SK130992A3 - Method of enzymatic hydrolysis of carboxylic acid derivatives - Google Patents

Description

Zpusob enzymatické hydrolyzy derivátu karboxylových kyselín

Oblast vvnálezu

Vynález se týká zpusobu enzymatické hydrolyzy derivátu karboxylových kyselín v organickém rozpouštédle.

Dosavadní stav techniky

Velké množství enzýmu je schopné hydrolyzovat deriváty karboxylových kyselín více méné špecificky. Tato vlastnosť hydroláz se již dlouho prumyslove využívá. Pritom je nutno uvést,že hydrolázy za obvyklých podmínek ve vodných roztocích poskytují dobré reakční rýchlosti a rovnéž pri jejich použití dochází jen k malým ztrátám účinnosti, avšak tyto enzymy jsou nicméné ve vode rozpustné a jen zrídka je možno je z vodných reakčních roztoku opet získat a znovu použít. Kovalentné imobilizované hydrolázy je sice možno z vodných roztoku získat zpet, avšak reakční rýchlosti jsou pri jejich použití nižší a také účinnosť je nižší než pri použití stejného množství hydrolázy v neimobilizované forme. Mimoto dochází i v prípade imobilizovaného enzýmu ve vodném systému k jeho částečnému rozpoušténí.

Byly již provádšny pokusy uskutečnit enzymatickou hydrolyzu v organickém prostredí. Napríklad v Pakistan Journal of Biochemistry, sv. 10, č.2, 1976 se uvádí, že pri hydrolyze esteru karboxylových kyselín muže být počáteční rýchlosť hydrolyzy v organickém prostredí vyšší, než ve vodném prostredí, avšak obecné účinnosť hydrolázy v organickém prostredí rýchle klesá vzhledem k tomu, že hydrolázy jsou na pusobení organických rozpouštédel citlivé.

V Chemical Abstracts, sv. 112, 154387z se proto navrhuje hydolázy chemicky modifikovať tak, aby bylo možno zvýšit jejich toleranci vzhledem k organickým rozpouštédlum.

V Chemical Abstracts sv. 109, 188832η se popisuje enzymatická hyórolyza s chemicky modifikovanou hydrolázou v benzenu, nasyceném vodou.

Nyní bylo neočekávané zjišteno, že pro dostatečnou reakční rýchlosť a vysokou účinnosť neni zapotrebí použitou hydrolázu chemicky modifikovať v prípade, že se reakce provádí v organickém rozpouštédle, které je jen omezene mísitelné s vodou a v prubehu reakce je toto rozpouštedlo vodou nasyceno s ohledem na skutečnost, že pri hydrolýze dochází ke spotrebovávání vody.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí zpusob enzymatické hydrolyzy derivátu karboxylových kyselín, který spočívá v tom, že se derivát karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouš tedle, jen omezene mísitelném s vodou, roztok se nasýti vodou a uvede do styku s hydrolázou, hydrolyza probíhá za spotŕebovávání vody, načež se reakční rozpouštedlo tak dlouho sytí vodou a uvádí do styku s hydrolázou, až se dosáhne požadovaného stupne premeny.

Zpusob podie vynálezu je vhodný pro hydrolyzu derivátu karboxylových kyselín, které je možno podrobiť enzymatické hyrolyze pusobením hydroláz. Jde napríklad o estery, diestery a triestery karboxylových kyselín, jejich amidy, thioestery apod. a analogické deriváty thiokarboxylových kyselín. Zvláštni význam má tento zpusob pro hydrolyzu derivátu karboxylových kyselín, které nesou v retézci kyseliny nebo v retézci skupiny, tvoŕícá derivát substituenty, které vytvárejí v molekule centrum chirality nebo pro hydrolyzu takových derivátu karboxylových kyselín, pri jejichž hydrolyze vzniká stred chirality. Takové deriváty (chirální nebo prochirální) karboxylových kyselín je možno hydrolyzovat pôsobením stereospecifických hydroláz na opticky aktívni sloučeniny, obohacené o jeden z možných enantioméru podie stereospecif ičnosti použité hydrolázy, pričemž pod pojmem chirálních derivátu karboxylových kyselín se rozumí jak racemické smesi, tak smesi, které jsou alespoň obohaceny o jeden z možných enantioméru.

Pod pojmem deriváty karboxylových kyselín se s výhodou rozumí smesi enantioméru chirálních esteru karboxylových kyselín s chirálním centrem v kyselé části molekuly, zvlášte výhodné jsou 2-substituované estery alkankyse1 in, zejména estery kyseliny 2-halogenpropionové.

Jako produkty hydrolyzy vznikají odpovídající kyseliny karboxylové nebo thiokarboxylové a alkoholy, aminy, thioly apod., pričemž požadovaným reakčním produktem, který je získán a izolován muže být jak karboxylová ykselina, tak alko hol, amin, thiol apod.

Pri provádéní zpusobu podie vynálezu se nejprve rozpustí derivát karboxylové ykseliny v organickém rozpouštédle, jen omezene mísitelném s vodou. Jako organické rozpouštédlo je možno použit napríklad uhľovodíky, jako pentan, hexan, benzen nebo toluén, halogenované uhlovodíky, jako methylenchlorid, chloroform, tetrachlormethan, ethylenchlorid, chlórbenzény nebo ethery, jako diethylether, diisopropalether nebo smesi takových rozpouštédel. Výhodnými rozpouštédly jsou ethery, zvlášte diisopropylether. Volba rozpouštédla muže mít značný význam vzhledem k tomu, že v určitém rozpouštédle muže reakce probíhat rýchleji než v jiném rozpouštédle. Za určitých okolností muže být výhodné pridat k organickému roz4 pouštédlu malé množství pomocného organického rozpouštedla, které je s vodou mísitelné, napríklad alkoholu, jako methanolu, ethanolu, isopropanolu nebo ketónu, napríklad acetónu ke zvýšení rozpustnosti derivátu karboxylové kyseliny v orga nickém rozpouštédle. Pridané množství pomocného rozpouštedla však musí být tak malé, aby organické rozpouštedlo po pridání pomocného rozpouštedla nebylo s vodou mísitelné bez omeze ní. Rozpouštedlo pro určitou reakci zvolí snadno každý odbor ník na základe jednoduchých predbežných pokusu.

Roztok výchozí látky v organickém rozpouštédle má být pokud možno koncentrovaný, pričemž koncentrace výchozí látky v určitém rozpouštédle je závislá jak na této látce, tak na použitém rozpouštédle.

Organický roztok výchozí látky se pak nasýti vodou. K nasycení vodou se organický roztok uvede do styku buď se systémem, obsahujícím vázanou vodu a schopným tuto vodu uvol nit pri styku s organickým rozpuštédlem, nebo s vodnou fází.

Systémy, které obsahují vázanou vodu jsou napríklad hydrogely, napríklad polyakrylamidové gély, polysacharidové gély apod. K organickému roztoku se pridá takové množství vázané vody, které je dostatečné pro nasycení roztoku vodou, pričemž pod pojmem voda se rozumí jak čistá vody, tak také roztoky pufru nebo solí. Množství použitého hydrogélu závisí na jeho schopnisti vázat vodu, tak také na mísitelnosti organického rozpouštedla s vodou.

Jako vodná fáze padá v úvahu čistá voda, roztok puf ru nebo také vodný roztok solí. Z pufru se s výhodou užije takový pufr, v némž je možno dosáhnout vysoké reakční rýchlosti a vysoké špecifičnosti pôsobení použité hydrolázy. K nasycení vodou se organický roztok vlije prímo čo vodné fáze nebo se s vodou fází smísí a pak se nechá ustát, čímž se vytvorí dve fáze.

Pak se roztok, nasycený vodou, uvede do styku s hydrolázou.

Z hydroláz se volí určitá vhodná hydroláza v závislosti na výchozí sloučenine a na požadovaném výsledném produktu. Príkladem hydroláz mohou být esterázy, proteázy, amidázy apod. Účelné je v závislosti na požadované premene použít takovou hydrolázu, pri jejímž použití je možno reakci uskutečnit pokud možno špecificky, v prípade chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové kyseliny pokud možno stereospecificky. S výhodou se pri provádéní zpusobu podie vynálezu použije lipáza. Výhoda zpusobu podie vynálezu spočívá v tom, že hydrolázu není zapotŕebí chemicky modifikovat ke zvýšení její tolerance vzhledem k organickému.rozpouštedlu. Jinak je však možno pri provádení zpusobu podie vynálezu použit také chemicky modifikované hydrolázy.

Hydrolázu je možno použit jako takovou, adsorbovanou na nosiči, napríklad na celitu, silikagélu, hlinkách, sklenených perlách nebo také v imobilizované forme. S výhodou se hydroláza aďsorbuje na inertní nosič, zvlášte na celit, pričemž k adsorpci hydrolázy na celit stačí jednoduché promísení hydrolázy s celitem.

Podstatnou výhodou zpusobu podie vynálezu je skutečnost, že hydrolázu není zapotŕebí použit v imobilizovaném stavu vzhedem k tomu, že není rozpustná v organických rozpouštédlech.

V prípade, že se k nasycení organického roztoku vodou užije hydrogel, obsahující vodu, pŕidává se hydroláza pŕímo do roztoku, nasyceného vodou, nacházející se v hydrogelu.Pri styku roztoku, nasyceného vodou s hydrolázou dôjde k hydrolyze v rozsahu, specifickém pro enzým a se selektivitou, špecifickou pro použitý enzým, pričemž se voda, spotrebovaná pri hydrolyze, doplňuje z hydrogélu, takže organický roztok zustává nasycen vodou.

V prípade, že se užije chirální nebo prochirální derivát karboxylové kyseliny, nechá se reakce probíhat až do požadovaného stupne premeny, který je možno sledovat pri použití optické otáčivosti.

Po dosažení požadovaného stupne premeny se enzým a hydrogél odfiltruj!. Pak je možno roztok zpracóvat v závislosti na požadovaném produktu, produkt je možno získat a/nebo čistit nekterým z bežným zpusobu, napríklad extrakcí, prekrystalováním, destilací nebo chromatografií.

V prípade, že se k nasycení organického roztoku vodou užije vodná fáze, uloží se hydroláza do reakční nádoby, nspríklad do sloupce a organický roztok, nasycený vodou se čerpá nádobou preš hydrolázu, takže se hydroláza nedostáva do styku s vodnou fází.

Pri styku organického roztoku, nasyceného vodou, s hydrolázou dochází k hydrolyze, špecifické pro použitý enzým v rozsahu a se stereospecifičností, rovnež odpovídající použitému enzýmu. Pritom se organický roztok, nasycený vodou vede preš hydrolázu kontinuálne a nakonec se vede vodnou fází vzhledem k tomu, že pri jednorázovém styku hydrolázy s reakčním roztokem není obvykle možno dosáhnout požadovaného stupne premeny. Vzhledem k tomu, že hydrolázy obvykle máji schopnosť premeniť oba enantioméry opticky aktivního derivátu karboxylové ykseliny, pričemž však k premene jednoho z enantiomeru dochází prednostne, obvykle se pri použití chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové kyseliny postupuje tak, že se kontinuálne merí optická otáčivost reakčního roztoku, která predstavuje údaj o prebytku určitého enantiomeru a reakce se preruší po získání pro hydrolázu výhodne jšího enantiomeru, čímž je možno získat v podstate čisté enantiomerní produkty.

Pri kontinuálním čerpaní organického, vodou nasyceného roztoku pŕes enzým je zapotrebí dbát toho, aby byl roztok pri styku s enzymem stále nasycen voodu. Vzhledem k tomu, že se v prubehu hydrolyzy na 1 mol rozštepené sloučeniny spot rebuje 1 mol vody, je nutno toto množství vody opet nahradit, a to predtím, než je organický roztok opet uveden do styku s hydrolázou.

Spotrebovanou vodu je možno nahradit napríklad tak, že se organický roztok po styku s hydrolázou vede preš bázické, hydroxidové ionty obsahující sloučeniny, uložené napríklad ve sloupci. Tím vznikne na 1 mol karboxylové kyseliny 1 mol vody a 1 mol soli karboxylové kyseliny, čímž dochází k náhrade vody, spotrebované pri hydrolyze a roztok zustává nasycen. Z basických sloučenin je možno použít napríklad iontoméniČe v OH-ŕorme, hydroxidy alkalických kovu nebo kovu alkalických zemín apod.

Po výstupu ze sloupce již roztok neobsahuje žádnou, pri enzymatické reakci vytvorenou karboxylovou kyselinu vzhledem k tomu, že tato kyselina zustává vázána na bázickou sloučeninu, roztok je však znovu nasycen vodou tvorbou 1 molu vody na 1 mol soli karboxylové kyseliny. Reakční roztok se tak dlouho prečerpává kontinuálne pŕes hydrolázu a pak pŕes sloupec s obsahem sloučenin s hydroxylovými ionty, až je dosaženo požadovaného stupne premeny. Organický reakční roztok je však možno k nasycení vodou po styku s hydrolázou vést také vodnou fází nebo je možno jej s vodnou fází smísit a nechat usadit. Jako vodná fáze padá v úvahu čistá voda, roztok pufru nebo roztoky solí. S výhodou se pH vodné fáze,které stykem s kyselinou, vytvorenou pri reakci klesá, udržuje pridáváním baze na stálé hodnote. Hodnota pH by nemela klesnout pod 3 ani stoupnout nad 11. Výhodná hodnota pH je v rozmezí 5 až 10, zvlášte 6 až 8.

Z baží je možno použit bežné baze, obvykle užívané k neutralizaci, napríklad hydroxidy, uhličitany nebo hydrogen uhličitany alkalických kovu nebo kovu alkalických zemín, amoniak apod., pŕičemž s výhodou se užijí hydroxidy alkalických kovu, jako hydroxid draselný nebo sodný. Bazi je možno užít ve forme vodného roztoku, s výhodou pri použití zarízení pro mérení pH, napríklad vodíkové elektródy, s výhodou pracujícího automaticky. Pŕidáním baze dôjde k vytvorení soli karboxylové kyseliny s pridanou baží a tato súl zustává ve vodné fázi, takže je možno vytvorenou karboxylovou kyselinu po dosažení rovnovážného stavu hydrolyzy oddelit, organický roztok se oddelí od vodné fáze v dusledku své omezené mísitelnos ti s vodou a současné dochází k jeho nasycení vodou. Organic ký roztok, nasycený vodou, se pak opét vede preš hydŕolázu. Tento postup se opakuje tak dlouho, dokud se nedosáhne požadovaného stupne premeny. Pak se reakce preruší a reakční produkty se izoluj í a poprípade čistí.

Karboxylová kyselina, která se v prubéhu postupu vytvorí se oddelí svrchu uvedeným zpusobem ve forme soli a po okyselení a poprípade po extrakci je možno ji oddelit a pak čistit destilací, chromatograficky nebo pŕekrystalováním.

V prípade, že požadovaným produktem není vznikající karboxylová kyselina, nýbrž druhý produkt hydrolyzy, to zna9 mená napríklad alkohol, amín, thiol nebo jsou požadovanými produkty jak karboxylová kyselina, tak alkohol, amin nebo thiol nebo v prípade, že se pri sycení vodou nepridává k organickému reakčnímu roztoku žádná baze, je možno požadované produkty po ukončení reakce z organického reakčního roztoku získat bežným zpusobem, napríklad extrakcí, destilací, krystalizací nebo prekrastalováním, poprípade chromatograficky a obdobným zpusobem je možno získané produkty teké dále čisti t .

Neočekávané se ukázalo, že enzymatickou účinnost hydrolázy je po probehnutí jednoho reakčního cyklu a pred začátkem druhého reakčního cyklu možno podstatné zvýšit propláchnutím chloroforemem, nebyl-li chloroform již užit jako organické rozpouštedlo pro derivát karboxylové ykseliny.Tak napríklad bylo možno špecifickou účinnost lipázy po nekolik reakčních cyklu zvýšit z hodnoty 138 na 339 mMol za hodinu v 1 gramu enzýmu, pŕičemž účinnost lipázy zustávala konštantní .

Zpusob podie vynálezu se s výhodou provádí pri teplote, pri níž je účinnost lipázy nejvyšší. Tyto teploty leží obecné v rozmézí 0 až 40 °C , s výhodou v rozmezí 20 až 30 °C a zvlášté výhodné je provádét reakci pri teplote místnosti, ve zvláštních pŕípadech je možno použít také vyšších teplôt, avšak vždy nižších, než je teplota varu rozpouštedla a nižší než je teplota deaktivace použité hydrolázy.

Zpusob podie vynálezu je možno provádét kontinuálné nebo diskontinuálné, s výhodou se provádí kontinuálné.

V prípade, že pri použití chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové ykseliny není pŕebytek jednoho z enantiomeru v produktu, získaném pusobením hydrolázy dostateč ný vzhledem k nízké stereospecifičnosti hydrolázy, je možno produkt, získaný po jednom reakčním cyklu znovu prevést na derivát karboxylové kyseliny a znovu jej zpracovat zpúsobem podie vynálezu tak dlouho, až bude dosaženo dostatečnébo obohacení produktu o požadovaný enantiomér. Nekdy je pro dosa žení vyšší čistoty enantiomeru účelné reakci prerušit již po krátké dobé jejího prubehu, a tím i pri malém podílu premeny výchozí látky.

Pri zvláštním provedení zpusobu podie vynálezu se postupuje tak, že se opticky aktívni derivát karboxylové kyseliny, zejména opticky aktívni ester akrboxylové kyseliny, obsahující stred chirality v kyselé časti molekuly (pŕičemž požadovaným produktem je jeden z enantiomeru opticky aktívni karboxylové ykseliny), rozpustí v diisopropyléteru nebo v toluénu na pokud možno koncentrovaný roztok a v zásobníku, v nemž se jako predloha nachází vodná fáze se za míchání s vodnou fází sýti vodou. Organická fáze, nasycená vodou se pomoci čerpadla ze zásobníku vede preš lipázu, adsorbovanou na inertní nosič a uloženou vné zásobníku s výhodou ve sloup ci, takže lipáza se nedostává do styku s vodnou fází v zásob niku. Tím dôjde k hydrolyze, špecifické pro použitý enzým. Organický reakční roztok se pak privádí zpet do vodné fáze v zásobníku. Pritom se pH vodné fáze, které klesá v dusledku prívodu vytvorené karboxylové ykseliny, udržuje pridáváním vodného roztoku hydroxidu sodného nebo draselného na hodnote približne 7. Tím se z karboxylové ykseliny vytvorí sul, která zústane ve vodném roztoku. Uvolnéný alkohol a nezreagovaná výchozí látka zustanou rozpustené v organickém reakčním roztoku, který se v dusledku své omezené mísitelnosti s vodou oddelí od vodné fáze v zásobníku a v tomto okruhu se tak dlouho vede preš hydrolázu a pak zpet do- vodné fáze, až je dosaženo požadovaného stupne premeny. Pak se reakce preruší a vodná fáze se oddelí od organické fáze. K izolaci vytvorené karboxylové kyseliny se vodná fáze okyselí podie potreby a uvolnéná karboxylová kyselina se extrahuje. Pak múže ná11 sledovať čistení prekrystalováním, destilací nebo chromatografií, čímž je možno dosáhnout dalšího obohacení o požadovaný enantiomer.

Ve zvlášté výhodném provedení zpúsobu podie vynálezu zuse destilovaná voda užije jako predloha v zásobníku a za míchání se pridá roztok enantiomerní smési esteru karboxylové kyseliny, substituovaného v poloze 2 kyselé části, s výhodou atomem halogénu, s výhodou jde o roztok v isopropylétéru, načež se smés nechá usadlt. Pak se organická fáze vede kontinuálne preš lipázu, adsorbovanou na celit vné zásobníku ve sloupci, pak se organická fáze privádí zpét do vodné fáze v zásobníku, pričemž se hodnota pH vodné fáze udržuje pridávaním vodného roztoku hydroxidu alkalického kovu v rozmezí 6 až 9. Vodnou fázi je také možno ze zásobníku vyjmout a nahradiť čerstvou vodnou fází. Také organickou fázi, která obsahuje pŕevážne enzymem nerozštépené enantiomery chirálního esteru karboxylové ykseliny a vytvorený alkohol je možno po dosažení požadovaného stupne premeny ze zásobníku vyjmout a nahradiť čerstvou organickou fázi. Čistý nebo obohacený enantiomer opticky aktívni karboxylové kyseliny je možno z vodného roztoku získať okyselením a extrakcí vodného roztoku organickým rozpouštédlem, rozpouštéjícím karboxylovou kyselinu.

Zpusobem podie vynálezu je možno snadno podrobiť enzymatické hydrolyze derivát karboxylové kyseliny v organickém rozpouštédle a získaný produkt snadno izolovať, pričemž enzým není nutno užít v imobilizované forme, zejména je možno enantiomerní smés chirální výchozí látky prevést popŕípadé pri použití vétšího počtu reakčních cyklu na vysoce obohacené enantiomery opticky aktívni sloučeniny, pričemž rozpouštédlo je možno opakované použit, současné nedochází k prakticky žádným ztrátám enzýmu nebo ztrátám jeho účinnosti v prubéhu delšího časového období a také nevznikaj! žádné od12 padni produkty, které by byly škodlivé pro životní prostredí a které by bylo zapotrebí znovu zpracovávat nebo odkládat jako škodlivý odpad. Zpusob podie vynálezu tedy predstavuje podstatný technický pokrok.

Praktické provedení zpusobu podie vynálezu bude osvétleno následujícími príklady

Príklady provedení vynálezu

Príklad 1

20,05 g enantiomerní smesi 5,61 g 2-ethylhexylesteru kyseliny S-2-brompropionové a 14,44 g odpovídajícího R-isomeru se rozpustí v diisopropyléteru na 170 ml roztoku. Pŕebytek použitého R-enantiomeru je 44 %, smes byla vyrobená esterifikací odpovídající smesi enantiomeru kyseliny 2-brompropionové pôsobením 2-ethylhexanolu. Vzniklý roztok se vlije do 140 ml vody s 5,5 ml ethanolu, který se nachází v zásobníku jako predloha.

Vytvorí se dve fáze. Vodou nasycená organická fáze se pomoci čerpadla vede preš 1,5 g lipázy z Candida cylindracea, uložené s 12 g celitu ve sloupci vne zásobníku, roztok se čerpá rýchlostí 100 ml/min. Po pruchodu sloupcem se organický roztok pŕivádí zpet do vodné fáze v zásobníku. Hodnota pH vodné fáze se automaticky udržuje pridáváním 2 M vodného roztoku hydroxidu sodného na hodnote 5 až 8. Tím se vytvorí sodná sul kyseliny 2-brompropionové, vytvorené pri reakci a tato sul zústává ve vodném roztoku, zatímco se organický reakční roztok sýti vodou a pak oddelí od vodné fáze v zásobníku. Znovu vodou nasycený organický roztok se znovu kontinuálne vede preš llpázu a pak opét preš vodnou fázi.

Po 0,5 hodine se spotrebuje 2,05 ml, po 1 hodine 5,85 ml 2M vodného roztoku hydroxidu sodného a dosáhne se stupne pre13 meny 15 %. Nakonec se vodný roztok okyselí kyselinou sírovou takto uvolnená kyselina 2-brompropionová se extrahuje diisopropyleterem a izoluje odparením rozpouštédla. Tímto zpusobe se získá 1,55 g smési enantiomerú kyseliny R- a S-2-brompropionové s optickou otáčivostí (alfa)^°+25,4 °, což odpovídá prebytku 90,4 % R-enantiomeru, smes tedy obsahuje 0,08 g S- a 1,57 g R-2-brompropionové kyseliny. Špecifická účinnost lipázy je 5,2 mMol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklady 2 až 10

Príklady 2 až 7 byly provedeny obdobným zpusobem jako príklad 1 pri použití téže lipázy Candida cylindracea jako v príkladu 1, reakční doba byla prodloužena až na 4 hodiny a reakce byla prerušená po dosažení stupne premeny približne 44 %>. Sloupec s obsahem lipázy Candida cylindracea byl po každém reakčním cyklu promyt diisopropyléterem.

Príklady 8 až 10 byly provedeny obdobným zpusobem, jako príklad 1, bylo však užito šestinásobného množství enan tiomerní smesi 2-ethylhexylesteru ykseliny 2-brompropionové, dlisopropyléteru, vody a ethanolu pri použití téže lipázy Candida cylindracea jako v príkladech 1 až 7. Sloupec, obsahující lipázu Candida cylindracea byl po každém reakčním cyklu promyt diisopropyléterem. Výsledky, získané svrchu uvedeným zpusobem jsou shrnuty v následuj ících tabulkách 1 a 2.

Tabulka 1

Tabulka uvádí premenu výchozí látky v % v prubehu času Príklady

h	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0,5	7,3		6,3		7,1	5,8	3,3	2,2	1,8
1,0	13,8				14,6
1,5		19,6	20,4	20,5
2,0		24,9		26,2	29,1
2,5	29,9	29,9	32,0	30,4	34,9	27,5	7,3	5,3
3,0		34,7			39,4
3,5	38,9
4,0	42,6		46,6
4,2	43,9	43,9		44,2	43,9
4,5						43,9
18,0									35,7
19,0								37,7
20,5							39,4
24,13							44,1
24,25								44,1	44,1

príklad	Tabulka	2
G (g)	alfa (°)	ee (%)	účinnost
2	4,66	+ 27,1	96,4	5,3
3	4,67	+ 26,2	93,2	5,3
4	4,91	+ 26,4	94,0	5,9
5	4,66	+ 28,2	100,4	5,3
6	4,68	+ 25,7	91,5	5,4
7	4,60	+ 28,6	101,3	4,9
8	28,0	+ 27,3	97,2	5,5
9	27,7	+ 27,7	98,6	5,5
10	28,03	+ 28,5	101,0	5,5

Vysvetlivky k tabulce 1 a 2:

G (g): alfa (°) ee (%) :

výtežek v gramech optická otáčivost (alfa) prebytek enantiomeru R- v pomeru ke kyseline S-2-brompropionové účinnost: špecifická účinnost lipázy Candida cylindracea v mMolech za hodinu na 1 g lipázy h: doba reakce v hodinách premena v %:pŕeménéný podíl enantiomerní smesi 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-brompropionové v gramech

Príklad 11 g racemické smesi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-brompropionové se rozpustí ve 150 ml diisopropyléteru. Roztok se pak pridá do zásobníku, v némž se nachází jako predloha 70 ml vody a obe složky se promíchají. Dôjde k vytvorení dvou fází. Organická fáze, nasycená vodou se pak prečerpává preš 50 mg lipázy Candida cylindracea ve smési s 2,8 g celitu ve sloupci vne zásobníku rýchlostí 100 ml/min. Po pruchodu sloupcem se organický roztok zpracovává stejným zpusobem jako v príkladu 1.

Po 6,22 hodinách bylo dosaženo stupne premeny

29,17 % a reakce byla prerušená. Tímto zpusobem bylo získáno

4,4 g enantiomerní smesi kyseliny R- a S-2-brompropionové 20 o s optickou otáčivostí (alfa)^ +20,6 , což odpovídá prebytku

R-enantiomeru 73,3 %.

Špecifická účinnost lipázy byla 70,78 mmol za hodinu na 1 g lipázy.

Príklady 12 až 17

Postup byl prováden obdobným zpusobem jako v pri kladu 11 pri použití stejných výcbozích množství složek, avšak sloupec, obsahující tutéž lipázu jako v príkladu 11 byl po každém pruchodu roztoku promyt chloroformem.

Výsledky, získané tímto zpusobem jsou uvedený v následující tabulce 3

Tabulka 3

Pŕíkl č.	premena %	čas h	alfa (°)	ee (%)	účinnost
12	29,8	3,25	+ 21,6	76,9	138,5
13	30	1,75	+ 22,1	78,6	258,3
14	29,8	2,23	+ 21,3	75,8	236,8
15	30	1,58	+ 22,7	80,8	285,5
16	30	1,33	+ 20,0	71,2	339,0
17	30 .	1,80	+ 17,2	61,2	251,1
Príklad 18
Postup byl prováden obdobným zpusobem jako v príkladu 11 pri použití 45,1 g racemické smesi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-brompropionové a 50 mg lipázy Candida cylindracea. Po 19,25 hodinách bylo dosaženo premeny na 45 %. Bylo získáno 9,88 g enantiomerní smesi kyseliny R-

a S-2-brompropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)_D +21,5 což odpovídá 76,5% prebytku R-enantiomeru.

Príklad 19

Kyselina 2-brompropionová, získaná v príkladu 18 byla chemicky esterifikována 2-ethylhexanolem. Vzniklý ester byl uveden do reakce s lipázou zpusobem podie príkladu 18 pri použití téže lipázy. Tímto zpusobem bylo po 15,25 hodinách dosaženo stupne premeny 72,3 %. Bylo získáno 6,62 g smesi enantiomeru kyselina R- a S-2-brompropionové s hodnotou op20 tické otáčivosti (alfa)_D +26,4, což odpovídá 94% prebytku kyseliny R-2-brompropionové.

Príklady 20 až 25

Príklady 20 až 21, 22 až 23 a 24 až 25 byly provádeny obdobným zpusobem jako príklady 18 až 19 pri použití téhož množství výchozích látek a téže lipázy Candida cylindracea z príkladu 18. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulee 4

Tabulka 4

Príkl. č.	premena %	čas h	alfa( )	ee (%)	výtežek %
20	53,6	17	+ 18,7	66,5	12,6
21	63,7	22	+ 26,2	93,2	8,0
22	42,6	22	+ 17,8	63,3	11,1
23	62,9	26,75	+ 26,2	93,2	6,7
24	43,2	25,5	+ 15,9	56,6	11,5
25	57,2	19,5	+ 27,2	96,8	6,5

18·'

Príklad 26 g racemické smesi butylesteru ykseliny R- a S-2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyléteru a roztok se pridá do zásobníku, obsahuj ícího jako predlohu 200 ml vody a složky se promíchají. Vzniknou dve fáze. Horní organická fáze se se čerpá preš 15 g lipázy Geotrichum candidum, smísené se 60 g celitu a uložené ve sloupci vné zásobníku, rychlost čerpání je 100 ml/min. Organický reakční roztok se pak privádí zpet do vodné fáze v zásobníku, pŕičemž pH této vodné fáze se udržuje pomoci automatického zaŕízení pridáváním 2M vodného roztoku hydroxidu sodného pri automatickém merení pH na hodnote 6 až 8.Tímto zpúsobem se vytvorí sodná sul kyseliny 2-chlorpropionové, vznikající pri reakci a tato sul zustávä ve vodné fázi. organický reakční roztok se od vodné fáze oddelí a kontinuálne se čerpá preš lipázu a pak opet zpét do vodné fáze.

Po 44,5 hodinách se dosáhne stupne premeny 20,6 % a reakce se preruší.

Vodný roztok se okyselí pridáním kyseliny sírové a pak se extrahuje chloroformem a organické rozpouštedlo se vysuší síranem sodným a pak se odparí.

Tímto zpúsobem se získá 5,3 g enantiomerní smesi kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)2θ-12 °, což odpovídá 73,2% prebytku S-enantiomeru této kyseliny.

Príklad 27

55,5 g racemické smési 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyl-.

éteru a pak se pridá do zásobníku, v nméž se nachází jako predloha 200 ml vody za míchání. Vzniknou dve fáze. Organická, vodou nasycená horní fáze se vede preš 1 g lipázy Candida cylindracea ve smési s 10 g celitu ve sloupci vné zásobníku. Pak se postupuje stejné jako v príkladu 1. Po dosažení stupne premeny 32 % se reakce preruší. Tímto zpusobem se získá enantiomerní smés kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s optickou otáčivostí (alfa)p°+6,9 °, což odpovídá 42,1% prebytku R-eanntiomeru. Špecifická účinnost lipázy je 11,58 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 28

55,5 g racemicke smesi 2-ethylhexylesteru kyseliny Ra S-2-chlorproppionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyletheru a za míchání se roztok pridá do zásobníku, v némž se jako predloha nachází 200 ml vody. Vytvorí se dve fáze.

Organická, vodou nasycená horní fáze se čerpá rýchlostí 100 ml/min preš sloupec, obsahující 2 g lipázy Candida cylindracea, zasíténé pôsobením 2 ml 50% glutaraldehydu v diisopropyletheru a smísené s 13 g celitu. Dále se postupuje stejné jako v príkladu 1.

Po dosažení stupne premény 32 % se reakce preruší. Získá se smés enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s optickou otáčivostí (alfa)^°+ 7,3 °, což odpovídá 44,5% prebytku R-eanntiomeru. Špecifická účinnost lipázy je 4,8 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 29

Pri použití 55,2 g racemické smési enantiomeru 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 400 ml hexanu místo diisopropyletheru a 3 g lipázy Candida cylindracea ve smési s 21 g celitu se zpusobem podie príkladu 26 dosáhne po 19 hodinách stupne premeny 78,6 %. Tím se získá smes enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s optickou otáčivostí (alfa)_D +2,5, což odpovídá 15,2% prebytku R-enantiomeru. Pŕebytek S-enantiomeru ve výchozím esteru pred zpracováním lipázou byl 56 %.

Príklad 30

Pri použití 294,1 g racemické smesi enantiomeru 2-ethyl hexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 100 ml diisopropylet heru a 20 ml acetónu místo čistého diisopropyletheru a 10 g lipázy Candida cylindracea ve smesi s 50 g celitu bylo zpuso bem podie príkladu 26 dosaženo stupne premeny 57 %. Tím byla získána smes enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivostí (alfa)^+6,l °, což odpovídá 37% prebytku R-enantiomeru.

Príklad 31

Pri použití 57,2 g racemické smesi enantiomeru fenylethylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové v roztoku ve 400 ml diisopropyletheru a 3 g lipázy Candida cylindracea ve sme si s 15 g celitu bylo dosaženo zpusobem podie príkladu 26 po 1,30 hodinách stupne premeny 60 %. Tímto zpusobem byla získána smes enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové 20 s hodnotou optické otáčivostí (alfa)^ +6,1, což odpovídá 37% prebytku R-eanntiomeru.

Špecifická účinnosť lipázy je v tomto prípade 41,7 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 32

Postupuje se zpusobem podie príkladu 31 pri použití 159 g racemické smesi enantioméru fenylethylesteru ykseliny R- a S-2-chlorpropionové jako výchozího materiálu v roztoku ve 400 ml diisopropyletheru a užije se tatáž lipáza jako v príkladu 31, která byla propláchnuta diisopropyletherem. Po 4,12 hodinách bylo dosaženo stupne premeny 57 % a reakce byla prerušený. Tímto zpusobem byla získána smes enantioméru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)_D +5,3, což odpovídá 32,3% prebytku R-enantiomeru uvedené kyseliny.

Príklady 33 až 35 g racemické smesi enantioméru butylesteru kysleiny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml rozpouštedla s roztok se za míchání pridá do zásobníku, v némž se jako predloha nachází 200 ml vody. Vytvorí se dve fáze. Organická fáze, nasycená vodou se čerpá preš sloupec, obsahující 3 g lipázy Candida cylindracea ve smesi s 9 g celitu tak dlouho, až se dosáhne stupne premeny 33 %. Pak se postupuje zpusobem podie príkladu 1. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tybulce:

Príklad	Rozpouštedlo	účinnosť	spec. otáčivost
33	di i sopropylether	27,18	+ 5,4
34	n-heptan	12,78	+ 5,2
35	chloroform	2,17	+ 5,6

špecifická otáčivost je uvedená jako (alfa)_D účinnosť je uvedená v mmol za hodinu na 1 gram lipázy

Príklad 36

55,2 g racemické smési enantiomeru 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 400 ml diisopropyl etheru a za míchání se roztok pridá do zásobníku, obsahující ho jako predlohu 200 ml vody. Vytvorí se dve fáze. Organická fáze, nasycená vodou se vede preš 6 g lipázy Humicola lanugi nosa ve smési s 20 g celitu. Dále se postupuje stejné jako v príkladu 1. Po 25 hodinách se dosáhne stupne premeny 32,4 % a reakce se preruší.

Tímto zpusobem se získá smes enantiomeru kyseliny R- a 20

S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^ +8,9 °, což odpovídá 54,3% prebytku R-enantiomeru. Špecifická účinnost lipázy je 0,54 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 37

Postupuje se stejne jako v príkladu 36 pri použití stej riých výchozích látek a pri použití téže lipázy jako v príkla du 36 po opakovaném propláchnutí sloupce s obsahem enzýmu diisopropyletherem. Po 48 hodinách bylo dosaženo stupne premeny 64,8 % a reakce byla prerušená. Tímto zpusobem se získá smes enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)p^+4,7 °, což odpovídá 28,7% prebytku R-eanntiomeru. Špecifická účinnost lipázy byla 0,56 mmol za hodinu na jeden gram liipázy.

Príklad 38

Pri použití organické fáze z príkladu 37, obsahující 19,4 g 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové a lipázy Pseudomonas fluorescens ve smesi s 12,5 g celitu se postupuje zpusobem podie príkladu 36 a po 8,6 hodinách se dosáh ne premeny 35,8 %. Tímto zpúsobem se získá smés enantiomerú kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)p^-12,6 °, což odpovídá 76,8% prebytku S-enantiomeru. Špecifická účinnost lipázy byla 1,48 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 39

Pri použití 102,5 g enantiomerní smési 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s prebytkem 58,5 % Senantiomeru, získané esterifikací odpovídajících enantiomerú kyseliny 2-chlorpropionové pusobením 2-ethylhexanolu a 4,8 mg lipásy Chromobacterium viscosum ve smési s 10 g celitu bylo dosaženo zpúsobem podie príkladu 36 stupne premeny

22,5 %. Tímto zpusobem bylo získáno 4,7 g smési enantiomerú kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)20-12,9 °, což odpovídá 78,7% prebytku S-enantiomeru. Špecifická účinnost lipázy byla 1,04 mol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 40

57,6 g recemické smési enantiomeru z príkladu 27 se zpracovává zpusobem, uvedeným v príkladu 27 s tím rozdílem, že se postup provádí pri teplote 0 ± 1,5 °C pri použití 6 g lipázy Candida cylindracea ve smési s 24 g celitu, tímto zpu sobem se v prubéhu 5 hodín dosáhne premény 70 % a získá se smés enantiomeru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové a hodnotou optické otáčivosti (alŕa)_D +4,3 °, což odpovídá 26% prebytku R-enantiomeru. Špecifická účinnost lipázy je v tomto prípade 5,83 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Príklad 41

Postupuje se zpusobem podie príkladu 40, avšak užije se teploty 10 °C, čímž se po dobé 2,8 hodin dosáhne stupné premény 70 %. Špecifická účinnost lipázy je 10,3 mmol za ho20 dinu na 1 gram lipázy. Hodnota optické otáčivosti (alfa)^ získané smési enantiomeru je + 4,4 °.

Príklad 42

56,6 g racemické smési enantiomeru 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 400 ml diisopropyletheru, nasyceného vodou a uloží do zísobníku. Tento roztok se pak čerpá pŕes 3 g lipázy Candida cylindracea ve smési s 15 g celitu. Takto získaný reakční roztok se pak prečerpává preš sloupec, obsahující smés 10 g hydroxidu vápenatého a 20 g celitu. Vzhledem ke tvorbé soli zustává kyselina 2-chlor propionová, vytvorená pri reakci ve sloupci a současné dochází v organickém roztoku k náhradé vody, spotrebované pri hydrolýze. Dále probíhá reakce kontinuálné svrchu uvedeným zpúsobem, po čtyrech hodinách se dosáhne stupne premeny 34,3 %. Tímto zpusobem se získá smés enantiomeru kyseliny R- a S-2chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^+7,0 θ což odpovídá 43% prebytku R-enantiomeru.

Príklad 43

6,59 g racemické smési enantiomeru butylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí v 75 ml diisopropyletheru a roztok se smísí s 1,6 ml pufru s fosforečnanem sodným o pH 7, s 0,1 g Sephadexu G50 (Pharmacia), nabobtnaném predem ve vodé, 6 g celitu a 6 g lipázy Geotrichum candidum a výsledná smés se míchá priteploté místnosti. Po 168,8 hodinách se dodáhne stupné premeny 37,4 % a reakce se preruší. Tímto zpu25 sobém se získá smés enantioméru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^°-8,8 °, což odpovídá 53,7% prebytku S-enantiomeru.

Príklad 44

Postupuje se obdobným zpusobem jako v príkladu 43, avšak užije se 15 g racemické smesi enantioméru propylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 5 g lipázy Geotrichum candidum, g celitu, 2,5 ml 10 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 7, 340 mg Hydrogélu Evergreen 500 (Chemie Linz AG), predem nabobtnaného ve vode, po 118,5 hodinách se dosáhne premeny 24,5 %. Tímto zpusobem se získá smés enantioméru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)20+3,0 °, což odpovídá 18,3% prebytku R-enantiomeru uvedené kyseliny.

Príklad 45

Postupuje se zpusobem, popsaným v príkladu 43, avšak místo Saphadexu G 50 se použije 0,1 g Hydrogélu Evergreen 500 (Chemie Linz AG), predem nabobtnaného ve vode, čímž se po 46,8 hodinách dosáhne stupne premeny 24 %. Tímto zpusobem se získá smés enantioméru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alf a)^-ll, 7 °, což odpovídá 71,3% prebytku S-enantiomeru uvedené kyseliny.

Príklad 46

6,58 g racemické smesi enantioméru butylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí v 50 ml diisopropyletheru a roztok se smísí s 1 g celitu, 0,1 g Sephadexu G50 (Pharmacia) predem nabobtnaného ve vode, 0,8 g 10 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 7 a 0,8 g lipásy Candida cylindracea a výsledná smés se míchá pri teploté místnosti. Po 1,75 hodiné se dosáhne stupne premeny 34,5 %>. Reakce se preruší a hydrogel a lipáza se odfiltrují. Reakční roztok obsahuje smes enantiomeru kyseliny R- a S-2.chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)_D +4,3, což odpovídá 26,2% prebytku R-enantiomeru. Špecifická účinnosť lipázy je 9,86 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Uvádéné hodnoty špecifické optické otáčivosti pro proo 20 dukty ze všech príkladu (alfa)_D byly naméreny pri vlnové délce 589 nm (sodíková D-čára), pri teplote 20 °C a pri c=l v chloroformu.

Jako celit byl ve všech pŕíkladech užit celit Hyflo Super-Cel (Fluka) s velikostí částic 2 až 25 mikrometru.

Príklady 47-52

Vždy 7,0 g racemické smési enantiomerú 1-fenylethylesteru kyseliny R- a S-oktanové se rozpustí ve 300 ml diisopropyl etheru a roztok se pridá za míchání do zásobníku, v némž se jako predloha nachází 200 ml vody. Vytvorí se dve fáze. Organická, vodou nasycená fáze se stejné jako v príkladu 1 Čerpá preš sloupec, obsahující 3 g lipázy Candida cylindracea (Meito) ve smési s 22 g celitu, tato lipáza byla užitá pro všechny príklady 47 až 52. Hodnota pH vodné fáze byla stejné jako v príkladu 1 udržována na hodnote 5 až 8. Po dosažení stupne premény 30 % se vodná fáze extrahuje diisopropyletherem a reakce se preruší. Po odparení diisopropyletheru se z odparku izoluje destilací ve vákuu 1-fenylethanol. Takto získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 5.

- 27 Pŕíkl. premena doba alfa (°) ee (%) č % h úč innost

47	32	22,0	41,1	92	0,137
48	30	22,0	-	-	0,128
49	31	23,0	41,2	92	0,127
50	25	20,5	-	-	0,119
51	29	24,5	-	-	0,111
52	29	25,5	39,7	88	0,103

účinnost: špecifická účinnost lipázy Candida cylindrace v mmol za hodinu na 1 gram lipázy alfa: hodnota optické otáčivosti, merenä pri vlnové délce 589 nm, pri. 20 °C, c = l v methanolu ee: pŕebytek R-l-fenylethanolu oproti S-isomeru

- : reakční roztok nebyl zpracován

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zpusob enzymatické hydrolyzy derivátu karboxylových kyselín, vyznačuj ící se tím, žese derivát karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouštédle, jen omezene mísitelném s vodou, pak se roztok nasýti vodou a uvede se do styku s hydrolázou, pričemž se voda, spotrebovaná hydrolyzou nahrazuje opetným sycením organického rozpouštedla vodou a organický roztok se znovu uvádí do styku s hydrolázou až do dosažení požadovaného stupne premeny.
2. 2. Zpusob podie nároku 1,vyznač u jící se tím, že se organická fáze sytí-vodou pri použití hydrogelu, obsahujícího vodu.
3. 3. Zpusob podie nároku 1,vyznač u jící se tím, že se po hydrolyze organické rozpoustédlo opet sytí vodou vedením reakčního roztoku preš látky, obsahující hydroxidové ionty, pričemž se vytvorená karboxylová kyselina odvádí a vody, spotrebovaná pri hydrolyze se nahrazuje.
4. 4. Zpusob podie nároku 1, vyznačuj íc í se tím, že se derivát karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouštédle a vzniklý organický roztok se privádí do vodné fáze v zásobníku, pričemž se organický roztok sytí vodou a oddelí se od vodné fáze, načež se organický roztok,nasycený vodou čerpá preš reakční nádobu s obsahem hydrolázy a vytvorený organický reakční roztok se pŕevádí zpét do vodné fáze v zásobníku, jejíž pH se udržuje na stálé hodnote pridáváním baze a vytvorená karboxylová kyselina zustává ve vodné fázi ve forme soli s pridanou baží a z vodné fáze se odvádí, kdežto organická fáze se znovu sytí vodou, oddelí se od vodné fáze a pak se opet tak dlouho prečerpává preš hyd29 rolázu a pak opét pŕes vodnou fázi, až se dosáhne požadované ho stupne premeny.
5. 5. Zpusoh podie nároku 4, vyznačuj íc í se tím, že se hydroláza po ukončení reakčního cyklu propláchne chloroforemem pred použitím v následujícím reakčním cyklu

   5. Zpusob podie nároku 1 až 5, vyznačuj ící s e t í m, že se užije chirální nebo prochirální derivát karboxylové kyseliny.
6. 7. Zpusob podie nároku 1 až 6, vyznačuj ící s e t í m, že se užije smés enantiomeru estru halogenpropionové kyseliny.
7. 8. Zpusob podie nároku 1 až 7, vyznačuj í c í s e t í m, že se jako organické rozpouštedlo užije ether.
8. 9. Zpusob podie nároku laž8,vyznačující s e t í m, že se jako hydroláza užije lipáza.
9. 10. Zpusob podie nároku 1 až 9, vyznačuj íc í s e t í m, že se užije hydroláza, adsorbovaná na nosiči.