ES2314990T3 - Construccion de gen que codifica una enzima heterologa que activa un profarmaco y un resto reconocedor de celulas. - Google Patents

Abstract

Una construcción génica que codifica un anticuerpo reconocedor de células y una enzima heteróloga activadora de un profármaco para usar como un medicamento en un huésped mamífero en el que la construcción génica es capaz de expresar el anticuerpo reconocedor de células y la enzima heteróloga activadora del profármaco como un conjugado dentro de una célula en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el resto reconocedor de la célula.

Description

Construcción de gen que codifica una enzima heteróloga que activa un profármaco y un resto reconocedor de células.

Esta invención se refiere particularmente a una terapia enzima profármaco dirigida por un gen (GDEPT) usando la generación de anticuerpos in situ para proporcionar selectividad mejorada, particularmente para usar en terapia contra el cáncer.

Propuestas terapéuticas de profármaco basadas en terapia génica conocida incluyen terapia enzima profármaco dirigida por un virus (VDEPT) y terapia profármaco de enzima dirigida a un gen (GDEPT), abarcando el último término tanto VDEPT como sistemas de reparto no virales. VDEPT implica reconocer células tumorales con un vector viral que lleva un gen que codifica una enzima capaz de activar un profármaco. El vector viral entra en la célula tumoral y la enzima se expresa desde el gen enzimático dentro de la célula. En GDEPT, pueden usarse propuestas alternativas tales como microinyección, reparto liposomal y absorción de ADN mediado por un receptor además de virus, para repartir el gen que codifica la enzima.

Tanto en VDEPT como en GDEPT, el gen enzimático puede regularse de forma transcripcional por las secuencias de ADN capaces de activarse selectivamente en células de mamíferos, por ejemplo, células tumorales (documento EP 415 731 (Wellcome); Huber et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8039-8043,1991). Mientras se de algún grado de selectividad, la expresión génica puede darse además en células que no son diana y esto es claramente indeseable cuando la propuesta se está usando para activar profármacos en potentes agentes citotóxicos. Además, estas secuencias regulatorias llevarán generalmente a la expresión reducida de la enzima comparado con el uso de promotores virales, y esto llevará a una capacidad reducida para convertir el profármaco en el tejido diana.

La expresión y localización de la enzima activadora del profármaco dentro de la célula tiene desventajas. El diseño de profármacos está gravemente limitado por el hecho de que el profármaco tiene que ser capaz de cruzar la membrana celular y entrar en la célula, aunque no ser tóxico hasta que se convierta al fármaco dentro de la célula mediante la enzima de activación. La mayoría de profármacos utilizan grupos hidrofílicos para evitar la entrada celular y así reducir la citotoxicidad. El movimiento del profármaco por la activación de la enzima produce un fármaco menos hidrofílico que puede entrar a las células para producir efectos anti-cancerígenos. Esta propuesta no puede usarse cuando la enzima de activación se expresa dentro de la célula. Otra desventaja es que las células diana que carecen de enzima de activación intracelular serán difíciles de atacar porque no son capaces de generar fármaco activo. Para alcanzar esta "actividad de paso" deseable (o "muerte de la célula vecina"), el fármaco activo tendrá que ser capaz de difusión fuera de la célula que contiene enzima de activación para alcanzar las células diana que carecen de expresión enzimática. Muchos fármacos activos, cuando se producen dentro de una célula, será imposible que escapen de la célula para alcanzar este efecto de paso.

Las modificaciones de GDEPT se han presentado para superar algunos de los problemas descritos anteriormente. En primer lugar, se han descrito vectores que se dice que expresan la enzima de activación en la superficie de la célula diana (documento WO 96/03515) uniendo un péptido señal y un dominio transmembrana a la enzima de activación. La propuesta, si es viable, superaría los problemas de tener la enzima de activación dentro de la célula aunque tendría aún que contar con secuencias reguladas transcripcionalmente capaces de expresarse selectivamente en células diana para restringir la expresión celular. Como se describe anteriormente, hay desventajas por el uso de dichas secuencias. En segundo lugar, se han descrito vectores que dan por resultado la secreción de la enzima de la célula diana (documento WO 96/16179). En esta propuesta, la enzima sería capaz de difundirse de su sitio de generación ya que es extracelular y no se une a la superficie celular. La enzima que se ha difundido del sitio diana sería capaz de activar el profármaco a sitios distintos de la diana conduciendo a una toxicidad indeseada. Para alcanzar alguna selectividad se sugiere que puedan usarse precursores enzimáticos, que se rompen por proteasas asociadas a patologías, para formar la enzima activa. Es probable que se alcance alguna selectividad por esta propuesta, aunque es improbable que la activación solo se de en sitios diana. Además, una vez activada, la enzima estará aún libre para difundirse del sitio diana y sufrir así por el mismo inconveniente descrito anteriormente.

Para las propuestas de GDEPT, pueden observarse tres niveles de selectividad. Primero, hay selectividad en la etapa de infección celular, de modo que solo se reconocen tipos específicos de células. Por ejemplo, la selectividad celular puede proporcionarse por el sistema de reparto génico per se. Un ejemplo de este tipo de selectividad se expone en la Solicitud de Patente Internacional WO 95/26412 (UAB Research Foundation) que describe el uso de proteínas de fibra de adenovirus modificado, que incorporan ligandos celulares específicos. Otros ejemplos de reconocimiento celular específico incluye la transferencia génica ex vivo a poblaciones celulares específicas tal como linfocitos e inyección directa de ADN en tejido muscular.

El segundo nivel de selectividad es el control de la expresión génica después de la infección celular tal como por ejemplo por el uso de promotores específicos de células o tejido. Si el gen se ha repartido a un tipo de célula de una manera selectiva, entonces es importante que se elija un promotor que sea compatible con la actividad en el tipo de célula.

El tercer nivel de selectividad puede considerarse como la selectividad de la construcción génica expresada. La selectividad a este nivel ha recibido escasa atención hasta la fecha. En la Solicitud de Patente Internacional WO 96/16179 (Wellcome Foundation) se sugiere que podrían usarse precursores enzimáticos que se rompen por proteasas asociadas a la patología para formar la enzima activa. Es probable que se alcance alguna selectividad por esta propuesta, aunque es improbable que la activación solo se de en sitios diana. Además, una vez activada, la enzima estará aún libre para difundirse desde el sitio diana y sufrir así el mismo inconveniente del profármaco de activación en sitios no reconocidos conduciendo a toxicidad indeseada.

Existe una necesidad de sistemas GDEPT más selectivos para reducir los efectos indeseados en tejidos normales que surjan de la activación errónea de profármacos.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que las construcciones génicas de anticuerpo-enzima heteróloga, pueden expresarse intracelularmente y usarse en sistemas GDEPT (u otros sistemas tal como AMIRACS - véase debajo) para elevar el reconocimiento celular a partir de la especificidad del anticuerpo para repartir enzima disponible a la superficie celular de una forma selectiva. Esta propuesta puede usarse opcionalmente en combinación con cualquier otra técnica(s) de mejora de especificidad adecuada tal como la infección celular reconocida y/o expresión específica del tejido.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción génica que codifica un anticuerpo reconocedor de células y una enzima heteróloga para usar como medicamento en un huésped mamífero en el que la construcción génica es capaz de expresar el anticuerpo y la enzima como un conjugado dentro de una célula diana en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el anticuerpo.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción génica que codifica un resto reconocedor de células y una enzima heteróloga activadora del profármaco para usar como medicamento en un huésped mamífero en el que la construcción génica es capaz de expresar el resto reconocedor de células y la enzima heteróloga activadora del profármaco como un conjugado dentro de una célula en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el resto reconocedor de células.

El "resto reconocedor de células" se define como cualquier polipéptido o fragmento del mismo que enlaza selectivamente a un tipo particular de célula en un huésped mediante el reconocimiento de un antígeno de la superficie celular. Preferiblemente, el resto reconocedor de células es un anticuerpo. Los restos reconocedores de células distintos de anticuerpos incluyen ligandos como se describen para usar en Terapia Enzima Profármaco Dirigida por un Ligando, como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 97/26918, Cancer Research Campaign Technology Limited, tal como por ejemplo factor de crecimiento epidérmico, heregulina, c-erbB2 y factor de crecimiento endotelial vascular, prefiriéndose el último.

El "anticuerpo reconocedor de células" se define como un anticuerpo o fragmento del mismo que enlaza selectivamente a un tipo particular de célula en un huésped mediante el reconocimiento de un antígeno de la superficie celular. Anticuerpos reconocedores de células preferidos son específicos para tumores sólidos, más preferiblemente tumores colorectales, más preferiblemente un anticuerpo anti-CEA, más preferiblemente un anticuerpo A5B7 o anticuerpo 806.077 con el anticuerpo 806.077 prefiriéndose especialmente. El anticuerpo hibridoma 806.077 se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology & Reseach, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, el 29 de Febrero de 1996 con el número de acceso 96022936 de acuerdo con el Tratado de Budapest.

El anticuerpo A5B7 enlaza al antígeno carcinoembrionario humano (CEA) y es particularmente adecuado para reconocer el carcinoma colorectal. El anticuerpo A5B7 está disponible por DAKO Ltd., 16 Manor Courtyard, Hughenden Avenue, High Wycombe, Bucks HP13 5RE, Inglaterra, Reino Unido. En general, el conjugado de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) - enzima sería al menos divalente, que es decir que es capaz de enlazarse a al menos 2 antígenos asociados al tumor (que pueden ser el mismo o diferentes). Las moléculas de anticuerpo pueden humanizarse por métodos conocidos tal como por ejemplo, "injertando CDR" como se describe en el documento EP239400 o injertando regiones variables completas de por ejemplo, un anticuerpo de murina en regiones constantes humanas ("anticuerpos quiméricos") como se describe en el documento US 4816567. Los anticuerpos humanizados pueden ser útiles para reducir la inmunogenicidad de un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo). Una versión humanizada del anticuerpo A5B7 se ha descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/01059 (Celltech).

El hibridoma que produce anticuerpo monoclonal A5B7 se depositó con la Colección Europea de Cultivos Celulares Animales, División de Compuestos Biológicos, PHLS Centre for Applied Microbiology & Reseach, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Reino Unido. La fecha de depósito fue el 14 de Julio de 1993 y el número de acceso es nº 93071411. El anticuerpo A5B7 puede obtenerse a partir del hibridoma depositado usando técnicas estándar conocidas en la técnica como se documenta en Fenge C, Fraune E & Schuegerl K en "Production of Biologicals from Animal Cells in Culture" (Spier RE, Griffiths JR & Meignier B, eds) Butterworth-Heinemann, 1991, 262-265 y Anderson BL & Gruenberg ML en "Commercial Production of Monoclonal Antibodies" (Seaver S, ed), Marcel Dekker, 1987, 175-195. Las células pueden necesitar la re-clonación de vez en cuando limitando la dilución para mantener buenos niveles de producción de anticuerpo.

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Una "enzima heteróloga" se define como una enzima para remover un sustrato que se ha administrado al huésped y la enzima no está presente de forma natural en el compartimiento pertinente del huésped. La enzima puede ser extraña al huésped mamífero (por ejemplo, una enzima bacteriana como CPG2) o puede no darse de forma natural dentro del compartimiento huésped pertinente (por ejemplo, el uso de lisozima como una enzima ADEPT (para una explicación de ADEPT véase debajo) es posible porque la lisozima no se da de forma natural en la circulación, véase el documento US 5433955, Akzo NV). El compartimiento huésped pertinente es aquella parte del huésped mamífero en que se distribuye el sustrato. Enzimas preferidas son enzimas adecuadas para ADEPT o AMIRACS (Antimetabolito con Inactivación de Agentes de Rescate en Sitios Cancerígenos; véase Bagshawe (1994) en Cell Biophysics 24/25, 83-91) aunque se prefieren las enzimas ADEPT. La terapia de enzima profármaco dirigida por un anticuerpo (ADEPT) es una propuesta terapéutica conocida para el cáncer. ADEPT usa un anticuerpo selectivo del tumor conjugado con una enzima. El conjugado se administra al paciente (normalmente de forma intravenosa), se deja localizar el(los) sitio(s)
tumorales y limpiar la sangre y otros tejidos normales. Entonces se administra un profármaco al paciente que se convierte por la enzima (localizada en el sitio del tumor) en un fármaco citotóxico que mata las células tumorales.

La Solicitud de Patente Internacional WO 96/20011, publicada el 4 de Julio del 96, propone un sistema ADEPT de "polaridad inversa" basado en enzimas humanas mutantes que tienen la ventaja de baja inmunogenicidad en comparación con, por ejemplo, las enzimas bacterianas. Una enzima huésped particular era la CPB pancreática humana (véase por ejemplo, Ejemplo 15 CPB [D253K]humana, 16 CPB [D253R]humana en el mismo) y profármacos de la misma (véase Ejemplos 18 & 19 en el mismo). La enzima huésped se muta para dar un cambio en el modo de interacción entre la enzima y el profármaco en términos de reconocimiento del sustrato en comparación con la enzima nativa del huésped. En la posterior Solicitud de Patente Internacional No PCT/GB96/01975 (publicada el 6 de Marzo del 97 como documento WO 97/07796) se describen combinaciones enzima CPB mutante/profármaco que siguen trabajando para ADEPT. Enzimas preferidas adecuadas para ADEPT son cualquiera de CPG2 o una enzima CPB de polaridad inversa, por ejemplo cualquiera de [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB o [A248S,G251T,D253K]HCPB. Una forma preferida de CPG2 es una en que los sitios de glicosilación de polipéptidos se han mutado, para así evitar o reducir la gicosilación en la expresión de células de mamíferos (véase el documento WO 96/03515, Cancer Research Campaign Technology); dando actividad enzimática mejorada. Consideraciones adicionales surgen para enzimas tales como CPB que necesitan un pro dominio para facilitar el plegamiento correcto; aquí el pro dominio puede o bien expresarse como un separado (en trans) o expresarse como parte de una proteína de fusión y eliminarse posteriormente.

La purificación a gran escala de CPG2 a partir de Pseudomonas RS-16 se describió en Sherwood et al (1985), Eur, J. Biochem., 148, 447 - 453. La CPG2 puede obtenerse del Centro para Microbiología Aplicada e Investigación, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido. La CPG2 también puede obtenerse por técnicas recombinantes. La secuencia codificadora de nucleótidos de CPG2 se ha publicado por Minton, N.P. et al., Gene, 31 (1984), 31-38. La expresión de la secuencia de codificación se ha presentado en E. coli (Chambers, S.P. et al., Appl. Microbiol, Biotechnol. (1988), 29, 572-578) y en Saccharomyces cerevisiae (Clarke, L. E. et al., J. Gen Microbiol, (1985) 131, 897-904). La síntesis génica total se ha descrito por M. Edwards en Am. Biotech. Lab (1987), 5, 38-44. La expresión de proteínas heterólogas en E. coli se han estudiado por F.A.O. Marston en ADN Cloning Vol. III, Practical Approach Series, IRL Press (Editor D M Glover), 1987, 59-88. La expresión de proteínas en levadura se ha estudiado en Methods in Enzymology Volume 194, Academic Press 1991, Editado por C. Guthrie y G R Fink.

Mientras se prefieren propuestas terapéuticas para el cáncer, la invención puede aplicarse también a otras áreas terapéuticas mientras pueda seleccionarse un antígeno diana y prepararse una combinación enzima/profármaco adecuada. Por ejemplo, pueden tratarse enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, usando por ejemplo un anticuerpo selectivo para células sinoviales condensadas a una enzima capaz de convertir un fármaco anti-inflamatorio en forma de un profármaco en un fármaco anti-inflamatorio. El uso de anticuerpos para reconocer la enfermedad de artritis reumatoide se ha descrito en Blakey et al, 1988, Scand. J. Rheumatology, Suppl. 76, 279-287.

Un "conjugado" entre anticuerpo y enzima puede ser una proteína de fusión (unión covalente) o el conjugado puede estar formado por enlace no covalente entre el anticuerpo y la enzima formado in situ. Preferiblemente, el conjugado está en la forma de una proteína de fusión, más preferiblemente el componente de anticuerpo de la fusión es al menos divalente (por avidez de enlace mejorado en comparación con el anticuerpo monovalente). Se prefieren las construcciones de anticuerpo con falta de una parte Fc, especialmente fragmentos Fab o F(ab')_{2}. Para fusiones CPG2 (o fusiones con cualquier enzima monomérica), se aplican consideraciones especiales porque CPG2 es una enzima dimérica y el anticuerpo es preferiblemente divalente, existiendo así el potencial para la dimerización competitiva indeseable entre dos especies moleculares. Por lo tanto, una fusión CPG2 preferida es una en que la proteína de fusión se forma mediante la unión de un C-terminal de una cadena pesada Fab de un anticuerpo (es decir, que le falta una región bisagra) a un N-terminal de una moléculas CPG2; dos de estas moléculas Fab-CPG2 de dimerizan entonces mediante el dominio de dimerización de CPG2 para formar un conjugado (Fab-CPG2)_{2}. Para construcciones de anticuerpo con enzimas monoméricas, se prefieren fragmentos F(ab')_{2}, especialmente fragmentos F(ab')_{2} que tienen una región bisagra IgG3 humana. Las fusiones entre anticuerpo y enzima pueden efectuarse opcionalmente a través de péptidos cortos de unión tal como por ejemplo (G_{4}S)_{3}. Las construcciones de fusión preferidas son aquellas en que la enzima se fusiona al C-terminal del anticuerpo, mediante la cadena pesada o ligera del mismo, prefiriéndose la fusión a través de la cadena pesada del anticuerpo. En consecuencia, una construcción génica preferida es una construcción génica para usar como un medicamento como se describe en este documento, en que el conjugado anticuerpo-enzima CPG2 es una proteína de fusión en que la enzima se fusiona al C-terminal del anticuerpo a través de la cadena pesada o ligera del mismo, a través del cual la dimerización del conjugado codificado cuando se expresa, puede tener lugar a través del dominio de dimerización en el CPG2. Una construcción génica más preferida es una construcción génica para usar como un medicamento en la que la proteína de fusión se forma a través de la unión a un C-terminal de una cadena pesada Fab del anticuerpo a un N-terminal de una molécula CPG2 para formar un Fab-CPG2 a través de la cual dos moléculas Fab-CPG2 cuando se expresan, se dimerizan a través de CPG2 para formar un conjugado (Fab-CPG2)_{2}.
En otra realización de la invención, una construcción génica preferida para usar como un medicamento es una en la que la carboxipeptidasa se selecciona de [D253K]HCPB, [G251T,D253K]HCPB o [A248S,G251T,D253K]HCPB.

Se contempla que podría ser posible obtener una enzima multimérica natural en forma monomérica mientras retiene esencialmente la actividad enzimática, entonces la forma monomérica de la enzima podría usarse para formar un conjugado de la invención. De forma similar, se contempla que podría ser posible obtener una enzima monomérica natural en forma multimérica mientras retiene esencialmente la actividad enzimática, entonces la forma multimérica de la enzima podría usarse para formar un conjugado de la invención.

El conjugado está dirigido para abandonar la célula después de la expresión a través del uso de una secuencia directora secretora que se parte cuando el conjugado pasa a través de la membrana celular. Preferiblemente, el director secretor es el director secretor que se da de forma natural con el anticuerpo.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una construcción génica que codifica un anticuerpo reconocedor de células y una enzima heteróloga para usar para la fabricación de un medicamento para la terapia de cáncer en un huésped mamífero en el que la construcción génica es capaz de expresar el anticuerpo y la enzima como un conjugado dentro de una célula diana en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el anticuerpo.

Cualquier sistema de reparto adecuado puede aplicarse para repartir la construcción génica de la presente invención que incluye sistemas virales y no virales. Los sistemas virales incluyen vectores retrovirales, vectores adenovirales, virus adeno-asociados, vaccinia, virus de herpes simple, VIH, virus diminuto de los ratones, virus de la hepatitis B y virus de la gripe. Sistemas no víricos incluyen ADN no complejado, complejos ADN-liposoma, complejos ADN-proteína y partículas de oro recubiertas de ADN.

Los vectores retrovirales carecen de proteínas inmunogénicas y no hay inmunidad del huésped pre-existente, aunque están limitadas a infectar células en división. Los retrovirus se han usado en ensayos clínicos (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 1990, 323: 570-578). Los retrovirus están compuestos de un genoma de RNA que está empaquetado en una cobertura derivada de la membrana celular huésped y proteína virales. Para la expresión génica, debe primero transcribir de forma inversa su genoma de RNA de hebra positiva en ADN de doble hebra, que se integra entonces en el ADN de la célula huésped usando la proteína transcriptasa inversa e integrasa contenida en la partícula de retrovirus. El provirus integrado es capaz de usar el sistema celular para la expresión génica.

El virus de la leucemia de murina se usa ampliamente (Miller et al., Methods Enzymol., 1993, 217: 581-599). Los vectores retrovirales están construidos eliminando los genes gag, pol y env para hacer espacio para la carga pertinente y para eliminar las funciones replicativas del virus. Los mRNA codificados víricamente se eliminan y esto elimina cualquier respuesta inmune potencial a las células transducidas. Los genes que codifican la resistencia antibiótica se incluyen a menudo como un medio de selección. Las funciones de promoción y potenciación también pueden incluirse, por ejemplo, para proporcionar la expresión específica del tejido después de la administración in vivo. Las funciones de promoción y potenciación contenidas en la repetición terminal larga también pueden usarse.

Estos virus pueden producirse solo en líneas celulares de empaquetamiento vírico. La línea celular de empaquetamiento puede construirse insertando de forma estable los genes virales eliminados (gag, pol. y env) en la célula de forma que residan en diferentes cromosomas para evitar la recombinación. La línea celular de empaquetamiento se usa para construir una línea celular productora que generará retrovirus defectuosos en replicación que contienen el gen de carga pertinente insertando el ADN proviral recombinante. El plásmido de ADN que contiene secuencias de repetición terminal largas flanqueando una pequeña porción de gen gag que contiene la secuencia de encapsulación, y los genes de interés se transfieren a la línea celular de empaquetamiento usando técnicas estándar para la transferencia y absorción de ADN (electroporación, precipitación con calcio, etc.). Variantes de esta propuesta se han empleado para disminuir la probabilidad de producción de virus competentes para la replicación (Jolly, D., Cancer Gene Therapy, 1994, 1, 51-64). El intervalo de célula huésped del virus se determina por el gen de envoltura (env) y puede emplearse la sustitución de genes env con diferentes especificidades celulares. La incorporación de ligandos apropiados en la proteína de envoltura puede usarse también para el reconocimiento.

La administración puede alcanzarse por cualquier técnica adecuada, por ejemplo, transducción ex vivo de células pacientes, por la inyección directa de virus en el tejido, y por la administración de las células productoras retrovirales.

La propuesta ex vivo tiene una desventaja en que necesita el aislamiento y mantenimiento en cultivo del tejido de las células pacientes, aunque tiene la ventaja de que la extensión de transferencia génica puede cuantificarse fácilmente y puede reconocerse una población específica de células. Además, puede alcanzarse un alto grado de partículas virales a células diana y así mejorar la eficacia de transducción (Anderson et al., Hum. Gene Ther., 1990, 1: 331-341; Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 1990, 323: 570-578; Culver et al., Hum. Gene Ther., 1991, 2: 107-109 Nienhuis et al., Cancer, 1991, 67: 2700-2704, Anderson et al., Hum. Gene Ther., 1990, 1: 331-341, Grossman et al., Nat. Genet., 1994, 6: 335-341, Lotze et al., Hum. Gene Ther., 1992, 3: 167-177; Lotze, M.T., Cell Transplant., 1993, 2: 33-47; Lotze et al., Hum. Gene Ther., 1994, 5: 41-55 y patente de EE.UU. 5399346 (Anderson). En algunos casos, la introducción directa de virus in vivo es necesaria. Los retrovirus se han usado para tratar tumores cerebrales en los que la capacidad de un retrovirus de infectar solo células en división (células tumorales) puede ser particularmente ventajosa.

Para aumentar la eficacia, Oldfield et al., en Hum. Gene Ther., 1993, 4: 39-69 propuso la administración de una línea celular productora de retrovirus directamente en tumores cerebrales de los pacientes. La célula productora de murina sobreviviría dentro del tumor cerebral durante un periodo de días, y secretaría retrovirus capaces de transducir el tumor cerebral circundante. Los virus que portan el gen timidina quinasa del virus del herpes dan células susceptibles de matar mediante ganciclovir, que se metaboliza a un compuesto citotóxico mediante la timidina quinasa. Las referencias de patentes en retrovirus son: EP 334301, WO 91/02805 & WO 92/05266 (Viagene) y; US 4650764 (Universidad de Wisconsin).

Las infecciones adenovirales humanas se han descrito (véase Horwitz, M.S., en Virology, 2ª ed. Raven Press, Nueva York, 1990, pp. 1723-1740). La mayoría de los adultos tienen una exposición previa al adenovirus y tienen anticuerpos anti-adenovirus. Estos virus poseen un genoma de ADN de doble hebra, y replican independientemente de la división de las células huésped.

Los vectores adenovirales poseen propiedades ventajosas. Son capaces de transducir un amplio espectro de los tejidos humanos y pueden obtenerse altos niveles de expresión génica en células en división y sin división. Pueden usarse varias rutas de administración que incluyen inyección intravenosa, intrabiliar, intraperitoneal, intravesicular, intracraneal e intratecal, e inyección directa al órgano diana. Así, el reconocimiento basado en límites anatómicos es posible.

El genoma adenoviral codifica aproximadamente 15 proteínas y la infección implica una proteína de fibra para enlazar al receptor de la superficie celular. La base pentón del cápside que une dominios del receptor de la integrina (\alpha_{3}\beta_{3}, o \alpha_{3}\beta_{5}) en la superficie celular da por resultado la internalización del virus. El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción sin división celular. La expresión y replicación está bajo control por los genes E1A y E1B (véase Horwitz, M.S., en Virology, 2ª ed., 1990, pp. 1723-1740). La eliminación de los genes E1 da la replicación incompetente del virus. La expresión de proteínas adenovirales lleva a ambas a una respuesta inmune que puede limitar la eficacia, particularmente en la administración repetida. Sin embargo, propuestas recientes en que otros genes adenovirales tales como el gen E2a (que controla la expresión de la acumulación de fibra y un número de otras proteínas) también se eliminan del genoma viral pueden abolir o reducir mucho la expresión de muchas de estas proteínas virales en las células diana.

Los serotipos adenovirales 2 y 5 se han usado extensamente para la construcción del vector. Bett et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91: 8802-8806 han usado un sistema vector adenoviral tipo 5 con supresiones de los genes adenovirales E1 y E3. La línea celular del riñón embrionario humano 293 se ha manipulado para expresar proteínas E1 y puede así transcomplementar el genoma viral deficiente en E1. El virus puede aislarse del medio celular 293 y purificarse por ensayos de placa de dilución limitada (Graham, F.L. y Prevek, L. en Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press 1991, pp. 109-128). El virus recombinante puede hacerse crecer en los cultivos de la línea celular 293 y aislarse mediante lisis de células infectadas y purificación por centrifugado por densidad en cloruro de cesio. Un problema de las células 293 para la fabricación de adenovirus recombinante es que, debido a las regiones adicionales de flanqueo de los genes E1, es que pueden ocasionar la replicación de adenovirus competente (RCA) durante la producción de partículas virales. Aunque este material es solo adenovirus de tipo salvaje y no replicación de virus recombinante competente, puede tener efectos significativos en el rendimiento eventual del material adenoviral deseado y llevar a aumentar los costes de fabricación, ensayos de control de calidad para las marchas de producción y aceptación de las cargas para el uso clínico. Se han desarrollado líneas celulares alternativas tales como el PER.C6 que tiene más definida la integración del gen E1 que las células 293 (es decir, no contienen secuencias virales de flanqueo), que no permiten los casos de recombinación que producen RCA y así tienen el potencial de superar los ensayos de producción viral anteriores.

Los vectores adenovirales tienen la desventaja de la duración relativamente corta de la expresión transgénica debido al despeje del sistema inmune y la pérdida dilucional durante la división de la célula diana, aunque se anticipan mejoras en el diseño del vector. Las referencias de patentes en adenovirus son: WO 96/03517 (Boehringer); WO 96/13596 (Rhone Poulenc Rorer); WO 95/29993 (Universidad de Michigan) y; WO 96/34969 (Canji). Avances recientes en vectores adenovirales para la terapia génica del cáncer incluyen el desarrollo de estrategias para reducir la inmunogenicidad, los vectores adenovirales/retrovirales quiméricos y los sistemas adenovirales recombinantes replicativos condicionales (o restringidos) se estudian en Bilbao et al., Exp. Opin. Ther. Patents, 1997, 7 (12):1427-1446.

Los virus adeno-asociados (AAV) (Kotin, R.M., Hum. Gene Ther., 1994, 5: 793-801) son parvovirus no autónomos, con ADN de una sola hebra, capaces de integrarse en el genoma de células que no se dividen de un muy amplio intervalo de huéspedes. Los AAV no se han mostrado que estén asociados con la enfermedad humana y no obtienen una respuesta inmune.

El AAV tiene dos fases distintas en el ciclo de la vida. Los virus de tipo salvaje infectarán una célula huésped, se integrarán y permanecerán latentes. En presencia de adenovirus, la fase lítica del virus es inducida, que es dependiente de la expresión de genes adenovirales tempranos, y lleva a activar la replicación vírica. El genoma de AAV está compuesto de dos estructuras de lectura abiertas (llamadas rep y cap) flanqueadas por secuencias de repetición terminales invertidas (ITR). La región rep codifica cuatro proteínas que median la replicación de AAV, transcripción de ADN viral y funciones de endonucleasa usadas en la integración del genoma del huésped. Los genes rep son las únicas secuencias AAV necesarias para la replicación viral. La secuencia cap codifica proteínas estructurales que forman el cápside viral. Los ITR contienen los orígenes virales de replicación, proporcionan señales de encapsulación y participan en la integración del ADN viral. Los virus recombinantes, de replicación defectuosa, que se han desarrollado para la terapia génica carecen de las secuencias rep y cap. El AAV de replicación defectuosa puede producirse por co-transferencia de los elementos necesarios separados para la replicación de AAV en una línea celular 293 permisiva. Las referencias de patentes de AAV incluyen: WO 94/13788 (Universidad de Pittsburgh) y US 4797368 (Departamento de Salud de EE.UU.).

Se han descrito vectores de terapia génica de virus pox (Moss, B. y Flexner, C., Annu. Rev. Immunol., 1987, 5: 305-324; Moss, B., In Virology, 1990, pp. 2079-2111). La vaccinia son virus grandes, de ADN recubierto, que replican en el citoplasma de las células infectadas. Se infectan células que no se dividen y que se dividen de muchos tejidos diferentes, y se observa la expresión génica de un genoma no integrado. El virus recombinante puede producirse insertando el transgen en un plásmido derivado de vaccinia y transfectando este ADN en células infectadas por vaccinia donde la recombinación de homólogos lleva a la producción de virus. Una desventaja significativa es que obtiene una respuesta inmune del huésped a las proteínas codificadas viralmente 150 a 200, haciendo problemática la administración repetida.

El virus del herpes simple es un virus grande, de ADN de doble hebra, que replica en el núcleo de las células infectadas adecuadas para el reparto génico (véase Kennedy, P.G.E. y Steiner, I., Q.J. Med., 1993, 86: 697-702). Las ventajas incluyen amplio intervalo de células huésped, infección de células que se dividen y que no se dividen, y grandes secuencias de ADN extraño pueden insertarse en el genoma viral por recombinación de homólogos. Las desventajas son la dificultad en dar preparados virales libres de virus de replicación competente y una potente respuesta inmune. La supresión del gen viral de timidina quinasa da el virus de replicación defectuosa en células con bajos niveles de timidina quinasa. Las células que sufren la división celular activa (por ejemplo, células tumorales) poseen suficiente actividad de timidina quinasa para permitir la replicación. Cantab Pharmaceuticals tienen una solicitud de patente publicada de virus del herpes (documento WO 92/05263).

Una variedad de otros virus, que incluyen VIH, el virus diminuto de los ratones, virus de hepatitis B y virus de la gripe, se han considerado como vectores posibles para la transferencia génica (véase Jolly, D., Cancer Gene Therapy, 1994, 1: 51-64).

El uso de la bacteria atenuada de Salmonella Typhimurium que reconoce específicamente y replica en medios hipóxicos (tal como se encuentra en los centros necróticos de tumores) como vehículos de reparto génico para terapia basada en profármaco enzima (Terapia de Profármaco Enzima Amplificado por Tumor conocido como TAPET^{TM}) también se han propuesto y está en desarrollo por Vion Pharmaceuticals. Este sistema ofrece una alternativa de reparto génico adicional a la propuesta de reparto viral y no viral tratado posteriormente.

Las estrategias de reparto de ADN no viral también son aplicables. Estos sistemas de reparto de ADN incluyen plásmidos de ADN no complejado, complejos ADN-liposoma, complejos ADN-proteína y partículas de oro recubiertas de ADN.

Puede inyectarse directamente ácido nucleico purificado en tejidos y da por resultado la expresión génica transitoria, por ejemplo, en tejido muscular, particularmente eficaz en músculo en regeneración (Wolff et al., Science, 1990, 247: 1465-1468). Davis et al., en Hum. Gene Ther., 1993, 4: 733-740 ha publicado en inyección directa de ADN en músculo maduro. Se prefiere generalmente músculo esquelético y cardiaco. Las referencias de patentes son: WO 90/11092, US 5589466 (Vical) y WO 97/05185 (hidrogeles impregnados de ADN biodegradable para inyección, Focal).

El plásmido de ADN en partículas de oro puede "dispararse" en las células (por ejemplo, epidermis o melanoma) usando una pistola génica. El ADN se coprecipita en la partícula de oro y después se dispara usando una chispa eléctrica o gas presurizado como propelente (Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90: 11478-11482). La electroporación se ha usado también para permitir la transferencia de ADN en tumores sólidos usando sondas de electroporación que emplean colecciones multi-aguja y campos eléctricos rotatorios, pulsados (Nishi et al., en Cancer Res., 1996, 56:1050-1055). Se ha reivindicado la transferencia génica de alta eficacia a tumores subcutáneos con mejora significativa de transfección celular y mejores características de distribución sobre los procedimientos de inyección intra-tumoral.

Los liposomas trabajan rodeando las moléculas hidrofílicas con moléculas hidrofóbicas para facilitar la entrada celular. Los liposomas son esferas unilaminares o multilaminares hechas de lípidos. La composición lipídica y los procesos de fabricación afectan a la estructura del liposoma. Otras moléculas pueden incorporarse en las membranas lipídicas. Los liposomas pueden ser aniónicos o catiónicos. Nicolau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1983, 80: 1068-1072 ha publicado la expresión de la insulina a partir de liposomas aniónicos inyectados en ratas. Los liposomas aniónicos principalmente reconocen las células reticuloendoteliales del hígado, a menos que se reconozca otra cosa. Las moléculas pueden incorporarse en la superficie de los liposomas para alterar su comportamiento, por ejemplo, reparto selectivo a la célula (Wu, G.Y. y Wu, C.H., J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432).

Felgner et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1987, 84: 7413-7417 ha publicado de liposomas catiónicos, ha demostrado su enlace de ácidos nucleicos por interacciones electrostáticas y ha mostrado la entrada celular. La inyección intravenosa de liposomas catiónicos conduce a la expresión transgénica en la mayoría de los órganos en inyección en el suministro de sangre aferente al órgano. Los liposomas catiónicos pueden administrarse mediante aerosol para reconocer el epitelio del pulmón (Brigham et al., Am. J. Med. Sci., 1989, 298: 278-281). Las referencias de patentes en liposomas son: WO 90/11092, WO 91/17424, WO 91/16024, WO 93/14788 (Vical) y; WO 90/01543 (Intracel).

Se han publicado estudios in-vivo con reparto transgénico de liposomas catiónico por: Nabel et al., Rev. Hum. Gene Ther., 1994, 5: 79-92; Hyde et al., Nature, 1993, 362: 250-255 y; Conary et al., J. Clin. Invest., 1994, 93: 1834-1840).

Las micropartículas se han estudiado como sistemas para el reparto de ADN a células fagocíticas, dichas propuestas se han comprado por Pangaea Pharmaceuticals en su sistema de reparto en microencapsulación de ADN ENDOSHERE^{TM}, que se ha usado para efectuar la transducción más eficaz de células gafocíticas tal como macrófagos que ingieren las microesferas. Las microesferas encapsulan plásmidos de ADN que codifican péptidos potencialmente inmunogenéticos, que cuando se expresan llevan a mostrar el péptido por medio de moléculas MHC en la superficie celular que puede estimular la respuesta frente a dichos péptidos y secuencias de proteína que contienen los mismos epítopes. Esta propuesta se apunta actualmente hacia un papel potencial en un desarrollo de una vacuna anti-tumoral y patógena, aunque puede tener otras posibles aplicaciones de terapia génica.

De la misma forma que los polímeros sintéticos se han usado para empaquetar ADN, las proteínas de recubrimiento viral natural que son capaces de auto-montaje homogéneo en partículas parecidas a virus (VLPs) se han usado para empaquetar ADN. La principal proteína de recubrimiento estructural VP1 del virus de polioma humano, puede expresarse como una proteína recombinante y es capaz de empaquetar plásmido de ADN durante el auto-montaje en una VLP. Las partículas resultantes pueden usarse posteriormente para transducir diversas líneas celulares, mientras que estudios preliminares muestran poca respuesta inmunogénica a dichos VLPs basados en VP 1. Dichos sistemas pueden ofrecer un intermedio atractivo entre vectores no virales de polímero sintético y los sistemas de reparto viral alternativo, ya que pueden ofrecer ventajas combinadas, por ejemplo, simplicidad de producción y alto nivel de eficacia de transducción.

Para mejorar la especificidad del reparto y expresión génica, el gen terapéutico, la inclusión de elementos de reconocimiento en los vehículos de reparto y el uso de los elementos de expresión regulatoria se han investigado tanto de manera singular como en combinación en muchos de los sistemas de reparto descrito anteriormente.

Las mejoras en vectores de ADN también se han hecho y son probablemente aplicables a todos los sistemas de reparto no virales. Estos incluyen el uso de minicírculos super-enrollados presentados por RPR Gencell (que no tiene orígenes bacterianos de replicación ni genes de resistencia antibiótica y así están potencialmente seguros, ya que muestran un contenido biológico de alto nivel), vectores de expresión episomal como los desarrollados por Copernicus Gene Systems Inc (sistemas de expresión episomal replicante donde el plásmido amplifica dentro de los núcleos aunque fuera de los cromosomas y así evitan casos de integración del genoma) y sistemas T7 como los desarrollados por Progenitor (un vector de expresión estrictamente citoplasmática en que el vector expresa el fago T7-RNA polimerasa y el gen terapéutico se lleva de un segundo promotor T7, usando la polimerasa generada por el primer promotor). Otras mejoras más generales a la tecnología del vector de ADN incluye el uso de elementos que actúan en cis para efectuar altos niveles de expresión (Vical), secuencias derivadas de ADN de repetición alfoide para suministrar replicación de uno por ciclo celular y secuencias de reconocimiento nuclear (a partir del gen EBNA-1 (Calos at Stanford, con Megabios); promotores/mejoradores tempranos de SV40 o secuencias de péptido unidas al ADN).

Los sistemas de reconocimiento basados en el reconocimiento del receptor celular por el ligando unido a ADN, se ha descrito por Michael, S.I. y Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232. Usando el ligando reconocido por dicho receptor, el ADN se vuelve enlazado selectivamente e internalizado en la célula diana (Wu, G.Y. y Wu, C.H., J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432). La poli-L-lisina (PLL), un policatión, se ha usado para unir una variedad de ligandos de proteína a ADN mediante métodos de reticulado químico. El ADN se enlaza electrostáticamente a moléculas de PLL-ligando. Los sistemas de reconocimiento se han publicado por Zenke et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1990, 87: 3655-3659 usando el receptor de transferrina; Wu, G.Y. y Wu, C.H., J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432 usando el receptor asialoorosumocoide y Batra et al., Gene Therapy, 1994, 1: 255-260, usando carbohidratos de la superficie celular. Pueden usarse agentes tales como cloroquina o adenovirus co-localizado para reducir la degradación de ADN en los lisosomas (véase Fisher, K.J. y Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299, 49-58). Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90: 11548-11552 ha construido complejos adenovirus-ADN-ligando. Las referencias de patente en la endocitosis mediada por el receptor son: WO 92/05250 (asialoglicoproteínas, Universidad de Connecticut) y US 5354844 (receptor de transferrina, Boehringer).

El ADN y el ligando pueden estar recubiertos sobre la superficie del adenovirus para crear un adenovirus recubierto (Fisher, K.J. y Wilson, J.M., Biochem. J., 1994, 299, 49-58). Sin embargo, la presencia de dos caminos de receptor para la entrada de ADN (receptor de ligando y receptor de adenovirus) reduce la especificidad de este sistema de reparto, aunque el camino del receptor de adenovirus puede eliminarse usando un anticuerpo contra la proteína de la fibra del adenovirus como los medios para la unión al ADN (Michael, S.I. y Curiel, D.T., Gene Therapy, 1994, 1: 223-232). El uso de proteínas endosomalíticas purificadas más que partículas intactas de adenovirus es otra opción (Seth, P., J. Virol., 1994, 68: 1204-1206).

La expresión de una construcción génica de la invención en su sitio diana está preferiblemente bajo el control de una secuencia regulatoria transcripcional (TRS). Una TRS es un promotor combinado opcionalmente con un potenciador y/o un elemento de control tal como un interruptor genético descrito posteriormente.

Un ejemplo de una TRS es un "interruptor genético" que puede emplearse para controlar la expresión de una construcción génica de la invención una vez que se haya repartido a una célula diana. El control de la expresión génica en células eucarióticas superiores por elementos regulatorios procarióticos (que se prefieren para la presente invención) se ha estudiado por Gossen en el TIBS, 18 de Diciembre de 1993, 471-475. Sistemas adecuados incluyen el operón lac de E. coli y el especialmente preferido operón de resistencia de E. coli tetraciclina. Las referencias en el sistema de tetraciclina incluyen Gossen et al (1995) Science 268, 1766; Damke et al (1995) Methods in Enzymology 257, Academic Press; Yin et al (1996) Anal. Biochem. 235, 195 y patentes de EE.UU. 5464758, US 5589362, WO 96/01313 y WO 94/29442 (Bujard). Un interruptor basado en ecdisona (Solicitud de Patente Internacional núm. PCT/GB96/01195 y núm. de publicación WO 96/37609, Zeneca) es otra opción. Otras opciones se enumeran posteriormente. Connaught Laboratories (documento WO-93/20218) describe un promotor eucariótico inducible sintético que comprende dos diferentes clases de elementos inducibles. Rhone-Poulenc Rorer (documento WO 96/30512) describe una aplicación relacionada con tetraciclina para un sistema de expresión génica condicional. Ariad (documento WO 94/18317) describe un sistema basado en la dimerización de proteína para el que se ha mostrado la actividad in vivo. Bert O'Malley del Colegio de Medicina Baylor (documentos WO 93/23431, US 5364791, WO 97/10337) describe un interruptor molecular basado en el uso de un receptor esteroide modificado. El Instituto Whitehead tiene un sistema de expresión génica inducible por NF-KB (documento WO 88/05083). Batelle Memorial ha descrito un promotor inducible por estrés (Patente Europea EP 263908).

Ejemplos de TRS que son independientes del tipo de célula incluyen los siguientes: el promotor/potenciador de citomegalovirus, promotor/potenciador de SV40 y el promotor/potenciador de repetición terminal larga retroviral. Ejemplos de TRS que son dependientes del tipo celular (para dar un grado adicional de reconocimiento) que incluye los siguientes promotores: antígeno carcinoembrionario (CEA) para el reconocimiento colorectal, de pulmón y de mama; alfa-fotoproteína (AFP) para el reconocimiento de los hepatocitos transformados; tirosina hidroxilasa, acetilcolina transferasa o enolasa específica de neuronas para reconocer neuroblastomas; insulina para reconocer al páncreas y; proteína ácida fibroglial para reconocer glioblastomas. Pueden además usarse algunos oncogenes que se expresan de forma selectiva en algunos tumores, por ejemplo HER-2/neu o c-ertB2 en mama y N-myc en neuroblastoma.

Por consiguiente, una construcción génica preferida para usar como un medicamento es una construcción que comprende una secuencia regulatoria transcripcional que comprende un promotor y un elemento de control que es un interruptor genético para controlar la expresión de la construcción génica. Un elemento de control del interruptor genético preferido, se regula por la presencia de tetraciclina o ecdisona. Un promotor preferido es dependiente del tipo de célula y se selecciona de los siguientes promotores: antígeno carcinoembrionario CEA); alfa-fotoproteína (AFP); tirosina hidroxilasa; acetil colina transferasa; enolasa específica de una neurona; insulina; proteína ácida de fibroglial; HER-2/neu; c-erbB2; y N-myc. Preferiblemente la construcción génica para usar como un medicamento descrito en este documento se empaqueta dentro de un adenovirus para repartir al huésped mamífero. Un estudio general de terapia génica reconocedora se da en Douglas et al., Tumor Targeting, 1995, 1: 67-84.

El anticuerpo codificado por la construcción génica de la invención puede ser cualquier forma de construcción de anticuerpo tal como por ejemplo F(ab')_{2}; F(ab'), Fab, Fv, cadena sencilla de Fv & V-min. Cualquier construcción de anticuerpo adecuada se contempla, por ejemplo un fragmento de anticuerpo descrito recientemente es "L-F(ab)2" como se describe por Zapata (1995) en Protein Engineering, 8, 1057-1062. También se contempla disulfuro unido a Fvs. Para construcciones basadas en la enzima CPG2, se prefieren las construcciones de fragmento Fab dimerizados a través de la dimerización de enzima. Anticuerpos no humanos pueden humanizarse para usar en animales reduciendo las respuestas inmunes del huésped. Un anticuerpo humanizado, fragmento relacionado o estructura de enlace al anticuerpo es un polipéptido compuesto en gran parte de un armazón estructural de secuencias de inmunoglobulina derivada humana que soportan secuencias de aminoácidos derivadas no humanas en y alrededor el sitio de enlace de antígeno (que determinan complementariamente las regiones o CDRs). Se ha descrito la metodología apropiada por ejemplo, en detalle en los documentos WO 91/09967, EP 0328404 y Queen et al. Proc Natl Acad Sci 86,10029, Mountain y Adair (1989) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 10, 1 (1992) aunque métodos alternativos de humanización también se contemplan, tal como anticuerpo chapado de residuos de superficie (EP 519596, Merck/NIH, Padlan et al).

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de dos componentes ajustados diseñados para usar en un huésped mamífero cuyos componentes comprenden:

(i)

un primer componente que comprende una construcción génica que codifica un anticuerpo reconocedor de células y una enzima heteróloga que activa el profármaco en el que la construcción génica es capaz de expresar el anticuerpo y la enzima como un conjugado dentro de una célula diana en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el anticuerpo y;

(ii)

un segundo componente que comprende un profármaco que puede convertirse en un fármaco activo por la enzima.

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La terapia enzima profármaco dirigida por anticuerpo (ADEPT) es una propuesta terapéutica conocida para el cáncer. ADEPT usa un anticuerpo selectivo del tumor conjugado con una enzima. El conjugado se administra al paciente (normalmente de forma intravenosa), para localizar el(los) sitio(s) tumorales y limpiarlo de la sangre y otros tejidos normales. Entonces se administra un profármaco al paciente que se convierte por la enzima (localizada en el sitio del tumor) en un fármaco citotóxico que mata las células tumorales.

La presente invención puede aplicarse a cualquier sistema ADEPT. Ejemplos adecuados de sistemas ADEPT incluyen los basados en cualquiera de las siguientes enzimas: carboxipeptidasa G2; carboxipeptidasa A; aminopeptidasa; fosfatasa alcalina; glicosidasas; \beta-glucuronidasa; penicilina amidasa; \beta-lactamasa; citosina desaminasa; nitroreductasa; o enzimas mutantes del huésped que incluyen carboxipeptidasa A, carboxipeptidasa B y ribonucleasa. Referencias adecuadas en sistemas ADEPT incluyen Melton RG (1996) en J. National Cancer Institute 88, 1; Niculescu-Duvaz 1 (1995) en Current Medicinal Chemistry 2, 687; Knox RJ (1995) en Clin. Immunother. 3, 136; documento WO 88/07378 (CRCT); Blakey et al, Cancer Res. 56, 3287-92, 1996; documento US 5587161 (CRCT y Zeneca); documento WO 97/07769 (Zeneca); y documento WO 95/13095 (Wellcome). La enzima heteróloga puede estar en forma de un anticuerpo catalítico; véase por ejemplo el documento EP 745673 (Zeneca). Unos artículos estudiados de sistemas ADEPT incluyen Hay & Denny (1996), Drugs of the Future, 21(9), 917-931 y Blakey (1997), Exp. Opin. Ther. Patents, 7(9), 965-977.

Un sistema de dos componentes igualados preferido es uno en que:

el primer componente comprende un gen que codifica la enzima heteróloga CPG2; y

el segundo componente de profármaco se selecciona de ácido N-(4-[N,N-bis(2-yodoetil)amino]-fenoxicar- bonil)-L-glutámico, N-(4-[N,N-bis(2-cloro-etil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico-gamma-(3,5-dicarboxi)anilida o ácido N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismos. Profármacos preferidos para usar con CPG2 se describen en las siguientes patentes de EE.UU. de Zeneca Limited y Cancer Research Campaign Technology Limited: US 5714148, US 5405990, 5587161 y 5660829.

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En otro aspecto de la invención se proporciona un método para el reparto de un fármaco citotóxico a un sitio que comprende administrar a un huésped un primer componente que comprende una construcción génica como se define en este documento; seguido por la administración al huésped de un segundo componente que comprende un profármaco que puede convertirse en un fármaco citotóxico mediante la enzima heteróloga codificada por el primer componente. Un método preferido para el reparto de un fármaco citotóxico a un sitio es uno cuyo primer componente comprende un gen que codifica la enzima heteróloga CPG2; y el segundo componente de profármaco se selecciona de ácido N-(4-[N,N-bis(2-yodoetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico, N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico-gamma-(3,5-dicarboxi)anilida o ácido N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

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Abreviaturas usadas en este documento incluyen:

AAV

Virus adeno-asociado

ADEPT

Terapia enzima profármaco dirigida por un anticuerpo

AFP

alfa-fotoproteína

AMIRACS

Antimetabolito con Inactivación de Agentes de Rescate en Sitios Cancerígenos

APS

persulfato de amonio

b.p.

par de bases

BPB

azul de bromofenol

CDRs

regiones determinantes de complementareidad

CEA

Antígeno Embrionario de Carcinoma

CL

dominio constante de la cadena ligera del anticuerpo

CPB

carboxipeptidasa B

CPG2

carboxipeptidasa G2

CPG2 R6

carboxipeptidasa G2 mutada para evitar la glicosilación en la expresión en las células eucarióticas, véase Ejemplo 1d

DAB

sustrato de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina

DEPC

pirocarbonato de dietilo

DMEM

Medio de Eagle modificado por Dulbecco

ECACC

Colección Europea de Cultivos Celulares Animales

EIA

Inmunoensayo enzimático

ELISA

Ensayo inmunosorbente unido a enzima

FAS

ácido folínico suplementado

FCS

Suero de ternero fetal

Fd

cadena pesada de Fab, Fab' o F(ab')_{2} que contiene opcionalmente una bisagra

GDEPT

terapia enzima profármaco dirigida por un gen

HAMA

Anticuerpo Humano anti-ratón

HCPB

carboxipeptidasa B humana, preferiblemente pancreática

bisagra (de una IgG)

un péptido corto rico en prolina que contiene las cisteinas que hacen puente entre las 2 cadenas pesadas

HRPO o HRP

peroxidasa de rábano silvestre

IRES

sitio de entrada del ribosoma interno

MTX

metotrexato

NCA

antígeno que reacciona con un cruce no específico

NCIMB

Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas

OPD

orto-fenilendiamina

PBS

solución salina tamponada con fosfato

PCR

reacción de la cadena polimerasa

PGP

ácido \underline{N}-(4-[\underline{N},\underline{N}-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-\underline{L}-glutámico

preproCPB

proCPB con una secuencia directora N-terminal

proCPB

CPB con su pro-dominio N-terminal

scFv

cadena sencilla Fv

SDS-PAGE

gel de electroforesis de dodecilsulfato sódico - poliacrilamida

SSC

sal de citrato sódico

TBS

Solución salina Tris-tamponada

Temed

N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina

TFA

ácido trifluoroacético

TRS

secuencia regulatoria transcripcional

VDEPT

terapia enzima profármaco dirigida por un virus

VH

región variable de la cadena pesada del anticuerpo

VK

región variable de la cadena ligera del anticuerpo

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En esta especificación se contemplan análogos de aminoácidos conservadores de secuencias específicas de aminoácidos que retienen las propiedades biológicas relevantes del componente de la invención, aunque difieren en la secuencia por uno o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos conservadores. Sin embargo, se prefieren las secuencias de aminoácidos enumeradas específicamente. Las sustituciones típicas de aminoácidos conservadores se tabulan posteriormente.

Original	Sustituciones Ejemplares	Sustituciones Preferidas
Ala (A)	Val; Leu; Ile	Val
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys; Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina	Leu
Leu (L)	Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Val (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina	Leu

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La nomenclatura de los aminoácidos se expone posteriormente.

1

En esta especificación, se contemplan variaciones de ácido nucleico (supresiones, sustituciones y adiciones) de secuencias específicas de ácido nucleico que retienen la capacidad de hibridar bajo condiciones astringentes a la secuencia específica en cuestión. Las condiciones astringentes se definen como 6xSSC, SDS al 0,1% a 60º durante 5 minutos. Sin embargo, se prefieren las secuencias de ácidos nucleicos enumeradas específicamente. Se contempla que los análogos químicos de estructuras naturales de ácidos nucleicos tales como "ácido nucleico péptido" (PNA) pueden ser un equivalente aceptable, particularmente para propósitos que no necesitan translación en proteína (Wittung (1994) Nature 368, 561).

La invención se ilustrará ahora mediante referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Las temperaturas son en grados Celsius.

La Figura 1 muestra una representación de la construcción génica de fusión que comprende el fragmento Fd de la cadena pesada de anticuerpo A5B7 unido a su C-terminal por medio de una unión peptídica flexible (G_{4}S)_{3} al N-terminal del polipéptido CPG2. SS representa la secuencia señal. L representa una secuencia de unión. CPG2/R6 representa CPG2 con sus sitios de glicosilación anulados mediante la mutación como se explica en el texto.

La Figura 2a muestra una representación de la proteína de fusión (Fab-CPG2)_{2} con la dimerización teniendo lugar a través de un enlace no covalente entre dos moléculas CPG2.

La Figura 2b muestra una representación de un fragmento de anticuerpo F(ab')_{2}.

La Figura 3 muestra un ensayo ELISA basado en células de material secretado de proteína de fusión. Solo la línea positiva de CEA ha aumentado los niveles de enlace con cantidades aumentadas de proteína de fusión añadida mientras la línea celular negativa de CEA tiene solo niveles de enlace de fondo constantes a lo largo del tiempo. El eje vertical representa lecturas de densidad óptica medidas a 490 nm y el eje horizontal la cantidad de proteína de fusión añadida medida en ng de proteína. El gráfico muestra los datos obtenidos del experimento donde un número de líneas celulares y un control negativo (sin células) se incubaron con cantidades aumentadas de proteína de fusión usando el ensayo celular descrito en el Ejemplo 6. Los resultados muestran que solo la línea celular LoVo (positivo de CEA) muestras un aumento de lectura OD490 correspondiente a cantidades aumentadas de proteínas de fusión añadida. Todas las demás líneas celulares (negativas en CEA) y el control (sin células) mostraron solo una lectura OD490 nm de fondo que no aumentó con la adición de proteína de fusión. Estos resultados proporcionan la evidencia de que el material de proteína de fusión enlaza específicamente a la línea celular positiva de CEA en una forma dependiente de la dosis y no enlaza con las líneas negativas de CEA.

La Figura 4 muestra la retención de proteína de fusión secretada a las células tumorales LoVo recombinantes. El eje vertical representa lecturas de densidad óptica medidas a 490 nm y el eje horizontal la cantidad de anticuerpo anti-CEA añadido (IIE6) medido en ng/ml de proteína. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 7 usando tres líneas celulares diferentes, líneas LoVo recombinante y Colo320DM (que ellas mismas secretan proteína de fusión) y una línea LoVo parental de control que no secreta proteína de fusión. En primer lugar, las líneas celulares se fijaron, y se lavaron para eliminar el sobrenadante existente y cualquier material no enlazado después de lo que se añadieron concentraciones aumentadas del anticuerpo anti-CEA (IIE6) a las células fijas. El ensayo se desarrolló como se describe en el texto para determinar el nivel de retención de cualquier material secretado y si anticuerpo añadido de forma adicional incrementaría la señal. Los resultados mostraron que sin añadir anticuerpo anti-CEA, la línea LoVo parental de control mostró solo una lectura de fondo OD490 nm (como se esperaba) mientras la línea LoVo recombinante dio una lectura OD 490 nm muy fuerte, indicando que el material de proteína de fusión se estaba reteniendo en las células LoVo positivas de CEA. El Colo320DM recombinante negativo en CEA dio una lectura más suave que las células LoVo, aunque la señal fue mayor que el fondo (posiblemente debido a ninguna fijación del anticuerpo secretado al principio del método de ensayo). Concentraciones aumentadas del anticuerpo anti-CEA (IIE6) añadidas a las células fijas mostraron una respuesta relacionada con la dosis en el caso de las células LoVo parentales, indicando así que son positivas en CEA y pueden enlazar material enlazado a CEA (tal como la proteína de fusión si está presente o añadida). Las células Colo320DM y LoVo recombinantes mostraron un pequeño aumento en la señal total OD490 con cantidades aumentadas de anticuerpo añadido con la excepción de las células LoVo que parecen mostrar una ligera respuesta a la mayor dosis de anticuerpo. Como los Colo320DM recombinantes son negativos en CEA, no se esperaría aumento en la señal debida al anticuerpo anti-CEA en los resultados de estas células. En el caso de las células LoVo recombinantes, la señal de adición debido a las cantidades de anticuerpo añadido en este ensayo podrían anegarse excepto a la mayor dosis, debido a la relativa fortaleza de la señal original.

La Figura 5 muestra la retención de proteína de fusión secretada a las células tumorales LoVo recombinantes. El eje vertical representa el volumen medio tumoral (cm^{3}) y el eje horizontal el tiempo el día después de la dosificación del profármaco. El experimento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 12 usando dosis de 60 mg/kg de profármaco. Los resultados muestran que los tumores GAD(c) de control (ningún profármaco tratado) crecieron a 6 veces su tamaño inicial en 11 días (día después de la dosis) en el momento en que los tumores se recogieron. Los tumores tratados con profármaco GAD(d) mostraron una velocidad de crecimiento significativamente menor y para el día 16 (día después de la dosis) habían alcanzado solo 3 veces su tamaño inicial. Estos datos indican al menos un retraso de crecimiento tumoral de 11 días.

En los Ejemplos posteriores, a menos que se afirme otra cosa, se han aplicado la siguiente metodología y materiales.

El ADN es recupera y purifica por el uso del equipo GENECLEAN^{TM} II (Stratech Scientific Ltd. o Bio 101 Inc.). El equipo contiene: 1) yoduro sódico 6 M; 2) una disolución concentrada de cloruro sódico, Tris y EDTA para hacer un lavado de cloruro sódico/etanol/agua; 3) Polvo de cristal - un vial de 1,5 ml que contiene 1,25 ml de una suspensión de una matriz de sílice especialmente formulada en agua. Esta es una técnica para la purificación de ADN basada en el método de Vogelstein y Gillespie publicado en Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Vol 76, p. 615. Brevemente, el procedimiento del equipo es como sigue. A 1 volumen de gel de sílice se añade 3 volúmenes de disolución de yoduro sódico del equipo. La agarosa se funde por calentamiento de la mezcla a 55º durante 10 min, después se añade el polvo de vidrio (5-10 ml), se mezcla bien y se deja estar durante 10 min a temperatura ambiente. El polvo de vidrio se decanta y se lava 3 veces con NEW WASH^{TM} (0,5 ml) del equipo. El tampón de lavado se elimina del Polvo de vidrio y se eluye el ADN incubando el Polvo de vidrio con agua (5-10 ml) a 55 durante 5-10 min. El sobrenadante acuoso que contiene el ADN eluido se recupera por centrifugado. La etapa de elución puede repetirse y los sobrenadantes reunirse.

Las células E. coli DH5\alpha competentes se obtuvieron de Life Technologies Ltd (células competentes DH5\alpha de eficacia MAX^{TM}).

Se hicieron mini-preparados de plásmidos de ADN de doble hebra usando el equipo de preparación de ADN RPM^{TM} de Bio101 Inc. (nº cat. 2070-400) o un producto similar - el equipo contiene disolución de lisis alcalina para liberar el plásmido de ADN de las células bacterianas y polvo de vidrio en un filtro de agitación para adsorber el ADN liberado que se eluye entonces con agua estéril o Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5.

La reacción PCR estándar contiene 100 ng de plásmido de ADN (excepto donde se afirme), 5 \mul de dNTP (2,5 mM), 5 \mul de 10x tampón enzimático (KCl 500 mM, Tris 100 mM, pH 8,3), MgCl_{2} 15 mM y gelatina al 0,1%), 1 \mul de una disolución de reserva de 25 pM/\mul de cada cebador, 0,5 \mul de ADN polimerasa termoestable y agua para obtener un volumen de 50 \mul. Las condiciones de PCR estándar eran: 15 ciclos de PCR a 94º durante 90 s; 55º durante 60 s; 72º durante 120 s, finalizando el último ciclo con una incubación adicional a 72º durante 10 min.

AMPLITAQ^{TM}, disponible de Perkin-Elmer Cetus, se usa como la fuente de ADN polimerasa termoestable.

Los procedimientos generales de biología molecular pueden seguirse a partir de cualquiera de los métodos descritos en "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Segunda Edición, Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Un medio libre de suero es OPTIMEM^{TM} I Medio Reducido de Suero, GibcoBRL Nº Cat. 31985. Este es una modificación del Medio Esencial Mínimo de Eagle tamponado con Hepes y bicarbonato sódico, suplementado con hipoxantina, timidina, piruvato sódico, L-glutamina, elementos traza y factores de crecimiento.

El reactivo LIPOFECTIN^{TM} (GibcoBRL Nº Cat. 18292-011) es una formulación de liposoma 1:1 (p/p) del lípido catiónico cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-n,n,n-trimetilamonio (DOTMA) y dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE) en agua filtrada por una membrana. Enlaza espontáneamente con ADN para formar un complejo lípido-ADN - véase Felgner et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84, 7431.

G418 (sulfato) es GENETICIN^{TM}, GibcoBRL Nº Cat. 1811, un antibiótico aminoglicósido relacionado con la gentamicina usado como un agente de selección en experimentos genéticos moleculares;

Para la ELISA de CEA, cada pocillo de una inmunoplaca de 96 pocillos (NUNC MAXISORB^{TM}) se recubrió con 50 ng de CEA en tampón de recubrimiento de carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6 (cápsulas de tampón - Sigma C3041) y se incubó a 4º toda la noche. La placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM} (PBS + 0,05% de TWEEN^{TM} 20) y después se bloqueó con 150 \mul por pocillo de BSA al 1% en PBS-TWEEN^{TM} durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM}, se añadieron 100 \mul de muestra de ensayo por pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. La placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM}, se añadieron 100 \mul por pocillo de una disolución 1/500 de anticuerpo kappa anti-humano de cabra marcado con HRPO (Sigma A 7164) en BSA al 1% en PBS-TWEEN^{TM} y se incubó a temperatura ambiente en una plataforma basculante durante al menos 1 hora. La placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM} y después una vez más con PBS. Para detectar el enlace, añadir 100 \mul por pocillo de disolución de desarrollo (una cápsula de tampón fosfato-citrato - Sigma P4922 - disuelta en 100 ml de H_{2}O a la que se añade un comprimido de 30 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina - Sigma P8412) y se incubó durante hasta 15 minutos. La reacción se paró añadiendo 75 \mul de H_{2}SO_{4} 2M, y se leyó la absorbancia
a 490 nm.

La ELISA de CEA usando un anticuerpo indicador anti CPG2 fue esencialmente como el anterior aunque en vez de anticuerpo kappa anti-humano de cabra marcado con HRPO se añadió una disolución 1/1000 de un suero policlonal anti-CPG2 de conejo, en BSA al 1% en PBS-TWEEN^{TM} y se incubó a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante 2 horas. La placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM}. Una disolución 1/2000 de un anticuerpo marcado con HRPO anti-conejo de cabra (Sigma A-6154) se añadió entonces y se incubó a temperatura ambiente en una plataforma oscilante durante 1 hora, la placa se lavó tres veces con PBS-TWEEN^{TM} y una vez con PBS. Para detectar el enlace, añadir 100 \mul por pocillo de disolución de desarrollo (una cápsula de tampón fosfato-citrato - Sigma P4922 - disuelta en 100 ml de H_{2}O a la que se añade un comprimido de 30 mg de dihidrocloruro de o-fenilendiamina - Sigma P8412) y se incubó durante hasta 15 minutos. La reacción se paró añadiendo 75 \mul de H_{2}SO_{4} 2M, y se leyó la absorbancia a 490 nm.

El análisis de mancha Western de transfección de sobrenadantes se llevó a cabo como sigue. Se prepararon minigeles al 10% para análisis de transfecciones de proteína de fusión usando un sistema de mini-gel adecuado (HOEFER MIGHTY SMALL^{TM}). El gel de la marcha al 10% es: 20 ml de acrilamida, 6 ml de 10x tampón de gel de la marcha; 34 ml de H_{2}O; 300 ml de SDS al 20%; 600 \mul de APS; 30 \mul de Temed. El tampón de gel de la marcha 10x es Tris 3,75 M pH 8,6. Gel de carga al 6% es: 9 ml de acrilamida; 4,5 ml 10x tampón de gel de carga; 31,5 ml de H_{2}O; 225 \mul de SDS al 20%, 450 \mul de APS al 10%; 24 \mul de Temed). El tampón de gel de carga 10x es Tris 1,25 M pH 6,8. El tampón de electroforesis 5x para SDS/PAGE es Tris 249 mM, glicina 799 mM, SDS al 0,6% p/v (pH no está ajustado).

Preparación de muestras 2 x tampón de Laemmli es Tris 0,125 M; SDS al 4%; glicerol al 30%; urea 4 M; BPB al 0,002% que contiene opcionalmente \beta-mercaptoetanol al 5%. Sobrenadantes: 25 \mul de muestra + 25 \mul de 2x tampón de Laemmli; 40 \mul cargados. Patrones F(ab')_{2} y CPG2: 2 \mul de 10 ng/ml de patrón; 8 \mul de H_{2}O; 10 \mul 2x tampón de Laemmli (-mercaptoetanol); 20 \mul cargados. Marcadores de peso molecular (Amersham RAINBOW^{TM}): 8 \mul de muestra; 8 \mul 2x tampón de Laemmli (+mercaptoetanol); 16 \mul cargados. Condiciones de la marcha: 30 miliamp hasta la boquilla frontal al fondo del gel (aprox. 1 hora). Transferencia: usando un transferidor semiseco (LKB) en una membrana de nitrocelulosa. Miliamp = 0,7 x cm^{2}, durante 45 minutos. Bloqueo: leche desnatada seca al 5% en PBS-TWEEN^{TM} durante 40 minutos.

Detección de F(ab')_{2}: anticuerpo marcado con HRPO de cadena ligera kappa anti-humano de cabra, 1/2500 en leche desnatada seca al 5% en PBS-TWEEN^{TM} incubado toda la noche.

Detección de CPG2: monoclonal anti-CPG2 de ratón (1/2000 en leche desnatada seca al 0,5% en PBS-TWEEN^{TM} incubado toda la noche; anticuerpo marcado con HRPO de cadena ligera kappa anti-ratón de cabra -Sigma 674301- (1/10000 en leche desnatada seca al 0,5% en PBS-TWEEN^{TM}) incubado durante al menos 2 horas.

Desarrollo de la Mancha: Se usó la detección de quimioluminiscencia de HRPO basado en sustrato de luminol en presencia de un potenciador (Sustrato Pierce SUPERSIGNAL^{TM}). La disolución de funcionamiento del sustrato se preparó como sigue: volumen recomendado: 0,125 ml/cm^{2} de superficie de la mancha. Mezclar volúmenes iguales de luminol/disolución de potenciador y disolución de peróxido estable, incubar la mancha con disolución de trabajo durante 5-10 minutos, eliminar la disolución y colocar la mancha en un protector de membrana y exponer frente a película autoradiográfica (normalmente entre 30 segundos y 5 minutos).

Depósitos de microorganismos: El plásmido pNG3-Vkss-HuCk se depositó en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1 RY, Escocia, Reino Unido el 11 de Abril de 1996, bajo el número de referencia de depósito NCIMB 40798 de acuerdo con el Tratado de Budapest. El plásmido pNG4-VHss-HulgG2CH1 se depositó en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1 RY, Escocia, Reino Unido el 11 de Abril de 1996, bajo el número de referencia de depósito NCIMB 40797 de acuerdo con el Tratado de Budapest. El plásmido pNG3-Vkss-HuCk-NEO se depositó en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen AB2 1 RY, Escocia, Reino Unido el 11 de Abril de 1996, bajo el número de referencia de depósito NCIMB 40799 de acuerdo con el Tratado de Budapest. El plásmido pICI266 se depositó bajo el número de acceso NCIMB 40589 el 11 de Octubre del 93 bajo el Tratado de Budapest en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas Limitadas (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Escocia, G.B..

Tipsinización: La tripsina - EDTA (Gibco BRL 45300-019) y la disolución de sal equilibrada de Hanks (HBSS; Gibco BRL 14170-088) se pre-calentaron a 37º en un baño de agua. Los medios existentes se eliminaron de los cultivos y se sustituyeron con un volumen de HBSS (que es la mitad del volumen de los medios anteriores) y la capa de células se lavaron oscilando cuidadosamente la placa o matraz para sí eliminar cualquier medio residual que contenga suero. El HBSS se eliminó y se añadió un volumen de disolución de tripsina (que es un cuarto del volumen del medio original), con oscilación suave del matraz para asegurar que la capa de células se cubrió completamente y se dejó durante 5 min. La tripsina se inactivó por adición del medio de cultivo normal apropiado (2x el volumen de la disolución de tripsina). La suspensión celular entonces o bien se contó o se diluyó adicionalmente para un cultivo continuado dependiendo del procedimiento a realizar.

Inactivación por calor del Suero de Ternera Fetal (FCS): El FCS (carga acreditada Viralex A15-651 - No Europea) se almacenó a -20º. Para usar, el suero se descongeló completamente a 4º toda la noche. Al día siguiente, el suero se incubó durante 15 min en un baño de agua a 37º y después se transfirió a un baño de agua a 56º durante 15 min. El suero se eliminó y se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de dividirse en alícuotas de 50 ml y almacenarse a -20ºC.

Medios DMEM Normales (usando componentes Gibco BRL): A 500 ml de DMEM (41966-086) añadir 12,5 ml de Hepes (15630-056); 5 ml de NEAA (11140-035); 5 ml de pen/strep (10378-016); y 50 ml de FCS inactivado por calor.

Medios FAS (usando componentes Gibco BRL a menos que se afirme otra cosa): 490 ml de DMEM (41966-086); 12,5 ml de Hepes (15630-056); 5 ml de aminoácidos no esenciales (11140-035); 5 ml de pen/strep (10378-016); 5 ml de vitaminas (11120-037); 5 ml de aminoácidos basales (51051-019); Ácido Folínico (Sigma F8259) a una concentración final de los medios de 10 \mug/ml; 50 ml de FCS inactivado por calor; 5 ml de mezcla dNTP; y G418 50 mg/ml de disolución de reserva (para producir la concentración de selección adecuada).

Mezcla dNTP: 35 mg de G (Sigma G6264), 35 mg de C (Sigma C4654), 35 mg de A (Sigma A4036), 35 mg de U (SigmaU3003), 125 mg de T (Sigma T1895) se disolvieron en 100 ml de agua, se esterilizó por filtrado y se almacenó a -20º.

Selección G418: para células LoVo (ATCC CCL 229) la selección se llevó a cabo a 1,25 mg/ml, para células HCT116 (ATCC CCL 247) y para células Colo320DM (ATCC CCL 220) la selección se llevó a cabo a 1,5 mg/ml a menos que se afirme otra cosa.

Vectores BLUESCRIPT^{TM} se obtuvieron de Stratagene Cloning Systems.

Vectores de expresión génica Tet-On se obtuvieron de Clontech (Palo Alto, California) nº cat. K1621-1.

A menos que se afirme otra cosa o sea evidente a partir del contexto usado, las construcciones de fusión de anticuerpo-CPG2 se referidos en los Ejemplos usan CPG2 mutado para evitar la glicosilación.

Ejemplo 1 Construcción de una proteína de fusión (A5B7 Fab-CPG2)_{2}

La construcción de una enzima de fusión (A5B7 Fab-CPG2)_{2} se planeó con el objetivo de obtener un antígeno carcinoembrionario humano bivalente (CEA) enlazando la molécula que además muestra actividad enzimática CPG2. Para este fin la construcción inicial se diseñó para contener un fragmento Fd de cadena pesada del anticuerpo A5B7 unida a su C-terminal por medio de un péptido de unión (G_{4}S)_{3} flexible al N-terminal del polipéptido CPG2 (Figura 1).

El anticuerpo A5B7 enlaza al antígeno carcinoembrionario humano (CEA) y es particularmente adecuado para reconocer el carcinoma colorectal u otras células que portan el antígeno CEA (la importancia de CEA como un antígeno asociado al cáncer se estudia por Shively, J.E. y Beatty, J.D. en "CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology", vol 2, p355-399, 1994). La enzima CPG2 es de naturaleza dimérica en la naturaleza, consistiendo en dos subunidades polipépticas idénticas asociadas. Cada subunidad de este dímero molecular consiste en un dominio catalítico mayor y un segundo dominio menor que forma la interfase del dímero.

En general, el conjugado de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) - enzima o proteínas de fusión sería al menos divalente, que es decir que es capaz de enlazarse a al menos 2 antígenos asociados al tumor (que pueden ser el mismo o diferentes). En el caso de la proteína de fusión (A5B7 Fab-CPG2)_{2}, la dimerización del componente enzimático tendría lugar después de la expresión, así como con la enzima nativa, formando así una molécula enzimática que contiene dos fragmentos de anticuerpo Fab (y es así bivalente con respecto a los sitios de enlace del anticuerpo) y dos moléculas de CPG2 (Figura 2a).

a) Clonación de los genes del anticuerpo A5B7

Los métodos para la preparación, purificación y caracterización de anticuerpo A5B7 F(ab')_{2} de murina recombinante se han publicado (Solicitud de Patente Internacional, Zeneca Limited, WO 96/20011, véase Ejemplo de Referencia 5 en este documento). En el Ejemplo de Referencia 5, sección f del mismo, los genes del anticuerpo A5B7 se clonaron en vectores del GS-SYSTEM^{TM} (Celltech), véase las Solicitudes de Patente Internacional WO 87/04462, WO 89/01036, WO 86/05807 y WO 89/10404, con el A5B7 Fd clonado en pEE6 y la cadena ligera en pEE12. Estos vectores fueron la fuente de los genes de anticuerpo A5B7 para la construcción de la proteína de fusión A5B7 Fab-CPG2.

b) Construcciones del vector A5B7 quimérico

Se amplificaron las regiones variables del anticuerpo de murina A5B7 por PCR a partir de los vectores de plásmido pEE6 y pEE12 usando cebadores de PCR apropiados que incluían los sitios de restricción necesarios para indicar en el clonaje en marco de las regiones variables de cadena pesada y ligera en los vectores pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB depósito nº 40797) y pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB depósito nº 40799) respectivamente. Los vectores resultantes se designaron NG4/A5B7VH-IgG2CH1' (Fd de cadena pesada quimérica de A5B7') y pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (cadena ligera quimérica de A5B7).

c) Clonación del gen CPG2

El gen que codifica el CPG2 puede obtenerse del Centro para Microbiología Aplicada e Investigación, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido. La CPG2 también puede obtenerse por técnicas recombinantes. La secuencia codificadora de nucleótidos para CPG2 se ha publicado por Minton, N.P. et al., Gene, 31 (1984), 31-38. La expresión de la secuencia de codificación se ha presentado en E. coli (Chambers, S.P. et al., Appl. Microbiol, Biotechnol. (1988), 29, 572-578) y en Saccharomyces cerevisiae (Clarke, L. E. et al., J. Gen Microbiol, (1985) 131, 897-904). Además el gen de CPG2 puede producirse como una construcción sintética de ADN por una variedad de métodos y usado como una fuente para más experimentos. La síntesis génica total se ha descrito por M. Edwards en Am. Biotech. Lab (1987), 5, 38-44, Jayaraman et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4084-4088, Foguet y Lubbert (1992) Biotechniques 13, 674-675 y Pierce (1994) Biotechniques 16, 708.

En la preparación para la clonación del gen CPG2, se construyó el vector pNG3-Vkss que es un derivado simple de pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB depósito nº 40799). Este vector se construyó eliminando primero el gen Neomicina (ya que contenía un sitio enzimático de restricción EcoRI) mediante la digestión con el enzima de restricción XbaI, después de lo que el fragmento de vector se aisló y después se volvió a ligar para formar el plásmido pNG3/Vkss-HuCk. Este vector intermedio se digirió con las enzimas SacII y EcoRI, que escindieron el fragmento de gen HuCk. La digestión se cargó después en un gel de agarosa al 1% y el fragmento escindido se separó del vector restante después de lo que el vector de ADN se cortó del gel y se purificó. Dos oligonucleótidos CME 00261 y CME 00262 (SEQ ID NO: 1 y 2) se diseñaron y se sintetizaron. Estos dos oligonucleótidos se hibridaron añadiendo 200 pmoles de cada oligonucleótido en un total de 30 \mul de H_{2}O, calentando a 95º y dejando a la disolución enfriar lentamente a 30º. 100 pmoles del producto de ADN templad se ligaron después directamente en el vector preparado previamente y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. En los clones obtenidos, la introducción de la "cinta" de ADN produjo una nueva secuencia de poliunión en preparación para el posterior clonaje génico de CPG2 para producir el vector pNG3-Vkss.

El gen estructural CPG2 que codifica los residuos de aminoácido Q26-K415 inclusive se amplificó por PCR usando los cebadores de oligonucleótidos de ADN apropiados y las condiciones de reacción de PCR estándar. El producto de reacción se analizó usando un gel de agarosa al 1%, se escindió una banda del tamaño esperado (aproximadamente 12000 b.p.), se purificó y se eluyó en 20 \mul de H_{2}O. Este material se digirió después usando la enzima de restricción SacII, después de lo que la reacción se cargó en un gel de agarosa al 1% y se escindió una banda del tamaño esperado (aproximadamente 250 b.p.) y posteriormente se purificó. Este fragmento se ligó en el vector de plásmido pNG3VKss, que se había digerido previamente con la enzima de restricción SacII, se desfosforiló, se hizo marchar en un gel de agarosa al 1%, se escindió la banda del vector linealizado, se purificó y la mezcla de ligado de transformó en E. coli. Los clones resultantes se analizaron para la presencia y orientación del fragmento CPG2 SacII por análisis de restricción de ADN usando las enzimas BgIII y FseI. Los clones que parecían tener un fragmento del tamaño y orientación correcta se confirmaron por secuenciación de ADN. Este plásmido intermedio se llamó pNG3-Vkss-SacIICPG2frag. Este plásmido se digirió con las enzimas de restricción por AgeI y EcoRI, se desfosforiló y el fragmento de vector se aisló. El producto de PCR del gen CPG2 original también se digirió con AgeI y EcoRI, un fragmento de aproximadamente 1000 bp. se aisló, se ligó y se trasformó en E. coli. Los clones resultantes se analizaron para un gen CPG2 de longitud total (aproximadamente 1200 bp.) por digestión con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI; los clones con la inserción de tamaño correcto se secuenciaron para confirmar la identidad. Finalmente, este plásmido (pNG3/Vkss-CPG2) se digirió con XbaI, se desfosforiló, se aisló un fragmento de vector y el fragmento de gen XbaI Neomicina (aproximadamente 1000 bp. que se había aislado también en las primeras etapas) se religó en el plásmido y se transformó en E. coli. Los clones resultantes se revisaron para la presencia y orientación del gen de Neomicina mediante digestiones individuales con las enzimas XbaI y EcoRI. Este vector se llamó pNG3-Vkss-CPG2-NEO.

d) Construcción de la variante CPG2 R6

El plásmido pNG3-Vkss/CPG2-NEO se usó como una plantilla para la mutagénesis de PCR del gen CPG2 para mutar 3 sitios potenciales de glicosilación que se habían identificado dentro de la secuencia natural de la enzima bacteriana. Los sitios de glicosilación de aminoácidos putativos (N-X-T/S) se observaron en las posiciones 222 (N-I-T), 264 (N-W-T) y 272 (N-V-S) usando la numeración posicional publicada por Minton, N.P. et al., en Gene, (1984) 31, 31-38. El residuo de asparagina (N) de los 3 sitios de glicosilación se mutó a glutamina (Q), negando así los sitios de glicosilación para evitar cualquier caso de glicosilación que afecte a la expresión de CPG2 o la actividad enzimática.

Una técnica de mutagénesis de PCR en que los 3 sitios se mutaron en una única serie de reacciones se usó para crear la variante génica CPG2 R6. El vector pNG3/Vkss/CPG2-NEO se usó como la plantilla para las tres reacciones de PCR iniciales. La reacción R1 usó los cebadores de secuencia de oligonucleótidos sintéticos CME 00395 y CME 00397 (SEQ ID NOS: 3 y 4), la reacción R2 usó los cebadores de secuencia de oligonucleótidos sintéticos CME 00395 y CME 00399 (SEQ ID NOS: 3 y 5), y la reacción R3 usó los cebadores de secuencia de oligonucleótidos sintéticos CME 00396 y CME 00400 (SEQ ID NOS: 6 y 7). Los productos de las reacciones de PCR R1 y R2 contenían los sitios de glicosilación mutados 222 y 264 + 272 respectivamente, con el producto R3 teniendo una copia del segmento C-terminal del gen CPG2. Los productos R2 y R3 (R2 aproximadamente 750 bp; R3 aproximadamente 360 bp), después de la separación y purificación de gel de agarosa, se unieron en una reacción de PCR adicional. Las mezclas de cantidades variables de los productos R2 y R3 se hicieron y las reacciones de PCR se llevaron a cabo usando los oligonucleótidos sintéticos CME 00395 y CME 00396 (SEQ ID NOS: 3 y 6). El producto resultante R4 (aproximadamente 1200 bps) se amplificó por PCR de nuevo usando los oligonucleótidos CME 00398 y CME 00396 (SEQ ID NOS: 8 y 6). El producto resultante R5 (aproximadamente 600 bp.) se unió al producto R1 (aproximadamente 620 b.p.) en una reacción final de PCR llevada a cabo usando los oligonucleótidos CME 00395 y CME 00396 (SEQ ID NOS: 3 y 6). El producto de PCR resultante R6 (aproximadamente 1200 bp), que ahora contenía los tres sitios de glicosilación mutados, podría clonarse (después de la digestión con las enzimas de restricción AgeI y BsrGI y el aislamiento del fragmento resultante) en el vector pNG3/Vkss-CPG2-Neo (que se había cortado previamente con las enzimas de restricción AgeI y Bsr GI y se había aislado posteriormente). Esto creó el ADN deseado (SEQ ID NO: 9) codificando la secuencia de la proteína CPG2/R6 (SEQ ID NO: 10) dentro del vector de expresión pNG3/Vkss-CPG2 R6-NEO.

e) Construcción del gen de la proteína de fusión Fd-CPG2 de cadena pesada A5B7

El fragmento de anticuerpo de cadena pesada y los genes de la enzima CPG2 se obtuvieron ambos por amplificación de PCR de plantillas de plásmidos. El plásmido pNG4/A5B7VH-IgG2CH1' se amplificó con cebadores CME 00966 (SEQ ID NO: 11) y CME 00969 (SEQ ID NO: 12) para obtener el componente Fd A5B7 (aproximadamente 300 b.p.) y el plásmido pNG3Nkss/CPG2 R6-NEO se amplificó con cebadores CME 00967 (SEQ ID NO: 13) y CME 00968 (SEQ ID NO: 14) para obtener el componente enzimático (aproximadamente 1350 b.p.). En cada caso el producto de reacción de PCR se cargó y se separó en un gel de agarosa al 1%, una banda del tamaño de producto correcto se escindió, posteriormente se purificó y se eluyó en 20 \mul de H_{2}O.

Una reacción de PCR adicional se llevó a cabo para unir (o coser) los dos productos de reacción PCR purificados juntos. Las condiciones de reacción PCR estándar se usaron con cantidades variables (entre 0,5 a 2 \mul) de cada producto de PCR aunque utilizando 25 ciclos (en vez de los 15 ciclos usuales). El producto de reacción se analizó usando un gel de agarosa al 1%, se escindió una banda del tamaño esperado (aproximadamente 1650 b.p.), se purificó y se eluyó en 20 \mul de H_{2}O. Este material se digirió después usando enzimas de restricción NheI y BamHI, después de lo cual se recuperó una banda del tamaño esperado (aproximadamente 1600 b.p.) y se purificó. El vector pNG4/A5B7VH-IgG2CH1' se preparó para recibir e producto de PCR anterior por digestión con enzimas de restricción NheI y BamHI, después de lo cual el ADN se desfosforiló y la mayor banda de vector se separó del fragmento menor NheI/Bam HI. La banda vector se recuperó, se purificó y posteriormente el producto de PCR restringido de forma similar se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y posteriormente secuenciados para confirmar la secuencia génica de fusión. Un número de los clones se encontró que eran correctos y uno de esos clones (designado R2.8) se renombró pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 (SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16).

f) Co-transfección, expresión transitoria

Los plásmidos pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 (que codifican la proteína de fusión Fd-CPG2 quimérica del anticuerpo) y pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (que codifica la cadena ligera quimérica del anticuerpo; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18) se co-transfectaron en células COS-7 usando un procedimiento basado en LIPOFECTIN^{TM} como se describe posteriormente. Las células COS7 se siembran en una placa de 6 pocillos a 2 x 10^{5} células/2 ml/pocillo, a partir de un cultivo sub-confluente y se incubaron toda la noche a 37º, CO_{2} al 5%. Se hace una mezcla de LIPOFECTIN^{TM}/medio libre de suero como sigue: 12 ml de LIPOFECTIN^{TM} más 200 ml de medio libre de suero se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se hace una mezcla de ADN/medio libre de suero como sigue: 4 mg de ADN (2 mg de cada construcción) más 200 ml de medio libre de suero. 200 ml de la mezcla de LIPOFECTIN^{TM}/medio libre de suero se añade entonces a la mezcla de ADN y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. 600 ml de medio libre de suero se añaden entonces a cada muestra. Las células se lavaron una vez con 2 ml de medio libre de suero, entonces el 1 ml de mezcla de LIPOFECTIN^{TM}/ADN se añade a las células y se incuban durante 5 horas, 37º, CO_{2} al 5%. La mezcla de LIPOFECTIN^{TM}/ADN se eliminó de las células y se añadieron medios normales de crecimiento después de lo cual las células se incubaron durante 72 horas, 37º, CO_{2} al 5%. Los sobrenadantes celulares se recogieron.

g) Análisis de la Proteína de Fusión Anticuerpo-Enzima

El material sobrenadante se analizó para la presencia de proteína de fusión de anticuerpo usando un ensayo ELISA que enlaza CEA usando un anticuerpo indicador de cadena ligera kappa anti-humano (para la presencia del anticuerpo), un ensayo ELISA que enlaza con CEA usando un anticuerpo indicador anti-CPG2 (para la presencia de proteína de fusión CPG2 enlazada a CEA), un ensayo de actividad enzimática de CPG2 basado en HPLC (para medir la actividad CPG2 específica) y SDS/PAGE seguido por ensayo de mancha Western (usando anticuerpos tanto indicador de cadena ligera kappa anti-humano como indicador CPG2) para detectar el material expresado.

El ensayo de actividad enzimática basado en HPLC muestra claramente que la actividad enzimática de CPG2 está presente en el sobrenadante celular y en ambos ensayos ELISA anti-CEA muestran el enlace de proteínas a niveles proporcionales con una molécula de anticuerpo A5B7 bivalente. El hecho de que la ELISA anti-CEA detectara con un anticuerpo indicador anti-CPG2 también muestra el claro enlace CEA indicando que no solo el anticuerpo sin también la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 estaba unido a CEA.

Los análisis de mancha Western con ambos ensayos de anticuerpo indicador presenta claramente una subunidad de proteína de fusión del tamaño esperado de aproximadamente 90 kDa sin degradación o productos minoritarios (tal como Fab o enzima) observables.

Como CPG2 se conoce solo por mostrar actividad enzimática cuando está en un estado dimérico y como solo está presente la proteína de fusión de enzima anticuerpo, esto indica que la proteína de fusión de 90 kDa (vista bajo condiciones SDS/PAGE) que dimeriza por medio del mecanismo natural de dimerización del CPG2 para formar una molécula de proteína de fusión anticuerpo-enzima (Figura 2a) en condiciones de tampón "nativo". Además, esta molécula muestra tanto actividad enzimática de CPG2 como propiedades de enlace del antígeno CEA que no parece ser significativamente diferentes en la proteína de fusión comparada con la enzima o anticuerpo solos.

h) Uso de la proteína de fusión expresada y profármaco de CPG2 en un ensayo citotóxico in vitro

Un ensayo que mata células in vitro se llevó a cabo en el que la proteína de fusión (A5B7-CPG2 R6)_{2} se comparó con un conjugado "convencional" de A5B7 F(ab')_{2}-CPG2 formado a través de la unión de A5B7 F(ab')_{2} a CPG2 con un reactivo químico heterobifuncional. En cada caso, el material que muestra iguales cantidades de actividad enzimática de CPG2 o cantidades iguales de proteína anticuerpo-CPG2 se incubaron con células tumorales, que portan CEA, LoVo. Las células se lavaron entonces para eliminar el material de proteína no enlazado y posteriormente se volvieron a suspender en el medio que contiene profármaco CPG2 fenol (PGP, véase el Ejemplo 2 posterior) durante un periodo de 1 hr, después de la que las células se lavaron, se volvieron a suspender en medios frescos y de dejó proliferar durante 4 días. Finalmente las células se trataron con tinte SRB y sus números se deter-
minaron.

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Los resultados obtenidos muestran claramente que la proteína de fusión (A5B7-CPG2 R6)_{2} (junto con el profármaco) provocaron al menos muerte celular equivalente y dieron por resultado menores números de células al final del periodo de ensayo que los niveles equivalentes del conjugado F(ab)2-CPG2 A5B7 (con el mismo profármaco). La muerte celular (anteriormente niveles de control basal) puede darse solo si el profármaco se convierte en fármaco activo por la enzima CPG2 (y como las células se lavan para eliminar la proteína no enlazada, solo la enzima enlazada a la célula permanecerá en la etapa donde el profármaco se añade). Así, este experimento muestra que l menos mucha de la proteína de fusión A5B7-CPG2 R6 permanece enlazada en comparación con el conjugado convencional A5B7 F(ab)_{2}-CPG2 mientras se da un mayor grado de muerte celular (presumiblemente debido a más conversión de profármaco a fármaco).

i) Construcción de un vector de proteína de fusión de coexpresión para usar en la expresión de líneas celulares transitorias y estables

Para una metodología de transfección más sencilla y el acoplamiento directo tanto de cintas de expresión como un indicador de selección sencillo, un vector de co-expresión para las expresión de proteínas de fusión se construyó usando los vectores existentes pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 (que codifica la proteína de fusión anticuerpo Fd-CPG2) y pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (que codifica la cadena ligera de anticuerpo). El plásmido pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 se digirió primero con la enzima de restricción ScaI, la reacción se cargó en un gel de agarosa al 1% y la banda de vector lineal se escindió del gel y se purificó. El vector de ADN se digirió entonces con enzimas de restricción BgIII y BamHI, la reacción se cargó en un gel de agarosa al 1%, la banda deseada (aproximadamente 2700 bp) se recuperó y se purificó. El plásmido pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO se digirió con la enzima de restricción BamHI después de lo cual el ADN se desfosforiló, entonces posteriormente se cargó en un gel de agarosa al 1% y la banda del vector se escindió del gel y se purificó. El fragmento de cinta de expresión de la cadena pesada se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. La orientación se comprobó por una variedad de digestivos de restricción y clones seleccionados que tenían la cinta de la cadena pesada en la misma dirección que los de cadena ligera. Estos plásmidos se nombraron pNG3-A5B7-CPG2/R6-coexp.-NEO.

j) Cambios génicos para la expresión de proteínas

Se ve que la expresión in vitro de CPG2 y las proteínas de fusión de CPG2 en células de mamíferos puede degradar los folatos de los medios llevando al lento crecimiento celular o muerte celular. La alta actividad del enzima CPG2 es probable que haga difícil que dicha deficiencia de folato se reduzca por suplementación de los medios. Sin embargo, se cree que en el caso de expresión de CPG2 o de proteína de fusión de CPG2 de células de mamíferos in vivo, es improbable que dichos problemas ocurran, ya que las células estarían constantemente reponiendo con todas las necesidades de crecimiento mediante los mecanismos normales circulatorios y celulares.

Se ha considerado un número de opciones para evitar posibles problemas de depleción de ácido fólico in vitro. Una de estas soluciones implica el uso de sistemas de cambios génicos inducibles aunque fuertemente controlados tales como los cambios "TET on" o "TET off" (Grossen, M. et al (1995) Science 268: 1766-1769) o el cambio de ecdisona/muristerona A (No, D. et al (1996) PNAS 93:3346-3351). Dichos sistemas permiten la expresión controlada de forma precisa de un gen de interés y permite la transformación estable de células de mamíferos con genes que codifican productos de expresión tóxicos o potencialmente dañinos. Un cambio génico permitiría líneas celulares estables recombinantes que incorporan genes de fusión CPG2 que son potencialmente más fáciles de establecer, mantener y expandir para la expresión de proteínas y cultivos de sembrado para estudios de crecimiento tumoral
in vivo.

Ejemplo 2 Las células tumorales HCT116 que expresan la proteína de fusión anticuerpo-enzima se matan selectivamente in vitro por un profármaco

Las células tumorales colorectales HCT116 (ATCC CCL 247) transfectadas con el gen de proteína de fusión anticuerpo-CPG2 del Ejemplo 1 pueden matarse selectivamente por un profármaco que se convierte por la enzima en un fármaco activo.

Para demostrar esto, células HCT116 no transfectadas de control o células HCT116 transfectadas con el gen de proteína de fusión anticuerpo-CPG2, se incuban con o bien el profármaco, ácido 4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil-L-glutámico (PGP; Blakey et al, Br. J. cancer 72, 1083, 1995) o el correspondiente fármaco liberado por CPG2, 4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenol. El profármaco PGP y el fármaco sobre el intervalo de concentración 5 X 10^{-4} a 5 X 10^{-8} M se añaden a placas de microtitrado de 96 pocillos que contienen 1000-2.500 HCT116 células/pocillo, durante 1 hr a 37º. Las células se lavan entonces y se incuban durante tres días más a 37º. Después de lavar para eliminar las células muertas, se añade entonces TCA y la cantidad de proteína celular adherida a las placas se evalúa por adición de tinte SRB como se describe por Skehan et al (J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107, 1990). La potencia del profármaco y el fármaco se evalúa por la concentración necesaria para inhibir el crecimiento celular al
50% (IC_{50}).

El tratamiento de células HCT 116 transfectadas o no transfectadas con el fármaco da por resultado un IC_{50} de aproximadamente 1 \muM. En contraste, el profármaco PGP da por resultado un IC_{50} de aproximadamente 200 \muM en células no transfectadas y aproximadamente 1 \muM en células transfectadas. Estos resultados demuestran que las células transfectadas que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 pueden convertir el profármaco PGP en el fármaco activo más potente mientras que las células HCT116 no transfectadas son incapaces de convertir el profármaco. Como consecuencia, las células HCT116 transfectadas son más de 100 veces más sensibles al profármaco PGP en términos de muerte celular en comparación con las células HCT116 no transfectadas. (Véase el Ejemplo 1j) para ensayos que implican posible depleción de ácido fólico en las células).

Estos estudios demuestran que las células tumorales de transfección con un gen para una proteína de fusión enzima-anticuerpo pueden llevar a la muerte celular tumoral selectiva con un profármaco.

Ejemplo 3 Actividad anti-tumoral del profármaco PGP en tumores HCT116 que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2

La actividad anti-tumoral in vivo del profármaco PGP en tumores HCT116 que expresan la proteína de fusión CPG2-anticuerpo puede demostrarse como sigue. Las células tumorales HCT116 transfectadas con el gen de proteína de fusión anticuerpo-CPG2 o células tumorales HCT116 no transfectadas de control se inyectan de forma subcutánea en ratones desnudos atímicos (10^{7} células tumorales por ratón). Cuando los tumores tienen 5-7 mm de diámetro se administra el profármaco PGP i.p. a los ratones (3 dosis en intervalos de una hora durante 2 horas en dosis que oscilan de 5-25 mg kg-1).Los efectos anti-tumorales se juzgan midiendo la longitud de los tumores en dos direcciones y calculando el volumen del tumor usando la fórmula:

Volumen = \Pi /6 \ x \ D^{2} \ X \ d

donde D es el diámetro mayor y d es el diámetro menor del tumor.

El volumen del tumor se expresa respecto al volumen del tumor en el momento que se administra el profármaco PGP. La actividad anti-tumoral se compara con el grupo de control que recibe o bien células tumorales transfectadas o no transfectadas y PBS (NaCl 170 mM, KCl 3,4 mM, Na_{2}HPO_{4} 12 mM y KH_{2}PO_{4} 1,8 mM, pH 7,2) en vez del profármaco PGP.

La administración de PGP a tumores HCT116 establecida a partir de células HCT116 transfectadas da por resultado un significativo efecto anti-tumoral como se juzga por los tumores tratados con PGP que disminuyen en tamaño en comparación con los tumores tratados con PBS y en que toman un tiempo significativamente más largo para los tumores tratados con PGP en alcanzar 4 veces su volumen tumoral inicial en comparación con los tumores tratados con PBS. En contraste, la administración de PGP a tumores HCT116 establecido a partir de células no transfectadas da por resultado una actividad anti-tumoral no significativa.

Pueden usarse estudios similares para demostrar que el gen anticuerpo-enzima repartido en un vector apropiado para establecer tumores HCT116 producidos a partir de células HCT116 no transfectadas cuando se usa en combinación con el profármaco PGP puede dar por resultado una actividad anti-tumoral significativa. Así, las células HCT116 no transfectadas se inyectan en ratones desnudos atímicos (1 X 10^{7} de células tumorales por ratón) y una vez que los tumores tienen 5-7 mm de diámetro, el vector que contiene el gen de proteína de fusión enzima-anticuerpo se inyecta intra-tumoralmente. Después de 1-3 días de dejar a la proteína de fusión anticuerpo-enzima expresarse y enlazar con las células tumorales HCT116, el profármaco PGP se administra como se describe anteriormente. Esto da por resultado una actividad anti-tumoral significativa en comparación con los ratones control que recibieron PBS en vez de profármaco PGP.

Ejemplo 4 Transfección Mejorada de Líneas Celulares Adherentes Usando medios FAS suplementados y/o Células de Alimentación V-79

Se vio que la expresión in vitro de CPG2 y las proteínas de fusión de CPG2 en células de mamíferos puede degradar los folatos de los medios llevando al lento crecimiento celular o muerte celular. Los medios FAS (ácido folínico suplementado) descritos en este documento se desarrollaron para líneas celulares de expresión de CPG2 y proteínas de fusión CPG2 para soportar mejor el crecimiento de dichas líneas celulares.

En la preparación para la transfección, se cultivaron líneas celulares adherentes en medios DMEM normales y se traspasaron al menos tres veces antes de la transfección. Se cultivaron células de alimentación V-79 (fibroblasto de pulmón de hámster, obtenido de la Unidad de Radiobiología MRC, Harwell, Oxford, Reino Unido) en medios DMEM normales y se traspasaron tres veces antes de usar. Para la transfección, se hizo un conteo viable (usando un hemocitómetro/manchado azul de tripano) de las células adherentes y las células se depositaron a 2 x 10^{5} células por pocillo en una placa de 6 pocillos (Costar 3516) y se dejaron durante 18-24 horas para que las células se volvieran a adherir.

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Para cada transfección individual, se añadieron 20 \mul de LIPOFECTIN^{TM} a 80 \mul de medio libre de suero y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos. El plásmido de ADN (2 \mug) de interés se añadió a 100 \mul de medio libre de suero y posteriormente se añadió a la mezcla de LIPOFECTIN^{TM} y se dejó durante unos 15 minutos adicionales. Las placas individuales de 6 pocillos se lavaron con 2 ml de medio libre de suero por pocillo para eliminar cualquier suero y sustituir con 800 \mul de medio libre de suero fresco. Los 200 \mul de mezclas de ADN/LIPOFECTIN^{TM}/medio libre de suero que se habían preparado previamente se añadieron entonces a cada pocillo de células. Las placas se incubaron a 37º durante 5 horas, el medio se eliminó y se añadieron 2 ml de medio normal fresco y se incubó durante unas 48 horas adicionales. Las células transfectadas en la placa de 6 pocillos se tiraron libres, la suspensión celular se eliminó y se centrifugó. Todo el sobrenadante se eliminó y la bolita de células se resuspendió en 20 ml de los medios de crecimiento frescos apropiados (por ejemplo, medio FAS DMEM) que contienen el agente selectivo apropiado para el ADN transfectado (por ejemplo, G418). Alícuotas (200 \mul) se pusieron en placas por pocillo en la placa de 96 pocillos (1,25 x 10^{4} células por pocillo).

Para mejorar la expansión clónica, las células de alimentación de filbroblastos pueden añadirse a las células transfectadas. células de alimentación semi-confluentes V-79 se tripsinaron y se llevó a cabo un conteo viable. Las células se resuspendieron a 1 x 10^{6} células/ml en un recipiente de cristal estéril, se irradiaron usando una fuente de Cesio mediante exposición a 5000 rad durante 12 minutos. Las células pueden almacenarse entonces a 4º durante 24-48 horas (las células irradiadas son metabólicamente activas, aunque no se dividirán, y así pueden actuar como alimentadores para otras células sin contaminar el cultivo). Las células de alimentación se depositarían a 4 x 10^{4} células por pocillo en una placa de 96 pocillos para producir una capa confluente para los clones recombinantes emergentes. Las células de alimentación inicialmente se adhieren a la placa, pero con el tiempo se despegan y flotan en el medio, dejando a cualquier clon recombinante aún unido al pocillo. Los cambios de los medios (200 \mul a la vez) se llevan a cabo dos veces a la semana para eliminar las células flotantes y reponer el medio. Las colonias se dejaron desarrollarse durante 10-14 días, después el sobrenadante se cribó por ensayo ELISA estándar para la secreción de la proteína
de fusión.

Para medir la velocidad de expresión en el caso de las construcciones génicas de fusión (A5B7-CPG2)_{2}, las células recombinantes se sembraron a 1 x 10^{6} en 10 ml de medios de cultivo normal fresco durante exactamente 24 horas. El sobrenadante se eliminó entonces, se centrifugó para eliminar los desechos celulares y se hizo un ensayo para la actividad de la enzima y la proteína de fusión mediante los métodos ELISA y HPLC descritos anteriormente. Los resultados para un número de líneas celulares de proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2} recombinantes se muestran
debajo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 5 Construcción de una línea celular tumoral que expresa la proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2} inducible, estable a) Construcción de un vector de expresión de proteína de fusión inducible

Para facilitar la expresión a partir de un solo promotor celular de mamífero inducible, una versión basada en IRES (Sitio de Entrada de Ribosoma Interno; véase Y. Sugimoto et al., Biotechnology (1994), 12, 694-8) de la proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2} se construyó. La construcción pNG3 pNG3/A5B7VK-HuCK-NEO (cadena ligera quimérica A5B7; descrita en el Ejemplo 1b anterior) se usó como una plantilla para la amplificación del gen de cadena ligera. El gen se amplificó usando oligonucleótidos CME 3153 y CME 3231 (SEQ ID NOS 19 y 20). Un producto de PCR del tamaño esperado (aproximadamente 700 b.p.) se purificó. Este producto se digirió entonces usando las enzimas de restricción EcoRI y BamHI y posteriormente se purificó. El fragmento se clonó en el vector Bluescript^{TM} KS+ (preparado para recibir el fragmento por digestión con las mismas enzimas de restricción, EcoRI y BamHI) después de lo que el ADN se desfosforiló y la banda del vector mayor se purificó. El fragmento de PCR restringido de forma similar se ligó al vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento de PCR. Los clones apropiados se secuenciaron para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido A5B7 Bluescript^{TM}.

De una manera similar, la cadena pesada A5B7 quimérica se amplificó por PCR a partir del plásmido pNG4/A5B7 VH-IgG2CH1/CPG2 R6 (descrito en el Ejemplo 1e anterior) usando oligonucleótidos CME 3151 y CME 3152 (SEQ ID NOS 21 y 22). Un producto de reacción PCR del tamaño esperado (aproximadamente 1800 b.p.) se purificó. Este producto se digirió entonces usando las enzimas de restricción BamHI y Xba I después de que la banda del fragmento se purificó. El fragmento se clonó entonces en el vector Bluescript^{TM} KS+ que se había preparado para recibir el fragmento anterior por digestión con las mismas enzimas de restricción, BamHI y XbaI, después de lo que el ADN se desfosforiló y la banda del vector mayor se purificó. El fragmento de PCR restringido de forma similar se ligó al vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento de PCR. Los clones apropiados se secuenciaron para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido Bluescript^{TM} Fd-CPG2 R6.

La secuencia IRES se suministró a partir del vector pSXLC (descrito en Y. Sugimoto et al. Biotechnology (1994), 12, 694-8, y se obtuvo a partir de los autores). La secuencia IRES se escindió por digestión con las enzimas de restricción BamHI y NcoI. Una banda de tamaño esperado (aproximadamente 500 b.p.) se purificó y se ligó en el plásmido Bluescript^{TM} Fd-CPG2 R6 (que se había preparado previamente por restricción con las mismas enzimas). La mezcla de ligado se transformó en E. coli y el ADN se preparó a partir de los clones obtenidos. El ADN se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento y clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido Bluescript^{TM} IRES Fd-CPG2 R6.

Para facilitar las últimas etapas de clonado, fue necesario eliminar el sitio Xba I que se había llevado en el fragmento IRES. Se llevó a cabo por mutagénesis de PCR con los cebadores de oligonucleótidos CME 3322 y CME 3306 (SEQ ID NOS: 23 y 24) y el Bluescript^{TM} IRES Fd-CPG2 R6 como plantilla de ADN. Un producto de reacción PCR del tamaño esperado (aproximadamente 500 b.p.) se purificó, se digirió con las enzimas de restricción BamHI y NcoI y se ligó en el plásmido Bluescript^{TM} IRES Fd-CPG2 R6 (que se había preparado previamente por restricción con las mismas enzimas de restricción). La mezcla de ligado se transformó en E. coli y el ADN se preparó a partir de los clones obtenidos. El ADN se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento y clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido Bluescript^{TM} IRES Fd-CPG2 R6-Xba del.

El fragmento de cadena ligera quimérica A5B7 se escindió del plásmido A5B7 Bluescript^{TM} por digestión con las enzimas de restricción EcoRland BamHI. Una banda del tamaño esperado (aproximadamente 700 b.p.) se purificó, se ligó en el plásmido Bluescript IRES Fd-CPG2 R6-Xba del preparado apropiadamente y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento. Los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido Bluescript^{TM} A5B7 IRES Fd-CPG2 R6-Xba del. La secuencia completa del gen de proteína de fusión quimérica A5B7 basada en IRES se muestra en SEQ ID NO: 52.

El gen de proteína de fusión quimérica A5B7 basado en IRES se transfirió después a un vector de expresión regulado por tetraciclina. Se obtuvieron vectores para el sistema de expresión génica Tet On de Clontech. El vector de expresión cambiable de Tetraciclina pTRE (conocido de otra forma como pHUD10-3, véase Gossen et al. (1992), PNAS, 89, 5547-51), se preparó para aceptar la cinta de proteína de fusión basada en IRES por digestión con las enzimas de restricción EcoRI y XbaI, se desfosforiló y la banda de vector mayor se purificó. La cinta del gen IRES se escindió del plásmido Bluescript^{TM} A5B7 IRES Fd-CPG2 R6-Xba del usando las mismas enzimas de restricción. El fragmento obtenido de aproximadamente 3000 b.p. se ligó al vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción para revisar la inserción del fragmento de PCR. Los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido pHUD10-3/A5B7 IRES Fd-CPG2 R6.

b) Construcción de una línea celular estable que expresa la proteína de fusión inducible

La metodología de transfección por lipofección estándar (como se describe previamente aunque sin el uso de células de alimentación) se usó para producir líneas celulares tumorales HCT116 recombinantes. Una co-transfección que usa 1 \mug del plásmido pHUD10-3/A5B7 IRES Fd-CPG2 R6 y 1 \mug del plásmido que expresa el transactivador pTet-On (del equipo Clontech) se llevó a cabo y se seleccionaron clones positivos usando los medios FAS que contenían 750 \mug de G418/ml.

c) Estudios de inducción de líneas celulares inducibles de HCT116 recombinantes

Los cultivos de clones obtenidos se dividieron para duplicar las placas de 48 pocillos, cada uno conteniendo 1 x 10^{6} células. Las células se hicieron crecer durante 48 horas con una de las placas inducida con 2 \mug/ml de doxiciclina y la otra actuando como un control no inducido. La expresión de la proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2} en el sobrenadante celular se ensayó usando los ensayos ELISA/mancha Western descritos en el Ejemplo 1g. Los resultados indicaron que la inducción de la proteína de fusión a partir de la línea celular inducible por el uso de doxiciclina podría demostrarse claramente, por ejemplo, uno de los clones obtenidos (F11), las células inducidas produjeron 120 ng/ml de proteína de fusión en el sobrenadante mientras que las células no inducidas produjeron solo niveles de fondo de proteína de fusión (por debajo de 1 ng/ml).

Ejemplo 6 Ensayo ELISA basado en células de material secretado de proteína de fusión

Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Becton Dickinson Biocoat^{TM} poli-D-Lisina, 35-6461) a una densidad de 1 x 10^{4} células por pocillo en 100 \mul de medio de cultivo normal y se dejaron aproximadamente 40 h a 37º. Se diluyeron 100 \mul de formaldehído al 6% en DMEM y se dejó durante 1 hora a 4º. Las placas se centrifugaron y se lavaron 3 veces en PBS que contenía Tween^{TM} al 0,05% empapando por inmersión (primero dos lavados durante 2 minutos y el lavado final durante 5 minutos).

100 \mul de diluciones de duplicación del sobrenadante del cultivo celular que contenía la proteína de fusión o anti-CEA de A5B7 quimérico se añadieron a cada pocillo como apropiado y las placas se incubaron toda la noche a 4º. Las placas se lavaron como se describe anteriormente y, en el caso de proteínas de fusión quiméricas, se añadieron 100 \mul de dilución 1:1000 de anticuerpo kappa anti-humano marcado por HRP (Sigma A-7164) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente (puede usarse una metodología de detección anti-CPG2 en el caso de proteínas de fusión scFv de murina). Las placas se lavaron como se describe anteriormente y el HPR se detectó usando sustrato OPD (Sigma P-8412). Se dejó desarrollar color durante aproximadamente 5 min, se paró con 75 \mul por pocillo de H_{2}SO_{4} 2M y se leyó OD a 490 nm.

En el caso de la proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2}, se produjo material en el sobrenadante a partir de células tumorales Colo320DM recombinantes (CEA-ve). El contenido de proteína de fusión se midió mediante el uso de CEA ELISA descrito anteriormente. Cantidades aumentadas de proteína de fusión se añadieron a un número de líneas celulares negativas de CEA y la línea parental LoVo positiva de CEA. Los resultados mostrados en la Figura 3 muestran claramente que solo la línea positiva de CEA muestra niveles aumentados de enlace con cantidades aumentadas de proteína de fusión añadida mientras las líneas celulares negativas de CEA muestran solo niveles de enlace de fondo constantes a lo largo del tiempo. Esto demuestra claramente que la proteína de fusión enlaza específicamente y se retiene en las células LoVo positivas de CEA.

Ejemplo 7 Células tumorales LoVo recombinantes que expresan proteína de fusión anticuerpo-enzima exhiben retención de la proteína de fusión en la superficie celular

Las células tumorales colorectales LoVo transfectadas con el gen de proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2} se han mostrado tanto que secretan como retienen la proteína de fusión en su superficie celular. Esto puede demostrarse comparando las células LoVo que expresan la proteína de fusión parental y recombinante bajo las condiciones expuestas en el ensayo ELISA basado en células de la proteína de fusión secretada (Figura 4). En el desarrollo de la reacción de color podría verse que las células LoVo recombinantes habían retenido la proteína de fusión expresada (mostrando un alto nivel de color). En los experimentos de control, usando células que expresan la proteína de fusión Colo320DM, el ensayo mostró alguna retención de la proteína de fusión expresada (probablemente no específica) y las células LoVo parentales solo muestran actividad de fondo. Los controles positivos en que se añadió anticuerpo de enlace a CEA para ensayar células tumorales que expresan proteína de fusión recombinante y a los controles LoVo parentales, dieron por resultado una señal obteniéndose de las LoVo parental (demostrando así que CEA estaba presente en las células parentales) aunque no hubo señal aumentada de Colo320DM (negativo en CEA).Las células LoVo recombinantes dieron aún una señal inicial fuerte tal que el anticuerpo añadido no generó diferencia en la señal total obtenida, la cual fue considerablemente mayor que cualquiera de los experimentos de control. Así, parece que la proteína de fusión anticuerpo enzima-CPG2 anti-CEA secretado a partir de líneas celulares tumorales positivas en CEA enlazan a la superficie de las células (por medio de CEA) mientras la misma proteína expresada a partir de tumores negativos en CEA no muestra dicho enlace.

Ejemplo 8 Células tumorales LoVo que expresan la proteína de fusión anticuerpo-enzima se matan selectivamente in vitro mediante un profármaco

Las células tumorales colorectales LoVo, transfectadas con el gen de proteína de fusión (A5B7-CPG2)_{2}, pueden matarse de forma selectiva mediante un profármaco que se convierte por la enzima CPG2 en un fármaco activo.

Para demostrar esto, células LoVo no transfectadas de control o células LoVo transfectadas con el gen de proteína de fusión anticuerpo-CPG2, se incuban con o bien el profármaco, ácido 4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil-L-glutámico (PGP; Blakey et al, (1995) Br. J. cancer 72, p1083) o con el correspondiente fármaco liberado por CPG2, 4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenol como se describe en el Ejemplo 2 con células HCT116.

Las células transfectadas que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 pueden convertir el profármaco PGP en el fármaco activo más potente mientras que las células LoVo no transfectadas son incapaces de convertir el profármaco.

Estos estudios demuestran que las células tumorales de transfección con un gen para una proteína de fusión anticuerpo-enzima pueden llevar a la muerte celular tumoral selectiva con un profármaco.

Ejemplo 9 Establecimiento de la proteína de fusión que expresa xenoinjertos de tumor LoVo en ratones atímicos

La proteína de fusión LoVo recombinante (A5B7-CPG2)_{2} que expresa células tumores o mezclas de células LoVo recombinantes o parentales, se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos (10^{7} células tumorales por ratón). Las velocidades de crecimiento tumoral para tanto 100% recombinante como mezclas 20%: 80% de células LoVo recombinante:parental, se compararon a aquellas de tumores de solo células parentales. No se vieron diferencias significativas en las curvas de crecimiento obtenidas mostrando que no se necesitaron correcciones durante las comparaciones entre las líneas celulares. Las velocidades de crecimiento tumoral observadas mostraron que en cada caso, para que los tumores de xenoinjerto alcanzaran un tamaño de 10 x 10 mm se necesitan aproximadamente 12 días.

Ejemplo 10 Determinación de actividad enzimática en muestras de xenoinjerto tumoral

Para actuar como un patrón para el ensayo, se preparó una curva patrón de enzima CPG2 en homogeneizado al 20% de tumor normal (tumor celular parental). Disoluciones posteriores de muestras se hicieron en el mismo homogeneizado al 20% de tumor normal.

Se eliminó tejido tumoral escindido del almacenaje a -80º (congelado rápidamente previamente en nitrógeno líquido) y se dejó descongelar. Cualquier tejido dérmico residual se eliminó antes de cortarse el tumor en pequeños fragmentos con un escalpelo. El tejido tumoral se transfirió a un tubo de pre-pesado y el peso del tejido tumoral se midió. Se añadió disolución de ZnCl_{2} 0,2 mM que contenía PBS a cada muestra tumoral para dar una mezcla al 20% (p/v), se homogeneizó y se colocó en hielo. Las disoluciones de tumores de muestra (en homogeneizado de tumor normal al 20%) se prepararon, por ejemplo solo, 1/10, 1/20 y 1/40.

Para la curva patrón, se hicieron disoluciones de enzima PGC2 a las siguientes concentraciones a un volumen final de 400 \mul. De manera similar, 400 \mul de cada disolución de muestras de tumor recombinante se prepararon también. Después del equilibrado a 30º, 4 \mul de disolución de metotrexato 10 mM (MTX) se añadió. La reacción se paró después de exactamente 10 minutos añadiendo 600 \mul de metanol frío hielo + TFA al 0,2%, se centrifugó y el sobrenadante se recogió. El sustrato y producto en el sobrenadante se separaron entonces por HPLC (usando una Columna de Intercambio de Cationes, HICROM^{TM} S5SCX-100A, fase móvil = metanol al 60%, formiato de amonio 60 mM al 40%/TFA al 0,1%, detección a 300 nm). Para calcular la actividad enzimática en el tejido tumoral, la curva patrón de dibujó como unidades de área de metabolito metotrexato (los patrones son tal que 20-30% del sustrato se metaboliza para asegurar que no es limitante de la velocidad). Las muestras de ensayo se analizaron comparando el área unitaria del metabolito frente a la curva patrón y después de multiplicaron por el factor de disolución. Finalmente, haciendo la suposición de trabajo de que 1 ml = 1 g, los resultados se multiplicaron por 5 (ya que las muestras se diluyeron originalmente a un homogeneizado al 20%).

Los resultados obtenidos con células LoVo recombinantes al 20%: parentales al 80% que expresan proteína de fusión (A5B7 Fab-CPG2)_{2} mostraron los siguientes resultados: los tumores tomados el día 5 tenían una actividad enzimática promedio = 0,26 U/g (intervalo entre 0,18-0,36 U/g) y al día 12 tenían una actividad enzimática promedio = 0,65 U/g (intervalo entre 0,19-1,1 U/g).

Ejemplo 11 Determinación de actividad enzimática en muestras de plasma

Para actuar como un patrón para el ensayo, se preparó una curva patrón de enzima CPG2 en plasma normal al 20% de las siguientes concentraciones: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 U/ml. De manera similar todas las muestras de plasma de ensayo se diluyeron también a plasma normal al 20%. Diluciones adicionales de estas muestras, por ejemplo: solo, 1/10, 1/20 y 1/50 también se hicieron usando suero normal al 20%. 200 \mul de alícuotas de disoluciones de cada patrón CPG2 y muestra de ensayo se equilibraron a 30º. 2 \mul de MTX 10 mM se añadieron a cada uno de los tubos y se mezcló bien a 30º. La reacción se paró después de exactamente 10 minutos (para aumentar la sensibilidad del ensayo, el tiempo de incubación puede aumentarse a 30 minutos) añadiendo 500 \mul de metanol frío hielo + 0,2% de TFA y ensayando para el producto usando la detección por HPLC como se describe anteriormente en el Ejemplo 10.

No se vio actividad en el plasma excepto en las raras ocasiones cuando el nivel de actividad enzimática en el tumor excede de 2,0 U/g, en cuyo caso los niveles de enzima en plasma se midió en el intervalo de 0,013 a 0,045 U/ml.

Ejemplo 12 Actividad anti-tumoral del profármaco PGP en tumores LoVo que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2

La proteína de fusión LoVo recombinante (A5B7-CPG2)_{2} que expresa células tumorales o mezclas de células LoVo recombinantes o parentales, se inyectaron subcutáneamente en ratones desnudos atímicos como se describe en el Ejemplo 9.

Cuando los tumores tienen 5-7 mm de diámetro se administra el profármaco PGP i.p. a los ratones (3 dosis en tampón DMSO/bicarbonato sódico 0,15 M en intervalos de una hora durante 2 horas en dosis que oscilan de 40-80 mg kg-1).

Los efectos anti-tumorales se juzgan midiendo la longitud de los tumores en dos direcciones y calculando el volumen del tumor usando la fórmula:

Volumen \ = \ \Pi/6 \ x \ D^{2} \ X \ d

donde D es el diámetro mayor y d es el diámetro menor del tumor. El volumen tumoral puede expresarse respecto al volumen tumoral en el momento en que se administra el profármaco PGP o pueden calcularse volúmenes tumorales medios de forma alternativa. La actividad anti-tumoral se compara a grupos de control que reciben o bien células tumorales transfectadas o no transfectadas o tampón sin profármaco PGP.

La administración de PGP a tumores LoVo establecida a partir de células LoVo recombinantes o mezclas de células LoVo recombinante/LoVo parental dio por resultado un significativo efecto anti-tumoral como se muestra por los tumores tratados con PGP que disminuyen en tamaño en comparación con los controles y en que toman un tiempo significativamente más largo para los tumores tratados con PGP para alcanzar 4 veces su volumen tumoral inicial en comparación con los controles (Figura 5). La administración de PGP a tumores LoVo establecido a partir de células no transfectadas dio por resultado una actividad anti-tumoral no significativa.

Pueden usarse estudios similares para demostrar que el gen anticuerpo-enzima repartido en un vector de reparto génico apropiado para establecer tumores LoVo producidos a partir de células LoVo parentales no transfectadas cuando se usa en combinación con el profármaco PGP, puede dar por resultado una actividad anti-tumoral significativa. Así, las células LoVo no transfectadas se inyectan en ratones desnudos atímicos (1 X 10^{7} de células tumorales por ratón) y una vez que los tumores tienen 5-7 mm de diámetro, el vector que contiene el gen de proteína de fusión anticuerpo-enzima se inyecta intra-tumoralmente. Después de 1-3 días de dejar a la proteína de fusión anticuerpo-enzima expresarse y enlazar con las células tumorales LoVo, el profármaco PGP se administra como se describe anteriormente. Esto da por resultado actividad anti-tumoral significativa en comparación con los controles.

Ejemplo 13 Construcción de una proteína de fusión (806.077 Fab-CPG2)_{2}

La construcción de una enzima de fusión (806.077 Fab-CPG2)_{2} se planeó con el objetivo de obtener un antígeno carcinoembrionario humano bivalente (CEA) enlazando la molécula que además muestra actividad enzimática CPG2. Para este fin, la construcción original se diseñó para contener fragmento Fd de cadena pesada de anticuerpo 806.077 unido a su C-terminal por medio de un péptido de unión flexible (G_{4}S)_{3} al N-terminal de los polipéptidos CPG2 (como se muestra en la Figura 1 aunque sustituyendo a 806.077 en vez de A5B7).

El anticuerpo 806.077 (descrito en la Solicitud de Patente Internacional WO 97/42329, Zeneca Limited) enlaza con un muy alto grado de especificidad al CEA humano. Así, el anticuerpo 806.077 es particularmente adecuado para reconocer el carcinoma colorectal u otras células que contengan antígeno CEA.

En general, el conjugado de anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) - enzima o proteínas de fusión sería al menos divalente, que es decir que es capaz de enlazarse a al menos 2 antígenos asociados al tumor (que pueden ser el mismo o diferentes). En el caso de la proteína de fusión (806.077 Fab-CPG2)_{2}, la dimerización del componente enzimático tiene lugar (después de la expresión, como con la enzima nativa), formando así una molécula enzimática que contiene dos fragmentos de anticuerpo Fab (y es así bivalente con respecto a los sitios de enlace del anticuerpo) y dos moléculas de CPG2 (Figura 2a).

a) Clonación de los genes del anticuerpo 806.077

Los métodos para el clonaje y caracterización de anticuerpo de murina recombinante 806.077 F(ab')_{2} se ha publicado (Solicitud de Patente Internacional WO 97/42329, Ejemplo 7). El ejemplo de referencia 7,5, describe el clonaje de genes de región variable de anticuerpo 806.077 en vectores Bluescript^{TM} KS+. Estos vectores se usaron posteriormente como la fuente de los genes de región variable 806.077 para la construcción de genes Fd de cadena pesada y ligera quimérica 806.077.

b) Construcciones de vector de anticuerpo 806.077 quimérico

La Solicitud de Patente Internacional WO 97/42329, Ejemplo 8, describe el clonaje de los genes Fd de cadena ligera y pesada quimérica de 806.077 en vectores pNG3-Vkss-HuCk-NEO (NCIMB depósito nº 40799) y pNG4-VHss-HuIgG2CH1' (NCIMB depósito nº 40797) respectivamente. Los vectores resultantes se designaron pNG4/VHss806. 077VH-IgG2CH1' (Fd' de cadena pesada quimérica de 806.077) y pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO (cadena ligera quimérica de 806.077). Estos vectores fueron la fuente de los genes de anticuerpo 806.077 para la construcción de la proteína de fusión 806.077 Fab-CPG2.

c) Construcción del gen de la proteína de fusión Fd de cadena pesada 806.077-CPG2

El clonaje y la construcción del gen CPG2 usado como se describe en el Ejemplo1, secciones c y d. De manera similar, la construcción del vector pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6, que se usó para la construcción del Fd de cadena pesada 806.077-CPG2, se describe en el Ejemplo 1, sección e. El gen de cadena pesada variable 806.077 se eliminó del vector pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1' por digestión con enzimas de restricción HindIII y NheI y una banda de tamaño deseado (aproximadamente 300 b.p.) que contiene el gen de región variable se purificó. Las mismas enzimas de restricción (HindII/NheI) se usaron para digerir el vector pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 en preparación para la sustitución de la región variable 806.077 por la del anticuerpo A5B7. Después de la digestión, el ADN se desfosforiló, después la banda del vector más grande se separó y se purificó. El fragmento de gen de región variable restringido de forma similar se ligó entonces a este vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó mediante análisis de restricción de digestión y posteriormente se secuenció para confirmar la secuencia génica de fusión. Un número de los clones se encontró que eran correctos y uno de esos clones, pNG4/VHss806VH-IgG2CH1/CPG2 R6, se eligió para el trabajo adicional. La secuencia del gen de proteína de fusión Fd de cadena pesada 806.077-CPG2 creado se muestra en SEQ ID NOS 25 y 26.

d) Co-transfección, expresión transitoria y análisis de la proteína de fusión

Los plásmidos pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2 R6 (que codifican la proteína de fusión Fd quimérica de anticuerpo-CPG2) y pNG3/VHss806.077VK-HuCK-NEO (que codifica la cadena ligera quimérica de anticuerpo), se co-transfectaron en células COS-7 usando un procedimiento basado en LIPOFECTIN^{TM} descrito en el Ejemplo 1f anterior. El análisis de la proteína de fusión se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1g. El ensayo de actividad enzimática basado en HPLC mostró claramente que la actividad enzimática CPG2 está presente en el sobrenadante celular y en ambos ensayos ELISA anti-CEA mostraron el enlace de proteínas a niveles proporcionales con una molécula de anticuerpo 806.077 bivalente. El hecho de que la ELISA anti-CEA detectara con un anticuerpo indicador anti-CPG2 también muestra el claro enlace CEA indicando que no solo el anticuerpo sin también la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 estaba unido a CEA. Los análisis de mancha Western con ambos ensayos de anticuerpo indicador, presentan claramente una subunidad de proteína de fusión (806.077 Fab-CPG2)_{2} del tamaño esperado de aproximadamente 90' kDa con solo una pequeña cantidad de degradación o productos menores (tal como Fab o enzima) observables. Como CPG2 se conoce solo por mostrar actividad enzimática cuando está en un estado dimérico y como solo está presente la proteína de fusión anticuerpo enzima, esto indica que la proteína de fusión de 90 kDa (véase bajo condiciones SDS/PAGE) dimeriza por medio del mecanismo natural de dimerización del CPG2 para formar una molécula de proteína de fusión anticuerpo-enzima dimérica de 180 kDa (Figura 2a) en condiciones de tampón "nativo". Además, esta molécula muestra tanto actividad enzimática de CPG2 como propiedades de enlace del antígeno CEA que no parecen ser significativamente diferentes en la proteína de fusión en comparación con la enzima o anticuerpo solos.

e) Construcción de un vector de coexpresión de proteína de fusión (806.077 Fab-CPG2)_{2} para usar en la expresión de la línea celular estable y transitoria

Para una metodología de transfección más sencilla y el acoplamiento directo tanto de cintas de expresión como un indicador de selección sencillo, un vector de co-expresión para la expresión de proteínas de fusión se construyó usando los vectores existentes pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2 (que codifica la proteína de fusión Fd de anticuerpo-CPG2) y NG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO (que codifica la cadena ligera de anticuerpo). El plásmido pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2 se digirió primero con la enzima de restricción ScaI, la banda de vector lineal se purificó, se digirió con enzimas de restricción BgIII y BamHI y una banda deseada (aproximadamente 2700 b.p.) se purificó. El plásmido pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO se digirió con la enzima de restricción BamHI después de lo que se desfosforiló el ADN y la banda del vector se purificó. El fragmento de cinta de expresión de la cadena pesada se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. La orientación se comprobó por una variedad de digestivos de restricción y se seleccionaron clones que tenían la cinta de la cadena pesada en la misma dirección que los de cadena ligera. Este plásmido se denominó pNG3-806.077-CPG2/R6-coexp.-NEO.

Ejemplo 14 Construcción de una proteína de fusión (55.1 scFv-CPG2)_{2}

El anticuerpo 55.1, descrito en la Patente de Estados Unidos 5.665.357, reconoce el antígeno asociado al tumor CA55.1 que se expresa en la mayoría de los tumores colorectales y solo se expresa suavemente o está ausente en el tejido colónico normal. La determinación de las secuencias de cADN de cadena ligera o pesada de 55.1 se describe en el Ejemplo 3 de la patente de EE.UU. mencionada anteriormente. Un vector de expresión de un plásmido permite la secreción de fragmentos de anticuerpo en el periplasma de E. coli utilizando una única secuencia directora peIB (pICI266), se ha depositado como número de acceso NCIMB 40589 el 11de octubre del 93 bajo el Tratado de Budapest en las Colecciones Nacionales de Bacterias Industriales y Marinas limitadas (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Escocia G.B.. Este vector se modificó como se describe en el Ejemplo 3.3a de la Patente de Estados Unidos 5.665.357 para crear pICI1646; este plásmido se usó para clonar diversos fragmentos de anticuerpo 55.1 como se describe en subsecciones adicionales del Ejemplo 3, incluyendo la producción de una construcción 55.1 scFv que se designó ICI1657.

El pICI1657 (conocido de otra forma como pICI-55.1 scFv) se usó como el punto de partida para la construcción de la proteína de fusión (55.1 scFv-CPG2)_{2}. El gen 55.1 scFv se amplificó usando oligonucleótidos CME 3270 y CME 3272 (SEQ ID NOS: 27 y 28 respectivamente) y el plásmido pICI1657 como la plantilla de ADN. La banda de producto de PCR resultante de aproximadamente 790 b.p. se purificó. De manera similar, el plásmido pNG4/A5B7VH-IgG2CH1/CPG2 R6 descrito en el Ejemplo 1e anterior se usó como la plantilla de ADN de una reacción PCR estándar para ampliar el gen GPC2 usando los cebadores de oligonucleótidos CME 3274 y CME 3275 (SEQ ID NOS: 29 y 30 respectivamente). La banda de producto de PCR esperada de aproximadamente 1200 b.p. se purificó.

Una reacción PCR adicional se llevó a cabo para unir (o coser) juntos los dos productos de reacción PCR purificados. Las condiciones estándar de la reacción PCR se usaron usando cantidades variables (entre 0,5 a 2 \mul) de cada producto de PCR aunque utilizando 25 ciclos (en vez de los 15 ciclos habituales) con los oligonucleótidos CME 3270 y CME 3275 (SEQ ID NOS: 27 & 30). Un producto de reacción del tamaño esperado (aproximadamente 2000 b.p.), se escindió, se purificó y se eluyó en 20 \mul de H_{2}O, se digirió usando la enzima de restricción EcoRI y se purificó. El vector pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1/CPG2 se preparó para recibir el producto de PCR anterior por digestión con enzima de restricción EcoRI, se desfosforiló, la banda de vector mayor se separó del fragmento menor y se purificó. El producto de PCR restringido de forma similar se ligó al vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción HindIII/NotI para revisar la correcta orientación del fragmento y los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia del gen de fusión. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido pNG4/55.1scFv/CPG2 R6. Las secuencias de ADN y aminoácidos de la proteína de fusión se muestran en SEQ ID NOS: 31 y 32.

Ejemplo 15 Modificación del plásmido pNG4/55.1scFv/CPG2 R6 para facilitar el intercambio génico scFv

Durante la construcción de pNG4/55.1scFv/CPG2 R6, un único BspEI (isosquizómero de AccIII) se introdujo en la secuencia de codificación de la unión (G_{4}S)_{3} flexible, se situó entre los genes del anticuerpo y de CPG2. Para facilitar el clonaje de construcciones scFv alternativas, el sitio 3 de EcoRI del gen CPG2 en pNG4/55.1scFv/CPG2 R6 se eliminó para permitir la inserción de genes de anticuerpo scFv alternativos en el marco, tanto detrás de la secuencia de señal del plásmido como 5 del gen CPG2, por medio de un clonaje de fragmento EcoRI/BspEI. Esta modificación se alcanzó por mutagénesis de PCR en que primero se amplificó el pNG4/55.1scFv/CPG2 R6 usando oligonucleótidos CME 3903 y CME 3906 (SEQ ID NOS: 33 y 34 respectivamente). En segundo lugar, se amplificó de nuevo el pNG4/55.1scFv/CPG2 R6, pero usando oligonucleótidos CME 4040 y CME 3905 (SEQ ID NOS: 35 y 36 respectivamente). La primera banda de producto de PCR esperada de aproximadamente 420 b.p. se purificó. La segunda reacción de PCR se trató de forma similar a la banda de producto de PCR esperado de aproximadamente 450 b.p. se purificó.

Una reacción PCR adicional se llevó a cabo para unir (o coser) juntos los dos productos de reacción PCR purificados. Las condiciones estándar de la reacción PCR se usaron usando cantidades variables (entre 0,5 a 2 \mul) de cada producto de PCR aunque utilizando entre 15 y 25 ciclos con los oligonucleótidos CME 3905 y CME 3906 (SEQ ID NOS: 36 & 34). Un producto de reacción de tamaño esperado (aproximadamente 840 b.p.) se purificó, se digirió usando las enzimas de restricción NotI y XbaI y la banda de fragmento esperada de ca.460 b.p. se purificó.

El pNG4/55.1scFv/CPG2 R6 original se preparó para recibir el producto de PCR anterior por digestión con enzimas de restricción NotI y XbaI, se desfosforiló y la banda de vector mayor se separó del fragmento menor. La banda vector se purificó y posteriormente el producto de PCR restringido de forma similar se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción EcoRI para revisar la inserción del fragmento modificado y los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar el cambio de secuencia. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido pNG4/55.1scFv/CPG2 R6/del EcoRI. Esta mutación elimina el sitio EcoRI que era 3' del gen CPG2 e introduce simultáneamente un codón de parada adicional. La secuencia de ADN del gen de proteína de fusión hasta, e incluyendo los dos codones de parada, se muestran en SEQ ID NO: 37.

Ejemplo 16 Construcción de un gen de anticuerpo 806.077 scFv

El 806.077 scFv se creó usando vectores pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1' y pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO que son fuentes para los genes de región variable 806.077 VH y VK. El gen 806.077 VH se amplificó a partir del plásmido pNG4/VHss806.077VH-IgG2CH1' usando condiciones PCR estándar con los oligonucleótidos CME 3260 y CME 3266 (SEQ ID NOS: 39 y 40 respectivamente). El 806.077 VK se amplificó a partir del plásmido pNG3/VKss806.077VK-HuCK-NEO usando oligonucleótidos CME 3262 y CME 3267 (SEQ ID NOS: 41 y 42 respectivamente). Los productos de reacción PCR VH y VK se purificaron.

Una reacción PCR adicional se llevó a cabo para unir (o coser) juntos los dos productos de reacción PCR purificados. Las condiciones estándar de la reacción PCR se usaron usando cantidades variables (entre 0,5 a 2 \mul) de cada producto de PCR aunque utilizando entre 15 y 25 ciclos con los oligonucleótidos de flanqueo CME 3260 y CME 3262 (SEQ ID NOS: 39 & 41). Un producto de reacción de tamaño esperado (aproximadamente 730 b.p.) se purificó, se digirió usando las enzimas de restricción NcoI y XhoI y la banda de fragmento esperada de aproximadamente 720 b.p. se purificó.

El plásmido pICI1657 (conocido de otra forma como pICI-55.1 scFv) se había modificado adicionalmente mediante la inserción de una cinta de ADN de doble hebra producida a partir de los dos oligonucleótidos CME 3143 y CME 3145 (SEQ ID NOS: 45 y 46) entre los sitios de restricción existentes de Xhol y EcoR por técnicas estándar de clonado para crear el vector pIC1266-55.1 scFv tag/his (la secuencia de ADN del gen 55.1 scFv tag/his resultante se muestra en SEQ ID NO: 47). Este vector se preparó para recibir el producto de PCR anterior por digestión con enzimas de restricción NcoI y XhoI, se desfosforiló y la banda de vector mayor se separó del fragmento menor. La banda vector se purificó y posteriormente el producto de PCR restringido de forma similar se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción EcoRI para revisar la inserción del fragmento modificado y los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar el cambio de secuencia. Se obtuvieron un número de clones con la secuencia correcta y a uno de estos clones se le dio la designación de plásmido pICI266/806IscFvtag/his (conocido de forma alternativa como pICI266-806VH/VLscFvtag/his). Las secuencias de ADN y proteína del gen 806I scFvtag/his se muestran en SEQ ID NOS: 25 y 26).

Ejemplo 17 Construcción de una proteína de fusión (806.077 scFv-CPG2)_{2}

El plásmido pICI266/806IscFvtag/his se usó como la fuente para el 806scFv. El gen se amplificó usando oligonucleótidos CME 3907 y CME 3908 (SEQ ID NOS: 48 y 49) y una banda del tamaño esperado se purificó. Este fragmento se digirió entonces usando las enzimas de restricción EcoRI y BspEI, después de lo que una banda de fragmento esperado de aproximadamente 760 b.p. se purificó.

El plásmido pNG4/55.1scFv/CPG2 R6/del EcoRI se preparó para recibir el fragmento anterior por digestión con enzimas de restricción EcoRI y BspEI, se desfosforiló y la banda de vector mayor se separó del fragmento menor. La banda vector se purificó y posteriormente el fragmento restringido de forma similar se ligó en el vector preparado y la mezcla de ligado se transformó en E. coli. El ADN se preparó a partir de los clones obtenidos y se analizó por digestión de restricción EcoRI para revisar la inserción del fragmento modificado. Los clones apropiados se secuenciaron posteriormente para confirmar la secuencia génica. Un número de los clones con la secuencia correcta se obtuvieron y a uno de estos clones se dio la designación de plásmido pNG4/806IscFv/CPG2 R6/del EcoRI. La secuencia de ADN y proteína del gen de proteína de fusión 806IscFv/CPG2 R6 se muestran en (SEQ ID NOS: 50 y 51).

Ejemplo 18 Co-transfección, expresión transitoria de proteínas de fusión anticuerpo-CPG2

Como se describe en el Ejemplo 1f, los plásmidos que codifican otras variantes de proteína de fusión pueden transfectarse usando las condiciones estándar dadas para obtener la expresión transitoria de sus proteínas de fusión codificadas a partir de células COS7. En el caso de proteínas de fusión (Fab-CPG2)_{2}, tanto la co-transfección de plásmidos apropiados como la transfección de proteínas de co-expresión puede llevarse a cabo. De manera similar, los plásmidos de una única expresión de la proteína de fusión (scFv-CPG2)_{2} pueden también transfectarse mediante el mismo protocolo. En cada caso, se usa un máximo total de 4 mg de ADN en una transfección individual.

Ejemplo 19 Interruptores génicos para la expresión de proteínas

Como se describe en el Ejemplo 1j, el uso de sistemas de interruptor génico inducibles aunque fuertemente controlados tales como los cambios "TET on" o "TET off" (Grossen, M. et al (1995) Science 268: 1766-1769) o la ecdisona/muristerona A (No, D. et al (1996) PNAS 93:3346-3351) pueden usarse para la expresión de proteínas de fusión. Puede usarse metodología y estrategias de clonado apropiadas como se describe en el Ejemplo 5, para fusiones de anticuerpo Fab-enzima que necesitan una secuencia IRES para la expresión. La inserción de la cinta génica apropiada en los vectores de expresión cambiables puede usarse si el producto de la proteína de fusión es una única cadena de polipéptidos tal como en las construcciones scFv-enzima.

Ejemplo 20 Determinación de las propiedades de proteínas de fusión anticuerpo-enzima secretadas por células COS7

El material sobrenadante de la célula COS7 puede analizarse por la presencia de proteínas de fusión de anticuerpo como se describe en el Ejemplo 1g. De forma similar, el uso de proteína de fusión expresada y profármaco en un ensayo citotóxico in vitro puede llevarse a cabo como se describe previamente en el Ejemplo 1h. El ensayo de actividad enzimática basado en HPLC puede mostrar que la actividad enzimática CPG2 está presente en el sobrenadante celular y puede detectarse por ELISA anti-CEA con un anticuerpo indicador anti-CPG2 para confirmar el enlace de proteína a niveles equilibrados con la molécula de anticuerpo A5B7 bivalente y además demostrar que la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 (no solo el componente de anticuerpo) se enlaza a CEA.

El análisis de mancha Western con ambos ensayos de anticuerpo indicador muestran claramente una subunidad de proteína de fusión del tamaño esperado. Como CPG2 se conoce solo por mostrar actividad enzimática cuando está en un estado dimérico y como solo está presente la proteína de fusión anticuerpo enzima, esto indica que la proteína de fusión (véase bajo condiciones SDS/PAGE) dimeriza por medio del mecanismo natural de dimerización del CPG2 para formar una molécula de proteína de fusión anticuerpo-enzima dimérica en condiciones de tampón "nativo". Además, esta molécula muestra tanto actividad enzimática de CPG2 como propiedades de enlace del antígeno CEA que no parece ser significativamente diferentes en la proteína de fusión en comparación con la enzima o anticuerpo solos. Los resultados obtenidos a partir del ensayo de citotoxicidad pueden demostrar que la proteína de fusión anticuerpo-enzima (junto con el profármaco) provocó al menos muerte celular equivalente y dieron por resultado menores números de células al final del periodo de ensayo que los niveles equivalentes del conjugado F(ab)2 A5B7-CPG2 (con el mismo profármaco). Como la muerte celular (anteriormente niveles de control basal) puede darse solo si el profármaco se convierte en fármaco activo por la enzima CPG2 (y como las células se lavan para eliminar la proteína no enlazada, solo la enzima enlazada a la célula permanecerá en la etapa donde el profármaco se añade). Así, este experimento puede demostrar que al menos tanto la proteína de fusión (A5B7-CPG2 R6)2 permanece enlazada en comparación con el conjugado convencional A5B7 F(ab)_{2}-CPG2 como se da un mayor grado de muerte celular (presumiblemente debido a más conversión de profármaco a fármaco).

Ejemplo 21 Determinación in vitro e in vivo de las propiedades de las proteínas de fusión anticuerpo-enzima expresadas a partir de células tumorales recombinantes

La construcción de líneas celulares tumorales que expresan proteínas de fusión puede llevarse a cabo como se describe en el Ejemplo 4.

La retención de la proteína de fusión en la superficie celular de células tumorales LoVo recombinantes que expresan proteína de fusión anticuerpo-enzima, puede mostrarse usando las técnicas descritas en el Ejemplo 7. La muerte selectiva de células tumorales LoVo cultivadas transfectadas con un gen de proteína de fusión anticuerpo-CPG2 mediante un profármaco que se convierte por la enzima en un fármaco activo, puede demostrarse como se describe en el Ejemplo 8. El establecimiento de una proteína de fusión anticuerpo-enzima que expresa xenoinjertos tumorales LoVo en ratones atímicos, puede llevarse a cabo como se describe en el Ejemplo 9. La determinación de actividad enzimática en muestras de xenoinjerto tumoral puede también determinarse como se describe en el Ejemplo 10.

La determinación de actividad enzimática en muestras de plasma se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 11. La actividad anti-tumoral del profármaco PGP en tumores LoVo que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 puede evaluarse usando el método descrito en el Ejemplo 12.

Los resultados de estos experimentos pueden usarse para mostrar que la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 secretada a partir de líneas celulares tumorales de CEA positivo enlazan a la superficie de las células (por medio de CEA) mientras la misma proteína expresada a partir de tumores negativos de CEA no muestran dicho enlace. Estos resultados pueden demostrar que las células transfectadas que expresan la proteína de fusión anticuerpo-CPG2 pueden convertir el profármaco PGP en el fármaco activo más potente mientras que las células LoVo no transfectadas son incapaces de convertir el profármaco. Por consiguiente, las células LoVo transfectadas serán sobre 100 veces más sensibles al profármaco PGP en términos de muerte celular en comparación con las células LoVo no transfectadas, demostrando así que las células tumorales transfectoras con un gen para una proteína de fusión anticuerpo-enzima pueden llevar a la muerte celular tumoral selectiva con un profármaco.

La administración de PGP a tumores LoVo establecida a partir de células LoVo recombinantes o mezclas de células LoVo recombinante/LoVo parental dio por resultado en un significativo efecto anti-tumoral como se juzga por los tumores tratados con PGP que disminuyen en tamaño en comparación con los tumores tratados solo con tampón de formulación y en que toman un tiempo significativamente más largo para los tumores tratados con PGP para alcanzar 4 veces su volumen tumoral inicial en comparación con los tumores tratados con tampón de formulación. En contraste, la administración de PGP a tumores LoVo establecido a partir de células no transfectadas daría por resultado una actividad anti-tumoral no significativa.

Pueden usarse estudios similares para demostrar que el gen anticuerpo-enzima repartido en un vector de reparto génico apropiado para establecer tumores LoVo producidos a partir de células LoVo parentales no transfectadas cuando se usa en combinación con el profármaco PGP, puede dar por resultado una actividad anti-tumoral significativa. Así, las células LoVo no transfectadas se inyectan en ratones desnudos atímicos (1 X 10^{7} de células tumorales por ratón) y una vez que los tumores tienen 5-7 mm de diámetro, el vector que contiene el gen de proteína de fusión anticuerpo-enzima se inyecta intra-tumoralmente. Después de 1-7 días de dejar a la proteína de fusión anticuerpo-enzima expresarse y enlazar con las células tumorales LoVo, el profármaco PGP se administra como se describe anteriormente. Esto da por resultado una actividad anti-tumoral significativa en comparación con los ratones control que recibieron tampón formulación en vez de profármaco PGP.

Ejemplo 22 Preparación de una proteína de fusión (murina A5B7 Fab-CPG2)_{2}

(Murina A5B7 Fab-CPG2)_{2} se expresa a partir de células COS-7 y CHO esencialmente como se describe en la parte (d) del Ejemplo 48 de la Solicitud de Patente Internacional WO 97/42329 (Zeneca Limited, publicada el 13 de Noviembre de 1997) por clonación de genes para la cadena ligera de A5B7 y A5B7 Fd unido a su C-terminal por medio del péptido de unión (G_{4}S)_{3} flexible a CPG2 en el vector de sobre-expresión pEE 14.

La cadena ligera de murina A5B7 se aisló a partir de pAF8 (descrito en la parte g del Ejemplo de Referencia 5 en la Solicitud de Patente Internacional WO 96/20011, Zeneca Limited). El plásmido pAF8 se corta con EcoRI y el fragmento de 732 bp resultante se aisló por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se clona en pEE14 (descrito por Bebbington en METHODS: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, 136-145) se cortó de forma similar con EcoRI y el plásmido resultante se usó para transformar la cepa DH5\alpha de E. coli. Las células transformadas se ponen en placas en L agar más ampicilina (100 \mug/ml). Un clon que contiene un plásmido con la secuencia y orientación correctas, se confirma por análisis secuencial de ADN (SEQ ID NO: 57) y el plásmido se llamó pEE14/A5B7muVkmuCK. La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la señal codificada (residuos de aminoácidos 1 a 22) y la cadena ligera de murina (residuos de aminoácidos 23 a 235) se muestran en SEQ ID NO: 58.

El gen Fd de murina-CPG2 se prepara a partir de la variante R6 del gen CPG2 (d del Ejemplo 1) y la secuencia A5B7 Fd de murina en pAF1 (descrito en la parte d del Ejemplo de Referencia 5 en la Solicitud de Patente Internacional WO 96/20011, Zeneca Limited). Una reacción PCR con oligonucleótidos SEQ ID NOS: 53 y 54 en pAF1 da un fragmento de 247 bp. Este se corta con HindIII y BamHI y se clona en pUC 19 cortado de forma similar. El plásmido resultante se usa para transformar la cepa DH5\alpha de E. coli. Las células transformadas se ponen en placas en L agar más ampicilina (100 \mug/ml). Un clon que contiene un plásmido con la secuencia correcta se nombra pUC19/muCH1/NcoI-AccIII(Fd). Un segundo PCR con oligonucleótidos SEQ ID NOS: 55 y 56 en pNG/VKss/CPG2/R6-neo (Ejemplo 1) da un fragmento de 265 bp que se corta con HindIII y EcoRI y se clona en pUC19 cortado de forma similar como antes para dar el plásmido pUC19/muCH1-unión-CPG2/AccIII-SacII. El plásmido pUC19/muCH1/NcoI-AccIII(Fd) se corta con HindIII y AccIII y el fragmento 258 bp se aísla por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se clona en pUC19/muCH1-unión-CPG2/AccIII-SacII cortado por HindIII y AccIII para dar el plásmido pUC 19/muCH1-unión-CPG2/NcoI-SacII. Un fragmento de 956 bp se aísla a partir de pNG/VKss/CPG2/R6-neo cortándolo con SacII y EcoRI. Éste se clona en pUC19/muCH1-unión-CPG2/Ncol-SacII cortado por Sacll y EcoRI para dar el plásmido pUC19/muCH1-unión-RC/CPG2(R6). La construcción génica completa se prepara aislando un fragmento de 498 bp HindIII a NcoI a partir de pAF1 y clonándolo en pUC19/muCH1-unión-RC/CPG2(R6)cortado por HindIII y NcoI. El plásmido resultante se usa para transformar la cepa DH5\alpha de E. coli. Las células transformadas se ponen en placas en L agar más ampicilina (100 \mug/ml). Un clon que contiene un plásmido con la secuencia y orientación correctas, se confirma por análisis secuencial de ADN (SEQ ID NO: 59) y el plásmido se nombra pUC19/muA5B7-RC/CPG2(R6). La secuencia de aminoácidos de la secuencia de la señal codificada (residuos de aminoácidos 1 a 19) y la Fd de murina-unión-CPG2 (residuos de aminoácidos 20 a 647) se muestran en SEQ ID NO: 60. De manera alternativa, la secuencia génica de CPG2 descrita en el Ejemplo 1 puede obtenerse por síntesis génica total y convertirse a la variante R6 como se describe en d del Ejemplo 1. En este caso, el residuo de base C en la posición 933 en SEQ ID NO: 59 se cambia por G. La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 60 permanece inalterada.

Para la expresión en el vector pEE 14, el gen se clona primero en pEE6 (éste es un derivado de pEE6.hCMV - Stephens y Cockett, 1989, Nucleic Acids Research 17, 7110, en que un sitio HindIII hacia arriba del promotor hCMV se ha convertido en un sitio BglII). El plásmido pUC19/muA5B7-RC/CPG2(R6) se corta con HindIII y EcoRI y el fragmento de 1974 bp se aísla por electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Este se clona en pEE6 cortado por HindIII y EcoRI en la cepa DH5\alpha de E. coli para dar el plásmido pEE6/muA5B7-RC/CPG2(R6). El vector de co-expresión pEE14 se hace primero cortando pEE6/muA5B7-RC/CPG2(R6) con BglII y BamHI y aislando el fragmento de 4320 bp en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se clona en pEE14/A5B7muVkmuCK cortad por BgIII y BamHI. El plásmido resultante se usa para transformar la cepa DH5\alpha de E. coli. Las células transformadas se ponen en placas en L agar más ampicilina (100 \mug/ml). Un clon que contiene un plásmido con la secuencia y orientación correctas se confirma por análisis secuencial de ADN y el plásmido se nombra pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6).

Para la expresión de (murina A5B7 Fab-CPG2)_{2}, se usa el plásmido pEE14/muA5B7-RC/CPG2(R6) para transfectar células COS-7 o CHO como se describe en el Ejemplo 48 de la Solicitud de Patente Internacional WO 97/42329, Zeneca Limited, publicada el 13 de Noviembre de 1997. Los sobrenadantes de las células COS y los sobrenadantes de los clones CHO se ensayan para la actividad como se describe en el Ejemplo 1 y se muestra que tienen actividad de enlace a CEA y enzimática CPG2.

Ejemplo 23 Composición farmacéutica

Lo siguiente ilustra una forma de dosificación farmacéutica representativa que contiene una construcción génica de la invención que puede usarse para terapia en combinación con un profármaco adecuado.

Una disolución acuosa estéril, para inyección o bien parenteral o directamente en tejido tumoral, que contiene 10^{7}-10^{11} partículas de adenovirus que comprende una construcción génica como se describe en el Ejemplo 1. Después de 3-7 días, tres dosis de 1 g de profármaco se administran como disoluciones estériles a intervalos de una hora. El profármaco se selecciona a partir de ácido N-(4-[N,N-bis(2-yodoetil)-amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico, N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico-gamma-(3,5-dicarboxi)anilida o ácido N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Zeneca Limited

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(B)

CALLE: 15 Stanhope Gate

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(C)

CIUDAD: Londres

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(D)

ESTADO: Inglaterra

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(E)

PAÍS: Reino Unido

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): W1Y 6LN

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 0171 304 5000

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

FAX: 0171 304 5151

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TÉLEX: 0171 304 2042

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CHEMICAL COMPOUNDS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 60

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(iv)

FORMATO LEGIBLE DE ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: PC compatible de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Version nº 1.30 (EPO)

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(vi)

DATOS DE SOLICITUD PREVIA:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9709421.3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 10-MAYO-1997

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAATTCCT CGAGGAGCTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGGAGCT CCTCGAGGAA TTCCCGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAAGCGCG ACAACGTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGGCCTTG CCGGTGATCT GGACCTGCAC GTAGGCGAT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGCCGGCG CCCAGATC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCGAACA TCATCCCC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACCGGCA AGGCCTCG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1236 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

5

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 412 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCACTCTCAC AGTGAGCTCG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGCTACCG CCACCACCAG AGCCACCACC GCCAACTGTC TTGTCCACCT TGGTG

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCCCTCTA GAGTCGAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGGTGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTG

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1929 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

8

80

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 643 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 705 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 235 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTGAAT TCGCCGCCAC TATGGATTTT CAAGTGCAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAATTGGAT CCGAGCTCCT ATTAACACTC TCCCCTGTTG AAGC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 50 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTCCGG ATCCCTGCAG CCATGGAGTT GTGGCTGAAC TGGATTTTCC

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTAGTC TAGATTATCA CTTGCCGGCG CCCAGATC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGGGATCC AGATCTGAGC TCCTGTAGAC GTCGACATTA ATTCCG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAAATCCA GTTCAGCCAC AACTCCATGG

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1926 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 642 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTGGAA TTCAGTGTCA GGTCCAACTG CAGCAGCCT

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTACCGCCA CCTCCGGAGC CACCACCGCC CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TGCC

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGGAGGTG GCGGTAGCGG TGGCGGGGGT TCCCAGAAGC GCGACAACGT GCTGTTCC

\hfill

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCGAGGAA TTCTTTCACT TGCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2019 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 673 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGCGCCGGC AAGTGATAAA ATTCCTCGAG GAGCTCC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCACCTCT GACTTGAGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGCTCCTC GAGGAATTTT ATCACTTGCC GGCGCCC

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTGAACGCC GACGTGCGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2025 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 288 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCAACCAG CCATGGCCGA GGTGCAGCTG CAGCAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACCCACCA CCGCCCGAGC CACCGCCACC CGAGCTCACG GCGACTGAGG TTCC

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGGGCGGTG GTGGGTCGGG TGGCGGCGGA TCTCAGATTG TGCTCACCCA GTCT

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTTTGATC TCGAGCTTGG TCCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 843 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 281 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

23

230

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 864 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGCTTGGAA TTCAGTGTGA GGTGCAGCTG CAGC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCCACCTCC GGAGCCACCA CCGCCCCGTT TGATCTCGAG CTTGG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1998 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3217 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGATCTGAA GCTTAAACTA ACTCCATGGT GACCC

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 61 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTGCGAAT TCAGCAGCAG GTTCTTGCCG CCGCGGCCCT TGATCTTGCC C

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 732 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16..720

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

34

340

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 235 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

35

350

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1974 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DISPOSICIÓN EN HEBRAS: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16..1956

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 647 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

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39

40

Claims (15)

1. Una construcción génica que codifica un anticuerpo reconocedor de células y una enzima heteróloga activadora de un profármaco para usar como un medicamento en un huésped mamífero en el que la construcción génica es capaz de expresar el anticuerpo reconocedor de células y la enzima heteróloga activadora del profármaco como un conjugado dentro de una célula en el huésped mamífero, y en el que el conjugado puede abandonar la célula desde entonces para la localización selectiva a un antígeno de la superficie celular reconocido por el resto reconocedor de la
célula.

2. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 2, en la que el anticuerpo es un anticuerpo antígeno anti-carcinoembrionario seleccionado del anticuerpo A5B7 o anticuerpo 806.077 con nº de acceso ECACC 96022936.

3. Una construcción génica para usar como un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enzima heteróloga activadora del profármaco es una carboxipeptidasa.

4. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 3, en la que la carbopeptidasa es CPG2.

5. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 4, en la que el CPG2 tiene sitios de glicosilación de polipéptido mutados para así evitar o reducir la glicosilación en la expresión de células de mamífero.

6. Una construcción génica para usar como un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en que el conjugado anticuerpo-enzima CPG2 es una proteína de fusión en la que la enzima está condensada al C-terminal del anticuerpo a través de la cadena pesada o ligera del mismo, por lo cual la dimerización del conjugado codificado cuando se expresa puede tener lugar a través de un dominio de dimerización en CPG2.

7. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 6, en la que la proteína de fusión se forma a través de la unión de un C-terminal de una cadena pesada Fab del anticuerpo a un N-terminal de una molécula CPG2 para formar un Fab-CPG2, por lo cual dos moléculas Fab-CPG2 cuando se expresan, se dimerizan a través de CPG2 para formar un conjugado (Fab-CPG2)_{2}.

8. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 3, en la que la carboxipeptidasa se selecciona de carboxipeptidasa humana B [D253K], carboxipeptidasa humana B [G251T,D253K] o carboxipeptidasa humana B [A248S,G251T,D253K].

9. Una construcción génica para usar como un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una secuencia regulatoria transcripcional que comprende un promotor y un elemento de control que es un interruptor genético para controlar la expresión de la construcción génica.

10. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 9, en que la secuencia regulatoria transcripcional comprende un elemento de control de cambio genético regulado por la presencia de tetraciclina o ecdisona.

11. Una construcción génica para usar como un medicamento según la reivindicación 9 o 10, en la que el promotor es dependiente del tipo de célula y se selecciona de los siguientes promotores: antígeno carcinoembrionario CEA); alfa-fotoproteína (AFP); tirosina hidroxilasa; acetil colina transferasa; enolasa específica de la tirosina insulina; proteína ácida de fibraglial; HER-2/neu; c-erbB2 y N-myc.

12. Una construcción génica para usar como un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está empaquetada dentro de un adenovirus para repartir a huésped mamífero.

13. El uso de una construcción génica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-11, para la fabricación de un medicamento para la terapia del cáncer en un huésped mamífero.

14. Un sistema de dos componentes igualados diseñado para usar en un huésped mamífero en que los componentes comprenden:

(i)

un primer componente que comprende una construcción génica como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y;

(ii)

un segundo componente que comprende un profármaco que puede convertirse en un fármaco citotóxico mediante la enzima heteróloga codificada por el primer componente.

15. Un sistema de dos componentes apareados según la reivindicación 14 en que:

el primer componente comprende un gen que codifica la enzima heteróloga CPG2; y

el segundo componente profármaco se selecciona de ácido N-(4-[N,N-bis(2-yodoetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico, N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)-amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico-gamma-(3,5-dicarboxi)anilida o ácido N-(4-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]-fenoxicarbonil)-L-glutámico o una sal aceptable farmacéuticamente de los mismos.