SK153295A3 - A truncated keratinocyte growth factor (kgf) having increased biological activity - Google Patents

Description

SKRÁTENÝ KERATINOCYTOVÝ RASTOVÝ FAKTOR (KGF), MAJÚCI ZVÝŠENÚ BIOLOGICKÚ AKTIVITU

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka všeobecne keratinocytového rastového faktoru (keratinocyte growth factor - KGF). Špecifickejšie sa tento vynález týka skráteného KGF fragmentu a jeho analógov, majúcich zvýšenú biologickú aktivitu a zníženú toxicitu v porovnaní s rekombinantným KGF plnej dĺžky, exprimovaným v systéme hmyzích buniek. Tomuto KGF fragmentu, označenému tu ako KGF_deal_₂₃, chýba prvých 23 aminokyselinových zvyškov od N-konca zrelého KGF plnej dĺžky, kde tento koniec zahrňuje glykozylačné miesto pri aminokyselinových zvyškoch 14 až 16 od N-konca ako je uvedené Finchom, P. W. a spol., Science 245: 752 - 755 (1989) a bol prv pokladaný za prepožičiavajúci KGF jeho epiteliálnu bunečnú špecifickosť.

Doterajší stav techniky

KGF patrí do rodiny fibroblastových rastových faktorov (FGF), ktorých prototypom je bázický FGF (bFGF). KGF je preto tiež označovaný ako FGF-6. Podobne iným FGF je KGF heparín viažuci proteín, ale na rozdiel od iných FGF, má jedinečnú špecifickosť delových buniek. Podrobnejšie sú FGF všeobecne schopné stimulovať proliferáciu a diferenciáciu rôznych typov buniek odvodených od primárneho alebo sekundárneho mezodermu, ako i z neuroektodermu. KGF je podobný iným FGF vo svojej schopnosti stimulovať epiteliálnu bunečnú proliferáciu, ale odlišuje sa od iných FGF svojho neschopnosťou stimulovať endoteliálne bunky alebo proliferáciu fibroblastov, ako popisuje Finch, P.W. a spol.

(loc. cit.).

FGF, zahrňujúci acidický fibroblastový rastový faktor (aFGF) a bázický fibroblastový rastový faktor (bFGF) sú známe tým, že majú heparín viažuce vlastnosti a majú schopnosť indukovať diferenciáciu a proliferáciu ventrálneho, ako i dorzálneho mezodermu v ranných blastulách, ako popisuje Gospodarovicz a spol., Celí. Biol. Rev. 29: 307 - 314 (1991) a Basilico a spol., Adsv. Cancer Res. 59: 115 - 165 (1992). Odozva buniek na FGF je sprostredkovaná ich väzbou k bunečným povrchovým receptorom (FGFR), od ktorých sú odvodené tri intertypy, ako popisuje Hou a spol., Science 251: 665 - 668 (1991). Vysoko afinitné FGFR sú tyrozín kinázy a zahrňujú Flg receptor (FGFR-1), bek receptor (FGFR-2) a J. Sam receptor (FGFR-3) ako uvádza Lee a spol. Science 245: 57 - 60 (1989), Dionne a spol., EMBO 9: 2685 - 2692 (1990), Miki a spol., Science 251: 72 - 75 (1991), Miki a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 246 - 250 (1992) a Dell a spol., J. Biol. Chem., 267: 21225 - 212209 (1992) .

Ako FGFR-1, tak FGFR-2 sú silne exprimované v mezodermáIných a neuroendodermálnych tkanivách a obidva sú schopné viazať aFGF a bFGF s podobnými afinitami. FGFR-3 je KGF receptor, ktorý je špecifický k epiteliálnym bunkám. Je to alternatívny transkript FGFR-2. Na rozdiel od FGFR-2, ktorý vykazuje vysokú afinitu ako pre aFGF, tak bFGF a nevykazuje afinitu pre KGF, FGFR-3 viaže KGF a aFGF s afinitou približne 20 až 1 000 krát vyššou ako bFGF, ako popisuje Miki a spol. (loc. cit.) a Dell a spol. (loc. cit.).

Úzko obmedzená aktivita profilu KGF k epiteliálnym bunkám je žiaduca napríklad ako vo veía typoch aplikácií hojenia rán, tak pri liečení hyperproliferatívnych chorôb epidermu ako je psoriasis a karcinóm bazálnych buniek. V súčasnosti, s výnimkou KGF, neexistuje pre tieto aplikácie žiaden vysoko vhodný mitogenický faktor. Je preto žiaduce, aby KGF bol modifikovaný na zvýšenie svojej potencie a zníženie svojej cytotoxicity pre terapeutické aplikácie.

V poslednej dobe zistili Ron a spol., J. Biol. Chem., 268: 2984 - 2988 (február 1993), že ak bol KGF₁₆₃ exprimovaný v T7 prokaryotickom expresnom systéme, mal by byt získaný rekombinantný KFG (rKFG) polypeptid, ktorý vykazuje mitogenickú aktivitu. Ak bola rKGF molekula skrátená deléciou 3, 8, 27, 38 a 48 aminokyselinových zvyškov, od N-konca zrelého KGF_ir-i lb J polypeptidu, mení sa biologická aktivita výsledných molekúl. S deléciou 3a 8 aminokyselinových zvyškov nie je mitogenická aktivita výsledných molekúl ovplyvnená v porovnaní s rKGF plnej dĺžky (rKGF₁₆₃). Delécia 27 aminokyselinových zvyškov však vedie k 10 až 20krát zníženej mitogenickej aktivite. Delécia 38 a 48 aminokyselinových zvyškov vedie k úplnej strate mitogenickej aktivity a heparín viažucej aktivity. Ron a spol. neboli úspešní pri produkcii akýchkoívek skrátených KFG fragmentov, ktoré vykazujú zvýšenú mitogenickú aktivitu v porovnaní s rKGF₁₆₃ molekulou.

Podstata vynálezu fragment, ktorý obsahuje plnej dĺžky, KGF_no< a mitogenickej

136 aktivity

Jedným predmetom predloženého vynálezu je poskytnúť KGF aminokyselinovú sekvenciu zrelého KGF vykazuje aspoň dvojnásobné zvýšenie porovnaní s rekombinantným KGF plnej dĺžky, rKGFj₃g. Zvláštnym predmetom je poskytnutie KGF fragmentu, ktorý nemá sekvenciu obsahujúcu prvých 23 N-koncových aminokyselinových zvyškov, C-N-D-M-T-P-E-Q-M-A-T-N-V-N-C-S-S-PE-R-H-T-R- z rKGF₁₃₆.

Ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnutie KGF fragmentu, ktorý má zníženú cytotoxicitu v porovnaní s KGF₁₆₃. Ešte ďalším predmetom je poskytnúť konjugát, ktorý obsahuje KGF fragment popísaný vyššie a toxínovú molekulu. Toxínovou molekulou môže byt aspoň jedna z molekúl ricínu A, diftéria toxínu a saporínu.

Ešte ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnutie terapeutickej kompozície, ktorá obsahuje KGF fragment, ako je popísaný vyššie a farmaceutický prijateľný nosič, napríklad niektorý z tých, ktoré sú vhodné na topickú aplikáciu na íudskú kožu.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnúť DNA molekulu, ktorá je zložená z nukleotidovej sekvencie, ktorá kóduje KGF fragment popísaný vyššie.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnúť expresný vektor, ktorý obsahuje DNA molekulu, ktorá kóduje KGF fragment, popísaný vyššie a regulátorovú sekvenciu pre expresiu DNA molekuly. Expresným vektorom môže byt napríklad bakulovírus.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnutie hostiteľskej bunky transformovanej vyššie popísaným expresným vektorom. Hostiteľskou bunkou môže napríklad byt bakteriálna bunka, kvasinková bunka, cicavčia bunka alebo hmyzia bunka.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnutie spôsobu produkcie KGF fragmentu kultiváciou transformovanej hostiteľskej bunky, ako je popísané vyššie a izolácia KGF fragmentu z kultúry.

Ešte ďalším predmetom predloženého vynálezu je poskytnutie metódy stimulácie rastu epiteliálnych buniek aplikáciou KGF fragmentu na plochu, v ktorej je požadovaný rast epiteliálnych buniek a ponechanie ich vyrastenia.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnúť metódu na hojenie rán aplikáciou terapeutickej kompozície popísanej vyššie na plochu ošetrovanej rany a jej zahojenie.

Ešte ďalším z predmetov predloženého vynálezu je poskytnúť spôsob liečenia hyperproliferatívnej choroby epidermu aplikáciou konjugátu popísaného vyššie na ošetrovanú plochu.

Ďalšie predmety, znaky a výhody predloženého vynálezu by mali byt zrejmé odborníkom v odbore a nie je potrebné ich tu uvádzať. Predložený vynález zahrňuje varianty a modifikácie vyššie uvedeného, ktoré sú zrejmé odborníkom v odbore a ktoré podstatne nemenia charakter a aktivitu fragmentu, konjugátu, terapeutickej kompozície, vektoru, hostiteľa a spôsobu použitia.

Popis obrázkov na pripojených výkresoch

Obr. 1 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu zrelého, ľudského KGF plnej dĺžky, začínajúci N-koncom a obsahujúci 163 aminokyselinových zvyškov a jediným N- pripojeným glykozylačným signálom pri aminokyselinových zvyškoch 14 - 16.

Obr. 2 predstavuje pAcl3 expresný vektor, do ktorého bola inzertovaná 163 aminokyselinová sekvencia KGF.

Obr. 3 ilustruje ďalšie čistenie KGF fragmentu podľa predloženého vynálezu z SFP bunečného kondicionovaného média po eluácii z Heparin Sepharosovej (HS) kolóny pomocou 1 M NaCI. Bioaktívne frakcie HS kolóny boli spojené, zriedené 5-násobne 10 mM Tris, pH 7,3 a vložené na Mono S HR5/5 katiónovýmennú FLPC.

Obr. 4 porovnáva biologickú aktivitu dlhej, t.j. fKGF₁₃₆ a krátkej t.j. ^KGFdesl-23 f°^riny KGF proti aFGF na bunkách bunečnej línie Balb/Mk.

Obr. 4 porovnáva biologickú aktivitu dlhej, t.j. fKGF^g a krátkej, t.j. KGF_desl_₂₃ formy KGF proti bFGF na vaskulárnych endoteliálnych bunkách získaných z veľkých ciev (A:ABAE bunky) alebo kapilár (B:ACE bunky).

Prekvapujúco bolo objavené, že skrátený, neglykozylovaný KGF, tu označený ako KGF fragment alebo ^KGFdesl-23 ' ^ktorÝ deléciu zahrňujúcu prvých 23 N-koncových aminokyselinových zvyškov z rKGF₁₆₃, vykazuje väčšiu biologickú aktivitu a zníženú cytotoxicitu na epiteliálnych bunkách v porovnaní s rKGF₁₆₃.

V súlade s vyššie uvedeným je preferovaným vyhotovením predloženého vynálezu nový skrátený, neglykozylovaný KGF fragment, KGF_desl_₂₃, ktorý nie je spojený s nečistotami, ktoré normálne sprevádzajú natívnu molekulu, ak je produkovaná in vivo.

Tento fragment má zjavnú molekulovú hmotnosť asi 18 kDA podlá jej migrácie v Na Dod SO₄/PAGE ako jediný pík. Špecifická aktivita čisteného ^KGFdesl-23 Balb/Mk buniek je približne 2,5 x lo¹ jednotiek na miligram (ED^q 40 pg/ml), asi 7- až 10-krát väčšia ako rKGF₁₆₃ proteín alebo aFGF pri porovnaní v štúdii bunečnej proliferácie a 100 krát väčšia ako je pri bioštúdii rKGF₁₆₃ skúšaním iniciácie DNA syntézy v Balb/Mk bunkách v chemicky definovanom médiu, ako je popísané v PCT patentovej prihláške č. WO 90/08771.

V ďalšom výhodnom vyhotovení predloženého vynálezu je produkovaný KGF_desl_₂₃ rekombinantnou DNA technológiou, najmä pre komerčnú výrobu vo velkom meradle. V ďalšom výhodnom vyhotovení rekombinantné DNA molekula a expresný vektor, obsahujúce každý KGF_desl_23 alebo ich analógy v súlade s predloženým vynálezom sú vyhotovené štandardnou technológiou génovej expresie použitím metód dobre v odbore známych.

V ďalšom vyhotovení môžu byť DNA alebo vektor, obsahujúci DNA, kódujúci ^KGFdesl-23' ^exPrimované v bakteriálnom, cicavčom, kvasinkovom alebo hmyzom bunečnom expresnom systéme. Vo výhodnom vyhotovení je bakteriálny alebo kvasinkový bunečný expresný systém ideálny pre produkciu ^KGFdesi-23 fragmentu. V ďalšom výhodnom vyhotovení sú DNA alebo vektor exprimované v expresnom systéme hmyzích buniek.

KGF fragment podlá predloženého vynálezu môže byť použitý na identifikáciu receptor rozpoznávajúcich miest ako i na zostavenie peptidových agonistov alebo antagonistov. Naviac, vzhladom špecifickosti KGF pre keratinocyty, jeho indukovať proliferáciu vaskulámych endoteliálnych fibroblastov a jeho netoxicite je v inom výhodnom vyhotovení predloženého vynálezu ^KGFdesl-23 ^výbodne použitý na aplikáciu pri hojení rán, najmä tam, kde je žiaduce podporovať reepitelizáciu kože. Výhodné vyhotovenie využíva ^KGFdesl-23 v obnove corneálneho epitelu. Iné aplikácie ^KGFdesl-23' ^m°žu byt založené na jeho špecifickosti k epiteliálnym bunkám k jedinečnej neschopnosti buniek alebo nachádzajúcim sa v gastrointestinálnom trakte.

Voľba KGF fragmentu z iných rastových faktorov ako je epidermálny rastový faktor (EGF), od doštičiek odvodený faktor (PDGF) a iné FGF na hojenie kože závisí od odborníka v odbore. Iné rastové faktory napríklad indukujú fibropláziu a angiogenézu, naviac k stimulácii, buď priamo alebo nepriamo, keratinocytovej proliferácie. Pri hojení kože by takéto ďalšie aktivity mohli produkovať nežiaduce vedľajšie

V corneálnom hojení zahrňujúcom zákroky, by toto použitie iných faktorov mohlo indukovať inváziu krvných ciev do cornea, čo by mohlo viest k nežiaducej opáčite k edému. KGF, naopak, má jedinečnú špecificitu pre a nevyvoláva proliferáciu vaskulárnych endoteliálnych buniek alebo fibroblastov, a preto by mohol byt činidlom voíby pre tieto konkrétne aplikácie pri hojení rán.

účinky ako je škárovanie. buď rany alebo chirurgické cornea alebo keratinocyty

Ďalej KGF fragment podía predloženého vynálezu môže byt použitý v inom vyhotovení predloženého vynálezu, vo forme konjugátu KGF fragment/toxín. Takýto konjugát môže spomaľovať alebo ukončovať chorobný proces v takých chorobách ako je psoriasis, čo vyplýva z hyperproliferácie bazálnej vrstvy keratinocytov z epidermis. Tento konjugát by nemal ovplyvňovať ďalšie dva hlavné bunečné typy ako sú vaskulárne endoteliálne bunky a fibroblasty, prítomné v týchto tkanivách.

V ďalšom vyhotovení predloženého vynálezu môže byt konjugát KGF fragment/toxín kvôli zabráneniu proliferácie nádorových buniek, napríklad bazálnych buniek karcinómu.

Praktické vyhotovenie predloženého vynálezu bude využívať, ak nie je uvedené inak, konvenčné techniky molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnéj DNA a imunológie, ktoré sú bežné v odbore, takéto techniky sú dobre vysvetlené v literatúre. Pozri napr. Sambrook a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), DNA Cloning, Volumes I and II, D. N. Glover, vyd. IRL Press (1985),

Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, vyd. IRL Press (1984), Nucleic Acid Hybridization, B. D. Hames and S. J. Higgins, vyd. IRL Press (1984), Transcription and Translation, B. D. Hames and S. J. Higgins, vyd. IRL Press (1984), Animal Celí Culture, R. i. Freshney, vyd. IRL Press (1986), B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, (vydavateľ) (1984), šerie: Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. H. Miller a M.P. Calos, vyd. Cold Spring Harbor Laboratory (1987), Methods in Enzymology, zv. 154 a zv. 155, Wu a Grossman a Wu, (vyd. Mayer a Walker), (1987), Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology, Academic Press, Londýn, Scopes (autor?), Proteín Purification: Principles and Practice, 2. vyd., Springer-Verlag, N.Y (rok?) a Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV, D.M. Weir, C. C. Blackwell vyd., (1986), Kitts a spol., Biotechniques 14: 810- 817 (1993), Munemitsu a spol., Mol. and Celí. Biol., 10: 5977 - 5982 (1987) a ďalší.

Na obr. 1 boli použité štandardné skratky pre aminokyseliny a rovnaké sú použité v tomto opise. Všetky publikácie, patenty a patentové prihlášky sú tu citované ako odkazy. Kvôli presnosti sú ďalej definované najčastejšie sa vyskytujúce výrazy.

Definície

Použitý výraz keratinocytový rastový faktor alebo KGF označuje polypeptidy, ktoré patria do rodiny štruktúrne odlišných proteínov, fibroblastových rastových faktorov, FGF, ktoré vykazujú rôzne stupne sekvenčnej homológie potvrdzujúce, že sú kódované príbuznou rodinou génov. KGF má charakteristiky popísané v tomto opise, napríklad sa viaže k FGFR-3 a je schopný stimulovať rast epiteliálnych buniek, najmä keratinocytov. KGF plnej dĺžky je tvorený 163 aminokyselinovými zvyškami.

Ako je tu použitý podľa predloženého vynálezu je KGF fragment polypeptid, ktorý je zložený z časti aminokyselinovéj sekvencie zrelého KGF plnej dĺžky. Analóg KGF fragmentu, ako je tu označovaný, zahrňuje minoritné inzercie, delécie alebo substitúcie KGF fragmentu, ktoré podstatne neovplyvňujú jeho vlastnosti. Napríklad, sú prijatelné náhrady konzervatívnych aminokyselín. Takéto náhrady sú napríklad tie, ktoré sú vykonávané v skupine aminokyselín, ktoré sú príbuzné vo svojich bočných reťazcoch. Skupiny aminokyselín sú (1) kyslé: kyselina aspartová, kyselina glutamová, (2) bázické: lyzín, arginín, histidín, (3) nepoláme: alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metonín, tryptofán a (4) nenabité polárne: glycín, asparagín, glutamín, cystín, serín, treonín, tyrozín. Fenylalanín, tryptofán a tyrozín sú niekedy klasifikované spolu ako skupina aromatických aminokyselín. Všeobecne sa prijíma, že konzervatívne aminokyselinové náhrady pozostávajúce z izolovanej náhrady leucínu izoleucínom alebo valínom, alebo aspartovej kyseliny kyselinou glutamovou alebo treonínu serínom alebo podobná konzervatívna náhrada aminokyseliny štruktúrne príbuznou aminokyselinou, v oblasti mimo polypeptidové aktívne miesto, nebudú mať podstatný vplyv na vlastnosti polypeptidu.

Vlastnosti	KGF
aktivitu, ktorá je
najvýhodnejšie	7 až
epiteliálnych	buniek
natívneho KGF	plnej
k FGFR-3.

fragmentu zahrňujú (i) jeho biologickú 2 až 10 krát väčšia, výhodne 2 krát, 10 krát zvýšená v stimulácii proliferácie v porovnaní s molekulou maturovaného dĺžky a (ii) jeho schopnosť viazať sa

Výraz rekombinantný polynukleotid ako je tu použitý, znamená polynukleotid polosyntetického alebo syntetického pôvodu alebo kódovaný cDNA alebo genómovou DNA (gDNA), ktorý (1) nie je spojený s celým alebo s časťou polynukleotidu, s ktorým je spojený v prírode, (2) je spojený s polynukleotidom iným ako tým, ku ktorému je pripojený v prírode, alebo (3) nevyskytuje sa v prírode.

Replikon je akýkoľvek genetický prvok, ako je plazmid, chromozóm, vírus, kozmid atď., ktorý sa správa ako autonómna jednotka polynukleotidovej replikácie v bunke, t.j. je schopný replikácie pod vlastnou kontrolou. Replikon môže obsahovať napríklad selektujúce markery.

Rekombinantný vektor je replikon, v ktorom je pripojený ďalší polynukleotidový segment, takže prináša replikáciu a/alebo expresiu pripojeného polynukleotidového segmentu.

Regulátorová sekvencia je polynukleotidová sekvencia, ktorá je nevyhnutná na reguláciu expresie kódujúcej sekvencie, ku ktorej je polynukleotidová sekvencia operabilne pripojená. Charakter takýchto regulátorových sekvencii sa odlišuje v závislosti od hostiteľskej bunky, v ktorej má byť kódujúca sekvencia exprimovaná. V prokaryotoch takéto regulátorové sekvencie všeobecne zahrňujú napríklad promótor, ribozomálne väzobné miesto a/alebo transkripčnú terminačnú sekvenciu. V eukaryotoch všeobecne takéto regulátorové sekvencie zahrňujú promótor a/alebo transkripčnú terminačnú sekvenciu. Výraz regulátorová sekvencia môže tiež zahrňovať ďalšie zložky, ktorých prítomnosť je výhodná, napríklad sekrečný leader sekvencie pre sekréciu polypeptidu, ktorý je exprimovaný.

Operabilne pripojený znamená polohu, kedy sú zložky spojené vo vztahu, ktorý im umožňuje pôsobiť ich zamýšľaným spôsobom. Napríklad regulátorová sekvencia je operabilne pripojená ku kódujúcej sekvencii, ktorá je spojená tak, že expresia kódujúca sekvenciu sa dosiahne za podmienok kompatibilných s regulátorovou sekvenciou.

Kódujúca sekvencia je polynukleotidová sekvencia, ktorá je translatovaná do polypeptidu, ak je umiestnený pod kontrolou vhodnej regulátorovéj sekvencie. Väzby kódujúce sekvencie sú všeobecne determinované translačným štart kodónom pri ich 5'-konci a translačným stop kodónom na ich 3'-konci. Kódujúca sekvencia môže zahrňovať napríklad cDNA a rekombinantné polynukleotidové sekvencie.

PCR označuje techniku polymerázovej reťazovej reakcie ako je popísaná Saikim a spol., Náture 324: 163 (1986), US patent č. 4683195 a US patent č. 4683202.

Tu použitý výraz polypeptid sa týka polyméru aminokyselín a netýka sa špecifickej dĺžky produktu. Peptidy, oligopeptidy a proteíny sú tak zahrnuté v tomto výraze. Tento výraz tiež zahrňuje translačné modifikácie polypeptidu, napríklad glykozyláciu, acetyláciu, fosforyláciu a podobne. Ďalej v tejto definícii sú napríklad zahrnuté polypeptidy so substituovanými väzbami, ako i inými modifikáciami známymi v odbore, ako prirodzene sa vyskytujúce, tak neprirodzene sa vyskytujúce.

Terminátory sú regulátorové sekvencie, ako sú polyadenylačné a transkripčné terminačné sekvencie, umiestnené 3' alebo v smere od stop kodónu kódujúcich sekvencií.

Rekombinantné hostiteľské bunky, hostiteľské bunky, bunky, bunečné kultúry a iné výrazy znamenajú napríklad mikroorganizmy, hmyzie bunky a cicavčie bunky, ktoré môžu byt alebo boli použité ako príjemcovia na zavedenie rekombinantného vektoru alebo inej transferovej DNA a zahrňujú predkov bunky, ktorá bola transformovaná. Takíto predkovia zahrňujú tie, ktoré musia byt nevyhnutne zhodné v morfologickom alebo genomickom alebo celkovom DNA komplemente ako pôvodný rodič a ktoré môžu byt produkované ako výsledok prirodzenej, acidentálnej alebo deliberačnej mutácie. Príklady takýchto hostiteľských buniek zahrňujú bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) a opičích ľadvín (COS).

Tu použitý výraz mikroorganizmus zahrňuje prokaryotické a eukaryotické mikrobiálne druhy ako sú baktérie a pliesne, kde posledne uvedené zahrňujú kvasinky a vláknité pliesne.

Transformácia ako je tu použitá, označuje prenesenie exogénneho polypeptidu do hostiteľskej bunky vrátane spôsobu použitého na prenesenie, ktorým môže napríklad byt infekcia, priamy príjem, transdukcia, F-mating, mikroinjekcia alebo elektroporácia. Exogénny polynukleotid môže byt udržiavaný ako neintegrovaný vektor, napríklad plazmid alebo alternatívne môže byt integrovaný do hostiteľovho genómu.

Čistený a izolovaný v súvislosti s polypeptidom alebo nukleotidovou sekvenciou znamená, že uvedená molekula je prítomná za v podstate neprítomnosti iných biologických makromolekúl rovnakého druhu alebo typu. Výraz znamená, že je prítomných aspoň 75 hmôt., výhodnejšie aspoň 95 % hmôt. hmôt. biologických makromolekúl čistený ako je tu použitý % hmôt., výhodne aspoň 85 % a najvýhodnejšie aspoň 98 % rovnakého typu, alebo môžu rovnako byt prítomné voda, pufre a iné malé molekuly, najmä molekuly, majúce molekulovú hmotnost menšiu ako 1 000.

Farmaceutický prijateľným nosičom je mienený akýkoívek nosič, ktorý môže byt použitý odborníkmi v odbore na podanie človeku, ktorý sám nevyvoláva akékoľvek nežiaduce vedlajšie účinky ako je produkcia protilátok, horúčku, atď. Vhodné nosiče sú typické veľké, pomaly metabolizujúce makromolekuly, ktorými môžu byt proteín, polysacharid, polymliečna kyselina, polyglykolová kyselina, polymérna aminokyselina, aminokyselinové kopolyméry alebo inaktívne vírusové častice. Iné nosiče môžu byt tie, ktoré sú známe odborníkom v odbore. Výhodne nosič obsahuje tyroglobulín.

Terapeutický prípravok typicky bude obsahovať farmaceutický prijateľné nosiče ako je voda, salinický roztok, glycerol, etanol atď. Ďalej môžu byt v takýchto prípravkoch prítomné pomocné zložky ako sú zmáčacie alebo emulgačné činidlá, pH pufrujúce zložky a podobne.

Terapeuticky účinným množstvom je tu mienené množstvo, ktoré je účinné na dosiahnutie požadovaného výsledku. Toto množstvo sa mení v závislosti od zdravotného a fyzického stavu liečeného jednotlivca, schopnosti imunitného systému jednotlivca syntetizovať protilátky na stupni požadovanej ochrany, prípravku, hodnotenia situácie ošetrujúcim lekárom a iných relevantných faktorov. Predpokladá sa, že množstvo bude spadať do relatívne širokého rozmedzia, ktoré je možné stanoviť rutinnými pokusmi.

Neočakávane sa zistilo, že ak je KGF exprimovaný v hmyzích bunkách Spodoptera frugiperda (SF9), pri infekcii rekombinantným bakulovírusom Autographa californica, obsahujúcim cDNA, kódujúcu KGF₁₆₃, tieto produkujú KGF fragment, ktorému chýba prvých domény,

KGF23 aminokyselinových zvyškov KGF

KGF

163

140

163 N-koncovej obsahujúcej jediné glykozylačné miesto, naviac ku Skrátený a neglykozylovaný KGF fragment KGFj_esl_₂₃ alebo na rozdiel od natívnej dlhej formy identifikovanej ako ^KGF163 ^7_ až 10-krát zvýšenú potenciu u cieľových buniek.

Špecifickosť cieľových buniek pre KGFj_esl_₂₃ í^e nezmenená. Ďalej, pri vysokých koncentráciách KGF fragmentu nie je pozorovaný na rozdiel od ^kgfiô3 žiaden toxický účinok. Tieto pozorovania potvrdzujú, že na rozdiel od toho, čo bolo popísané v PCT prihláške č. WO 90/08771, špecifičnosť KGF pre cieľové bunky nie je daná jeho N-koncovou doménou. Ďalej predložený vynález ukazuje, že N-koncovo zoslabená verzia KGF v skutočnosti predstavuje zlepšenú verziu KGF s vyššou biologickou aktivitou a zníženou cytotoxicitou pre terapeutickú aplikáciu.

Veľké množstvo KGF fragmentu môže byť produkované rekombinantnými DNA technikami, čo je výhodné oproti alternatívnemu spôsobu izolácie a čistenie KGF z prírodných zdrojov a štiepenia prvých 23 aminokyselinových zvyškov z ich N-konca. KGF produkovaný rekombinantnými technikami umožňuje, aby bol KGF izolovaný za neprítomnosti kontaminujúcich molekúl, ktoré sú normálne prítomné v bunkách. V skutočnosti KGF kompozície úplne zbavené akýchkoľvek stôp ľudských proteínových kontaminantov môžu byt ľahko produkované napríklad v bakteriálnych bunkách, kvasinkových bunkách a hmyzích bunkách. Pri použití rekombinantných DNA techník môžu byť tiež produkované miestne riadenou metagenézou.

Akýkoľvek promótor, ktorý by mohol umožniť expresiu KGF fragmentu v požadovanom hostiteľovi, môže byť použitý v predloženom vynáleze. Napríklad v E. coli môže byt použitá regulátorová sekvencia lac operónu. Inými príkladom je kvasinkový alkohol dehydrogenáza (ADH) promótor, ktorý má sekvenciu proti smeru aktivátora (upsteam activator sequence UAS), ktorá moduluj e aktivitu ADH promótora. Ďalej môžu byt tiež použité určité vírusové enhancery. Takéto enhancery nielen amplifikujú, ale tiež regulujú expresiu v cicavčích bunkách. Tieto enhancery môžu byt inkorporované do cicavčích promótorových sekvencií, ktoré budú aktivované iba za prítomnosti induktora ako je hormónový alebo enzýmový substrát, ako je popísané v Sassone-Corsi a Borelli, Trends Genet., 2: 215 (1986), Maniatis a spol., Science 236: 1237 (1987). Promótory, ktoré môžu byt použité v predloženom vynáleze, tiež zahrňujú bakulovírusový polyhedrón hybridný promótor a plO promótor.

Príklady terminačných sekvencií, ktoré môžu byt použité v predloženom vynáleze, sú Saccharomyces cerevisiae alfa - faktor terminátor a bakulovírus terminátor. Ďalej môžu tiež byt použité virálne terminátory, ktoré sú operabilné v určitej hostiteľskej bunke. Napríklad SV40 terminátor je funkčný v bunkách vaječníka čínskeho škrečka (CHO).

natívneho KGF. uvedená na obr.

Pri vytváraní skrátených proteínov sú niektoré KGF preferované pri praktickom vyhotovení vynálezu. Jedným je neglykozylovaný KGF, napríklad skrátením 23 aminokyselín cDNA, kódujúca preferovaný skrátený KGF, je 1. Iné druhy KGF fragmentov existujú alebo môžu byt vytvorené rutinnými metódami. V uvedenej sekvencií sa môže objaviť pre skrátený proteín štiepiace miesto označené zátvorkou (a), čo poskytne proteín majúci molekulovú hmotnosť asi 18 000 Da. Použitím sekvenčných dát na obr. 1, ako i uvedených charakteristík skráteného KGF, môže odborník v odbore získať iné DNA sekvencie, kódujúce skrátený KGF. Napríklad môže byt štrukturálny gén spracovaný menením jednotlivých, nukleotidov, pri zachovaní správnych aminokyselín, alebo menením nukleotidov tak, že sa modifikujú aminokyseliny, bez straty biologickej aktivity. Nukleotidy môžu byt nahradené, inzertované alebo deletované známymi technikami, zahrňujúcimi napríklad in vitro mutagenézu a primérovú reparáciu. Štrukturálny gén môže byt skrátený na svojom 3'-konci a/alebo na svojom 5'-konci a udržať si svoju biologickú aktivitu.

KGF fragment kódujúca sekvencia môže byť konštruovaná syntézou DNA sekvencie, kódujúcej KGF fragment alebo zmenou existujúcej alebo natívnej KGF kódujúcej sekvencie na produkciu požadovanej sekvencie. Natívne KGF kódujúce sekvencie alebo polypeptid sú tie, ktoré sa objavujú v prírode. Aminokyselinová sekvencia natívneho KGF je uvedená na obr. X. Syntetický KGF fragment môže byt vyrobený na báze známej aminokyselinovej sekvencie KGF použitím kodónov preferovaných zvolenou hostiteľskou bunkou ako odporúča Urdea a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7461 (1983). Alternatívne môže byt požadovaný KGF fragment kódujúca sekvencia klonovaná z knižníc nukleových kyselín za použitia sond na báze nukleokyselinovej sekvencie uvedenej na obr. X. Techniky na produkciu a sondovanie knižníc nukleokyselinových sekvencii sú popísané napr. v práci Sambrooka a spol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989). Iné rekombinantné techniky ako je miestne špecifická mutagenéza, PCR, enzymatické štiepenie a ligácia, môžu byť tiež použité na konštrukciu analógov a derivátov kódujúcej sekvencie KGF fragmentu. Natívna KGF polypeptid kódujúca sekvencia môže byť ľahko modifikovateľná na vytvorenie iných tried KGF polypeptidov.

Napríklad môžu byt vytvorené analógy KGF fragmentu konzervatívnymi aminokyselinovými substitúciami, ktoré nezhoršujú aktivitu KGF fragmentu. Predložený vynález ďalej zahrňuje podskupinu analógov KGF fragmentu zvaných muteíny, v ktorých sú nesulfidové väzby prítomných cysteínov v KGF fragmente substituované, všeobecne serínmi. Tieto mutácie musia byť stabilné v širšom teplotnom rozmedzí ako nemodifikovaný KGF fragment. Muteíny môžu tiež obsahovať aminokyselinové delécie v porovnaní s natívnym KGF fragmentom. Muteíny si budú udržiavať aspoň 20 %, výhodne aspoň 50 % a najvýhodnejšie aspoň 80 % aktivity natívneho KGF fragmentu. Kódujúce sekvencie muteínov môžu byť konštruované in vitro mutagenézou kódujúcej sekvencie natívneho KGF fragmentu.

Fragmenty sa odlišujú od natívnej KGF molekuly amino a/alebo karboxyl terminálnymi aminokyselinovými deléciami. Počet aminokyselín, ktoré sú skrátené, nie je podstatný, pokiaľ KGF fragment neobsahuje N-terminálne glykozylačné miesto a udržiava si aspoň 20 % KGF aktivity natívnej KGF molekuly. Kódujúce sekvencie takýchto fragmentov môžu byť ľahko konštruované odštiepením neočakávaných nukleotidov od natívnej KGF kódujúcej sekvencie alebo ich variantov.

Expresný vektor podľa predloženého vynálezu obsahuje promótor, ktorý je operabilný v hostiteľskej bunke a je operatívne pripojený ku kódujúcej sekvencii KGF fragmentu alebo analógu. Expresný vektor môže prípadne obsahovať signálnu sekvenciu pre sekréciu, terminátor selektujúci marker, počiatok replikácie a sekvencie homológne k hostiteľským bunečným sekvenciám. Tieto ďalšie prvky môžu byt obsiahnuté kvôli optimalizácii expresie.

Môžu tiež byť použité funkčne neprirodzené promótory, napríklad syntetické promótory založené na zhodných sekvenciách rozdielnych promótorov. Tiež účinnými promótormi môžu byt hybridné promótory, ktoré obsahujú regulátorový región spojený s heterológnym expresným iniciačným regiónom. Príklady hybridných promótorov sú E. coli lac operátor spojený s E. coli tac transkripčným aktivačným regiónom;

dehydrogenázová (ADH) regulátorová kvasinkovému glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázovému (GAPDH) transkripčnému aktivačnému regiónu, ako je popísané v US patentoch č. 4876197 a 4880734, zahrnuté tu ako odkaz;

a cytomegalovírus (CMV) enhancer napojený k promótoru opičieho vírusu SV40.

kvasinková alkoholová sekvencia napojená ku

Kódujúca sekvencia pre KGF fragment alebo analóg podľa predloženého vynálezu môže byt tiež napojená v čítacom rámci k signálnej sekvencii. Signálna sekvencia typicky kóduje aminokyselinovú sekvenciu pre sekréciu, zahrňujúcu hydrofóbne aminokyseliny, ktoré riadia KGF fragment alebo analóg k bunečnej membráne. Vo výhodnom vyhotovení je miesto upravenia umiestnené medzi signálnu sekvenciu a KGF fragment, aby umožnilo štiepenie medzi signálnou sekvenciou a KGF fragmentom buď in vivo alebo in vitro. Vhodné signálne sekvencie sú tie, ktoré sú odvodené od génov pre proteíny sekretované endogénnymi hostitelskými bunkami, ako je gén kvasinkovej invertázy popísaný v EP č. 12873 a japonskom patente č. 62,096,086, gén A-faktora ako je popísaný v US patente č. 4588684 a interferónová signálna sekvencia ako je popísaná v EP 60057.

Preferovanou triedou sekrečných leadrov na použitie v predloženom vynáleze pre kvasinkovú expresiu je skrátená kvasinková alfa-faktor sekvencia, ktorá obsahuje aspoň časť pre signálnej sekvencie a pro región. Alfa - faktor leaderové sekvencie, ktoré môžu tu byt použité, zahrňujú pre-pro alfa faktor leader plnej dĺžky, majúci asi 83 aminokyselinových zvyškov, ako i skrátené alfa-faktor leadery, typicky asi 25 až asi 50 aminokyselinových zvyškov, ako je popísané v US patentoch č. 4546083 a 4870008 (a US pat. prihláške xxxx) a európskom patente č. EP 324274, zahrnutom tu ako odkaz. Ďalšie leadery využívajúce alfa-faktorový leader fragment, ktoré tu môžu byt použité, zahrňujú hybridné alfa-faktorové leadery vyrobené s presekvenciou od prvej kvasinkovej signálnej sekvencie, ale pro-regiónom z druhého kvasinkového alfa-faktora (pozri napr. PCT WO 89/02463).

f) Expresné systémy

KGF fragmenty a ich analógy môžu byt exprimované rekombinantnými technikami, kedy sa DNA sekvencie, kódujúce KGF fragment alebo analóg, operabilne napoja do vektora v správnom čítacom rámci a orientácii, ako sú tieto známe odborníkom v odbore. Ak sa produkuje genetický konštrukt, obsahujúci KGF fragment, je preferovaným východiskovým materiálom cDNA, kódujúca KGF fragment. Typicky bude skrátený KGF gén inzertovaný v smere od promótora a bude nasledovaný terminačnou sekvenciou, hoci KGF fragment môže byt produkovaný ako hybridný proteín, ktorý môže byt štiepený, ak je to žiaduce. Všeobecne budú použité sekvencie špecifické pre hostiteľskú bunku, zlepšujúce produkčný výťažok skráteného KGF a skrátených KGF polypeptidových derivátov a vhodné kontrolné sekvencie, ako sú enhancerové sekvencie, polyadenylačné sekvencie a ribozómové väzobné miesta budú pridané k expresnému vektoru. Keď je vhodná kódujúca sekvencia izolovaná, môže byt exprimovaná vo veľa rôznych expresných systémoch; ako ich príklady môžu byt použité cicavčie bunky, bakulovírusy, baktérie a kvasinky. Tieto sú tu diskutované ďalej.

i) Cicavčie systémy

Cicavčie expresné systémy sú v odbore známe. Cicavčí promótor je akákoľvek DNA sekvencia schopná väzby cicavčej RNA smere (3') od kódujúcej mRNA. Promótor bude mat je zvyčajne umiestnený polymerázy a iniciácie transkripcie v sekvencie (napr. štrukturálny gén) do transkripčný iniciačný región, ktorý blízko k 5' kódujúcej sekvencie a TATA box, zvyčajne umiestnený 25 - 30 bázových párov (bp) proti smeru od miesta začiatku transkripcie. TATA box je považovaný za riadiacu RNA polymerázu II tak, aby začala RNA syntéza na správnom mieste. Cicavčí promótor bude tiež obsahovať protismerový promótorový prvok, typicky umiestnený v 100 až 200 bp proti smeru od TATA boxu. Protiprúdový promótorový prvok|determinuje rýchlosť, ktorou začne transkripcia a môže pôsobiť v inej orientácii (Sambrook a spol. (1989) Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. J.).

Cicavčie virálne gény sú často vysoko exprimované a majú široký hostiteľský rozsah; preto sekvencie, kódujúce cicavčie virálne gény, poskytujú najmä vhodné promótorové sekvence. Príklady zahrňujú SV40 skorý promótor, promótor vírusu nádoru myšej mliečnej žľazy LTR, adenovírus hlavný oneskorený promótor (Ad MLP) a promótor herpes simplex vírusu.. Ďalej sekvencie odvodené od nevirálnych génov ako je myší metaloteionénový gén, poskytujú tiež vhodné promótorové sekvencie. Expresia môže byť buď konštitutívna alebo regulovaná (inducibilná), v závislosti od promótora môže byť indukovaná glukokortikoidmi v bunkách, odpovedajúcich na hormón.

Prítomnosť enhancerového prvku (enhancera), kombinovaného s promótorovými prvkami popísanými vyššie, budú typicky zvyšovať expresné hladiny. Enhancer je regulátorová DNA sekvencia, ktorá môže stimulovať transkripciu až 1 000-krát, ak je napojená k homológnym alebo heterológnym promótorom, so syntézou začínajúcou pri normálnom RNA štart mieste. Enhancery sú tiež aktívne, ak sú umiestnené proti smeru alebo po smere od miesta začiatku transkripcie, buď v normálnej alebo obrátenej orientácii alebo vo vzdialenosti väčšej ako 1 000 nukleotidov od promótora (Maniatis a spol. (1987), Science 236: 1237, Alberts a spol. (1989), Molecular Biology of the Celí, 2. vyd.)). Najmä môžu byt použité enhancerové prvky odvodené od .vírusu, pretože typicky majú širší hostitelský rozsah. Príklady zahrňujú SV40 skorý génový enhancer (Dijkema a spol. (1985), EMBO J. 4: 761) a enhancer/ promótory odvodené z dlhých terminálnych opakovaní (long terminál repeat - LTR) vírusu Rousovho sarkómu (Gorman a spol. (1982b), Proc. Natl. Acad. Sci. 79, 6777) a z ludského cytomegalovírusu (Boshart a spol. (1985), Celí 41: 521). Ďalej sú niektoré enhancery regulovatelné a stávajú sa aktívne iba za prítomnosti induktora, ako je hormón alebo kovový ión (Sassone-Corsi a Borelli (1986), Trends Genet. 2: 215, Maniatis a spol. (1987), Science 236: 1237).

DNA molekula môže byt exprimovaná extracelulárne v cicavčích bunkách. Promótorová sekvencia môže byt priamo spojená s DNA molekulou a v tomto prípade bude prvou aminokyselinou pri N-konci rekombinantného proteínu metionín, ktorý je kódovaný ATG štart kodónom. Ak je to žiaduce, môže byt N-koniec odštiepený z proteínu in vitro inkubáciou brómkyánom.

Alternatívne môžu byť tiež cudzie proteiny sekretované z bunky do rastového média vytvorením chimérnych DNA molekúl, ktoré kódujú fúzny proteín, obsahujúci leader sekventný fragment, ktorý poskytuje sekréciu cudzieho proteínu v cicavčích bunkách. Výhodne sú tu opracovávané miesta kódované medzi leader fragmentom a cudzím génom, ktoré môžu byť štiepené buď in vivo alebo in vitro. Leader sekvenčný fragment typicky kóduje signálny peptid, obsahujúci hydrofóbne aminokyseliny, ktoré riadia sekréciu proteínu z bunky. Adenovírus tripartitný leader je príkladom leader sekvencie, ktorá poskytuje sekréciu cudzieho proteínu v cicavčích bunkách.

Typicky transkripčné terminačné a polyadenylačné sekvencie rozoznávané cicavčími bunkami sú regulátorové regióny umiestnené 3' k translačnému stop kodónu a tak, spolu s promótorovými prvkami, lemujú kódujúcu sekvenciu. 3' koniec zrelého mRNA je vytvorený miestne špecifickým posttranskripčným štiepením a polyadenyláciou (Birnstiel a spol. (1985), Celí 41: 349,

Proudfoot a Whitelaw (1988), Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and Splicing a D. M. Glover), Proudfoot (1989), Trends

105). Tieto sekvencie riadia transkripciu mRNA, ktorá môže byt translatovaná do polypeptidu, kódovaného DNA. Príklady transkripčných signálov terminátor/polyadenylácia zahrňujú tie, ktoré sú odvodené z SV40 (Sambrook a spol. (1989), Expression of Cloned Genes in Cultured Mammalian Cells. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual).

(vyd. E. D. Hámes Biochem. Sci. 14:

Niektoré gény môžu byt exprimované oveía účinnejšie, keď sú prítomné intróny (nazývané tiež intervenčné sekvencie). Niektoré cDNA boli však účinne exprimované z vektorov, ktorým chýbajú signály pre strih (tiež nazývané strihové donorové a akceptorové miesta) (pozri napr. Gothing a Sambrook (1981), Náture 293: 620). Intróny sú intervenčné nekódujúce sekvencie v kódujúcej sekvencii, ktorá obsahuje strihové donorové a akceptorové miesta. Sú odstránené spôsobom nazvaným zostrih, po polyadenylácii primárneho transkriptu (Nevins (1983), Annu. Rev. Biochem. 52:

441, Green (1986), Annu. Rev. Genet. 20: (1986), Annu. rev. Biochem., 55: 1119, (1988), RNA Splicing v Transcription and Hames a D. M. Glover)).

671, Padget a spol. Krainer a Maniatis Splicing (vyd. B. D.

pre replikáciu vyžadujú plazmidy, obsahujúce

Typicky vyššie uvedené zložky, obsahujúce promótor, polyadenylačný signál a transkripčné terminačné sekvencie sa zavedú do expresných konštruktov. Enhancery, intróny s funkčnými strihovými donorovými a akceptorovými miestami a leader sekvencie môžu byt tiež obsiahnuté v expresnom konstrukte, ak je to žiaduce. Expresné konštrukty sú často udržiavané v replikone, ako je extrachromozornáIny element (napr. plazmidy), schopnom stabilného udržiavania v hostiteľovi, ako sú cicavčie bunky alebo baktérie. Cicavčie replikačné systémy zahrňujú tie, ktoré sú odvodené od živočíšnych vírusov, ktoré trans-pôsobiace faktory. Napríklad replikačné systémy papovavírusov ako je SV40 (Gluzman (1981), Celí 23: 175) alebo polyomavírus, replikujú extrémne vysoký počet kópií za prítomnosti vhodného virálneho T antigénu. Ďalšie príklady cicavčích replikonov zahrňujú tie, ktoré sú odvodené od hovädzieho papillomavírusu a Epstein-Barrovej vírusu. Ďalej môže replikon mat dva replikačné systémy a je tak umožnené, aby bol udržiavaný napríklad v cicavčích bunkách pre expresiu a v prokaryotickom hostiteľovi na klonovanie a amplifikáciu. Príklady takýchto cicavčích bakteriálnych vektorov zahrňujú pMT2 (Kaufman a spol. (1989), (Mol. Celí. Biol. 9: 946 a pHEBO (Shimizu a spol. (1986), Mol. Celí. Biol., 6: 1074).

Použitý transformačný proces závisí od hostiteľa, ktorý má byť transformovaný. Spôsoby zavedenia heterológnych polynukleotidov do cicavčích buniek sú známe v odbore a zahrňujú dextránom sprostredkovanú transfekciu, zrážanie fosforečnanom vápenatým, polybrénom sprostredkovanú transfekciu, protoplastovú fúziu, elektroporáciu, enkapsuláciu polynukleotidu(ov) do lipozómov a priame mikroinjektovanie DNA do jadra.

Cicavčie bunečné línie dostupné ako hostitelia pre expresiu sú známe v odbore a zahrňujú veľa imortalizovaných bunečných línií dostupných od American Type Culture Collection (ATCC), zahrňujúce, ale neobmedzujúce sa na ne, bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO), HeLa bunky, bunky ľadvín novorodencov škrečka (BHK), bunky opičích ľadvín (COS), ľudskej hepatocelulárnej karcinómovej bunky (napr. Hep G2) a veľa iných bunečných línií.

ii) Bakulovírusové systémy

Polynukleotid kódujúci KGF môže byť inzertovaný do vhodného expresného vektora, napríklad hmyzieho bunečného expresného vektora a operabilne pripojený ku kontrolným prvkom v tom istom vektore. Vektorová konštrukcia využíva techniky, ktoré sú známe v odbore. Hlavne, na účely predloženého vynálezu, je konštruovaný bakulovírusový expresný vektor v podstate podlá Kittsa a spol., BioTechniques 14: 810 - 817 (1993).

Stručne, najprv sa skonštruuje KGF expresná kazeta inzerciou tu vektora, obsahujúceho homológna k časti ako bakulovírusová hoihológnej ^kgf163 kódujúcej sekvencie do transfer polynukleotidovú sekvenciu, ktorá je bakulovírusového genómu (označená sekvencia a je s ňou schopná

Bakulovírusová sekvencia obsahuje aspoň polynukleotidovú sekvenciu, ako je popísaná ďalej sekvencia sa inzertuje do transfer vektora takým lemuje obidva konce bakulovírusovéj sekvencie.

rekombinácie.

podstatnú

KGF kódujúca spôsobom, že

Transfer vektor, obsahujúci KGF kódujúcu sekvenciu je transferovaný do hostiteľských buniek spolu s mutantom prirodzeného typu bakulovírusu, ktorému chýba podstatná polynukleotidová sekvencia nevyhnutná na produkciu funkčného vírusu. Z tohto hľadiska môže byt funkčný vírus produkovaný v hostiteľských bunkách po transfekcii, ak sa mutantný bakulovírus rekombinuje s KGF expresnou kazetou.

Funkčný bakulovírus produkovaný týmto spôsobom má tak inkorporovanú KGF expresnú kazetu a je vhodný na transfekciu do

- 23 nových hostiteľských buniek na produkciu rekombinantného KGF a rekombinantného KGF_desl_₂3- Alternatívne môže byt tento spôsob vykonaný s ^KGFdesl-23 kódujúcou sekvenciou namiesto ^KGFig3 kódujúcej sekvencie. Všeobecne zahrňujú zložky expresného systému transfer vektor, zvyčajne bakteriálny plazmid, ktorý obsahuje ako fragment bakulovírusového genómu, tak zvyčajné reštrikčné miesto pre inzerciu heterológneho génu alebo génov, ktoré sú exprimované; prirodzený typ bakulovírusu sa sekvenciou homológnou k bakulovírus - špecifickému fragmentu v transfer vektore (táto umožňuje homológnu rekombináciu heterológneho génu do bakulovírusového genómu), a vhodné hmyzie hostiteľské bunky a rastové média.

Po inzercii skrátenej KGF DNA sekvencie do transfer vektora sú vektor a genóm prirodzeného typu vektora transfektované do hmyzej hostiteľskej bunky, kde prebehne rekombinácia vektora a vírusového genómu. Vzniknutý rekombinantný vírus je exprimovaný a rekombinantné plaky sú identifikované a čistené. Materiály a spôsoby na expresné systémy bakulovírus/hmyzia bunka sú komerčne dostupné vo forme gitu od, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (MaxBac git). Tieto techniky sú všeobecne známe odborníkom v odbore a sú popísané v práci Summersa a Smitha, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (ďalej tu Summers a Smith), ktorá je tu zahrnutá ako odkaz.

Pred inzerciou skrátenej KGF DNA sekvencie do bakulovírusového genómu sú vyššie uvedené zložky, zahrňujúce promótor, leader (ak je to žiaduce), žiadanú kódujúcu sekvenciu a transkripčnú terminačnú sekvenciu, typicky zostavené do medziproduktového prenášajúceho konštruktu (transfer vektor). Tento konštrukt môže obsahovať, jediný gén a operatívne pripojené regulátorové elementy; viac génov, ktoré sú každý operatívne pripojené k regulátorovým prvkom; alebo viac génov, regulovaných rovnakou sadou regulátorových prvkov. Medziproduktové prenášajúce konštrukty sú často udržiavané v replikone, ako je extrachromozomálny element (napr. plazmidy) schopný stabilného udržania v hostiteľovi ako je baktéria. Replikon bude mať replikačný systém, ktorý mu umožňuje byt zachovaný vo vhodnom hostiteľovi na klonovanie a amplifikáciu.

V súčasnosti je najbežnejšie používaný transfer vektorom na zavedenie cudzích génov do AcNPV pAc373. Je rovnako možné zostaviť vela iných vektorov, ako bude zrejmé odborníkom v odbore. Tieto napríklad zahrňujú pVL985 (ktorý mení polyhedrín štart kodón z ATG na ATT a ktorý zavádza BamHI klonovacie miesto 32 bázových párov po smere expresie od ATT, pozri Luckow a Summers, Virology (1989) 17: 31).

Plazmid zvyčajne tiež obsahuje polyhedrín polyadenylačný signál (Miller a spol. (1988), Ann. Rev. Microbiol., 42: 1, 77) a gén prokaryotickej ampicilínovej rezistencie (amp) a počiatok replikácie selekcie a propagácie v E. coli.

Bakulovírus transfer vektory zvyčajne obsahujú bakulovírusový promótor. Bakulovírusový promótor je akákoľvek DNA sekvencia schopná viazat bakulovírus RNA polymerázu a iniciovat proti smeru expresie (5' k 3') transkripciu kódujúcej sekvencie (napr. štrukturálneho génu) do mRNA. Promótor bude mat transkripčný iniciačný región, ktorý je zvyčajne umiestnený v blízkosti 5' konca kódujúcej sekvencie. Tento transkripčný iniciačný región typicky obsahuje RNA polymerázové väzobné miesto a transkripčné počiatočné miesto. Bakulovírus transfer vektor môže tiež mat druhú doménu nazvanú enhancer, ktorá, ak je prítomná, je zvyčajne vzdialená od štrukturálneho génu. Expresia môže byt buď regulovaná alebo konštitutívna.

Štrukturálne gény, v poslednej dobe hojne, transkribované vo virálnom infekčnom cykle, poskytujú obzvlášt vhodné promótorové sekvencie. Príklady zahrňujú sekvencie odvodené od génu, kódujúceho virálny polyhedrón proteín, Friesen a spol. (1986), The Regulation of Baculovirus Gene Expression, v The Molecular Biology of Baculoviruses (vyd. Walter Doerfler), EPO č. 127839 a 155476) a génu kódujúceho plO proteín Vlak a spol. ,(1988), J. Gen. Virol. 69: 765.

DNA, kódujúca vhodné signálne sekvencie, môže byť odvodená od génov pre sekréciu hmyzích alebo bakulovírusových proteínov, ako je bakulovírus polyhedrin gen (Carbonell a spol. (1988), Gene, 73: 409). Alternatívne, pretože signály procicavčej bunečnej posttranslačnej modifikácie (ako je signálne peptidová štiepenie, proteolytické štiepenie a fosforylácia) zdajú sa byť rozoznávané hmyzími bunkami a signály vyžadované na sekréciu a akumuláciu v jadre sa zdajú byť konzervované medzi invertebrálnymi bunkami a vertebrálnymi bunkami, môžu byt tiež použité pre sekréciu v hmyze leadermi nehmyzieho pôvodu, ako sú tie, ktoré sú odvodené od génov, kódujúcich ludský α-interferón, Maeda a spol. (1985), Náture 315: 592, ludský gastrín uvoľňujúci peptid, Labacq - Verheyden a spol. (1988), Molec. Celí. Biol., 8: 3129, ludský IL-2, Smith a spol., (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404, myšou IL-3 (Miyajima a spol., (1987), Gene, 58: 273 a ľudskú glukocerebrodizázu, Martin a spol. (1988), DNA, 7: 99.

Rekombinantný polypeptid alebo polyproteín môže byť exprimovaný intracelulárne alebo, ak je exprimovaný so správnymi regulátorovými sekvenciami, môže byť sekretovaný. Dobrá intracelulárna expresia nefúzovaných cudzích proteínov zvyčajne vyžaduje heterológne gény, ktoré ideálne majú krátku leader sekvenciu, obsahujúcu vhodné translačné iniciačné signály predchádzajúce ATG štart signálu. Ak je to žiaduce, môže byt metionín na N-konci odštiepený zo zrelého proteínu in vitro inkubáciou brómkyánom.

Alternatívne, rekombinantné polyproteíny alebo proteíny, ktoré nie sú prirodzene sekretované, môžu byt sekretované z hmyzej bunky vytvorením chimérnych DNA molekúl, ktoré kódujú fúzny proteín, obsahujúci leader sekvenčný fragment, ktorý poskytuje sekréciu cudzieho proteínu v hmyze. Leader sekvenčný fragment typicky kóduje signálny peptid, obsahujúci hydrofóbne aminokyseliny, ktoré riadia translokáciu proteínu do endoplazmického retikula.

Po inzercii skrátenej KGF DNA sekvencie a/alebo génu, kódujúceho prekurzor expresného produktu, je hmyzia hostiteľská bunka ko-transformovaná s heterológnou DNA transfer vektora a genómovou DNA prirodzeného typu bakulovírusu - obyčajne ko-transfekciou. Promótorová a transkripčná terminačná sekvencia konštruktu bude typicky obsahovať 2 - 5 kb sekciu bakulovírusového genómu. Spôsoby zavedenia heterológnej DNA do požadovaného miesta bakulovírusu sú známe v odbore. (Pozri Summers a Smith supra, Ju a spol., Mol. Celí. Biol. (1983), 3: 2156 a Luckow a Summer (1989)). Napríklad inzercia do génu ako je polyhedrín gén, môže byť vykonaná homológnou dvojitou cross-over rekombináciou; inzercia môže tiež byť do miesta reštrikčného enzýmu zapracovaného do požadovaného bakulovírusového génu, Miller a spol. (1989)), Bioessays, 4: 91. DNA sekvencia, ak je klonovaná namiesto polyhedrínového génu v expresnom vektore, je lemovaná ako 5', tak 3' polyhedrín - špecifickými sekvenciami a je umiestnená po smere expresie polyhedrínového promótora.

Novo vytvorený bakulovírus expresný vektor je následne umiestnený do infekčného rekombinantného bakulovírusu. Homológna rekombinácia prebieha pri malej frekvencii (medzi asi 1 % a asi 5 %); to znamená, že podstatná časť vírusu produkovaného po kotransfekcii je ešte štandardného typu. Preto je potrebná metóda na identifikáciu rekombinantných vírusov. Výhodou expresného systému je vizuálny screening, umožňujúci rozlíšenie rekombinantných vírusov. Polyhedrín proteín, ktorý je produkovaný natívnym vírusom, je produkovaný vo veľmi vysokých hladinách v jadre infikovaných buniek po vírusovej infekcii. Akumulovaný polyhedrín proteín vytvára oklúzne telieska, ktoré tiež obsahujú uzatvorené častice. Tieto oklúzne telieska až do veľkosti 15 gm, sú vysoko odrážajúce, a preto sú jasne trblietavého vzhľadu, ktorý je ľahko vizualizovaný pod svetelným mikroskopom. Bunky infikované rekombinantnými vírusmi nemajú oklúzne telieska. Kvôli rozlíšeniu rekombinantného vírusu od prirodzeného vírusu sa transfekčný supernatant plakuje na monovrstvu hmyzích buniek technikami, ktoré sú odborníkom v odbore známe. Totiž, plaky sa screenujú pod svetelným mikroskopom na prítomnosť (indikujúcu prírodný typ vírusu) alebo neprítomnosť (indikujúcu rekombinantný vírus) oklúznych teliesok, Current Protocols in Microbiology, č. 2 (Ausubel a spol.) vyd. 16.8. (dod. 10, 1990), Summers a Smith, supra, Miller a spol. (1980).

Rekombinantný bakulovírus expresné infekciu do niektorých hmyzích buniek, rekombinantné bakulovírusy pre, inter vektory boli vyvinuté na Napríklad boli vyvinuté alia: Aedes aegypti,

Autographa californica, Spodoptera frugiperda WO 89/046699, Carbonell

Bombyx mori, Drosophila melanogaster, a Trichoplusia ni (PCT č. pub. a spol. (1985), J. Virol., 56: 153,

Wright (1986), Náture 321: 718, Smith a spol. (1983), Mol. Celí. Biol., 3: 2156 a pozri všeobecne Fraser a spol. (1989), In Vitro Celí. Dev. Biol., 25: 225).

Bunky a bunečné média sú komerčne dostupné ako pre priamu, tak fúznu expresiu heterológnych polypeptidov v bakulovírus/ expresnom systéme; technológia bunečnej kultúry je všeobecne odborníkom v odbore dobre známa - pozri napr. Summers a Smith, supra.

Modifikované hmyzie bunky môžu potom rásť vo vhodnom živnom médiu, ktoré umožňuje stabilné zachovanie plazmidu(ov) prítomných v modifikovanom hmyzom hostiteľovi. Ak je génový expresný produkt pod indukčnou kontrolou, hostiteľ môže rásť vo vysokej hustote a indukovať expresiu. Alternatívne, ak je expresia konštitutívna, produkt bude kontinuálne exprimovaný do média a. živné médium musí plynulé cirkulovať pri odstraňovaní požadovaného produktu a doplňovaní vyčerpaných živín. Produkt môže byť čistený takými technikami ako je chromatografia, napr. HPLC, afinitná chromátografia, iónovýmenná chromatografia, atď.; elektroforéza, odstreďovanie s hustotným gradientom, extrakcia rozpúšťadlami a podobne. Ak je to vhodné, produkt môže byt ďalej čistený podľa požiadaviek tak, že sa odstránia v podstate akékoľvek hmyzie proteíny, ktoré sú tiež sekretované do média alebo sú výsledkom lýzie hmyzích buniek tak, že sa poskytne produkt, ktorý je aspoň v podstate zbavený zlomov hostiteľských buniek, napr. proteínov, lipidov a polysacharidov.

Za účelom získania expresie skráteného KGF, sa rekombinantné hostiteľské bunky, získané z transformantov, inkubujú za podmienok, ktoré umožňujú expresiou rekombinantné skrátenie KGF kódujúcej sekvencie. Tieto podmienky sa budú menit v závislosti od zvolenej hostiteľskej bunky. Podmienky bude však ľahké stanoviť odborníkom na základe toho, čo je v odbore známe.

iii) Bakteriálne systémy

Bakteriálne expresné techniky sú známe v odbore. Bakteriálny promótor je akákoľvek DNA sekvencia schopná väzby bakteriálnej RNA polymerázy a iniciácie transkripcie po smere expresie (3) kódujúcej sekvencie (napr. štruktúrneho génu) do mRNA. Promótor bude mať transkripčný iniciačný región, ktorý je zvyčajne umiestnený blízko 5' konca kódujúcej sekvencie. Transkripčný iniciačný región typicky zahrňuje RNA polymerázové väzobné miesto a transkripčné iniciačné miesto. Bakteriálny promótor môže tiež mat druhú doménu zvanú operátor, ktorá môže presahovať pripojené RNA polymerázové väzobné miesto, pri ktorom začína RNA syntéza. Operátor umožňuje negatívne regulovanú (indukovatelnú) transkripciu, pretože gén represor proteínu môže viazať operátor, a tým inhibovať transkripciu špecifického génu. Konštitutívna expresia môže prebiehať za neprítomnosti negatívnych regulátorových prvkov ako je operátor. Naviac, pozitívna regulácia môže byt dosiahnutá gén aktivátor proteínovou väzobnou sekvenciou, ktorá, ak je prítomná, je zvyčajne blízko (5') k RNA

Príkladom gén aktivátor proteín (CAP - catabolite počiatku transkripcie lac polymerázovej väzobnej sekvencií. proteínu je katabolitový aktivátor activator protein), ktorý napomáha operónu v Escherichia coli (E. coli) (Raibaud a spol. (1984), Annu. Rev. Genet., 18: 173). Regulovaná expresia môže byt preto ako pozitívna, tak negatívna, čím sa zvyšuje alebo redukuje transkripcia.

Sekvencie, kódujúce metabolickú dráhu enzýmov, poskytujú obzvlášť vhodné promótorové sekvencie. Príklady zahrňujú promótorové sekvencie odvodené z enzýmov, metaboližujúcich cukor ako je galaktóza, laktóza (lac) (Chang a spol. (1977), Náture

198: 1056) maltóza sekvencie odvodené z

Ďalšie príklady zahrňujú promótorové biosyntetických enzýmov ako je tryptofán (trp) (Goeddel a spol. (1980) Nuc. Acids Res., 8: 4057, Yelverton a spol. (1981), Nucl. Acids Res., 9: 731, US 4738921, EPO pub. č. 036776 a 121775). g-Laotamasa (bla) promótorový systém (Weissmann (1981) The Cloning of Interferon and Other Mistakes. V Interferon 3 (vyd. I. Gresser) (bakteriofág lambda PL ) Simatake a spol. (1981), Náture 292: 128) a T5 (US 4689406) promótorové systémy poskytujú tiež vhodné promótorové sekvencie.

Ďalej môžu syntetické promótory, ktoré sa nevyskytujú v prírode, tiež pôsobiť ako bakteriálne promótory. Napríklad transkripčné aktivačné Isekvencie jedného bakteriálneho alebo bakteriofágového promótora môžu byť spojené s operónovými sekvenciami iného bakteriálneho alebo bakteriofágového promótora, za vytvorenia syntetického hybridného promótora (US patent č. 4551433). Napríklad tac promótor je hybrid trp - lac promótora, obsahujúci ako trp promótorovu, tak lac operónovú sekvenciu, ktorá je regulovaná lac represorom (Amann a spol., (1983), Gene 25: 167, de Boer a spol. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 21). Naviac môže bakteriálny promótor obsahovať prirodzene sa vyskytujúce promótory nebakteriálneho pôvodu, ktoré majú schopnosť sa viazať k bakteriálnej RNA polymeráze a iniciovať transkripciu. Prirodzene sa vyskytujúci promótor nebakteriálneho pôvodu môže byť tiež kondenzovaný s kompatibilnou RNA polymerázou kvôli získaniu vysokých hladín expresie rovnakých génov v prokaryotoch. Systém bakteriofágová T7 RNA polymeráza/promótor je príkladom kondenzovaného promótorového systému (Studier a spol. (1986), J. Mol. Biol., 113, Tábor a spol. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., 82: 1074). Naviac môže hybridný promótor tiež obsahovať bakteriofágový promótor a E. coli operátor región (EPO pub. č. 267851).

Naviac k funkčnej promótorovej sekvencii je tiež účinné ribozóm väzobné miesto na expresiu cudzích génov v prokaryotoch. V E. coli je ribozómové väzobné miesto nazvané Shine - Dalgarno (SD) sekvencie a obsahuje iniciačný kodón (ATG) a sekvenciu 3 - 9 nukleotidov dĺžky umiestnenú proti smeru expresie od iniciačného kodónu (Shine a spol. (1975), Náture 254: 34). SD sekvencia je považovaná za promótujúcu väzbu mRNA k ribozómu párovaním báz medzi SD sekvenciou a 3' a E. coli 16S rRNA (steitz a spol. (1979), Genetic Signals and Nucleotide Sequences in Messenger RNA v Biological Regulation and Development, Gene Expression (vyd. R. F. Goldberger)). Pre expresiu eukaryotických génov a prokaryotických génov so slabým ribozóm - väzobným miestom (Sambrook a spol. (1989), Expression of Cloned Genes in Escherichia coli v Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

DNA molekula môže byť exprimovaná intracelulárne. Promótorová sekvencia môže byť priamo spojená s DNA molekulou a v tomto prípade bude vždy prvou aminokyselinou na N-konci metionín, ktorý kóduje ATG štart kodón. Ak je to žiaduce, môže byť metionín na N-konci odštiepený z proteínu in vitro inkubáciou s brómkyánom alebo in vivo alebo in vitro inkubáciou s bakteriálnou metionín N-koncovou peptidázou (EPO pub. č. 219237).

Alternatívou pre riadenú expresiu sú fúzne proteíny. Typicky DNA sekvencia, kódujúca N-koncovú časť endogénneho bakteriálneho proteínu alebo iného stabilného proteínu, je fúzovaná k 5' koncu heterologných kódujúcich sekvencii. Pri expresii tento konštrukt bude poskytovať fúziu dvoch aminokyselinových sekvencii. Napríklad bakteriofág lambda bunečný gén môže byť pripojený k 5' koncu cudzieho génu a exprimovaný v baktérii. Výsledný fúzny proteín si výhodne udržiava miesto pri opracovávajúci enzým (faktor Xa) na štiepenie bakteriofágového proteínu z cudzieho génu (Nagai a spol. (1984), Náture 309: 810). Fúzne proteíny môžu tiež byť vyrobené so sekvenciami z lacZ/Jia a spol. (1987), Gene 60: 197), trpE (Alien a spol. (1987), J. Biotechnol. 5: 93, Makoff a spol. (1989), J. Gen. Microbiol. 135: 11) a Chey (EPO pub. č. 324647) génov. DNA sekvencia pri spojení dvoch aminokyselinových sekvencii môže alebo nemusí kódovať miesto štiepenia. Iným príkladom je ubiquitín fúzny proteín. Takýto fúzny proteín sa vyrobí s ubiquitínovým regiónom, ktorý si výhodne zachováva miesto pre opracovávajúci enzým (napr. ubiquitín špecifickú opracovávajúcu proteázu) na štiepenie ubiquitínu z cudzieho proteínu. Touto metódou môže byť izolovaný natívny cudzí proteín (Miller a spol. (1989) Bio/Technology 7: 698) .

Alternatívne cudzie proteíny môžu byť tiež sekretované z buniek vytvorením chimérnych DNA molekúl, ktoré kódujú fúzny proteín, obsahujúci signálny peptidový sekvenčný fragment, ktorý poskytuje sekréciu cudzieho proteínu v baktérii (US 4336336). Signálny sekvenčný fragment typicky kóduje signálny peptid obsahujúci hydrofóbne aminokyseliny, ktoré riadia sekréciu proteínu z bunky. Proteín je buď sekretovaný do rastového média (gram - pozitívne baktérie) alebo do periplazmického priestoru, umiestneného medzi vnútornou a vonkajšou membránou bunky (gram - negatívne baktérie). Výhodne sú tu také miesta na úpravu, ktoré môžu byť štiepené buď in vivo alebo in vitro, zakódované medzi signálny peptidový fragment a cudzí gén.

DNA kódujúca vhodná signálna sekvencia môže byť odvodená z génov pre sekretované bakteriálne proteíny, ako je E. coli vonkajší membránový proteínový gén (ompA) (Masiu a spol. (1983) v Experimental Manipulation of Gene Expression, Ghrayeb a spol. (1984) EMBO J. 2: 2437) a E. coli alkalická fosfatáza signálnej sekvencie (phoA) (Oka a spol. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212). Ako ďalší príklad môže byt použitá signálna sekvencia alfa-amyláza génov z rôznych Bacilus kmeňov na sekretovanie heterológnych proteínov z B. subtilis (Palva a spol. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582, EPO pub. č. 244042).

Typicky sú transkripčné terminačné sekvencie rozpoznávané baktériami umiestnené 3' k translačnému stop kodónu, a tak spolu s promótorom lemujú kódujúce sekvencie. Tieto sekvencie riadia transkripciu mRNA, ktorá môže byt translatovaná do polypeptidu kódovaného mRNA, ktorá môže byť translatovaná do polypeptidu kódovaného DNA. Transkripčné terminačné sekvencie často zahrňujú DNA sekvencie o asi 50 . nukleotidoch, schopné tvorby kmeňových slučkových štruktúr, ktoré napomáhajú terminačnej transkripcii. Príklady zahrňujú transkripčné terminačné sekvencie odvodené od génov so silnými promótormi, ako je trp gén v E. coli ako i iné biosyntetické gény.

Typicky, vyššie uvedené zložky, zahrňujúce promótor, signálnu sekvenciu (ak je žiaduca), kódujúcu požadovanú sekvenciu a transkripčnú terminačnú sekvenciu, tvoria expresné konštrukty. Expresné konštrukty sú často udržiavané v replikone ako je extrachromozomálny element (napr. plazmidy), schopný stabilného zachovania v hostiteľovi, ako je baktéria. Replikon bude mat replikačný systém, ktorý umožňuje, aby bol zachovaný v prokaryotickom hostiteľovi na expresiu alebo na klonovanie a amplifikáciu. Ďalej môže byť replikon plazmid s buď vysokým alebo nízkym počtom kópií. Plazmid s vysokým počtom kópií bude všeobecne mať počet kópií v rozmedzí od asi 5 do asi 2 000 a typicky 10 až asi 150. Hostiteľ, obsahujúci plazmid s vysokým počtom kópií bude výhodne obsahovať aspoň asi 10 a výhodnejšie aspoň asi 20 plazmidov. Môže byt zvolený vektor ako s vysokým počtom kópií, tak s nízkym počtom kópií v závislosti od účinku vektora a cudzieho proteínu na hostiteľa.

Alternatívne môžu byt expresné konštrukty integrované do bakteriálneho genómu s integračným vektorom. Integračné vektory typicky obsahujú aspoň jednu sekvenciu homológnu k bakteriálnemu chromozómu, ktorá umožňuje vektoru sa integrovať. Integrácia sa zdá byt výsledkom rekombinácií medzi homológnou DNA vo vektore a bakteriálnom chromozóme. Napríklad integračné vektory konštruované s DNA z rôznych Bacillus kmeňov integrujú do Bacillus chromozómu (EPO pub. č. 127328). Integrujúce vektory môžu tiež obsahovať bakteriofágové alebo transpozónové sekvencie.

Typicky môžu extrachromozomálne a integračné expresné konštrukty obsahovať selektovateľné markery kvôli umožneniu selekcie bakteriálnych kmeňov, ktoré boli transformované. Selektovateľné markery môžu byt exprimované v bakteriálnom hostiteľovi a môžu zahrňovať gény, ktoré udeľujú baktérii rezistenciu k liekom ako je ampicilín, chloramfenikol, erytromycín, kanamycín, (neomycín) a tetracyklín (Davies a spol. (1978), Annu. Rev. Microbiol., 32: 469). Selektovateľné markery môžu tiež obsahovať biosyntetické gény ako sú gény v dráhach biosyntézy histidínu, tryptofánu a leucínu.

Alternatívne môžu niektoré z vyššie popísaných zložiek spolu vstupovať do transformačného vektoru. Transformačné vektory typicky obsahujú selektovateľný marker, ktorý je buď udržiavaný v replikone alebo vypestovaný v integračnom vektore ako je popísané vyššie.

Expresné a transformačné replikony alebo integračné transformáciu do expresné vektory substilis (Palva a

5582, EPO pub. č. 036259 coli (Shimatake (1985), Gene 40:

113, EPO pub. č.

(Powell a spol.

vektory, buď extrachromozomálne vektory, boli vyvinuté pre mnohých baktérií. Napríklad boli inter alia vyvinuté pre nasledujúce baktérie: Bacillus spol. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:

a 063953, PCT WO 84/04541), Escherichia a spol. (1981), Náture 292: 128, Amann a spol. 183, Studier a spol. (1986), J. Mol. Biol. 189: 036776, 136829 a 136907), Streptococcus cremoris (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54: 655),

Streptococcus lividans (Powell a spol. (1988), Appl. Environ. Microbiol., 54: 655), Streptomyces lividans (US 4745056).

Spôsoby zavedenia exogénnej DNA do bakteriálnych hostiteľov sú v odbore dobre známe a typicky zahrňujú buď transformáciu baktérií ošetrených CaCl₂ alebo inými činidlami, ako sú divalentné katióny a DMSO. DNA môže byt tiež zvedená do bakteriálnych buniek elektroporáciou. Transformačné postupy sa zvyčajne menia podľa transformovaných bakteriálnych druhov. Pozri napr. (Masson a spol. (1989), FEMS Microbiol. Lett., 60: 273, Palva a spol., (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582, EPO pub. č. 036259 a 063953, PCT pub.č. WO 84/04541, Bacillus), (Miller a spol. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 856, Wang a spol. (1990), J. Bacteriol., 172: 949, Campylobacter), (Cohen a spol. (1973), Proc. Natl. Acad. Sci., 69: 2110, Dower a spol. (1988), Nucleic Acids Res., 16: 6127, Kushner (1978), An Improved Method for Transformation of Escherichia coli with ColEl-Derived Plasmids. V Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (vyd. H. W. Boyer a S. Micosia), Mandel a spol. (1970), J. Mol. Biol., 53: 159, Takeo (1988), Biochim. Biophys. Acta, 949: 318, Escherichia), (Chassy a spol. (1987) FEMS Microbiol. Lett., 44: 173 Lactobacillus), (Fiedler

1988), Anál. Biochem. 170: 38, Pseudomonas), (Augustín

Lett., 66: 203, Staphylococcus), Bacteriol., 144: 698, Harlander

Streptococcus lactis by a spol.

a spol. (1990), FEMS Microbiol. (Barany a spol. (1980), J. (1987), Transformation of

Electroporation, v.: Streptococcal Genetics (vyd. J. Ferretti a R. Curtis III), Perry a spol. (1981), Infec. Immun., 32: 1295, (1988), Appl. Environ. Microbiol.

54: 665,

Powell a spol.

Somkuti a spol. (1987), Proc. 4 th Env. 412, Streptococcus).

Cong. Biotechnology, 1:

iv) Kvasinková expresia

Kvasinkové expresné systémy sú odborníkom v odbore dobre známe. Kvasinkový promótor je akákoľvek DNA sekvencia schopná viazať kvasinkovú RNA polymerázu a iniciovať po smere (3') transkripciu kódujúcej sekvencie (napr. štrukturálny gén) do nRNA. Promótor bude mat transkripčný iniciačný región, ktorý je zvyčajne umiestnený blízko 5' konca kódujúcej sekvencie. Tento transkripčný iniciačný región typicky obsahuje RNA polymerázové väzobné miesto (TATA box) a transkripčné iniciačné miesto. Kvasinkový promótor môže mat tiež druhú doménu nazvanú protismerová aktivátorová sekvencia (upstream activator sequence - UAS), ktorá, ak je prítomná, je zvyčajne distálna k štrukturálnemu génu. UAS umožňuje regulovanú (indukovateľnú) expresiu. Konštitutívna expresia sa objavuje za neprítomnosti UAS. Regulovaná expresia môže byť buď pozitívna alebo negatívna, čím sa buď zvyšuje alebo redukuje transkripcia.

Kvasinka je fermentujúci organizmus s aktívnou metabolickou dráhou, preto sekvencie, kódujúce enzýmy v metabolickej dráhe, poskytujú obzvlášť vhodné promótorové sekvencie. Príklady zahrňujú alkohol dehydrogenázu (ADH) (EPO pub.č. 284044), enolázu, glukóza-6-fosfát glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázu (GAP hexokinázu, fosforruktokinázu, 3-fosfoglycerát kinázu (PyK) (EPO pub. č. 329203). Kvasinkový PHO5 gén, kódujúci kyslú fosfatázu, poskytuje tiež vhodné promótorové sekvencie (Myanohara a spol. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1).

izomerazu, alebo GAPDH), mutázu a pyruvát

Ďalej syntetické promótory, ktoré sa nevyskytujú v prírode, tiež pôsobia ako kvasinkové promótory. Napríklad UAS sekvencie jedného kvasinkového promótora môžu byt spojené s transkripčným aktivačným regiónom iného kvasinkového promótora, vytvorí sa tak syntetický hybridný promótor. Príklady takýchto hybridných promótorov zahrňujú ADH regulátorovú sekvenciu napojenú ku GAP transkripčnému aktivačnému regiónu (US 4876197 a US 4880734). Iné príklady hybridných promótorov zahrňujú promótory, ktoré obsahujú regulátorové sekvencie buď ADH2, GAL4, GAL10 alebo PHO5 gény spojené s transkripčným aktivačným regiónom glykolytického enzýmu ako je GAP alebo PyK (EPO pub. č. 164556). Ďalej môže kvasinkový promótor zahrňovať prirodzene sa vyskytujúce promótory nekvasinkového pôvodu, ktoré majú schopnosť viazať kvasinkovú RNA polymerázu a iniciujú transkripciu. Príklady takýchto promótorov zahrňujú, inter alia, (Cohen a spol. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078, Henikoff a spol. (1981), Náture 283: 835, Hollenberg a spol. (1981), Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119, Hollenberg a spol. (1979), The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae, v: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (vyd. K. N. Timmis a A. Puhler), Mercerau - Puigalon a spol. (1980), Gene 11: 163, Panthier a spol. (1980), Cur. Genet., 2: 109).

DNA molekula môže byt exprimovaná intracelulárne v kvasinke.

Promótorová sekvencia môže byť priamo spojená s DNA molekulou a v tomto prípade prvá aminokyselina na N-konci rekombinantného proteínu vždy bude metionín, ktorý je kódovaný ATG štart kodónom. Ak je to žiaduce, metionín na N-konci môže byť odštiepený z proteínu in vitro inkubáciou s brómkyánom.

Fúzne proteíny poskytujú alternatívu pre kvasinkové expresné systémy, ako cicavčie, bakulovírusové a bakteriálne systémy. Typicky, DNA sekvencia, kódujúca N-koncovú časť endogénneho stabilného proteínu, je kódujúcej sekvencie. Pri poskytovať fúziu dvoch kvasinkového proteínu fúzovaná k 5' koncu expresii bude tento alebo iného heterológnej konštrukt aminokyselinových sekvencii. Napríklad gén kvasinkovej alebo ludskej superoxid dizmutázy (SOD) môže byť pripojený k 5' koncu cudzieho génu a exprimovaný v kvasinke. DNA sekvencia v spojení dvoch aminokyselinových sekvencii môže alebo nemusí kódovať štiepiteľné miesto. Pozri napr. EPO pub. č. 196056. ďalším príkladom je ubiquitínový fúzny proteín. Takýto fúzny proteín je pripravený s ubiquitínovým regiónom, ktorý si výhodne udržiava miesto pre upravujúci enzým (napr. ubiquitín - špecificky upravujúcu proteázu) na odštiepenie ubiquitínu z cudzieho proteínu. Touto metódou tak môže byt izolovaný natívny cudzí proteín (pozri napr. PCT publ. č. WO 88/024066).

Alternatívne môžu byť tiež cudzie proteíny sekretované z bunky do rastového média vytvorením chimérnych DNA molekúl, ktoré kódujú fúzny proteín, obsahujúci leader sekvenčný fragment, ktorý poskytuje sekréciu cudzieho proteínu v kvasinke. Výhodne sú tu upravujúce miesta kódované medzi leader fragmentom a cudzím génom, ktoré budú štiepené buď in vivo alebo in vitro. Leader sekvenčný fragment typicky kóduje signálny peptid, obsahujúci hydrofóbne aminokyseliny, ktorý riadi sekréciu proteínu z bunky.

DNA, kódujúce vhodné signálne sekvencie, môžu byť odvodené z génov pre sekréciu kvasinkových proteínov, ako je kvasinkový invertázový gén (EPO pub.č. 012873, JPO pub. č. 62,096,086) a A-faktorový gén (US 4588684). Alternatívne existujú leadery nekvasinkového pôvodu, ako je interferón leader, ktoré tiež poskytujú sekréciu v kvasinke (EPO pub. č. 060057).

Preferovanou triedou sekrečných leaderov sú tie, ktoré využívajú fragment génu kvasinkového alfa faktora, ktorý obsahuje pre signálnu sekvenciu a pro región. Typy alfa faktorových fragmentov, ktoré môžu byt použité, zahrňujúce plnú dĺžku pre-pro alfa faktorového leadera (asi 83 aminokyselinových zvyškov), ako i skrátené alfa - faktorové leadery (typicky asi 25 až asi 50 aminokyselinových zvyškov) (US 4546083 a US a 4870008, EPO pub.č. 324274). Ďalšie leadery, využívajúce alfa - faktorový leader fragment, ktoré poskytujú sekréciu, zahrňujú hybridné alfa faktor leadery vyrobené s presekvenciou prvej kvasinky, ale s pro - regiónom druhého kvasinkového alfa faktora. Pozri napr. PCT pub. č. WO 89/02463.

Typicky sú transkripčné terminačné sekvencie rozpoznávané kvasinkou regulátorové regióny umiestnené 3' k translačnému stop kodónu, a tak spolu s promótorom lemujú kódujúcu sekvenciu. Tieto sekvencie riadia transkripciu mRNA, ktorá môže byt translatovaná do polypeptidu, kódovaného DNA. Príklady transkripčnéj terminačnej sekvencie a iných kvasinkou rozpoznávaných terminačných sekvencií, ako sú napríklad tie, ktoré kódujú glykolytické enzýmy.

Typicky vyššie popísané zložky, obsahujúce promótor, leader (ak je požadovaný), požadovanú kódujúcu sekvenciu a transkripčnú terminačnú sekvenciu, spoločne vstupujú do expresných konštruktov. Expresné konštrukty sú často udržiavané v replikone, ako je extrachromozomálny element (napr. plazmidy), schopnom stabilného uchovania v hostiteíovi, ako je kvasinka alebo baktéria. Replikon môže mat dva replikačné systémy, ktoré umožňujú, aby bol uchovaný, napríklad v kvasinke na expresiu a v prokaryotickom hostiteíovi na klonovanie a amplifikáciu. Príklady takýchto kvasinka - baktéria shuttle vektorov zahrňujú YEp24 (Botsein a spol. (1979), Gene 8: 17 -24), pCl/1 (Brake a spol. (Brake a spol. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:

4642 - 4646) a YRpl7 (Stinchcomb a spol. (1982), J. Mol. Biol., 158: 157). Naviac môže byt replikon plazmid s buď vysokým alebo nízkym počtom kópií. Vysokokópiový plazmid bude všeobecne mat počet kópií v rozmedzí od asi 5 do asi 200 a typicky asi 10 až asi 150. Hostite!, obsahujúci vysokokópiový plazmid, bude všeobecne mat aspoň asi 10 a výhodnejšie aspoň asi 20. Vstup vysoko alebo nízkokópiového vektora môže byt zvolený, v závislosti od účinku vektoru a cudzieho proteínu na hostiteľa. Pozri Brake a spol., supra.

Alternatívne môžu expresné konštrukty byt integrované do kvasinkového genómu s integračným vektorom. Integračné vektory typicky obsahujú aspoň jednu sekvenciu homológnu ku kvasinkovému chromozómu, ktorý umožňuje vektoru integrovať a výhodne obsahuje dve homológne sekvencie lemujúce expresný konštrukt. Integrácia sa zdá byť výsledkom rekombinácie medzi homológnou DNA vo vektore a kvasinkového chromozónu (Orr - Weaver a spol. (1983), Methods in Enzymol., 101: 228 - 245). Integračný vektor môže byť riadený k špecifickému miestu v kvasinke výberom vhodnej homológnej sekvencie kvôli zahrnutiu do vektora. Pozri Orr - Weaver a spol., supra. Integrovať môže jeden alebo viacero expresných konštruktov, čo ovplyvňuje hladiny produkovaného rekombinantného proteínu (Rine a spol. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6750). Chromozomálne sekvencie zahrnuté vo vektore, sa môžu objavovať ako jediný segment vo vektore, ktorý vedie k integrácii celého vektora, alebo dva segmenty homológne k pripojeným segmentom v chromozóme a lemujúce expresný konštrukt vo vektore, ktorý môže viesť k stabilnej integrácii iba expresného konštruktu.

Typicky extrachromozomálne a integračné expresné konštrukty môžu obsahovať selektujúce markery na umožnenie výberu kvasinkových kmeňov, ktoré boli transformované. Selektovateľné markery môžu zahrňovať biosyntetické gény, ktoré môžu byť exprimované v kvasinkovom hostiteľovi, ako je gén ADE2, HIS4, LEU2, TRPÍ a ALG7 a G418 rezistencie, ktoré udeľujú rezistenciu v kvasinkách k tunicarmycínu a G418. Naviac, vhodný selektujúci marker môže tiež poskytnúť kvasinku so schopnosťou rásť za prítomnosti toxických zlúčenín, ako je kov. Napríklad prítomnosť CUIP umožňuje kvasinkám rásť za prítomnosti iónov medi (Butt a spol. (1987), Microbiol. Rev., 51: 351).

Alternatívne môžu niektoré z vyššie popísaných zložiek spolu vstupovať do transformačných vektorov. Transformačné vektory typicky obsahujú selektujúci marker, ktorý je buď udržiavaný v replikone alebo vyvinutý v integračnom vektore, ako je popísané vyššie.

Expresné a transformačné vektory, buď extrachromozomálne replikony alebo integračné vektory, boli vyvinuté pre transformáciu do mnohých kvasiniek. Napríklad boli vyvinuté expresné vektory pre, inter alia, nasledujúce kvasinky: Candida albicans (Kurtz a spol. (1986), Mol. Celí. Biol., 6: 142), Candida maltosa (Kunze a spol. (1985), J. Basic Microbiol., 25: 141), Hansenula polymorpha (Gleeson a spol. (1986), J. Gen. Microbiol., 132: 3459, Roggemkamp a spol. (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 302), Kluyveromyces fragilis (Das a spol. (1984), J. Bacteriol., 158: 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt a spol. (1983), J. Bacteriol., 154: 737, Van den Berg a spol. (1990), Bio/Technology 8: 135), Pichia guillerimondií (Kunze a spol. (1985), J. Basic Microbiol., 25: 141), Pichia pastoris (Cregg a spol. (1985), Mol. Celí. Biol., 5: 3376, US 4837148 a US 4929555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen a spol. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, Ito a spol. (1983), J. Bacteriol., 153: 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach a Nurse (1981), Náture 300: 706) a Yarrowia lipolytica (Davidow a spol. (1985), Curr. Genet., 10: 380 - 471, Gaillardin a spol. (1985), Curr. Genet. 10: 49).

Spôsoby zavedenia exogénnej DNA do kvasinkových hostitelov sú v odbore známe a typicky zahrňujú transformáciu sferoplastov alebo intaktných kvasinkových buniek spracovaných s alkalickými katiónmi. Transformačné postupy sa zvyčajne menia s transformovanými kvasinkovými druhmi. Pozri napr. (Kurtz a spol. (1986), Mol. J. Basic Microbiol., J. Gen. Microbiol., Gen. Genet., 202:

Bacteriol., 158:

Bacteriol., 154: Bio/Technology, 8 Mol. Celí. Biol.

Celí. Biol., 6: 142, Kunze a spol. (1985), 25: 141, Candida), (Gleeson a spol. (1986), 132: 3459, Roggenkamp a spol. (1986), Mol. Hanseluna), (Das a spol. (1984), J.

Louvencourt a spol. (1983), J.

(1990) , (1985) , (1985), J. Basic

302,

1165, De

1165, Van den Berg a spol.

135, Kluyveromyces), Cregg a spol.

5: 3376, Kunze a spol.

Microbiol., 25: 141, US 4837148 a US 4929555, Pichia), (Hinnen a spol. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929, Ito a spol. (1983), J. Bacteriol., 153: 163, Saccharomyces), (Beach a Nurse (1981), Náture 300: 706, Schizosaccharomyces), (Davidow a spol. (1985), Curr. Genet. 10: 39, Gaillardin a spol. (1985), Curr. Genet., 10: 49, Yarrowia).

V predloženom vynáleze môžu byť v expresnom vektore obsiahnuté selektujúce markery, počiatok replikácie a homológne sekvencie hostiteľských buniek. Selektujúci marker môže byt použitý na prehľadanie hostiteľských buniek ktoré potenciálne obsahujú expresný vektor. Takéto markery zahrňujú tie, ktoré robia hostiteľskú bunku rezistentnou k liekom ako je ampicilín, chloramfenikol, erytromycín, enomycín a tetracyklín. Markery môžu tiež zahrňovať biosyntetické gény ako sú gény v dráhach histidínu, tryptofánu a leucínu, ktoré sú vyžadované pre rast v hostiteľskej bunke. Ak je použitá napríklad leu(-) hostiteľská bunka ako príjemca v transformácii expresným vektorom a leucín je neprítomný v médiu, budú prežívať iba bunky, ktoré nesú plazmid s leu(+) génom.

V predloženom vynáleze môže byť inkorporovaný do expresného vektora kvôli replikácie v hostiteľskej bunke. Takýto zahrňuje tie, ktoré umožňujú, aby začiatok replikácie umožneniu autonómnej počiatok replikácie expresný vektor bol reprodukovaný vo vysokom počte kópií za.prítomnosti vhodných proteínov v bunke, napríklad 2 gm a autonómne sa replikujúcej sekvencie, ktoré sú účinné v kvasinke, a počiatok replikácie virálneho T-antigénu, ktorý je účinný v COS-7 bunkách.

Pre účel predloženého vynálezu môžu byt expresné vektory buď integrované do genómu hostiteľskej bunky alebo zostávajú v bunke autonómne. Kvôli integrácii do hostiteľského genómu môže expresný vektor obsahovať polynukleotidové sekvencie, ktoré sú homológne so sekvenciami v genóme hostiteľskej bunky. Homológne sekvencie nevyhnutne nemusia byť pripojené k expresnému vektoru. Napríklad môžu expresné vektory byť integrované do CHO genómu cez nepripojený gén dihydrofolát reduktázy. V kvasinke je preferované, keď homológna sekvencia lemuje expresnú kazetu. Obzvlášť výhodné homológne sekvencie kvasinkového genómu podlá predloženého vynálezu sú tie, ktoré sú popísané v PCT WO 90/01800 a sekvencie HIS4 génu, popísané v Genbank, prír. číslo J01331.

Voľba promótora, terminátora a iných prípadných prvkov expresného vektoru bude tiež závisieť od zvolenej hostiteľskej bunky ako je známe odborníkom v odbore.

Predložený vynález nie je závislý od vybranej hostiteľskej bunky. V odbore je známych vela hostitelov pre expresiu a sú dostupné z American Type Culture Collection (ATCC).

Napríklad bakteriálni hostitelia vhodní pre expresiu KGF fragmentu alebo analógu zahrňujú: Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus a Streptococcus. Môžu byt použití kvasinkoví hostitelia z nasledujúcich rodov: Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces a Yarowia. Imortalizované cicavčie bunky, ktoré môžu byt použité ako hostitelia, zahrňujú CHO bunky, HeLa bunky, bunky ľadvín mláďata škrečka (BKB), bunky opičích ľadvín (COS) a bunky ľudského hepatocelulárneho karcinómu, napr. Hep G2. Na expresiu KGF fragmentu alebo jeho analógu je vhodných vela hmyzích bunečných hostitelov, ktorí zahrňujú: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster a Spodoptera frugiperda ako sú popísané v PCT WO 89/046699, Carbonell a spol., J. Virol., 56: 153 (1985), Wright, Náture 321: 718 (1986), Smith a spol., Mol. Celí. Biol., 3: 2156 (1983) a všeobecne Fraser a spol. in vitro Celí. Dev. Biol., 25: 225 (1989).

Expresný vektor, obsahujúci KGF fragment alebo jeho analóg, sa inzertuje do hostiteľskej bunky. Na inzertovanie expresných vektorov do hostiteľskej bunky môžu byť použité akékoľvek transformačné techniky, ktoré sú známe v odbore. Napríklad transformácia bakteriálnych hostiteľov typicky zahrňuje prvé upravenie baktérie buď s CaCl₂ alebo inými činidlami, ako sú divalentné katióny a DMSO a umožnenie zavedenia exogénnej DNA do ošetrených bakteriálnych buniek. DNA môže byť tiež zavedená do bakteriálnych buniek elektroporáciou alebo virálnou infekciou. Transformačné postupy pre bakteriálneho hostiteľa, ktoré môžu byť

použité, zahrňujú	tie,	ktoré sú	popísané v	Masson	a spol.
(1989), FEMS Microbiol.	Lett., 60:	273, Palva a	spol.,	(1982),
Proc. Natl. Acad.	Sci	. USA 79:	5582, EPO	pub. č.	036259
a 063953, PCT pub.	č.	WO 84/04541	, Bacillus),	(Miller	a spol.
(1988), Proc. Natl.	Acad	. Sci., 85:	856, Wang a	spol. (1990) , J.
Bacteriol., 172:	949,	Campylobacter), (Cohen	a spol.	(1973),
Proc. Natl. Acad.	Sci. ,	69: 2110,	Dower a spol.	(1988) ,	Nucleic

Acids Res., 16: 6127, Kushner, An Improved Method for Transformation of Escherichia coli with ColEl - Derived Plasmids. V Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (vyd. H. W. Boyer a S. Nicosia) (1978), Mandel a spol. (1970), J. Mol. Biol., 53: 159, Takéto (1988), Biochim. Biophys. Acta, 949: 318, Escherichia), (Chassy a spol. (1987) FEMS Microbiol. Lett., 44: 173 Lactobacillus), (Fiedler a spol. (1988), Anál. Biochem., 170: 38, Pseudomonas), (Augustín a spol. (1990) FEMS Microbiol. Lett., 66: 203, Staphylococcus), (Bary a spol. (1980), J. Bacteriol., 144: 698, Harlander (1987), Transformation of Streptococcus lactis by Electroporation, v: Streptococcal Genetics (vyd. J. Ferretti a R. Curtis III), Perry a spol., Infec. Immun., 32: 1295 (1981), Powell a spol., Appl. Environ. Microbiol., 54: 665 (1988), Somkuti a spol., Proc. 4 th Evr. Cong. Biotechnology, 1: 412 (1987), Streptococcus).

Transformačné metódy pre kvasinkových hostiteľov sú dobre známe v odbore a typicky zahrňujú transformáciu buď sferoblastov alebo intaktných kvasinkových buniek spracovaných s alkalickými katiónmi. Kvasinkové bunky môžu byt tiež transformované elektroporáciou ako je popísané v Methods in Enzymology, diel 194, 1991, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Podľa predloženého vynálezu sa použitý transformačný postup mení podľa transformovaných kvasinkových druhov a zahrňuje tie, ktoré sú popísané v Kurtz a spol. (1986), Mol. Celí. Biol. 6: 142), Candida maltosa (Kunze a spol. (1985)), J. Basic Microbiol., 25: 141), Hansenula polymorpha (Gleeson a spol. (1986), J. Gen. Microbiol., 132: 3459, Roggemkamp a spol. (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 302), Kluyveromyces fragilis (Das a spol. (1984), J. Bacteriol., 158: 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt a spol. (1983), J. Bacteriol., 154: 737, Van den Berg a spol. (1990), Bio/Technology, 8: 135), Pichia guillerimondii (Kunze a spol. (1985), J. Basic Microbiol., 25: 141), Pichia pastoris (Cregg a spol. (1985), Mol. Celí. Biol., 5: 3376, US 4837148 a US 4929555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen a spol. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, Ito a spol. (1983), J. Bacteriol., 153: 163), Schizosaccharomyces pombe (each a Nurse (1981), Náture 300: 706) a Yarrowia lipolytica (Davidow a spol. (1985), Curr. Genet., 10: 380 - 471, Gaillardin a spol. (1985), Curr. Genet., 10: 49).

Spôsoby zavedenia exogénnej DNA do kvasinkových hostiteľov sú v odbore známe a typicky zahrňujú transformáciu sferoplastov alebo intaktných kvasinkových buniek spracovaných s alkalickými katiónmi. Transformačné postupy sa zvyčajne menia s transformovanými kvasinkovými druhmi a zahrňujú tie, ktoré sú popísané v práci Kurtz a spol. (1986), Mol. Celí. Biol., 6: 142, Kunze a spol. (1985), J. Basic Microbiol., 25: 141, Candida, Gleeson a spol. (1986), J. Gen. Microbiol., 132: 3459, Roggenkamp a spol. (1986), Mol. Gen. Genet., 202: 302, Hansenula, Das a spol., (1984), J. Bacteriol., 158: 1165, De Louvencourt a spol. (1983), J. Bacteriol., 154: 1165, Van den Berg a spol. (1990), Bio/Technology, 8: 135, Kluyveromyces, Cregg a spol. (1985), Mol.

- 44 Celí. Biol., 5: 3376, Kunze a spol. (1985), J. Basic Microbiol., 25: 141, US 4837148 a US 4929555, Pichia, Hinnen a spol. (1978),

Proc. Natl. Acad. Bacteriol., 153:

Náture 300: 706, Curr. Genet., 10:

10: 49, Yarrowia.

Sci. USA, 75: 1929, Ito a 163, Saccharomyces, (Beach Schizosaccharomyces, Davidow spol. (1983), j. a Nurse (1981) , a spol. (1985),

39, Gaillardin a spol. (1985), Curr. Genet.,

Spôsoby zavedenia heterológnych polypeptidov do cicavčích buniek sú známe v odbore a zahrňujú, napríklad vírusovú infekciu, dextránom sprostredkovanú transfekciu, zrážanie fosforečnanom vápenatým, polybrénom sprostredkovanú transfekciu, protoplastovú fúziu, elektroporáciu, enkapsuláciu polynukleotidu(ov) v lipozómoch a priame mikroinjektovanie DNA do jadra.

Spôsoby na zavedenie heterológnej DNA do bakulovírusového vektoru a na transformáciu tiež v odbore známe ako je Celí. Biol., 3: 2156 (1983) 31 (1989). Napríklad môže byť vírusu na vytvorenie expresného hmyzích hostiteľských buniek sú popísané v Smith a spol., Mol. a Lucklow a Summers, Virology, 17:

KGF fragment DNA inzertovaná do polyhedrón génu homológnou dvojitou cross-over rekombináciou. Inzercia môže byť tiež vykonaná zapracovaním miesta pre reštrikčný enzým do požadovaného bakulovírusového génu, ako popisuje Miller a spol., Bioessays, 4: 91 (1989). DNA sekvencia KGF fragmentu, ak je klonovaná namiesto polyhedrón génu v expresnom vektore, je lemovaná ako 5', tak 3' polyhedrón - špecifickými sekvenciami a je umiestnená v zmesi polyhedrónového promótora.

Vo vyhotovení predloženého vynálezu môže byt novo formovaný bakulovírus expresný vektor následne vložený do infekčného rekombinantného bakulovírusu. V bakulovírusovom expresnom systéme sa objavuje homológna rekombinácia málo často, medzi asi 1 % a asi 5 %. Preto zvyčajne väčšina vírusu produkuje po transfekcii ešte prirodzený typ vírusu. Rekombinantné vírusy však môžu byt identifikované známymi metódami. Napríklad natívny vírus produkuje polyhedrón proteín vo veľmi vysokých hladinách v jadre infikovaných buniek počas neskorého štádia vírusovej infekcie. Akumulovaný polyhedrón protein tvorí oklúzne telieska, ktoré tiež obsahujú zapuzdrené vírusové častice. Tieto oklúzne telieska majúce veľkosť až 15 μπι, majú vysokú odrazivosť, čo ich robí veľmi jasnými, a preto sú ľahko vizualizované pod svetelným mikroskopom. Bunky infikované rekombinantnými vírusmi nemajú oklúzne telieska. Rekombinantný vírus a prirodzený vírus môžu byt rozlíšené umiestnením na platni, transfekciou supernatantu alebo jeho riedením do monovrstvy hmyzích buniek štandardnými technikami. Plaky môžu potom byť screenované pod svetelným mikroskopom na prítomnosť indikujúcu prirodzený typ vírusu, alebo neprítomnosť, indikujúcu rekombinantný vírus, oklúznych teliesok ako je popísané v Current Protocols in Microbiology, zv. 2 (Ausubel a spol. vyd. 16.8., dod. 10.1990).

Imunoskúšky a skúšky aktivity, ktoré sú známe v odbore, môžu byt použité na stanovenie, či transformované hostiteľské bunky exprimujú požadovaný KGF fragment. Napríklad imunofluorescencia môže byť vykonaná na transformovanom hostiteľovi bez oddelenia KGF fragmentov z bunečnej membrány. V tejto skúške sú hostiteľské bunky najprv fixované do pevného nosiča, ako sú mikroskopické rezy alebo mikrotitračná jamka. Potom sú hostiteľské bunky vystavené anti-KGF protilátke. Výhodne, kvôli zvýšeniu citlivosti skúšky, sú fixované bunky vystavené druhej protilátke, ktoré je značená a viaže sa k anti-KGF protilátke. Napríklad môže byť sekundárna protilátka značená fluorescentným markerom. Hostiteľské bunky, ktoré exprimujú KGF fragmenty, budú fluorescenčné značené a môžu byť vizualizované pod mikroskopom.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Ľudská KGF cDNA bola inzertovaná do bakulovírusového expresného systému klonovaním cDNA do pAcC13Pst/not 1 expresného vektoru, ako je uvedené na obr. 1. Tento plazmid bol odvodený z pAcCIZ, ako popísal Munemitsu a spol., Mol. Celí. Biol., 10:

5977 - 5982 (1990 ) .

PCR oligonukleotidové priméry boli vytvorené pre skrátený 19 kd KGF na báze dostupných N-terminálnych aminokyselinových sekvencii KGF popísaných v práci Finch a spol., Science, 2: 752 - 755 (1989). Lemujúce reštrikčné miesta (PstI a Nôti) boli inkorporované do primérov kvôli uľahčeniu subklonovania do pAcC13 expresného vektora, derivátu pVL941 transfer vektoru, ako popisuje Luckow a spol,. Virology, 170: 31 - 39 (1989) a Quiliam a spol., Mol. Celí. Biol., 10: 2900102908 (1990). Tento expresný vektor bol konštruovaný inzerciou KGF - kódujúceho fragmentu do Pstl/NotI polylinkerového miesta pAcC13. KFG cDNA kóduje zrelú upravenú formu KGF, ktorá bola zložená zo 163 aminokyselinových zvyškov, s potenciálnym N-glykozylačným miestom u zvyškov 14 až 16.

Príprava kondičného média

Spodoptera frugiperda, Sf9 hmyzej bunky boli infikované bakulovírusom, Autographa californica, obsahujúcim cDNA pre ^KGF1-163' ^{Po zr}i^edení ^x 10^x) buniek/ml, boli bunky kultivované po 48 až 72 hod. v Excell - 400 za neprítomnosti sérového doplnku, antibiotík alebo fungicídov. Kvapalina z kultúry bola zhromaždená a odstredená pri 10 000 x g po 30 min. kvôli odstráneniu plávajúcich buniek a iných bunečných zvyškov. Kondičné médium bolo potom filtrované 0,8 μ - filtrom (Millipore) a približne 5 litrov tohto média bolo koncentrované na 200 ml za použitia Filtron kazetového systému (Omega membrána), majúceho deliacu schopnosť 3 kDa.mol. hmotnosti.

Po koncentrácii bolo kondicionované médium z transfektovaných Sf9 buniek oddelené odstreďovaním pri 10 000 x g po 20 minút a médium bolo čistené nasledujúcou heparín Sepharose (HS) afinitnou chromatografiou. V jednom vyhotovení vynálezu bol približne 1 liter Sf9 bunečného kondicionovaného média ultra - filtrovaný za získania 200 ml ultrafiltračného retentátu za použitia Omega membrány (Filtron), majúcej deliacu schopnosť 3-kDa.

HSAC a Mono S katiónovýmenná chromatografia

Supernatant bol upravený na pH 7,2. 30 ml vzorka bola vložená na heparín Sepharose živicu, ktorá bola ekvilibrovaná v 10 mM Tris-HCl pH 7,3, 150 mM NaCl. Živica bola premývaná intenzívne ekvilibračným pufrom až do navrátenia absorbancie na základnú hodnotu a potom postupne eluovaná zvyšujúcimi sa NaCl koncentráciami od 0,45 M do IM a 2 M NaCl. Z frakcií boli odobrané podiely na použitie v bunečných proliferačných štúdiách a 1 M NaCl frakcie s najvyššou bioaktivitou boli spojené. Spojené frakcie boli zriedené päťnásobne s 10 mM Tris pH 7,2 (konečná koncentrácia soli 0,2 M NaCl) a vzorka bola aplikovaná so Super slučkou na Mono S kolónu pripojenú k FPLC systému (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluácia bola vykonaná s lineárnym gradientom (10 mM Tris pH 7,3, 0,2 M NaCl až 10 mM Tris pH 7,3, 1 M NaCl). Po testovaní frakcií na bioaktivitu boli aktívne frakcie spojené.

Retentát bol upravený na pH 7,3 a vložený na HS kolónu, obsahujúcu lôžko približne s objemom 30 ml. Kolóna bola ponechaná pretekať približne 2 hodiny pri 4 “C. Kolóna bola premytá 150 ml ekvilibračného pufra, obsahujúceho 10 mM Tris-HCl a 0,15 M NaCl pri pH 7,3. Zadržaný proteín bol eluovaný 0,45 NaCl a 1 M NaCl. Prietoková rýchlosť počas eluácie bola upravená na približne 90 ml/h a boli odoberané frakcie s velkostou 3 ml.

Bioaktívne 1 M NaCl chromatografie boli spojené a priamo vnesené na Mono S frakcie zo stupňov HS afinitnej a zriedené 5-krát 10 mM Tris pH 7,3 HR 5/5 kolónu (Pharmacia). Zadržané proteíny boli eluované za použitia 0,2 M NaCl až 1 M NaCl gradientu. Bioskúška aktívnej frakcie bola vykonaná použitím Balb - Mk bunečnej línie. Bola vykonaná SDS PAGE analýza frakciou bioaktívneho proteínu izolovaných Mono S katiónovýmennou chromatografiou. Frakcie 37 - 39 a frakcie 41 - 42 boli spojené a 10 ml podiely boli pridané k SDS a 10 mM DTT. Vzorky boli tepelne denaturované a elektroforézované v 12 % polyakrylamidovom géli, ktorý bol následne vyfarbený striebrom. Bola pozorovaná podobná migrácia u vzoriek, ktoré prešli ako redukčným prostredím, tak prostredím neredukčným. 25 kDa bola zjavná molekulová hmotnosť, proteínu získaného z frakcií 37 - 39 a 18 kDa bola zjavná molekulová hmotnosť proteínu obsiahnutého vo frakciách 41 - 42.

Chromatogram HS bioaktívnej frakcie ukazuje profil Balb/Mk bioaktivity, pokrývajúcej frakcie 31 až 47 demonštrujúcej prítomnosť 12 molekulových druhov, jednej eluujúcej pri 0,55 M NaCl a druhej eluujúcej pri 0,6M NaCl.

Stanovenie KGF aktivity

Prítomnosť KGF aktivity v získaných frakciách bola hodnotená schopnosťou frakcií promótovať rast BALB/C-Mk buniek. Za tým účelom boli 10 μΐ frakcie zriedené 1 ml 0,2 % želatíny vo fosfátom pufrovánom salinickom roztoku (PBS) a 10 μΐ zriedených frakcií bolo testovaných na rast stimulujúcu aktivitu BALB/C-Mk buniek vysiatych na 12 jamkové platne (cluster plate), obsahujúce n

každa 22 mm jamky, v množstve 5 x 10 buniek na jamku. Všetka aktivita KGF bola zadržaná v kolóne a bola eluovaná IM NaCl.

KGF bioaktívne frakcie eluované z HS kolóny IM NaCl boli ďalej čistené katiónovýmennou FPLC stĺpcovou chromatografiou. Tieto frakcie boli spojené, zriedené 5-násobne 10 mM Tris na pH

7,3 a priamo vložené na Mono S HR 5/5 kolónu od fy Pharmacia.

Proteín zadržaný v Mono S HR 5/5 kolóne bol eluovaný gradientom 2,2M NaCl až IM NaCl. Bioaktivita frakcií bola hodnotená ako je popísané vyššie, za použitia BALB/C-Mk buniek. Obr. 3 ilustruje aktivitný profil, pokrývajúci frakcie 31 až 47.

V mitogenickej štúdii bolo 10⁴ ABAE a 5 x 10³ buniek na

O jamku vysiate na 12 jamkové cluster platne v hustote 5 x 10 buniek na jamku v 1 ml DMEM doplnenom 10 % teíacím sérom a antibiotikami, ako je popísané Bohlenom a spol., EMBO 4: 1951

- 1956 (1985) a Gospodarowiczom a spol., J. Celí. Physiol., 127: 121 - 136 (1986).a Bellostou a spol., J. Celí. Biol., 121: 705

- 713 (1993). Po šiestich hodinách inkubácie boli sady vždy troch jamôk tryptinizované a bunky boli zrátané kvôli stanoveniu účinnosti upravenia na platni. Mikrolitrové podiely vhodného riedenia každej vzorky potom boli pridané do uvedených troch jamôk v miskách v deň 0., 2. a 4. Po 5-tom dni v kultúre boli platne tryptinizované a stanovené bunečné hustoty pomocou Coulter čítača (Coulter Electronics, Hialeh, FL).

Prídavky KGF alebo bázického KGF boli vykonané v deň 0. a každý ďalší deň v uvedenej koncentrácii. Po 5 dňoch v kultúre boli bunky tryptinizované a konečná bunečná hustota bola stanovená pomocou Coulter čítača.

Elektroforéza (NaDodS0₄)

Polyakrylamidové gély boli pripravené s NaDodS0₄ postupom podlá Lammeliho a spol., Náture, 227: 680 - 685 (1970). Vzorky boli varené 3 minúty za prítomnosti 10 mM DTT a elektroforézované v 12 % polyakrylamidovom géli. Gély boli fixované a vyfarbené striebrom za použitia činidiel a protokolu od BioRad a ako je diskutované v práci Merrila a spol., Science, 211: 1437 - 1438. Vhodné markery molekulovej hmotnosti boli od BioRad.

Skúška bunečnej proliferácie

Mitogenická aktivita kolónových frakcií a čistených vzoriek bola stanovená za použitia Balb/Mk buniek ako cieľových buniek. Zásobné kultúry rástli a boli udržiavané s nízkym obsahom vápnika modifikovanom Eagle médiu, doplnenom 10 % FCS, 50 ^g/ml gentamicínu, 0,25 μg/ml fungizónu a 10 ng/ml aFGF ako popísal Gospodarowicz a spol., J. Celí. Physiol, 142: 325 - 333. Pre mitogenickú skúšku, boli bunky vysiate do 12 jamkových cluster platní v hustote 5 x 10³ až 10⁴ buniek na jamku v 1 ml MEM s nízkym obsahom vápnika, doplnenom 10 % FCS podľa Gospodarowicza a spol. Prídavky vzoriek a konečné stanovenie bunečnej hustoty boli vykonané po 5 dňoch v kultúre, ako popísal Gospodarowicz a spol.

Mitogenická aktivita konečného testovaná na dospelých hovädzích bunkách (ABAE - adult bovine čisteného materiálu bola aortických endoteliálnych aortic endothelial cells) a kapilárnych bunkách získaných z adrenálneho kortexu (ACE bunky) ako popísal Gospodarowicz a spol., Proc. Natl. Acad. Sci., 73: 412 - 4124 (1976). Zásobné kultúry boli udržiavané za prítomnosti DMEM doplneného 10 % CS, 50 μg/ml gentamicínu a 0,25 μg/ml fungizónu pasážovaním na slabo gelovaných miskách tkanivovej kultúry pri pomere delenia 1 : 10.

Použitím štandardnej metódy dobre v odbore známej bola stanovená jednoznačná aminokyselinová sekvencia pre polohu 1 až 20 od NH₂ konca KGF_desl_₂₃ ako nasledujúca:

S₁YDM₅EGGDIRVRRLFXRTQ

Predložený vynález tiež zahrňuje DNA segmenty, kódujúce KGFdesi-23 ^a kratšiu formu KGF s chýbajúcou nekonzervovanou NH₂ koncovou charakteristikou KGF₁₆₃ proti iným členom KGF rodiny.

Proteínové mikrosekvencovanie

Dve nominálne 100 pikomólové vzorky KGF₁₆₃ a ^KGFa_esi-23 ^b°li analyzované Edmanovou degradáciou a AA analýzou po odstreďovaní adsorpciou k polyvinylidéndifluoridu (PVDF, Applied Biosystems Biospin). Vzorky boli vložené do proteínového sekvenátora v plynnej fáze Applied Biosystems 477A. Bolo vykonaných dvadsať cyklov za použitia štandardného softwaru a chemikálií dodávaných Applied Biosystems a identifikácie PTH aminokyselín boli vykonané na automatizovanej on-line HPLC kolóne (model 120A, Applied Biosystems).

Claims (18)

1. Keratinocytový rastový faktorový fragment obsahujúci časť aminokyselinovej sekvencie zrelého keratinocytového faktora plnej dĺžky, kde čast vykazuje aspoň dvojnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým, rekombinantným keratinocytovým faktorom plnej dĺžky a nemá sekvenciu, obsahujúcu prvé aminokyselinové zvyšky z N-konca zrelého keratinocytového faktora plnej dĺžky.

2. Fragment keratinocytového rastového faktoru podía nároku 1, kde fragment vykazuje sedemnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým rekombinantným keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky.

3. Fragment keratinocytového rastového faktoru podía nároku 1, kde fragment vykazuje desaťnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým rekombinantným keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky.

4. Fragment keratinocytového rastového faktoru podía nároku 1, kde fragment vykazuje zníženie cytotoxicity v porovnaní so zrelým rekombinantným keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky.

5. Konjugát, obsahujúci:

a) fragment keratinocytového rastového faktoru, ktorý obsahuje časť aminokyselinovej sekvencie zrelého keratinocytového rastového faktoru plnej dĺžky, kde časť vykazuje aspoň dvojnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky a nemá sekvenciu obsahujúcu prvých 23 - N-koncových aminokyselinových zvyškov zrelého, keratinocytového rastového faktoru plnej dĺžky a

b) toxínovú molekulu.

6. Konjugát podlá nároku 5, kde toxínová molekula je vybraná zo skupiny, zahrňujúcej ricín A, diftéria toxín a saporín.

7. Konjugát podlá nároku 5, kde fragment vykazuje sedemnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým rekombinantným keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky.

8. Konjugát podlá nároku 5, kde fragment vykazuje desaťnásobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým rekombinantným keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky.

9. Terapeutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) fragment keratinocytového rastového faktoru, ktorý obsahuje časť aminokyselinovej sekvencie zrelého keratinocytového rastového faktoru plnej dĺžky, kde časť vykazuje aspoň 2-násobné zvýšenie mitogenickej aktivity v porovnaní so zrelým keratinocytovým rastovým faktorom plnej dĺžky a nemá sekvenciu, obsahujúcu prvých 23 - N-koncových aminokyselinových zvyškov zrelého keratinocytového rastového faktora plnej dĺžky a

b) farmaceutický prijateľný nosič.

10. DNA molekula, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje fragment keratinocytového rastového faktoru podlá nároku

1.

11. DNA molekula, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje fragment keratinocytového rastového faktoru podlá nároku

2.

12. DNA molekula, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje fragment keratinocytového rastového faktoru podľa nároku

3.

13. Expresný vektor, obsahujúci DNA molekulu podľa nároku 10 a regulátorovú sekvenciu pre expresiu DNA molekuly.

14. Expresný vektor podľa nároku 13, kde vektorom je bakulovírus.

15. Hostiteľská bunka transformovaná expresným vektorom podľa nároku 13.

16. Hostiteľská bunka podľa nároku 15, kde bunka je vybraná zo skupiny, zahrňujúcej bakteriálnu bunku, kvasinkovú bunku, cicavčiu bunku a hmyziu bunku.

17. Spôsob prípravy fragmentu keratinocytového faktoru, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje stupne kultivácie hostiteľskej bunky podľa nároku 15 a izoláciu fragmentu keratinocytového rastového faktoru z kultúry.

18. Spôsob hojenia rán, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje aplikáciu terapeutickej kompozície podľa nároku 9 na plochu rany, ktorá má byt hojená a ponechanie rany, aby sa zahojila.