly

Phe

Thr

Val

Thr

Arg

65

70

75

80

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly

Leu

Val

Gly Asp

Asn

íle

Val

Gly

Lys

íle

85

90

95

Lys

Gly

Arg

Gly Gly Lys

Asn

Leu

Met

Ser

His

Met

Asp

Thr

100 105 110

Val Tyr Leu Lys Gly	íle Leu Ala Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly
	115	120	125
Asp	Lys Ala Tyr Gly 130	Pro Gly íle 135	Ala Asp Asp Lys Gly Gly Asn Ala 140
Val 145	íle Leu His Thr	Leu Lys Leu 150	Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp 155 160
Tyr	Gly Thr íle Thr 165	Val Leu Phe	Asn Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser 170 175
Phe	Gly Ser Arg Asp 180	Leu íle Gin	Glu Glu Ala Lys Leu Ala Asp Tyr 185 190
Val	Leu Ser Phe Glu 195	Pro Thr Ser 200	Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser Leu 205
Gly	Thr Ser Gly íle 210	Ala Tyr Val 215	Gin Val Gin íle Thr Gly Lys Ala 220
Ser 225	His Ala Gly Ala	Ala Pro Glu 230	Leu Gly Val Asn Ala Leu Val Glu 235 240
Ala	Ser Asp Leu Val 245	Leu Arg Thr	Met Asn íle Asp Asp Lys Ala Lys 250 255
Asn	Leu Arg Phe Gin 260	Trp Thr íle	Ala Lys Ala Gly Gin Val Ser Asn 265 270
íle	íle Pro Ala Ser 275	Ala Thr Leu 280	Asn Ala Asp Val Arg Tyr Ala Arg 285
Asn	Glu Asp Phe Asp 290	Ala Ala Met 295	Lys Thr Leu Glu Glu Arg Ala Gin 300

Gin	Lys	Lys Leu	Pro Glu	Ala Asp Val Lys Val íle Val	Thr Arg Gly
305			310	315	320
Arg	Pro	Ala Phe	Asn Ala	Gly Glu Gly Gly Lys Lys Leu	Val Asp Lys
			32S	330	335
Ala	Val	Ala Tyr	Tyr Lys	Glu Ala Gly Gly Thr Leu Gly	Val Glu Glu
		340		345	350
Arg	Thr	Gly Gly Gly Thr	Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu	Ser Gly Lys
		355		360 365
Pro	Val	íle Glu	Ser Leu	Gly Leu Pro Gly Phe Gly Tyr	His Ser Asp
	370			375 380
Lys	Ala	Glu Tyr	Val Asp	íle Ser Ala íle Pro Arg Arg	Leu Tyr Met
385			390	395	400
Ala	Ala	Arg Leu	íle Met	Asp Leu Gly Ala Gly Lys

405 410 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 11 (i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 21 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 11:

CCACTCTCAC AGTGAGCTCG G (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 12:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 55 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 12:

ACCGCTACCG CCACCACCAG AGCCACCACC GCCAACTGTC TTGTCCACCT TGGTG 55 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 13:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 18 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 13:

ACCCCCTCTA GAGTCGAC 18 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 14:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 54 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 14:

TCTGGTGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTG 54 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 15:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1929 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 15:

ATGGÄGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGTAT CCAGTGTGAG 60

GTGAAGCTGG TGGAGTCTGG AGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGTTCTCT GAGACTCTCC 120

TGTGCAACTT CTGGGTTCAC CTTCACTGAT TACTACATGA ACTGGGTCCG CCAGCCTCCA 180

GGAAAGGCAC TTGAGTGGTT GGGTTTTATT GGAAACAAAG CTAATGGTTA CACAACAGAG 240

TACAGTGCAT CTGTGAAGGG TCGGTTCACC ATCTCCAGAG ATAAATCCCA AAGCATCCTC 300

TATCTTCAAA TGAACACCCT GAGAGCTGAG GACAGTGCCA CTTATTACTG TACAAGAGAT 360

AGGGGGCTAC GGTTCTACTT TGACTACTGG GGCCAAGGCA CCACTCTCAC AGTGAGCTCG 420

GCTAGCACCA AGGGACCATC GGTCTTCCCC CTGGCCCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG 480

AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG 540

TGGAACTCAG GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA 600

GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTCGTGACG GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 660

TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC AGTTGGCGGT 720

GGTGGCTCTG GTGGTGGCGG TAGCGGTGGC GGGGGTTCCC AGAAGCGCGA CAACGTGCTG 780

TTCCAGGCAG CTACCGACGA GCAGCCGGCC GTGATCAAGA CGCTGGAGAA GCTGGTCAAC 840

ATCGAGACCG GCACCGGTGA CGCCGAGGGC ATCGCCGCTG CGGGCAACTT CCTCGAGGCC 900

GAGCTCAAGA ACCTCGGCTT CACGGTCACG CGAAGCAAGT CGGCCGGCCT GGTGGTGGGC 960

GACAACATCG TGGGCAAGAT CAAGGGCCGC GGCGGCAAGA ACCTGCTGCT GATGTCGCAC 1020

ATGGACACCG TCTACCTCAA GGGCATTCTC GCGAAGGCCC CGTTCCGCGT CGAAGGCGAC 1080

AAGGCCTACG GCCCGGGCAT CGCCGACGAC AAGGGCGGCA ACGCGGTCAT CCTGCACACG 1140

CTCÄAGCTGC TGAAGGAATA CGGCGTGCGC GACTACGGCA CCATCACCGT GCTGTTCAAC 1200

ACCGACGAGG AAAAGGGTTC CTTCGGCTCG CGCGACCTGA TCCAGGAAGA AGCCAAGCTG 1260

GCCGACTACG TGCTCTCCTT CGAGCCCACC AGCGCAGGCG ACGAAAAACT CTCGCTGGGC 1320

ACCTCGGGCA TCGCCTACGT GCAGGTCCAG ATCACCGGCA AGGCCTCGCA TGCCGGCGCC 1380

GCGCCCGAGC TGGGCGTGAA CGCGCTGGTC GAGGCTTCCG ACCTCGTGCT GCGCACGATG 1440

AACATCGACG ACAAGGCGAA GAACCTGCGC TTCCAGTGGA CCATCGCCAA GGCCGGCCAG 1500

GTCTCGAACA TCATCCCCGC CAGCGCCACG CTGAACGCCG ACGTGCGCTA CGCGCGCAAC 1560

GAGGACTTCG ACGCCGCCAT GAAGACGCTG GAAGAGCGCG CGCAGCAGAA GAAGCTGCCC 1620

GAGGCCGACG TGAAGGTGAT CGTCACGCGC GGCCGCCCGG CCTTCAATGC CGGCGAAGGC 1680

GGCAAGAAGC TGGTCGACAA GGCGGTGGCC TACTACAAGG AAGCCGGCGG CACGCTGGGC 1740

GTGGAAGAGC GCACCGGCGG CGGCACCGAC GCGGCCTACG CCGCGCTCTC AGGCAAGCCA 1800

GTGATCGAGA GCCTGGGCCT GCCGGGCTTC GGCTACCACA GCGACAAGGC CGAGTACGTG 1860

GACATCAGCG CGATTCCGCG CCGCCTGTAC ATGGCTGCGC GCCTGATCAT GGATCTGGGC 1920

GCCGGCAAG 1929 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 16:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 643 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 16:

Met i

Glu

Leu

Trp

Leu

Asn

Trp

íle

Phe

Leu

Val

Thr

Leu

Asn

Gly

1

5

10

15

íle

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu

Val

Glu

Ser

Gly Gly Gly

Leu

Val

Gin

20

25

30

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Asp

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

íle

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly Tyr

Thr

Glu

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

85

90

95

Gin

Ser

íle

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

115 Gly

Gin

Gly

Thr

120 Leu

Thr

Val

Ser

125 Ala

Ser

Thr

Lys

130

135

140

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

Pro

Cys

Ser

Arg

Ser

Thr

Ser

Glu

145

150

155

160

Ser

Thr

Ala

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Asp

Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

165

170

175

Val

Thr

Val

Ser

Trp

Asn

Ser

Gly

Ala

Leu

Thr

Ser

Gly

Val

His

Thr

180

185

190

Phe

Pro

Ala

Val

Leu

Gin

Ser

Gly

Leu

Tyr

Ser

Leu

Ser

Val

195

200

205

Val

. Thr

Val

Pro

i Sex

Ser

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Thr

Tyr

Thr

Cys

Asn

210

215

220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Lys Arg

245 250 255

Asp Asn Val Leu Phe Gin Ala Ala Thr Asp Glu Gin Pro Ala Val íle
	260	265	270
Lys	Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn	íle Glu Thr	Gly Thr Gly Asp Ala
	275 280		285
Glu	Gly íle Ala Ala Ala Gly Asn	Phe Leu Glu	Ala Glu Leu Lys Asn
	290 295		300
Leu	Gly Phe Thr Val Thr Arg Ser	Lys Ser Ala	Gly Leu Val Val Gly
305	310	315	320
Asp	Asn íle Val Gly Lys íle Lys	Gly Arg Gly	Gly Lys Asn Leu Leu
	325	330	335
Leu	Met Ser His Met Asp Thr Val	Tyr Leu Lys	Gly íle Leu Ala Lys
	340	345	350
Ala	Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp	Lys Ala Tyr	Gly Pro Gly íle Ala
	355 360		365
Asp	Asp Lys Gly Gly Asn Ala Val	íle Leu His	Thr Leu Lys Leu Leu
	370 375		380
Lys	Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr Gly Thr íle	Thr Val Leu Phe Asn

385 390 395 400

Thr

Asp

Glu

Lys 405

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser 410

Arg

Asp

Leu

íle

Gin 415

Glu

Ala

Lys

Leu 420

Ala

Asp

Tyr

Val

Leu 425

Ser

Phe

Glu

Pro

Thr 430

Ser

Ala

Gly

Asp

Glu 435

Lys

Leu

Ser

Leu

Gly 440

Thr

Ser

Gly

íle

Ala 445

Tyr

Val

Gin

Val

Gin 450

íle

Thr

Gly

Lys

Ala 455

Ser

His

Ala

Gly

Ala 460

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly 465

Val

Asn

Ala

Leu

Val 470

Glu

Ala

Ser

Asp

Leu 475

Val

Leu

Arg

Thr

Met 480

Asn

íle

Asp Asp

Lys 485

Ala

Lys

Asn

Leu

Arg 490

Phe

Gin

Trp

Thr

íle 495

Ala

Lys

Ala

Gly

Gin

Val

Ser

Asn

íle

Pro

Ala

Ser

Ala

Thr

Leu

Asn

500 505 510

Ala Asp

Val 515

Arg

Tyr

Ala

Arg Asn Glu Asp Phe Asp Ala Ala Met Lys

520

525

Thr

Leu

Glu

Arg

Ala

Gin

Lys

Leu

Pro

Glu

Ala

Asp

Val

530

535

540

Lys

Val

íle

Val

Thr

Arg

Gly

Arg

Pro

Ala

Phe

Asn

Ala

Gly

Glu

Gly

545

550

555

560

Gly

Lys

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

Tyr

Lys

Glu

Ala

Gly

565

570

575

Gly Thr Leu Gly Val Glu Glu Arg
	580
Tyr Ala Ala	Leu Ser Gly Lys Pro
595	600
Gly Phe Gly	Tyr His Ser Asp Lys
610	615
íle Pro Arg	Arg Leu Tyr Met Ala
625	620
Ala Gly Lys

Thr Gly Gly Gly Thr Asp Ala Ala

585 590

Val íle Glu Ser Leu Gly Leu Pro

605

Ala Glu Tyr Val Asp íle Ser Ala 620

Ala Arg Leu íle Met Asp Leu Gly 635 640 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 17:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 705 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 17:

ATGGATTTTC	AAGTGCAGAT	TTTCAGCTTC	CTGCTAATCA	GTGCTTCAGT	CATAATGTCC	60
AGAGGACAAA	CTGTTCTCTC	CCAGTCTCCA	GCAATCCTGT	CTGCATCTCC	AGGGGAGAAG	120
GTCACAATGA	CTTGCAGGGC	CAGCTCAAGT	GTAACTTACA	TTCÄCTGGTA	CCAGCAGAAG	180
CCAGGTTCCT	CCCCCAAATC	CTGGATTTAT	GCCACATCCA	ACCTGGCTTC	TGGAGTCCCT	240
GCTCGCTTCA	GTGGCAGTGG	GTCTGGGACC	TCTTACTCTC	TCACAATCAG	CAGAGTGGAG	200
GCTGAAGATG	CTGCCACTTA	TTACTGCCAA	CATTGGAGTA	GTAAACCACC	GACGTTCGGT	360
GGAGGCACCA	AGCTCGAGAT	CAAACGGACT	GTGGCTGCAC	CATCTGTCTT	CATCTTCCCG	420
CCATCTGATG	AGCAGTTGAA	ATCTGGAACT	GCCTCTGTTG	TGTGCCTGCT	GAATAACTTC	480
TATCCCAGAG	AGGCCAAAGT	ACAGTGGAAG	GTGGATAACG	CCCTCCAATC	GGGTAACTCC	540
CAGGAGAGTG	TCACAGAGCA	GGACAGCAAG	GACAGCACCT	ACAGCCTCAG	CAGCACCCTG	600
ACGCTGAGCA	AAGCAGACTA	CGAGAAACAC	AAAGTCTACG	CCTGCGAAGT	CACCCATCAG	660
GGCCTGAGTT	CGCCCGTCAC	AAAGAGCTTC	AACAGGGGAG	AGTGT		705

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 18:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 235 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 18:

Mec

Asp

Phe

Gin

Val

Gin

íle

Phe

Ser

Phe

Leu

íle

Ser

Ala

Ser

1

5

10

15

Val

íle

Mec

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

Gin

Ser

Pro

Ala

íle

20

25

30

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Mec

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

35

40

45

Ser

Val

Thr

Tyr

íle

His

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser

50

55

60

Pro

Lys

Ser

Trp

íle

Tyr

Ala

Thr

Ser

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

65

70

75

80

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

íle

85

90

95

Ser

Arg

Val

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

His

Trp

100

105

110

Ser

Lys

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

íle

Lys

115 120 125

Arg Thr Val 130

Ala Ala

Pro Ser Val Phe íle Phe Pro

Pro Ser Asp

Glu

135

140

Gin

Leu

Lys

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Cys

Leu

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Arg

Glu

Ala

Lys

Val

Gin

Trp

Lys

val

Asp

Asn

Ala

Leu

Gin

165

no

175

Ser

Gly

Asn

Ser

Gin

Glu

Ser

Val

Thr

Glu

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Leu

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Ser

Lys

Ala

Asp

Tyr

Glu

195

200

205

Lys

His

Lys

Val

Tyr

Ala

Cys

Glu

Val

Thr

His

Gin

Gly

Leu

Ser

210

215

220

Pro

Val

Thr

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Gly

Glu

Cys

225

230

235

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 19:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 19:

AAGCTTGAAT TCGCCGCCAC TATGGATTTT CAAGTGCAG 39 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 20:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 44 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 20:

TTAATTGGAT CCGAGCTCCT ATTAACACTC TCCCCTGTTG AAGC 44 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 21:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 50 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 21:

AAGCTTCCGG ATCCCTGCAG CCATGGAGTT GTGGCTGAAC TGGATTTTCC 50 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 22:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 38 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 22:

AAGCTTAGTC ATGATTATCA CTTGCCGGCG CCCAGATC 38 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 23:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 46 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 23:

CGGGGGATCC AGATCTGAGC TCCTGTAGAC GTCGACATTA ATTCCG 46 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 24:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 30 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 24:

GGAAAATCCA GTTCAGCCAC AACTCCATGG 30 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 25:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1926 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 25:

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GÄTTTTCCTT GTAACÄCTTT TAAATGGAÄT TCAGTGTGAG 60

GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAGGTCAG GGGCCTCAGT CÄAGTTGTCC 120

TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC AÄCTÄTATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT 180

GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGCÄTGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC 240

CCGAAGTTCC GGGGCAAGGC CACTTTGACT GCAGACTCAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 300

CACCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTCATGT CCTGATCTAT 360

GCTGGTTATT TGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCGCCGT GAGCTCGGCT 420

AGCACCAAGG GACCATCGGT CTTCCCCCIG GCCCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC 480

ACAGCCGCCC TGGGCTGCCT GGTCÄAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG 540

AACTCAGGCG CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCGG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA 600

CTCTACTCCC TCAGCAGCGT CGTGACGGTG CCCTCCAGCÄ ACTTCGGCAC CCAGACCTAC 660

ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG ACAAGACÄGT TGGCGGTGGT 720

GGCTCTGGTG GTGGCGGTAG CGGTGGCGGG GGTTCCCAGA AGCGCGACAA CGTGCTGTTC 780

CAGGCAGCTA CCGACGAGCA GCCGGCCGTG ATCAÄGACGC TGGAGAAGCT GGTCÄACATC 840

GAGACCGGCA CCGGTGACGC CGAGGGCATC GCCGCIGCGG GCAACTTCCT CGAGGCCGAG 900

CTCAAGAACC TCGGCTTCAC GGTCACGCGA AGCAAGTCGG CCGGCCTGGT GGTGGGCGAC 960

AACATCGTGG GCAAGATCAA GGGCCGCGGC GGCAAGAACC TGCTGCTGAT GTCGCACATG 1020

GACACCGTCT ACCTCAAGGG CATTCTCGGG AAGGCCCCGT TCCGCGTCGA AGGCGACAAG 1080

GCCTACGGCC CGGGCATCGC CGACGACAAG GGCGGCAACG CGGTCATCCT GCACÄOGCTC 1140

AAGCTGCTGA AGGAATACGG CGTGCGCGAC TACGGCACCA TCÄCCGTGCT GTTCAACACC 1200

GACGAGGAAA AGGGTTCCTT CGGCTCGCGC GACCTGATCC AGGAAGAAGC CAAGCTGGCC 1260

GACTACGTGC TCTCCTTCGA GCCCACCAGC GCAGGCGACG AAAAACTCTC GCTGGGCACC 1320

TCGGGCATCG CCTACGTGCA GGTCCAGÄTC ACCGGCAAGG CCTCGCATGC CGGCGCCGCG 1380

CCCGAGCTGG	GCGTGAACGC	GCTGGTCGAG	GCTTCCGACC	TCGTGCTGCG	CACGATGAAC	1440
ATCGACGACA	AGGCGAAGAA	CCTGCGCITC	CAGTGGACCA	TCGCCAAGGC	CGGCCAGGTC	1500
TCGAACATCA	TCCCCGCCAG	CGCCACGCTG	AACGCCGACG	TGCGCTACGC	GCGCÄACGAG	1550
GACTTCGACG	CCGCCÄTGAA	GACGCTGGAA	GAGCGCGCGC	AGCAGAAGAA	GCTGCCCGAG	1620
GCCGACGTGA	AGGTGATCGT	CACGCGCGGC	CGCCQGGCCT	TCAATGCCGG	CGMGGCGGC	1680
AAGAAGCTGG	TCGACAAGGC	GGTGGCCTAC	TACAAGGAAG	CCGGCGGCAC	GCTGGGCGTG	1740
GAAGAGCGCA	CCGGCGGCGG	CACCGACGCG	GCCTACGCCG	CGCTCTCAGG	CAAGCCAGTG	1800
ATCGAGAGCC	TGGGCCTGCC	GGGCTTCGGC	TACCACAGCG	ACÄAGGCCGA	GTÄCGTGGAC	1860
ATCAGCGCGA	TTCCGCGCCG	CCTGTACATG	GCTGCGCGCC	TGATCATGGA.	TCTGGGCGCC	1920
GGCAAG						1926

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 26:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 642 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 26:

Met

Lys

Leu

Trp

Leu

Asn

Trp

íle

Phe

Leu

Val

Thr

Leu

Asn

Gly

x

5

10

15

íle

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Asn

íle

35

40

45

Lys

Asp

Asn

Tyr

Met

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Glu

Gin

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

íle

Ala

Trp

íle

Asp

Pro

Glu

Asn

Gly

Asp

Thr

Glu

Tyr

.Ala

65

70

75

80

Pro

Lys

Phe

Arg

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Ser

Asn

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Leu

His

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

100

105

110

Tyr

Cys

His

Val

Leu

íle

Tyr

Ala

Gly

Tyr

Leu

Ala

Met

Asp

Tyr

115

120

125

Trp Gly 130	Gin Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
135	140
Pro Ser	Val Phe Pro Leu Ala	Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
145	150	155 160
Thr Ala	Ala Leu Gly Cys Leu	Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
	165	170 175
Thr Val	Ser Trp Asn Ser Gly	Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
	180	185 190
Pro Ala	Val Leu Gin Ser Ser	Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
	195	200 205
Thr Val	Pro Ser Ser Asn Phe	Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210	215	220
Asp His	Lys Pro Ser Asn Thr	Lys Val Asp Lys Thr Val Gly Gly Gly

225 230 235 240

Giy Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin Lys Arg Asp

245 250 255

Asn Val Leu Phe

Gin

Ala Ala Thr Asp Glu Gin Pro Ala Val

íle

Lys

260

265

270

Thr

Leu

Glu

Lys

Leu

Val

Asn

íle

Glu

Thr

Gly

Thr

Gly Asp

Ala

Glu

275

280

285

Gly

íle

Ala

Gly

Asn

Phe

Leu

Glu

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

Leu

290

295

300

Gly

Phe

Thr

Val

Thr

Arg

Ser

Lys

Ser

Ala

Gly

Leu

Val

Gly

Asp

305

310

315

320

Asn

íle

Val

Gly

Lys

íle

Lys

Gly

Arg

Gly

Lys

Asn

Leu

325

330

335

Met

Ser

His

Met

Asp

Thr

Val

Tyr

Leu

Lys

Gly

íle

Leu

Ala

Lys

Ala

340

345

350

Pro

Phe

Arg

Val

Glu

Gly

Asp

Lys

Ala

Tyr

Gly

Pro

Gly

íle

Ala

Asp

355

360

365

Asp

Lys

Gly

Asn

Ala

Val

íle

Leu

His

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

370

375

380

Glu

Tyr

Gly

Val

Arg

Asp

Tyr

Gly

Thr

íle

Thr

Val

Leu

Phe

Asn

Thr

385

390

395

400

Asp

Glu

Lys

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Arg

Asp

Leu

íle

Gin

Glu

405

410

415

Ala

Lys

Leu

Ala

Asp

Tyr

Val

Leu

Ser

Phe

Glu

Pro

Thr

Ser

Ala

Gly

420

425

430

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

Gly

íle

Ala

Tyr

Val

Gin

Val

Gin

435

440

Ala 460

445 Pro

tf Glu

Leu

Gly

íle 450

Thr Gly

Lys

Ala

Ser 455

His Ala

Gly

Ala

Val

Asn

Ala

Leu

Val

Glu

Ala

Ser

Asp

Leu

Val

Leu

Arg

Thr

Met

Asn

465

470

475

480

íle

Asp

Lys

Ala

Lys

Asn

Leu

Arg

Phe

Gin

Trp

Thr

íle

Ala

Lys

485

490

495

Ala

Gly

Gin

Val

Ser

Asn

íle

Pro

Ala

Ser

Ala

Thr

Leu

Asn

Ala

500

505

510

Asp

Val

Arg

Tyr

Ala

Arg

Asn

Glu

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

Lys

Thr

515 520 525

Leu Glu Glu Arg Ala Gin Gin Lys Lys Leu Pro Glu Ala Asp Val Lys

530	535	540
Val íle Val Thr Arg Gly	Arg	Pro Ala Phe Asn Ala Gly Glu Gly Gly
545 550		555 560
Lys Lys Leu Val Asp Lys	Ala	Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Ala Gly Gly
565		570 575
Thr Leu Gly Val Glu Glu	Arg	Thr Gly Gly Gly Thr Asp Ala Ala Tyr
580		585 590
Ala Ala Leu Ser Gly Lys	Pro	Val íle Glu Ser Leu Gly Leu Pro Gly
595		600 60S
Phe Gly Tyr His Ser Asp	Lys	Ala Glu Tyr Val Asp íle Ser Ala íle
610	615	620
Pro Arg Arg Leu Tyr Met	Ala	Ala Arg Leu íle Met Asp Leu Gly Ala
625 630		635 ««O

Gly Lys (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 27:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 39 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 27:

AAGCTTGGAA TTCAGTGTCA GGTCCAACTG CAGCAGCCT (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 28:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 54 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 28:

GCTACCGCCA CCTCCGGAGC CACCACCGCC CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCC 54 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 29:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 58 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 29:

TCCGGAGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTGTTCC 58 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 30:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 24 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 30:

CCTCGAGGAA TTCTTTCACT TGCC 24 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 31:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 2019 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 31:

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTCAG 60

GTCCAACTGC AGCAGCCTGG GGCTGAACTG GTGAAGCCTG GGGCTTCAGT GCAGCTCTCC 120

TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCGGC TACTGGATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT 180

GGACAAGGCC TTGAGTGGAT TGGAGAGGTT AATCCTAGTA CCGGTCGTTC TGACTACÄAT 240

GAGAAGTTCA AGAACAAGGC CACACTGACT GTAGACAAAT CCTCCACCAC AGCCTACATG 300

CAACTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG AGAGAGGGCC 360

TATGGTTACG ACGATGCTAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCACGGTCAC CGTCTCCTCA 420

GGTGGCGGTG GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG GATCTGACAT TGAGCTCTCA 480

CAGTCTCCAT CCTCCCTGGC TGTGTCAGCA GGAGAGAAGG TCACCATGAG CTGCAAATCC 540

AGTCAGAGTC TCCTCAACAG TAGAACCCGA AAGAACTACT TGGCTTGGTA CCAGCAGAGA 600

CCAGGGCAGT CTCCTAAACT GCTGATCTAT TGGGCATCCA CTAGGACATC TGGGGTCCCT 660

GATCGCTTCA CAGGCAGTGG ATCTGGGACA GATTTCACTC TCACCATCAG CAGTGTGCAG 720

GCTGAAGACC TGGCAATTTA TTACTGCAAG CAATCTTATA CTCTTCGGAC GTTCGGTGGA 780

GGCACCAAGC TCGAGATCAA ACGGGGCGGT GGTGGCTCCG GAGGTGGCGG TAGCGGTGGC 840

GGGGGTTCCC AGAAGCGCGA CAACGTGCTG TTCCAGGCAG CTACCGACGA GCAGCCGGCC 900

GTGATCAAGA CGCTGGAGAA GCTGGTCAAC ATCGAGACCG GCACCGGTGA CGCCGAGGGC 960

ATCGCCGCTG CGGGCAACTT CCTCGAGGCC GAGCTCAAGA ACCTCGGCTT CACGGTCACG 1020

CGAAGCAAGT CGGCCGGCCT GGTGGTGGGC GACAACATCG TGGGCAAGAT CAAGGGCCGC 1080

GGCGGCAAGA ACCTGCTGCT GATGTCGCAC ATGGACACCG TCTACCTCAA GGGCATTCTC 1140

GCGAAGGCCC CGTTCCGCGT CGAAGGCGAC AAGGCCTACG GCCCGGGCAT CGCCGACGAC 1200

AAGGGCGGCA ACGCGGTCAT CCTGCACACG CTCAAGCTGC TGAAGGAATA CGGCGTGCGC 1260

GACTACGGCA CCATCACCGT GCTGTTCAAC ACCGACGAGG AAAAGGGTTC CTTCGGCTCG 1320

CGCGACCTGA TCCAGGAAGA AGCCAAGCTG GCCGACTACG TGCTCTCCTT CGAGCCCACC 1380

AGCGCAGGCG ACGAAAAACT CTCGCTGGGC ACCTCGGGCA TCGCCTACGT GCAGGTCCAG 1440

ATCACCGGCA AGGCCTCGCA TGCCGGCGCC GCGCCCGAGC TGGGCGTGAA CGCGCTGGTC 1500

GAGGCTTCCG ACCTCGTGCT GCGCACGATG AACATCGACG ACAAGGCGAA GAACCTGCGC 1560

TTCCAGTGGA CCATCGCCAA GGCCGGCCAG GTCTCGAACA TCATCCCCGC CAGCGCCACG 1620

CTGAACGCCG ACGTGCGCTA CGCGCGCAAC GAGGACTTCG ACGCCGCCAT GAAGACGCTG 1680

GAAGAGCGCG CGCAGCAGAA GAAGCTGCCC GAGGCCGACG TGAAGGTGAT CGTCACGCGC 1740

GGCCGCCCGG CCTTCAATGC CGGCGAAGGC GGCAAGAAGC TGGTCGACAA GGCGGTGGCC 1800

TACTACAAGG AAGCCGGCGG CACGCTGGGC GTGGAAGAGC GCACCGGCGG CGGCACCGAC 1860

GCGGCCTACG CCGCGCTCTC AGGCAAGCCA GTGATCGAGA GCCTGGGCCT GCCGGGCTTC 1920

GGCTACCACA GCGACAAGGC CGAGTACGTG GACATCAGCG CGATTCCGCG CCGCCTGTAC 1980

ATGGCTGCGC GCCTGATCAT GGATCTGGGC GCCGGCAAG 2019 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 32:

(i)

ch

ara

kte

ris

tik

a sekvenc

:ie:

(

A)

dĺž

ka:

67

3 aminokysel

.ín

(

B)

typ

: a

min

okyselina

(

C)

typ

vl

ákn

a: jednoduché

(

D)

top

oló

gia

: lineárna

(ii

) t

yp

mol

e ku

ly:

proteín

(Xi

) O

pis

se

kve

nci

e SEQ

ID

NO:

32

1 ·

Met

Lys

Leu

Trp

Leu ,

&sn

Trp

íle Phe

Leu Val *

rhr :

Leu

Leu j

ten i

Gly

1

5

10

15

íle

Gin

Cys

Gin

Val

Gin

Leu

Gin Gin

Pro ¹

Gly :

Ma i

Glu

Leu

Val

Lys

20

25

30

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Gin

Leu

Ser Cys

Lys ,

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Gly

Trp

íle

His

Trp

Val Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

íle

Gly

Glu

Val

Asn

Pro Ser

Thr

Gly

Arg

Ser

Asp

Tyr

Asn

65

70

75

80

Glu

Lys

Phe

Lys

Asn

Lys

Ala

Thr Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Thr

85

90

95

Thr

Ala

Tyr

Met

Gin

Leu

Ser

Ser Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ma

Val

100

105

110

Tyr

Cys

Ala

Arg

Glu

Arg

Ala Tyr

Gly

Tyr

Asp

Ma

Met

Asp

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val Thr

Val

Ser

Gly

130

135

140

Ser

Gly

Ser

Gly

Gly Gly

Gly

Ser

Asp

íle

Glu

Leu

Ser

145

150

155

160

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Val Ser

Ala

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Met

165

170

175

Ser

Cys

Lys

Ser

Gin

Ser

Leu Leu

Asn

Ser

Arg

Thr

Arg

Lys

Asn

180

185

190

Tyr

Leu

Ala

Trp

Tyr

Gin

Arg Pro

Gly

Gin

Ser

Pro

Lys

Leu

195

200

205

íle

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Thr Ser

Gly

Val

Pro

Asp

i Arg

Phe

, Thr

210

215

220

Gly

Ser

Gly

Sex

Gly

Thr

Asp

Phe Thr

' Leu

Thr

íle

Ser Sex

Val

. Gin

225

230

235

240

Ala

Glu

Asp

Leu

i Ala

íle

Tyr

Tyr Cys

i Lys

Gin

. Sex

: Tyr Thr

Leu Arg

245 250 255

Thr Phe Gly Gly	Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg Gly Gly Gly Gly
	260	265	270
Ser Gly	Gly Gly	Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin	Lys Arg Asp Asn
	275	280	285
Val Leu	Phe Gin	Ala Ala Thr Asp Glu Gin Pro Ala	Val íle Lys Thr
290		295 300
Leu Glu	Lys Leu	Val Asn íle Glu Thr Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly
305		310 315	320
íle Ala	Ala Ala	Gly Asn Phe Leu Glu Ala Glu Leu	Lys Asn Leu Gly

325 330 335

Phe

Thr

Val

Thr 340

Arg

Ser

Lys

Ser

Ala 345

Gly

Leu

Val

Gly Asp 350

Asn

íle

Val

Gly 355

Lys

íle

Lys

Gly

Arg 360

Gly

Lys

Asn

Leu 365

Leu

Met

Ser

His 370

Met

Asp

Thr

Val

Tyr 375

Leu

Lys

Gly

íle

Leu 380

Ala

Lys

Ala

Pro

Phe 385

Arg

Val

Glu

Gly Asp 390

Lys

Ala

Tyr

Gly

Pro 395

Gly

íle

Ala

Asp

Asp 400

Lys

Gly

Asn

Ala 405

Val

íle

Leu

His

Thr 410

Leu

Lys

Leu

Lys 415

Glu

Tyr

Gly

Val

Arg 420

Asp

Tyr

Gly

Thr

íle 425

Thr

Val

Leu

Phe

Asn 430

Thr

Asp

Glu

Lys 435

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser 440

Arg

Asp

Leu

íle

Gin 445

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Asp

Tyr

Val

Leu

Ser

Phe

Glu

Pro

Thr

Ser

Ala

Gly Asp

450 455 460

Glu Lys Leu Ser Leu Gly Thr Ser Gly íle Ala Tyr Val Gin Val Gin

465

470

475

480

íle

Thr

Gly

Lys

Ala

Ser

His

Ala

Gly

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Val

485

490

495

Asn

Ala

Leu

Val

Glu

Ala

Ser

Asp

Leu

Val

Leu

Arg

Thr

Met

Asn

íle

500

505

510 4

Asp

Lys

Ala

Lys

Asn

Leu

Arg

Phe

Gin

Trp

Thr

íle

Ala

Lys

Ala

515

520

525

Gly

Gin

Val

Ser

Asn

íle

Pro

Ala

Ser

Ala

Thr

Leu

Asn

Ala

Asp

530

535

540

Val

Arg

Tyr

Ala

Arg

Asn

Glu

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

Lys

Thr

Leu

545

550

555

560

Glu

Arg

Ala

Gin

Lys

Leu

Pro

Glu

Ala

Asp

Val

Lys

Val

565

570

575

íle

Val

Thr

Arg

Gly

Arg

Pro

Ala

Phe

Asn

Ala

Gly

Glu

Gly Gly

Lys

580

585

590

Lys

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

Tyr

Lys

Glu

Ala

Gly Gly

Thr

595

600

605

100

Leu	Gly 610	Val	Glu	Glu	Arg	Thr 615	Gly
Ala 62S	Leu	Ser	Gly	Lys	Pro 630	Val	íle
Gly	Tyr	His	Ser	Asp 645	Lys	Ala	Glu
Arg	Arg	Leu	Tyr 660	Met	Ala	Ala	Arg

Lys

Gly Gly Thr Asp Ala Ala Tyr Ala 620

Glu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Phe 635 640

Tyr Val Asp íle Ser Ala íle Pro 650 655

Leu íle Het Asp Leu Gly Ala Gly

665 670 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 33:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 37 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 33:

GGGCGCCGGC AAGTGATAAA ATTCCTCGAG GAGCTCC (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 34:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 34:

101

CGCCACCTCT GACTTGAGC 19 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 35:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 37 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 35:

GGAGCTCCTC GAGGAATTTT ATCACTTGCC GGCGCCC 37 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 36:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 19 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 36:

GCTGAACGCC GACGTGCGC 19 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 37:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 2025 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 37:

102

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACRCTTT TAAATGGAAT TCAGTGTCAG 60 _

GTCCAACTGC AGCAGCCTGG GGCTGAACTG GTGAAGCCTG GGGCTTCAGT GCAGCTGTCC 120

TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCGGC TACTGGATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT 180

GGACAAGGCC TTGAGTGGAT TGGAGAGGTT AATCCTAGTÄ CCGGTCGTTC TGACTACAAT 240

GAGAAGTTCA AGAACAAGGC CACACTGACT GTAGACAAAT CCTCCACCAC AGCCTACATG 300

CAACTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG AGAGAGGGCC 360

TATGGTTACG ACGATGCTAT GGACTACTGG GGCCAAGGGA CCACGGTCAC CGTCTCCTCA 420

GGTGGCGGTG GCTCGGGCGG TGGTGGGTCG GGTGGCGGCG GATCTGACAT TGAGCTCTCA 480

CAGTCTCCAT CCTCCCTGGC TGTGTCAGCA GGAGAGAAGG TCACCATGAG CTGCAAATCC 540

AGTCAGAGTC TCCTCAACAG TAGAACCCGA AAGAACTACT TGGCTTGGTA CCAGCAGAGA 600

CCAGGGCAGT CTCCTAAACT GCTGATCTAT TGGGCATCCA CTAGGACATC TGGGGTCCCT 660

GATCGCTTCA CAGGCAGTGG ATCTGGGACA GATTTCACTC TCACCATCAG CAGTGTGCAG 720

GCTGAAGACC TGGCAATTTA TTACTGCAAG CAATCTTATA CTCTTCGGAC GTTCGGTGGA 780

GGCACCAAGC TCGAGATCAA ACGGGGCGGT GGTGGCTCCG GAGGTGGCGG TAGCGGTGGC 840

GGGGGTTCCC AGAAGCGCGÄ CAACGTGCTG TTCCAGGCAG CTACCGACGA GCAGCCGGCC 900

GTGATCAAGA CGCTGGAGAA GCTGGTCAAC ATCGAGACCG GCACCGGTGA CGCCGAGGGC 960

ATCGCCGCTG CGGGCAACTT CCTCGAGGCC GAGCTCAAGA ACCTCGGCTT CACGGTCACG 1020

CGAAGCAAGT CGGCCGGCCT GGTGGTGGGC GACAACATCG TGGGCAAGAT CAAGGGCCGC 1080

GGCGGCAAGA ACCTGCTGCT GATGTCGCAC ATGGACACCG TCTACCTCAA GGGCATTCTC 1140

GCGAAGGCCC CGTTCCGCGT CGAAGGCGAC AAGGCCTACG GCCCGGGCAT CGCCGACGAC 1200

AAGGGCGGCA ACGCGGTCAT CCTGCACACG CTCAAGCTGC TGAAGGAATA CGGCGTGCGC 1260

GACTACGGCA CCATCACCGT GCTGTTCAAC ACCGACGAGG AAAAGGGTTC CTTCSGCTCG 1320

CGCGACCTGA TCCAGGAAGA AGCCAAGCTG GCCGACTACG TGCTCTCCTT CGAGCCCACC 1380

AGCGCAGGCG ACGAAAAACT CTCGCTGGGC ACCTCGGGCA TCGCCTACGT GCAGGTCCAG 1440

ATCACCGGCA AGGCCTCGCA TGCCGGCGCC GCGCCCGAGC TGGGCGTGAA CGCGCTGGTC 1500

GAGGCTTCCG ACCTCGTGCT GCGCACGATG AACATCGACG ACAAGGCGAA GAACCTGCGC 1560

TTCCAGTGGA CCATCGCCAA GGCCGGCCAG GTCTCGAACA TCATCCCCGC CAGCGCCACG 1620

CTGAACGCCG ACGTGCGCTA CGCGCGCAAC GAGGACTTCG ACGCCGCCAT GAAGACGCTG 1680

GAAGAGCGCG CGCAGCAGAA GAAGCTGCCC GAGGCCGACG TGAAGGTGAT CGTCACGCGC 1740

GGCCGCCCGG CCTTCAATGC CGGCGAAGGC GGCAAGAAGC TGGTCGACAA GGCGGTGGCC 1800

TACTACAAGG AAGCCGGCGG CACGCTGGGC GTGGAAGAGC GCACCGGCGG CGGCACCGAC 1860

GCGGCCTACG CCGCGCTCTC AGGCAAGCCA GTGATCGAGA GCCTGGGCCT GCCGGGCTTC 1920

GGCTACCACA GCGACAAGGC CGAGTACGTG GACATCAGCG CGATTCCGCG CCGCCTGTAC 1980

ATGGCTGCGC GCCTGATCAT GGATCTGGGC GCCGGCAAGT GATAA 2025 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 38: (i) charakteristika sekvencie:

103 (A) dĺžka: 288 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín

(Xi)	opis	sekvencie	SEQ ID NO:	38:
Met Lys 1	Tyr Leu	Leu Pro Thr 5	Ala Ala Ala Gly 10	Leu Leu Leu Leu Ala 15
Ala Gin	Pro Ala 20	Met Ala Gin	Val Gin Leu Gin 25	Gin Pro Gly Ala Glu 30
Leu Val	Lys Pro ³⁵	Gly Ala Ser	Val Gin Leu Ser 40	Cys Lys Ala Ser Gly 45
Tyr Thr 50	Phe Thr	Gly Tyr Trp 55	íle His Trp Val	Lys Gin Arg Pro Gly 60
Gin Gly 65	Leu Glu	Trp íle Gly 70	Glu Val Asn Pro 75	Ser Thr Gly Arg Ser 80
Asp Tyr	Asn Glu	Lys Phe Lys 85	Asn Lys Ala Thr 90	Leu Thr Val Asp Lys 95
Ser Ser	Thr Thr 100	Ala Tyr Met	Gin Leu Ser Ser 105	Leu Thr Ser Glu Asp 110
Ser Ala	Val Tyr 115	Tyr Cys Ala	Arg Glu Arg Ala 120	Tyr Gly Tyr Asp Asp 125
Ala Met 130	Asp Tyr	Trp Gly Gin 135	Gly Thr Thr Val	Thr Val Ser Ser Gly 140
Gly Gly 145	Gly Ser	Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 150 155	Gly Gly Ser Asp íle 160
Giu Leu	Ser Gin	Ser Pro Ser 165	Ser Leu Ala Val 170	Ser Ala Gly Glu Lys 175
Val Thr	Met Ser 180	Cys Lys Ser	Ser Gin Ser Leu 185	Leu Asn Ser Arg Thr 190
Arg Lys	Asn Tyr 195	Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Arg 200	Pro Gly Gin Ser Pro 205
Lys Leu	Leu íle	Tyr Trp Ala	Ser Thr Arg Thr	Ser Gly Val Pro Asp

210 215 220

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr íle Ser

225 230 235 240

Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala íle Tyr Tyr Cys Lys Gin Ser Tyr

245 250 255

Thr Leu Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu íle Lys Arg Glu

260 265 270

Gin Lys Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu Asn His His His His His His

275 280 285

104 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 39:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 36 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 39:

GCCCAACCAG CCATGGCCGA GGTGCAGCTG CAGCAG 36 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 40:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 54 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 40:

CGACCCACCA CCGCCCGAGC CACCGCCACC CGAGCTCAGG GCGACTGAGG TTCC 54 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 41:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 54 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 41:

105

TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTCAGATTG TGCTCACCCA GTCT (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 42:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 24 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 24:

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TCCC 24 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 43:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 843 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 43:

ATGAAATACC TATTGCCTAC GSCAGCCGCT GGATTGTTAT TACTCGCTGC CCAACCAGCC 60

ATGGCCGAGG TGCAGCTGCA GCAGTCTGGG GCAGAGCTTG TGAGGTCAGG GGCCTCÄGTC 120

AAGTTGTCCT GCACAGCTTC TGGCTTCAAC ATTAAAGACA ACTATATGCA CTGGGTGAAG 180

CAGAGGCCTG AACAGGGCCT GGAGTGGATT GCATGGATTG ATCCTGAGAA TGGTGATACT 240

GAATATGCCC CGAAGTTCCG GGGCAAGGCC ACTTTGACTG CAGACTCATC CTCCAACACA 300

GCCTACCTGC ACCTCAGCAG CCTGACATCT GAGGACACTG CCGTCTATTA CTGTCATGTC 360

CTGATCTATG CTGGTTATTT GGCTATGGAC TACTGGGGTC AAGGAACCTC AGTCGCCGTG 420

AGCTCGGGTG GCGGTGGCTC GGGCGGTGGT GGGTCGGGTG GCGGCGGATC TCAGATTGTG 480

CTCACCCAGt’cTCCAGCAAT CATGTCTGCA TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC CATAACCTGC 540

106

AGTGCCAGCT CAAGTGTAAC TTACATGCAC TGGTTCCAGC AGAAGCCAGG CACTTCTCCC AAACTCTGGA TTTATAGCAC ATCCAACCTG GCTTCTGGAG TCCCTGCTCG CTTCAGTGGC AGTGGATCTG GGACCTCTTA CTCTCTCACA ATCAGCCGAA TGGAGGCTGA AGATGCTGCC ACTTATTACT GCCAGCAAAG GAGTACTTAC CCGCTCACGT TCGGTGCTGG GACCAAGCTC GAGATCAAAC GGGAACAAAA ACTCATCTCA GÄAGAAGATC TGAATCACCA CCATCACCAC CAT

600

660

720

780

840

843 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 44:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 281 aminokyselín (B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 44:

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr	Ala Ala Ala Gly	Leu Leu Leu Leu Ala
1 5	10	15
Ala Gin Pre Ala Met Ala Glu	Val Gin Leu Gin	Gin Ser Gly Ala Glu
20	25	30
Leu Val Arg Ser Gly Ala Ser	Val Lys Leu Ser	Cys Thr Ala Ser Gly
35	40	45
Phe Asn íle Lys Asp Asn Tyr	Met His Trp Val	Lys Gin Arg Pro Glu
50 55		60
Gin Gly Leu Glu Trp íle Ala	Trp íle Asp Pro	Glu Asn Gly Asp Thr
65 70	75	80
Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr	Leu Thr Ala Asp Ser
85	90	95
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu	His Leu Ser Ser	Leu Thr Ser Glu Asp
100	105	110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His	Val Leu íle Tyr	Ala Gly Tyr Leu Ala
115	120	125
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly	Thr Ser Val Ala	Val Ser Ser Gly Gly
130 135		140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly	Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gin íle Val
145 150	155	160
Leu Thr Gin Ser Pro Ala íle	Met Ser Ala Ser	Pro Gly Glu Lys Val
165	170	175
Thr íle Thr Cys Ser Ala Ser	Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Phe
180	185	190

107

Gin

Gin Lys 195

Pro

Gly

Thr

Ser

Pro Lys Leu Trp íle Tyr Ser Thr Ser

200

205

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Val

Pro

Ala Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

210

215

220

Thr

Ser

Tyr

Ser

Leu

Thr

íle

Ser

Arg

Met

Glu

Ala

Glu

Asp

Ala

225

230

235

240

Thr

Tyr

Cys

Gin

Arg

Ser

Thr

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Ala

245

250

255

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Íle

Lys

Arg

Glu

Gin

Lys

Leu

íle

Ser

Glu

260

265

270

Asp

Leu

Asn

His

275

280

(2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 45:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 72 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 45:

TCGAGATCAA ACGGGAACAA AAACTCATCT CAGAAGAAGA TCTGAATCAC CACCATCACC ACCATTAATG AG (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 46:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 72 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina

108 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 46:

AATTCTCATT AATGGTGGTG ATGGTGGTGA TTCAGATCTT CTTCTGAGAT GAGTTTTTGT 60 TCCCGTTTGA TC 72 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 47:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 846 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 47:

ATGAAATACC	TATTGCCTAC	GGCAGCCGCT	GGATTGTTAT	TACTCGCTGC	CCAACCAGCC	60
ATGGCCCAGG	TCCAACTGCA	GCAGCCTGGG	GCTGAACTGG	TGAAGCCTGG	GGCTTCAGTG	120
CAGCTGTCCT	GCAAGGCTTC	TGGCTACACC	TTCACCGGCT	ACTGGATACA	CTGGGTGAAG	180
CAGAGGCCTG	GACAAGGCCT	TGAGTGGATT	GGAGAGGTTA	ATCCTAGTAC	CGGTCGTTCT	240
GACTACAATG	AGAAGTTCAA	GAACAAGGCC	ACACTGACTG	TAGACAAATC	CTCCACCACA	300
GCCTACATGC	AACTCAGCAG	CCTGACATCT	GAGGACTCTG	CGGTCTATTA	CTGTGCAAGA	360
GAGAGGGCCT	ATGGTTACGA	CGÄTGCTÄTG	GACTACTGGG	GCCAAGGGAC	CACGGTCACC	420
GTCTCCTCAG	GTGGCGGTGG	CTCGGGCGGT	GGTGGGTCGG	gtggcggcgg	ATCTGACATT	480
GAGCTCTCAC	AGTCTCCATC	CTCCCTGGCT	GTGTCAGCAG	GAGAGAAGGT	CACCATGAGC	540
TGCAAATCCA	GTCAGAGTCT	CCTCAACÄGT	AGAACCCGAA	AGAACTACTT	GGCTTGGTAC	600
CAGCAGAGAC	CAGGGCAGTC	TCCTAAACTG	CTGATCTATT	GGGCATCCAC	TAGGACATCT	660
GGGGTCCCTG	ATCGCTTCAC	AGGCAGTGGA	TCTGGGACAG	ATTTCACTCT	CACCATCAGC	720
AGTGTGCAGG	CTGAAGÄCCT	GGCAATTTAT	TACTGCAAGC	aatcttatac	TCTTCGGACG	780
TTCGGTGGAG	GCACCÄAGCT	CGAGATCAAA	CGGGAACAAA	AACTCATCTC	AGAAGAAGAT	840
CTGAATCACC	ACCATCACCA	CCAT				864

109 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 48:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 34 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 48:

AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGC 34 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 49:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 45 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 49:

CGCCACCTCC GGAGCCACCA CCGCCCCGTT TGATCTCGAG CTTGG 45 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 50:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1998 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 50:

110

ATGAAGTTGT GGCTGAACTG GATTTTCCTT GTAACACTTT TAAATGGAAT TCAGTGTGAG 60

GTGCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCAGAGCTT GTGAGGTCAG GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC 120

TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC AACTATATGC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT 180

GAACAGGGCC TGGAGTGGAT TGCATGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TGAATATGCC 240

CCGAAGTTCC GGGGCAAGGC CACTTTGACT GCAGACTCAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 300

CACCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCGTCTATT ACTGTCATGT CCTGATCTAT 360

GCTGGTTATT TGGCTATGGA CTACTGGGGT CAAGGAACCT CAGTCGCCGT GAGCTCGGGT 420

GGCGGTGGCT CGGGCGGTGG TGGGTCGGGT GGCGGCGGAT CTCAGATTGT GCTCACCCAG 480

TCTCCAGCAA TCATGTCTGC ATCTCCAGGG GAGAAGGTCA CCATAACCTG CAGTGCCAGC 540

TCAAGTGTAA CTTACATGCA CTGGTTCCAG CAGAAGCCAG GCACTTCTCC CAAACTCTGG 600

ATTTATAGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGCTC GCTTCAGTGG CAGTGGÄTCT 660

GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCCGA ATGGAGGCTG AAGATGCTGC CACTTATTAC 720

TGCCAGCAAA GGAGTACTTA CCCGCTCACG TTCGGTGCTG GGACCAAGCT CGAGATCAAA 780

CGGGGCGGTG GTGGCTCCGG AGGTGGCGGT AGCGGTGGCG GGGGTTCCCA GAAGCGCGAC 840

AACGTGCTGT TCCAGGCAGC TACCGACGAG CAGCCGGCCG TGATCAAGAC GCTGGAGAAG 900

CTGGTCAACA TCGAGACCGG CACCGGTGAC GCCGAGGGCA TCGCCGCTGC GGGCAACTTC 960

CTCGAGGCCG AGCTCAAGAA CCTCGGCTTC ACGGTCACGC GAAGCAAGTC GGCCGGCCTG 1020

GTGGTGGGCG ACAACATCGT GGGCAAGATC AAGGGCCGCG GCGGCAAGAA CCTGCTGCTG 1080

ATGTCGCACA TGGACACCGT CTACCTCAAG GGCATTCTCG CGAAGGCCCC GTTCCGCGTC 1140

GAAGGCGACA AGGCCTACGG CCCGGGCATC GCCGACGACA AGGGCGGCAA CGCGGTCATC 1200

CTGCACACGC TCAAGCTGCT GAAGGAATAC GGCGTGCGCG ACTACGGCAC CATCACCGTG 1260

CTGTTCAACA CCGACGÄGGA AAAGGGTTCC TTCGGCTCGC GCGACCTGAT CCAGGAAGAA 1320

GCCAAGCTGG CCGACTACGT GCTCTCCTTC GAGCCCACCA GCGCAGGCGA CGAAAAACTC 1380

TCGCTGGGCA CCTCGGGCAT CGCCTACGTG CAGGTCCAGA TCACCGGCAA GGCCTCGCAT 1440

GCCGGCGCCG CGCCCGAGCT GGGCGTGAAC GCGCTGGTCG AGGCTTCCGA CCTCGTGCTG 1500

CGCACGATGA ACATCGACGA CAAGGCGAAG AACCTGCGCT TCCAGTGGAC CATCGCCAAG 1560

GCCGGCCAGG TCTCGAACAT CATCCCCGCC AGCGCCACGC TGAACGCCGA CGTGCGCTAC 1620

GCGCGCAACG AGGACTTCGA CGCCGCCATG AAGACGCTGG AAGAGCGCGC GCAGCAGAAG 1680

AAGCTGCCCG AGGCCGACGT GAAGGTGATC GTCACGCGCG GCCGCCCGGC CTTCAATGCC 1740

GGCGAAGGCG GCAAGAAGCT GGTCGACAAG GCGGTGGCCT ACTACAAGGA AGCCGGCGGC 1800

ACGCTGGGCG TGGAAGAGCG CACCGGCGGC GGCACCGACG CGGCCTACGC CGCGCTCTCA 1860

GGCAAGCCAG TGATCGAGAG CCTGGGCCTG CCGGGCTTCG GCTACCACAG CGACAAGGCC 1920

GAGTACGTGG ACATCAGCGC GATTCCGCGC CGCCTGTACA TGGCTGCGCG CCTGATCATG 1980 GATCTGGGCG CCGGCAAG 1998 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 51: (i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 666 aminokyselín

III

(B) typ: aminokyselina (C) typ vlákna: jednoduché
	(D)	topológia: lineárna
(ii)	typ	molekuly: proteín
(xi)	opis sekvencie SEQ ID NO: 51:

Met

Lys

Leu

Trp

Leu

Asn

Trp

íle

Phe

Leu

Val

Thr

Leu

Asn

Gly

1

5

10

15

íle

Gin

Cys

Glu

Val

Gin

Leu

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Leu

Val

Arg

20

25

30

Ser

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Leu

Ser

Cys

Thr

Ala

Ser

Gly

Phe

Asn

íle

35

40

45

Lys

Asp

Asn

Tyr

Met

His

Trp

val

Lys

Gin

Arg

Pro

Glu

Gin

Gly

Leu

50

55

60

Glu

Trp

íle

Ala

Trp

íle

Asp

Pro

Glu

Asn

Gly

Asp

Thr

Glu

Tyr

Ala

70 75 80

Pro Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn

90 95

Thr Ala Tyr Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys His Val Leu íle Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly	Gly	Gly Gly	Ser Gly Gly Gly Gly	Ser	Gin íle	Val Leu Thr	Gin
145			150		155		160
Ser	Pro	Ala íle	Met Ser Ala Ser Pro 165	Gly 170	Glu Lys	Val Thr íle 175	Thr
Cys	Ser	Ala Ser 180	Ser Ser Val Thr Tyr 185	Met	His Trp	Phe Gin Gin 190	Lys
Pro	Gly	Thr Ser 195	Pro Lys Leu Trp íle 200	Tyr	Ser Thr	Ser Asn Leu 20S	Ala
Ser	Gly 210	Val Pro	Ala Arg Phe Ser Gly 215	Ser	Gly Ser 220	Gly Thr Ser	Tyr
Ser 225	Leu	Thr íle	Ser Arg Met Glu Ala 230	Glu	Asp Ala 235	Ala Thr Tyr	Tyr 240
Cys	Gin	Gin Arg	Ser Thr Tyr Pro Leu 245	Thr 250	Phe Gly	Ala Gly Thr 255	Lys
Leu	Glu	íle Lys 260	Arg Gly Gly Gly Gly 265	Ser	Gly Gly	Gly Gly Ser 270	Gly
Gly	Gly	Gly Ser 275	Gin Lys Arg Asp Asn 280	Val	Leu Phe	Gin Ala Ala 285	Thr
Asp	Glu 290	Gin Pro	Ala Val íle Lys Thr 295	Leu	Glu Lys 300	Leu Val Asn	íle

112

Glu

Thr

Gly

Thr

Gly

Asp

Ala

Glu Gly

Íle

Ala

Gly

Asn

Phe

305

310

315

320

Leu

Glu

Ala

Glu

Leu

Lys

Asn

Leu

Gly

Phe

Thr

Val

Thr

Arg

Ser

Lys

325

330

335

Ser

Ala

Gly

Leu

Val

Gly

Asp

Asn

íle

Val

Gly

Lys

íle

Lys

Gly

340

345

350

Arg

Gly

Lys

Asn

Leu

Met

Ser

His

Met

Asp

Thr

Val

Tyr

355 360 365

Leu Lys Gly

íle Leu Ala

Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp Lys

370

375

380

Ala

Tyr

Gly

Pro

Gly

íle

Ala

Asp Asp

Lys

Gly

Asn

Ala

Val

íle

385

390

395

400

Leu

His

Thr

Leu

Lys

Leu

Lys

Glu

Tyr

Gly

Val

Arg

Asp

Tyr

Gly

405

410

415

Thr

íle

Thr

Val

Leu

Phe

Asn

Thr

Asp

Glu

Lys

Gly

Ser

Phe

Gly

420

425

430

Ser

Arg

Asp

Leu

íle

Gin

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Asp

Tyr

Val

Leu

435

440

445

Ser

Phe

Glu

Pro

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Gly

Thr

450

455

460

Ser

Gly

íle

Ala

Tyr

Val

Gin

Val

Gin

íle

Thr

Gly

Lys

Ala

Ser

His

465

470

475

480

Ala

Gly

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Leu

val

Glu

Ala

Ser

485

490

495

Asp

Leu

Val

Leu

Arg

Thr

Met

Asn

íle

Asp

Lys

Ala

Lys

Asn

Leu

500

505

510

Arg

Phe

Gin

Trp

Thr

íle

Ala

Lys

Ala

Gly

Gin

Val

Ser

Asn

íle

515 520 525

Pro

Ala Ser Ala 530

Thr

Leu

Asn Ala Asp Val Arg Tyr Ala Arg Asn Glu

535

540

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

Lys

Thr

Leu

Glu

Arg

Ala

Gin

Lys

545

550

555

560

Lys

Leu

Pro

Glu

Ala

Asp

Val

Lys

Val

íle

Val

Thr

Arg

Gly

Arg

Pro

565

570

575

Ala

Phe

Asn

Ala

Gly

Glu

Gly Gly

Lys

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

Val

580

585

590

Ala

Tyr

Lys

Glu

Ala

Gly Gly

Thr

Leu

Gly

Val

Glu

Arg

Thr

595

600

605

Gly

Thr

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

Ser

Gly

Lys

Pro

Val

610

615

620

íle

Glu

Ser

Leu

Gly

Leu

Pro

Gly

Phe

Gly

Tyr

His

Ser

Asp

Lys

Ala

625

630

635

640

Glu

Tyr

Val

Asp

íle

Ser

Ala

íle

Pro

Arg

Leu

Tyr

Met

Ala

645

650

655

Arg

Leu

íle

Met

Asp

Leu

Gly

Ala

Gly

Lys

660 665

113 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 52:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 3217 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 52:

GAATTCGCCG CCACTATGGA TTTTCAAGTG CAGATTTTCA GCTTCCTGCT AATCAGTGCT 60

TCAGTCATAA TGTCCAGAGG ACAAACTGTT CTCTCCCAGT CTCCAGCAAT CCTGTCTGCA 120

TCTCCAGGGG AGAAGGTCAC AATGÄCTTGC AGGGCCAGCT CAAGTGTAAC TTACATTCAC 180

TGGTACCAGC AGAAGCCAGG TTCCTCCCCC AAATCCTGGA TTTATGCCAC ÄTCCAACCTG 240

GCTTCTGGAG TCCCTGCTCG CTTCAGTGGC AGTGGGTCTG GGACCTCTTA CTCTCTCACA 300

ATCAGCAGAG TGGAGGCTGA AGATGCTGCC ACTTATTACT GCCAACATTG GAGTAGTAAA 360

CCACCGACGT TCGGTGGAGG CACCAAGCTC GAGATCAAAC GGACTGTGGC TGCACCATCT 420

GTCTTCATCT TCCCGCCATC TGATGAGCAG TTGAAATCTG GAACTGCCTC TGTTGTGTGC 480

CTGCTGAATA ACTTCTATCC CAGAGAGGCC AAAGTACAGT GGAAGGTGGA TAACGCCCTC 540

CAATCGGGTA ACTCCCAGGA GAGTGTCACA GAGCAGGACA GCAAGGACAG CACCTACAGC 600

CTCAGCAGCA CCCTGACGCT GAGCAAAGCA GACTACGAGA AACACAAAGT CTACSCCTGC 660

GAAGTCACCC ATCAGGGCCT GAGTTCGCCC GTCACAAAGA GCTTCAACAG GGGAGAGTGT 720

TAATAGGAGC TCGGATCCAG ATCTGAGCTC CTGTAGACGT CGACATTAAT TCCGGTTATT 780

TTCCACCATA TTGCCGTCTT TTGGCAATGT GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT 840

GACGAGCATT CCTAGGGGTC TTTCCCCTCT CGCCAAAGGA ATGCAAGGTC TGTTGAATGT 900

CGTGAAGGAA GCAGTTCCTC TGGAAGCTTC TTGAAGACAA ACAACGTCTG TAGCGACCCT 960

TTGCAGGCAG CGGAACCCCC CACCTGGCGA CAGG7GCCTC TGCGGCCAAA AGCCACGTGT 1020

ATAAGATACA CCTGCAAAGG CGGCACAACC CCAGTGCCAC GTTGTGAGTT GGATAGTTGT 1080

GGAAAGAGTC AAATGGCTCT CCTCAAGCGT ATTCAACAAG GGGCTGAAGG ATGCCCAGAA 1140

GGTACCCCAT TGTATGGGAT CTGATCTGGG GCCTCGGTGC ACATGCTTTA CATGTGTTTA 1200

GTCGAGGTTA AAAAACGTCT AGGCCCCCCG AACCACGGGG ACGTGGTTTT CCTTTGAAAA 1260

ACACGATGAT AATACCATGG AGTTGTGGCT GAACTGGATT TTCCTTGTAA CACTTTTAAA 1320

TGGTATCCAG TGTGAGGTGA AGCTGGTGGA GTCTGGAGGA GGCTTGGTAC AGCCTGGGGG 1380

TTCTCTGAGA CTCTCCTGTG CAACTTCTGG GTTCACCTTC ACTGATTACT ACATGAACTG 1440

GGTCCGCCAG CCTCCAGGAA AGGCACTTGA GTGGTTGGGT TTTATTGGAA ACAAAGCTAA 1500

TGGTTACACA ACAGAGTACA GTGCÄTCTGT GAAGGGTCGG TTCACCATCT CCAGAGATAA 1560

ATCCCAAAGC ATCCTCTATC TTCAAATGAA CACCCTGAGA GCTGAGGACA GTGCCACTTA 1620

TTACTGTACA AGAGATAGGG GGCTACGGTT CTACTTTGAC TACTGGGGCC AAGGCACCAC 1680

114

TCTCACAGTG AGCTCGGCTA GCACCAAGGG ACCATCGGTC TTCCCCCTGG CCCCCTGCTC 1740

CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA 1800

ACCGGTGACG GTGTCGTGGA ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC 1860

TGTCCTACAG TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTC GTGACGGTGC CCTCCÄGCAA 1920

CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA CCAAGGTGGA 1980

CAAGACAGTT GGCGGTGGTG GCTCTGGTGG TGGCGGTAGC GGTGGCGGGG GTTCCCAGAA 2040

GCGCGACAAC GTGCTGTTCC AGGCAGCTAC CGACGAGCAG CCGGCCGTGA TCAAGACGCT 2100

GGAGAAGCTG GTCAACATCG AGACCGGCAC CGGTGACGCC GAGGGCATCG CCGCTGCGGG 2160

CAACTTCCTC GAGGCCGAGC TCAAGAACCT CGGCTTCACG GTCACGCGAA GCAAGTCGGC 2220

CGGCCTGGTG GTGGGCGACA ACATCGTGGG CAAGATCAAG GGCCGCGGCG GCAAGAACCT 2280

GCTGCTGATG TCGCACATGG ACACCGTCTA CCTCAAGGGC ATTCTCGCGA AGGCCCCGTT 2340

CCGCGTCGAA GGCGACAAGG CCTACGGCCC GGGCATCGCC GACGAGAAGG GCGGCAACGC 2400

GGTCATCCTG CACACGCTCA AGCTGCTGAA GGAATACGGC GTGCGCGACT ACGGCACCAT 2460

CACCGTGCTG TTCAACACCG ACGAGGAAAA GGGTTCCTTC GGCTCGCGCG ACCTGATCCA 2520

GGAAGAAGCC AAGCTGGCCG ACTACGTGCT CTCCTTCGAG CCCACCAGCG CAGGCGACGA 2580

AAAACTCTCG CTGGGCACCT CGGGCATCGC CTACGTGCAG GTCCAGATCA CCGGCAAGGC 2640

CTCGCATGCC GGCGCCGCGC CCGAGCTGGG CGTGAACGCG CTGGTCGAGG CTTCCGACCT 2700

CGTGCTGCGC ACGATGAACA TCGACGACAA GGCGAAGAAC CTGCGCTTCC AGTGGACCAT 2760

CGCCAAGGCC GGCCAGGTCT CGAACATCAT CCCCGCCAGC GCCACGCTGA ACGCCGACGT 2820

GCGCTACGCG CGCAACGAGG ACTTCGACGC CGCCATGAAG ACGCTGGAAG AGCGCGCGCA 2880

GCAGAAGAAG CTGCCCGAGG CCGACGTGAA GGTGATCGTC ACGCGCGGCC GCCCGGCCTT 2940

CAATGCCGGC GAAGGCGGCA AGAAGCTGGT CGACAAGGCG GTGGCCTACT ACAAGGAAGC 3000

CGGCGGCACG CTGGGCGTGG AAGAGCGCAC CGGCGGCGGC ACCGACGCGG CCTACGCCGC 3060

GCTCTCAGGC AAGCCAGTGA TCGAGAGCCT GGGCCTGCCG GGCTTCGGCT ACCACAGCGA 3120

GAAGGCCGAG TACGTGGACA TCAGCGCGAT TCCGCGCCGC CTGTACATGG CTGCGCGCCT 3180

GATCATGGAT CTGGGCGCCG GCAAGTGATA ATCTAGA 3217

115 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 53:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 35 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 53:

TGGATCTGAA GCTTAAACTA ACTCCATGGT GACC 35 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 54:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 61 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 54:

GCCACGGATC CCGCCACCTC CGGAGCCACC ACCGCCACAA TCCCTGGGCA CAATTTTCTT 60 G 61 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 55:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 94 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 55:

116

GCCCAGGAAG CTTGGCGGTG GTGGCTCCGG AGGTGGCGGT AGCGGTGGCG GGGGTTCCCA 60 GAAGCGCGAC AACGTGCTGT TCCAGGCAGC TACC 94 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 56:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 51 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 56:

ATGTGCGAAT TCAGCAGCAG GTTCTTGCCG CCGCGGCCCT TGATCTTGCC C 51 (2) Informácia o sekvencií SEQ ID NO: 57:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 732 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 16...720 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 57:

GAATTCGCCG CCACC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AGC TTC CTG CTA

Met Asp Phe Gin Val Gin íle Phe Ser Phe Leu Leu 15 10

ATC

AGT

GCT

TCA

GTC

ΑΤΆ

ATG

TCC

AGA

GGA

CAA

ACT

GTT

CTC

TCC

CAG

íle

Ser

Ala

Ser

Val

íle

Met

Ser

Arg

Gly

Gin

Thr

Val

Leu

Ser

Gin

15

20

25

TCT

CCA

GCA

ATC

CTG

TCT

GCA

TCT

CCA

GGG

GAG

AAG

GTC

ACA

ATG

ACT

Ser

Pro

Ala

íle

Leu

Ser

Ala

Ser

Pro

Gly

Glu

Lys

Val

Thr

Mep.

Thr

30

35

40

147

117

TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTÄ ACT TAC ATT CAC TGG TAC CAG CAG AAG

Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr íle His Trp Tyr Gin Gin Lys

50 55 60

CCA GGT TCC TCC CCC AAA TCC TGG ATT TAT GCC ACA TCC AAC CTG GCT

Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ser Trp íle Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala

70 75

TCT '

GGA '

GTC

CCT 1

GCT CGC TTC .

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACC

TCT '

TAC

Ser

Gly

Val

Pro , 80

Ala Arg Phe

Ser

Gly 85

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr 90

Ser

Tyr

TCT

CTC

ACA

ATC

AGC AGA GTG

GAG

GCT

GAA

GAT

GCT

GCC

ACT

TAT

TAC

Ser

Leu

Thr 95

íle

Ser Arg Val

Glu 100

Ala

Glu

Asp

Ala

Ala 105

Thr

Tyr Tyr

TGC

CAA

CAT

TGG

AGT AGT AAA

CCA

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

Cys

Gin 110

His

Trp

Ser Ser Lys 115

Pro

Thr

Phe

Gly 120

Gly

Thr

Lys

CTG

GAA

ATC

AAA

CGG GCT GAT

GCT

GCA

CCA

ACT

GTÄ

TCC

ATC

TTC

CCA

Leu 125

Glu

íle

Lys

Arg Ala Asp 130

Ala

Pro

Thr 135

Val

Ser

íle

Phe

Pro 140

CCA

TCC

AGT

GAG

CAG TTA ACA

TCT

GGA

GGT

GCC

TCA

GTC

GTG

TGC

TTC

Pro

Ser

Glu

Gin Leu Thr 145

Ser

Gly

Gly 150

Ala

Ser

Val

Cys 155

Phe

TTG

AAC

TTC

TAC CCC AAA

GAC

ATC

AAT

GTC

AAG

TGG

AAG

ATT

GAT

Leu

Asn

Phe 160

Tyr Pro Lys

Asp

íle 165

Asn

Val

Lys

Trp

Lys 170

íle

Asp

GGC

AGT

GAA

CGA

CAA AAT GGC

GTC

CTG

AAC

AGT

TGG

ACT

GAT

CAG

GAC

Gly

Ser

Glu 175

Arg

Gin Asn Gly

Val 180

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr 185

Asp

Gin

Asp

AGC

AAA

GAC

AGC

ACC TAC AGC

ATG

AGC

ACC

CTC

ACG

TTG

ACC

AAG

Ser

Lys 190

Asp

Ser

Thr Tyr Ser 195

Met

Ser

Thr

Leu 200

Thr

Leu

Thr

Lys

GAC

GAG

TAT

GAA

CGA CAT AAC

AGC

TAT

ACC

TGT

GAG

GCC

ACT

CAC

AAG

Asp 205

Glu

Tyr

Glu

Arg His Asn 210

Ser

Tyr

Thr

Cys 215

Glu

Ala

Thr

His

Lys 220

ACA

TCA

ACT

TCA

CCC ATT GTC

AAG

AGC

TTC

AAC

AGG

AAT

GAG

TGT

Thr

Ser

Thr

Ser

Pro íle Val 225

Lys

Ser

Phe 230

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys 235

TAATAAGAAT TC

195

243

291

339

387

435

483

531

579

627

675

720

732 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 58:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 235 aminokyselín (B) typ: aminokyselina

118 (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: proteín (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 58:

Met Asp Phe Gin Val Gin íle Phe Ser Phe Leu Leu íle Ser Ala Ser 1 5 10 15

Val íle Met Ser Arg Gly Gin Thr Val Leu Ser Gin Ser Pro Ala íle 20 25 30

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45

Ser Ser Val Thr Tyr íle His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60

Pro Lys Ser Trp íle Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr íle 85 90 95

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Trp 100 105 110

Ser Ser Lys 115

Pro Pro

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

Glu íle

Lys

120

125

Arg

Ala

Asp

Ala

Pro

Thr

Val

Ser

íle

Phe

Pro

Ser

Glu

130

135

140

Gin

Leu

Thr

Ser

Gly Gly

Ala

Ser

Val

Cys

Phe

Leu

Asn

Phe

145

150

155

160

Tyr

Pro

Lys

Asp

íle

Asn

Val

Lys

Trp

Lys

íle

Asp

Gly

Ser

Glu

Arg

165

170

175

Gin

Asn

Gly

Val

Leu

Asn

Ser

Trp

Thr

Asp

Gin

Asp

Ser

Lys

Asp

Ser

180

185

190

Thr

Tyr

Ser

Met

Ser

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Lys

Asp

Glu

Tyr

Glu

195

200

205

Arg

His

Asn

Ser

Tyr

Thr

Cys

Glu

Ala

Thr

His

Lys

Thr

Ser

Thr

Ser

210

215

220

Pro

íle

Val

Lys

Ser

Phe

Asn

Arg

Asn

Glu

Cys

225

230

235

119 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 59:

(i) charakteristika sekvencie:

(A) dĺžka: 1974 bázových párov (B) typ: nukleová kyselina (C) typ vlákna: jednoduché (D) topológia: lineárna (ii) typ molekuly: iná nukleová kyselina (ix) znaky:

(A) meno/označenie: CDS (B) pozícia: 16...1956 (xi) opis sekvencie SEQ ID NO: 59:

AAGCTTGCCG CCACC

ATG

AAG

TTG

TGG

CTG

AAC

TGG

ATT

TTC

CTT

GTA

ACA

51

Met

Lys Leu Trp

Leu

Asn Trp

íle

Phe

Leu

Val

Thr

1

5

10

CTT TTA AAT GGT .

ATC

CAG

TGT

GAG

GTG

AAG

CTG l

GTG <

GAG ¹

TCT GGA GGA

99

25 Leu Leu Asn Gly

íle

Gin

Cys

Glu

Val

Lys

Leu '

val

Glu

Ser i

Gly i

Gly

15

20

25

GGC TTG GTA CAG

CCT

GGG

GGT

TCT

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

ACT

TCT

147

Gly Leu Val Gin

Pro

Gly Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr

Ser

30

35

40

30 GGG TTC ACC TTC

ACT

GAT

TAC

ATG

AAC

TGG

GTC

CGC

CAG

CCT

CCA

195

Gly Phe Thr Phe

Thr

Asp

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

45

50

55

60

GGA AAG GCA CTT

GAG

TGG

TTG

GGT

TTT

ATT

GGA

AAC

AAA

GCT

AAT

GGT

243

Gly Lys Ala Leu

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

íle

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly

35

65

70

75

TAC ACA ACA GAG

TAC

AGT

GCA

TCT

GTG

AAG

GGT

CGG

TTC

ACC

ATC

TCC

291

Tyr Thr Thr Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

íle

Ser

80

85

90

AGA GAT AAA TCC

CAA

AGC

ATC

CTC

TAT

CTT

CAA

ATG

AAC

ACC

CTG

AGA

339

40 Arg Asp Lys Ser

Gin

Ser

íle

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

95

100

105

GCT GAG GAC AGT

GCC

ACT

TAT

TAC

TGT

ACA

AGA

GAT

AGG

GGG

CTA

CGG

387

Ala Glu Asp Ser

Ala

Thr

Tyr Tyr Cys

Thr

Arg

Asp

Arg Gly

Leu

Arg

110

115

120

45 TTC TAC TTT GAC

TAC

TGG

GGC

CAA

, GGC

ACC

ACT

CTC

ACA

. GTC

: tcc

TCA

435

Phe Tyr Phe Asp

Tyr Trp

Gly Gin Gly

Thr

Leu

, Thr

Val

Ser

125

130

135

140

120

GCC AAA ACG ACA CCC CCA TCT GTC TAT CCA CTG GCC CCT GGA TCT GCT 483

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

145 150 '155

GCC CAA ACT AAC TCC ATG GTG ACC CTG GGA TGC CTG GTC AAG GGC TAT 531

Ala Gin Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

160 165 170

TTC CCT GAG CCA GTG ACA GTG ACC TGG AAC TCT GGA TCT CTG TCC AGC 579

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

175 180 185

GGT GTG CAC ACC TTC CCA GCT GTC CTG CAG TCT GAC CTC TAC ACT CTG 627

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

190 195 200

AGC AGC TCA GTG ACT GTC CCC TCC AGC ACC TGG CCC AGC GAG ACC GTC 675

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val

205 210 215 220

ACC TGC AAC GTT GCC CAC CCG GCC AGC AGC ACC AAG GTG GAC AAG AAA 723

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

225 230 235

ATT GTG CCC AGG GAT TGT GGC GGT GGT GGC TCC GGA GGT GGC GGT AGC 771 íle Val Pro Arg Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

240 245 250

GGT GGC GGG GGT TCC CAG AAG CGC GAC AAC GTG CTG TTC CAG GCA GCT 819

Gly Gly Gly Gly Ser Gin Lys Arg Asp Asn Val Leu Phe Gin Ala Ala

255 260 265

ACC GAC GAG CAG CCG GCC GTG ATC AAG ACG CTG GAG AAG CTG GTC AAC 867

Thr Asp Glu Gin Pro Ala Val íle Lys Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn

270 275 280

ATC GAG ACC GGC ACC GGT GAC GCC GAG GGC ATC GCC GCT GCG GGC AAC 915 íle Glu Thr Gly Thr Gly Asp Ala Glu Gly íle Ala Ala Ala Gly Asn

285 290 295 300

TTC CTC GAG GCC GAG CTC AAG AAC CTC GGC TTC ACG GTC ACG CGA AGC 963

Phe Leu Glu Ala Glu Leu Lys Asn Leu Gly Phe Thr Val Thr Arg Ser

305 310 315

AAG TCG GCC GGC CTG GTG GTG GGC GAC AAC ATC GTG GGC AAG ATC AAG 1011

Lys Ser Ala Gly Leu Val Val Gly Asp Asn íle Val Gly Lys Íle Lys

320 . 325 330

GGC CGC GGC GGC AAG AAC CTG CTG CTG ATG TCG CAC ATG GAC ACC GTC 1059

Gly Arg Gly Gly Lys Asn Leu Leu Leu Met Ser His Met Asp Thr Val

335 340 345

TAC CTC AAG GGC ATT CTC GCG AAG GCC CCG TTC CGC GTC GAA GGC GAC 1107

Tyr Leu Lys Gly íle Leu Ala Lys Ala Pro Phe Arg Val Glu Gly Asp

350 355 360

AAG GCC TAC GGC CCG GGC ATC GCC GAC GAC AAG GGC GGC AAC GCG GTC 1155

Lys Ala Tyr Gly Pro Gly íle Ala Asp Asp Lys Gly Gly Asn Ala Val

365 370 375 380

ATC CTG CAC ACG CTC AAG CTG CTG AAG GAA TAC GGC GTG CGC GAC TAC 1203 íle Leu His Thr Leu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Val Arg Asp Tyr

121

385 390 395

GGC ACC ATC ACC GTG CTG TTC AAC ACC GAC GAG GAA AAG GGT TCC TTC 1251

Gly Thr Íle Thr Val Leu Phe Asn Thr Asp Glu Glu Lys Gly Ser Phe

400 405 410

GGC TCG CGC GAC CTG ATC CAG GAA GAA GCC AAG CTG GCC GAC TAC GTG 1299

Gly Ser Arg Asp Leu íle Gin Glu Glu Ala Lys Leu Ala Asp Tyr Val

415 420 425

CTC TCC TTC GAG CCC ACC AGC GCA GGC GAC GAA AAA CTC TCG CTG GGC 1347

Leu Ser Phe Glu Pro Thr Ser Ala Gly Asp Glu Lys Leu Ser Leu Gly

430 435 440

ACC TCG GGC ATC GCC TAC GTG CAG GTC AAC ATC ACC GGC AAG GCC TCG 1395

Thr Ser Gly íle Ala Tyr Val Gin Val Asn íle Thr Gly Lys Ala Ser

445 450 455 460

CAT

GCC

GGC

GCC

GCG

CCC

GAG

CTG

GGC

GTG

AAC

GCG

CTG

GTC

GAG i

GCT

1443

His

Ala

Gly

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Leu

Val

Glu .

Ala

465

470

475

TCC

GAC

CTC

GTG

CTG

CGC

ACG

ATG

AAC

ATC

GAC

AAG

GCG

AAG

AAC

1491

Ser

Asp

Leu

Val

Leu

Arg

Thr

Met

Asn

íle

Asp

Lys

Ala

Lys

Asn

480

485

490

CTG

CGC

TTC

AAC

TGG

ACC

ATC

GCC

AAG

GCC

GGC

AAC

GTC

TCG

AAC

ATC

1539

Leu

Arg

Phe

Asn

Trp

Thr

íle

Ala

Lys

Ala

Gly

Asn

Val

Ser

Asn

íle

495

500

505

ATC

CCC

GCC

AGC

GCC

ACG

CTG

AAC

GCC

GAC

GTG

CGC

TAC

GCG

CGC

AAC

1587

íle

Pro

Ala

Ser

Ala

Thr

Leu

Asn

Ala

Asp

Val

Arg

Tyr

Ala

Arg

Asn

510

515

520

GAG

GAC

TTC

GAC

GCC

ATG

AAG

ACG

CTG

GAA

GAG

CGC

GCG

CAG

1635

Glu

Asp

Phe

Asp

Ala

Met

Lys

Thr

Leu

Glu

Arg

Ala

Gin

525

530

535

540

AAG

CTG

CCC

GAG

GCC

GAC

GTG

AAG

GTG

ATC

GTC

ACG

CGC

GGC

CGC

1683

Lys

Leu

Pro

Glu

Ala

Asp

Val

Lys

Val

íle

Val

Thr

Arg

Gly

Arg

545

550

555

CCG

GCC

TTC

AAT

GCC

GGC

GAA

GGC

AAG

CTG

GTC

GAC

AAG

GCG

1731

Pro

Ala

Phe

Asn

Ala

Gly

Glu

Gly Gly

Lys

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

560 565 570

GTG GCC TAC TAC AAG GAA GCC GGC GGC ACG CTG GGC GTG GAA GAG CGC 1779

Val Ala Tyr Tyr Lys Glu Ala Gly Gly Thr Leu Gly Val Glu Glu Arg

575 580 585

ACC GGC GGC GGC ACC GAC GCG GCC TAC GCC GCG CTC TCA GGC AAG CCA 1827

Thr Gly Gly Gly Thr Asp Ala Ala Tyr Ala Ala Leu Ser Gly Lys Pro

590 595 600

GTG ATC GAG AGC CTG GGC CTG CCG GGC TTC GGC TAC CAC AGC GAC AAG 1875

Val íle Glu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Phe Gly Tyr His Ser Asp Lys

605 610 615 620

GCC GAG TAC GTG GAC ATC AGC GCG ATT CCG CGC CGC CTG TAC ATG GCT 1923

Ala Glu Tyr Val Asp íle Ser Ala íle Pro Arg Arg Leu Tyr Met Ala

625 630 635

GCG CGC CTG ATC ATG GAT CTG GGC GCC GGC AAG TGATAAGAAT TCCTCGAG 1974

Ala Arg Leu íle Met Asp Leu Gly Ala Gly Lys

640 645

122 (2) Informácia o sekvencii SEQ ID NO: 60:

(i) charakteristika sekvencie:

	(A)	dĺžka: 647 aminokyselín
	(B)	typ: aminokyselina
	(C)	typ vlákna: jednoduché
	(D)	topológia: lineárna
(ii)	typ	molekuly: proteín
(xi)	opis sekvencie SEQ ID NO: 60:

Met Lys Leu Trp Leu Asn Trp íle Phe Leu Val Thr Leu Leu Asn Gly 15 10 1S íle Gin Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin

20

25

30

Pro

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Thr

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

35

40

45

Thr

Asp

Tyr

Met

Asn

Trp

Val

Arg

Gin

Pro

Gly

Lys

Ala

Leu

50

55

60

Glu

Trp

Leu

Gly

Phe

íle

Gly

Asn

Lys

Ala

Asn

Gly

Tyr

Thr

Glu

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Val

Lys

Gly

Arg

Phe

Thr

íle

Ser

Arg

Asp

Lys

Ser

85

90

95

Gin

Ser

íle

Leu

Tyr

Leu

Gin

Met

Asn

Thr

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Ser

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Cys

Thr

Arg

Asp

Arg

Gly

Leu

Arg

Phe

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Thr

Val

Ser

Ala

Lys

Thr

130

135

140

Pro

Ser

Val

Tyr

Pro

Leu

Ala

Pro

Gly

Ser

Ala

Gin

Thr

Asn

145

150

155

160

Ser

Met

Val

Thr

Leu

Gly

Cys

Leu

Val

Lys

Gly Tyr

Phe

Pro

Glu

Pro

165

170

175

Val

Thr

Val

Thr

Trp

Asn

Ser

Gly

Ser

Leu

Ser

Gly

Val

His

Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp' Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val

210 215 220

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys íle Val Pro Arg

225 230 235 240

Asp Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Gin Lys Arg Asp Asn Val Leu Phe Gin Ala Ala Thr Asp Glu Gin

260 265 270

Pro Ala Val íle Lys Thr Leu Glu Lys Leu Val Asn íle Glu Thr Gly

275 280 285

123

Thr Gly 290

Asp Ala

Glu Gly íle Ala Ala Ala Gly Asn Phe Leu Glu Ala

295

300

Glu

Leu

Lys

Asn

Leu

Gly

Phe

Thr

Val

Thr

Arg

Ser

Lys

Ser·

Ala Gly

305

310

315

320

Leu

Val

Gly Asp

Asn

íle

Val

Gly

Lys

íle

Lys

Gly

Arg

Gly Gly

325

330

335

Lys

Asn

Leu

Mec

Ser

His

Mec

Asp

Thr

Val

Tyr

Leu

Lys Gly

340

345

350

íle

Leu

Ala

Lys

Ala

Pro

Phe

Arg

Val

Glu

Gly Asp

Lys

Ala

Tyr Gly

355

360

365

Pro

Gly

íle

Ala

Asp

Lys

Gly

Asn

Ala

Val

íle

Leu

His Thr

370 375 380

Leu

Lys

Leu

Lys

Glu

Tyr

Gly

Val

Arg

Asp

Tyr

Gly

Thr

íle Thr

385

390

395

400

Val

Leu

Phe

Asn

Thr

Asp

Glu

Lys

Gly

Ser

Phe

Gly

Ser

Arg Asp

405

410

415

Leu

íle

Gin

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Asp

Tyr

Val

Leu

Ser

Phe

Glu

420

425

430

Pro

Thr

Ser

Ala

Gly

Asp

Glu

Lys

Leu

Ser

Leu

Gly

Thr

Ser

Gly

íle

435

440

445

Ala

Tyr

Val

Gin

Val

Asn

íle

Thr

Gly

Lys

Ala

Ser

His

Ala

Gly

Ala

450

455

460

Ala

Pro

Glu

Leu

Gly

Val

Asn

Ala

Leu

Val

Glu

Ala

Ser

Asp

Leu

Val

465

470

475

480

Leu

Arg

Thr

Mec

Asn

íle

Asp

Lys

Ala

Lys

Asn

Leu

Arg

Phe

Asn

485

490

495

Trp

Thr

íle

Ala

Lys

Ala

Gly

Asn

Val

Ser

Asn

íle

Pro

Ala

Ser

500 505 510

Ala	Thr	Leu 515	Asn	Ala Asp Val	Arg Tyr Ala Arg Asn Glu Asp Phe Asp
520	525
Ala	Ala	Met	Lys	Thr Leu Glu	Glu Arg Ala Gin	Gin Lys Lys Leu Pro
	530			535		540
Glu	Ala	Asp	Val	Lys Val íle	Val Thr Arg Gly	Arg Pro Ala Phe Asn
545				550	555	560
Ala	Gly	Glu	Gly Gly Lys Lys	Leu Val Asp Lys	Ala Val Ala Tyr Tyr
				565	570	575
Lys	Glu	Ala	Gly Gly Thr Leu	Gly Val Glu Glu	Arg Thr Gly Gly Gly
			580		585	590
Thr	Asp	Ala	Ala	Tyr Ala Ala	Leu Ser Gly Lys	Pro Val íle Glu Ser
		595			600	605
Leu	Gly	Leu	Pro	Gly Phe Gly	Tyr His Ser Asp	Lys Ala Glu Tyr Val
	610			615		620
Asp	íle	Ser	Ala	íle Pro Arg	Arg Leu Tyr Met	Ala Ala Arg Leu íle
625				630	635	640
Met	Asp	Leu	Gly	Ala Gly Lys

645

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Génový konštrukt, ktorý kóduje časť zacielujúcu bunku a heterologický enzým aktivujúci predliek, na použitie ako liečivo v cicavčom hostitelovi, pričom génový konštrukt je schopný exprimovať časť zacielujúcu bunku a heterologický enzým aktivujúci predliek ako konjugát vo vnútri bunky, pričom konjugát je zacielený tak, že potom opustí bunku a je selektívne lokalizovaný na antigéne bunkového povrchu, ktorý je rozpoznávaný časťou zacieľujúcou bunku.
2. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podlá nároku 1, kde časťou zacieľujúcou bunku je protilátka.
3. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa nároku 2, kde protilátkou je anti-CEA protilátka vybraná z protilátok A5B7 a 806.077.
4. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde heterologickým enzýmom aktivujúcim predliek je karboxypeptidáza.
5. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa nároku 4, kde karboxypeptidázou je CPG2.
6. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa nároku 5, kde CPG2 má mutované polypeptidové glykozylačné miesta, aby sa odstránila alebo znížila glykozylácia po expresii v cicavčej bunke.

125
7. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podía ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 6, kde konjugátom protilátka-enzým CPG2 je fúzny proteín, v ktorom je enzým fúzovaný k C-koncu protilátky prostredníctvom ťažkého alebo lahkého reťazca protilátky, pričom dimerizácia kódovaného konjugátu po expresii sa uskutoční prostredníctvom dimerizačnej domény CPG2.
8. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa nároku 7, kde fúzny proteín je vytvorený naviazaním C-konca protilátkového ťažkého reťazca Fab k N-koncu molekuly CPG2, čím vytvorí FabCPG2, pričom dve molekuly Fab-CPG2 po expresii dimerizujú prostredníctvom CPG2, takže vytvoria konjugát (Fab-CPG2)₂9. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa nároku 4, kde karboxypeptidáza je vybraná z enzýmov [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB alebo [A248S,G251,D253K]HCPB.
10. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podía ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý obsahuje transkripčnú regulačnú sekvenciu, ktorá obsahuje promótor a regulačný prvok, pričom tento prvok obsahuje genetický vypínač na riadenie expresie génového konštruktu.
11. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podía nároku 10, kde transkripčná regulačná sekvencia obsahuje ako regulačný prvok genetický vypínač, ktorý je regulovaný prítomnosťou tetracyklínu alebo ekdyzónu.
12. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podía nároku 10 alebo 11, kde promótor je závislý na bunkovom type a je vybraný z nasledovných promótorov: karcinoembryonálny antigén (CEA), alfafetoproteín (AFP), tyrozínhydroxyláza, cholínacetyltransferáza,

126 neurónovo špecifický enoláza, inzulín, gliový kyslý fibroproteín, HER-2/neu, c-erbB2 a N-myc.
13. Génový konštrukt na použitie ako liečivo podľa ktoréhokoľvek z prechádzajúcich nárokov, ktorý je vložený v adenovíruse na prenos do cicavčieho hostiteľa.
14. Použitie génového konštruktu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 na výrobu liečiva na liečenie rakoviny u cicavcov.
15. Usporiadaný dvojzložkový systém na použitie na cicavčom hostiteíovi, vyznačujúci sa tým, že zložky obsahujú

I) prvá zložka obsahuje génový konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, a

II) druhá zložka obsahuje predliek, ktorý sa môže konvertovať na cytotoxický liek heterologickým enzýmom kódovaným prvou zložkou.
16. Usporiadaný dvojzložkový systém podlá nároku 15, vyznačujúci sa tým, že prvá zložka obsahuje gén kódujúci heterologický enzým CPG2, a predliek v druhej zložke je vybraný zo skupiny obsahujúcej N-(4-[Ν,Ν-bis(2-jodoetyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-[4-[Ν,Ν-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovej a N-{4-[Ν,Ν-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-Lglutámovú kyselinu alebo ich farmaceutický prijateľné soli.
17. Spôsob podávania cytotoxického liečiva na určené miesto, vyznačujúci sa tým, že obsahuje krok, keď sa podá hostiteľovi prvá zložka, ktorá obsahuje génový konštrukt podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, potom nasleduje podanie

127 druhej zložky, ktorá obsahuje predliek, ktorý sa môže konvertovať na cytotoxický liek heterologickým enzýmom kódovaným prvou zložkou.
18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že prvá zložka obsahuje gén kódujúci heterologický enzým CPG2 a predliek v druhej zložke je vybraný zo skupiny obsahujúcej N — (4— - [N,N-bis(2-jodoetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu, gama-(3,5-dikarboxy)anilid kyseliny N-[4-[N,N-bis(2-chloroetyl)amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovej a N-{4-[N,N-bis(2-chloroetyl) amino]-fenoxykarbonyl)-L-glutámovú kyselinu alebo ich farmaceutický prijateľné soli.