CZ130992A3

CZ130992A3 - Process of enzymatic hydrolysis of carboxylic acids derivatives

Info

Publication number: CZ130992A3
Application number: CS921309A
Authority: CZ
Inventors: Maria Buchner; Robert Estermann; Herbert Mayrhofer; Gerald Banko
Original assignee: Chemie Linz Gmbh
Priority date: 1991-04-29
Filing date: 1992-04-29
Publication date: 1994-01-19
Also published as: NZ242279A; DK0511526T3; ATA88691A; HUT62940A; AT398081B; JPH05130881A; AU1502492A; AU662134B2; ZA923072B; CA2065550A1; US5278054A; SK130992A3; HU9201412D0; EP0511526A1

Description

Oblast vynálezu te>’

Vynález se týká způsobu enzymatické hydrolyzy derivátů karboxylových kyselin v organickém rozpouštědle.

Dosavadní stav techniky

Velké množství enzymů je schopné hydrolyzovat deriváty karboxylových kyselin více méně specificky. Tato vlastnost hydroláz se již dlouho průmyslově využívá. Přitom je nutno uvést,že hydrolázy za obvyklých podmínek ve vodných roztocích poskytují dobré reakční rychlosti a rovněž při jejich použití dochází jen k malým ztrátám účinnosti, avšak tyto enzymy jsou nicméně ve vodě rozpustné a jen zřídka je možno je z vodných reakčních roztoků opět získat a znovu použít. Kovalentně imobilizované hydrolázy je sice možno z vodných roztoků získat zpět, avšak reakční rychlosti jsou při jejich použití nižší a také účinnost je nižší než při použití stejného množství hydrolázy v neimobilizované formě. Mimoto dochází i v případě imobilizovaného enzymu ve vodném systému k jeho částečnému rozpouštění.

Byly již prováděny pokusy uskutečnit enzymatickou hydrolyzu v organickém prostředí. Například v Pákistán Journal of Biochemistry, sv. 10, č.2, 1976 se uvádí, že při hydrolyze esterů karboxylových kyselin může být počáteční rychlost hydrolyzy v organickém prostředí vyšší, než ve vodném prostředí, avšak obecně účinnost hydrolázy v organickém prostředí rychle klesá vzhledem k tomu, že hydrolázy jsou na působení organických rozpouštědel citlivé.

V Chemical Abstracts, sv. 112, 154387z se proto navrhuje hydolázy chemicky modifikovat tak, aby bylo možno zvýšit jejich toleranci vzhledem k organickým rozpouštědlům.

V Chemical Abstracts sv. 109, 188832η se popisuje enzymatická hydrolyza s chemicky modifikovanou hydrolázou v benzenu, nasyceném vodou.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že pro dostatečnou reakční rychlost a vysokou účinnost není zapotřebí použitou hydrolázu chemicky modifikovat v případě, že se reakce provádí v organickém rozpouštědle, které je jen omezeně mísitelné s vodou a v průběhu reakce je toto rozpouštědlo vodou nasyceno s ohledem na skutečnost, že při hydrolýze dochází ke spotřebovávání vody.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob enzymatické hydrolyzy derivátů karboxylových kyselin, který spočívá v tom, že se derivát karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouštědle , jen omezeně mísitelném s vodou, roztok se nasytí vodou a uvede do styku s hydrolázou, hydrolyza probíhá za spotřebovávání vody, načež se reakční rozpouštědlo tak dlouho sytí vodou a uvádí do styku s hydrolázou, až se dosáhne požadovaného stupně přeměny.

Způsob podle vynálezu je vhodný pro hydrolyzu derivátů karboxylových kyselin, které je možno podrobit enzymatické hyrolyze působením hydroláz. Jde například o estery, diestery a triestery karboxylových kyselin, jejich amidy, thioestery apod. a analogické deriváty thiokarboxylových kyselin. Zvláštní význam má tento způsob pro hydrolyzu derivátů karboxylových kyselin, které nesou v řetězci kyseliny nebo v řetězci skupiny, tvořícá derivát substituenty, které vytvářejí v molekule centrum chirality nebo pro hydrolyzu takových derivátů karboxylových kyselin, při jejichž hydrolyze vzniká střed chirality. Takové deriváty (chirální nebo prochirálni) karboxylových kyselin je možno hydrolyzovat působením stereospecifických hydroláz na opticky aktivní sloučeniny, obohacené o jeden z možných enantiomerů podle stereospecif ičnosti použité hydrolázy, přičemž pod pojmem chirálních derivátů karboxylových kyselin se rozumí jak racemické směsi, tak směsi, které jsou alespoň obohaceny o jeden z možných enantiomerů.

Pod pojmem deriváty karboxylových kyselin se s výhodou rozumí směsi enantiomerů chirálních esterů karbóxylových kyselin s chirálním centrem v kyselé části molekuly, zvláště výhodné jsou 2-substituované estery alkankyselin, zejména estery kyseliny 2-halogenpropionové.

Jako produkty hydrolyzy vznikají odpovídající kyseliny karboxylové nebo thiokarboxylové a alkoholy, aminy, thioly apod., přičemž požadovaným reakčním produktem, který je

- získán a izolován může být jak karboxylová ykselina, tak alkoV hol, amin, thiol apod.

Při provádění způsobu podle vynálezu se nejprve rozpustí derivát karboxylové ykseliny v organickém rozpouštědle, jen omezeně mísitelném s vodou. Jako organické rozpouštědlo je možno použít například uhlovodíky, jako pentan, hexan, benzen nebo toluen, halogenované uhlovodíky, jako methylenchlorid, chloroform, tetrachlormethan, ethylenchlorid, chlorbenzeny nebo ethery, jako diethylether, diisopropalether nebo směsi takových rozpouštědel. Výhodnými rozpouštědly jsou ethery, zvláště diisopropylether. Volba rozpouštědla může mít značný význam vzhledem k tomu, že v určitém rozpouštědle může reakce probíhat rychleji než v jiném rozpouštědle. Za určitých okolností může být výhodné přidat k organickému roz4 pouštědlu malé množství pomocného organického rozpouštědla, které je s vodou mísitelné, například alkoholu, jako methanolu, ethanolu, isopropanolu nebo ketonu, například acetonu ke zvýšení rozpustnosti derivátu karboxylové kyseliny v organickém rozpouštědle. Přidané množství pomocného rozpouštědla však musí být tak malé, aby organické rozpouštědlo po přidání pomocného rozpouštědla nebylo s vodou mísitelné bez omezení. Rozpouštědlo pro určitou reakci zvolí snadno každý odborník na základě jednoduchých předběžných pokusů.

Roztok výchozí látky v organickém rozpouštědle má být pokud možno koncentrovaný, přičemž koncentrace výchozí látky v určitém rozpouštědle je závislá jak na této látce, tak na použitém rozpouštědle.

Organický roztok výchozílátky se pak nasytí vodou.

K nasycení vodou se organický roztok uvede do styku buď se systémem, obsahujícím vázanou vodu a schopným tuto vodu uvolnit při styku s organickým, rozpuštědlem, nebo s vodnou fází.---------Systémy, které obsahují vázanou vodu jsou například hydrogely, například polyakrylamidové gely,'polysacharidové gely apod. K organickému roztoku se přidá takové množství vázané vody, které je dostatečné pro nasycení roztoku vodou, přičemž pod pojmem voda se rozumí jak čistá vody, tak také roztoky pufru nebo solí. Množství použitého hydrogelu závisí na jeho schopnisti vázat vodu, tak také na mísitelnosti organického rozpouštědla s vodou.

Jako vodná fáze padá v úvahu čistá voda, roztok pufru nebo také vodný roztok solí. Z pufrů se s výhodou užije takový pufr, v němž je možno dosáhnout vysoké reakční rychlosti a vysoké specifičnosti působení použité hydrolázy. K nasycení vodou se organický roztok vlije přímo do vodné fáze nebo se s vodou fází smísí a pak se nechá ustát, čímž se vytvoří dvě fáze.

Pak se roztok, nasycený vodou, uvede do styku s hydrolázou.

Z hydroláz se volí určitá vhodná hydroláza v závislosti na výchozí sloučenině a na požadovaném výsledném produktu. Příkladem hydroláz mohou být esterázy, proteázy, amidázy apod. Účelné je v závislosti na požadované přeměně použít takovou hydrolázu, při jejímž použití je možno reakci uskutečnit pokud možno specificky, v případě chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové kyseliny pokud možno ste..reospecificky. S výhodou se při provádění způsobu podle vynálezu použije lipáza. Výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že hydrolázu není zapotřebí chemicky modifikovat ke zvýšení její tolerance vzhledem k organickému rozpouštědlu. Jinak je však možno při provádění způsobu podle vynálezu .použít také chemicky modifikované hydrolázy.

Hydrolázu je možno použít jako takovou, adsorbovanou na nosiči, například na celitu, silikagelu,’hlinkách, skleněných perlách nebo také v imobilizované formě. S výhodou se hydroláza adsorbuje na inertní nosič, zvláště na celit, přičemž k adsorpci hydrolázy na celit stačí jednoduché promísení hydrolázy s celitem.

Podstatnou výhodou způsobu podle vynálezu je skutečnost, že hydrolázu není zapotřebí použít v imobilizovaném stavu vzhedem k tomu, že není rozpustná v organických rozpouštědlech .

V případě, že se k nasycení organického roztoku vodou užije hydrogél, obsahující vodu, přidává se hydroláza přímo do roztoku, nasyceného vodou, nacházející se v hydrogelu. Při styku roztoku, nasyceného vodou s hydrolázou dojde k hydrolyze v rozsahu, specifickém pro enzym a se selektivitou, specifickou pro použitý enzym, přičemž se voda, spotřebovaná při hydrolyze, doplňuje z hydrogelu, takže organický roztok zůstává nasycen vodou.

V případě, že se užije chirální nebo prochirální derivát karboxylové kyseliny, nechá se reakce probíhat až do požadovaného stupně přeměny, který je možno sledovat při použití optické otáčivosti.

Po dosažení požadovaného stupně přeměny se enzym a hydrogel odfiltrují. Pak je možno roztok zpracovat v závislosti na požadovaném produktu, produkt je možno získat a/nebo Čistit některým z běžným způsobů, například extrakcí, překrystalováním, destilací nebo chromatografii.

V případě, že se k nasycení organického roztoku vo— dou užije vodná fáze, uloží se hydroláza do reakční nádoby, nspříklad do sloupce a organický roztok, nasycený vodou se čerpá nádobou přes hydrolázu, takže se hydroláza nedostává do styku s vodnou fází.

Při styku organického roztoku, nasyceného vodou, s hydrolázou dochází k hydrolyze, specifické pro použitý enzym v rozsahu a se stereospecifičností, rovněž odpovídající použitému enzymu. Přitom se organický roztok, nasycený vodou vede přes hydrolázu kontinuálně a nakonec se vede vodnou fází vzhledem k tomu, že při jednorázovém styku hydrolázy s reakčnim roztokem není obvykle možno dosáhnout požadovaného stupně přeměny. Vzhledem k tomu, že hydrolázy obvykle mají schopnost přeměnit oba enantiomery opticky aktivního derivátu karboxylové ykseliny, přičemž však k přeměně jednoho

Ί

z. enantiomerů dochází přednostně, obvykle se při použití chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové kyseliny postupuje tak, že se kontinuálně měří optická otáčivost reakčního roztoku, která představuje údaj o přebytku určitého enantiomeru a reakce se přeruší po získání pro hydrolázu výhodnějšího enantiomerů, čímž je možno získat v podstatě čisté enantiomerní produkty.

Při kontinuálním čerpání organického, vodou nasyceného roztoku přes enzym je zapotřebí dbát toho, aby byl roztok při styku s enzymem stále nasycen voodu. Vzhledem k tomu, že se v průběhu hydrolyzy na 1 mol rozštěpené sloučeniny spotřebuje 1 mol vody, je nutno toto množství vody opět nahradit, a to předtím, než je organický roztok opět uveden do styku s hydrolázou.

Spotřebovanou vodu je možno nahradit například tak, že se organický roztok po styku s hydrolázou vede přes bazické, hydroxidové ionty obsahující sloučeniny, uložené například ve sloupci. Tím vznikne na 1 mol karboxylové kyseliny 1 mol vody a 1 mol soli karboxylové kyseliny, čímž dochází k náhradě vody, spotřebované při hydrolyze'a roztok zůstává nasycen. Z basických sloučenin je možno použít například iontoměniče v OH-formě, hydroxidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin apod.

Po výstupu ze sloupce již roztok neobsahuje žádnou, při enzymatické reakci vytvořenou karboxylovou kyselinu vzhledem k tomu, že tato kyselina zůstává vázána na bazickou sloučeninu, roztok je však znovu nasycen vodou tvorbou 1 molu vody na 1 mol soli karboxylové kyseliny. Reakční roztok se tak dlouho přečerpává kontinuálně přes hydrolázu a pak přes sloupec s obsahem sloučenin s hydroxylovými ionty, až je dosaženo požadovaného stupně přeměny. Organický reakční roztok je však možno k nasycení vodou po styku s hydrolázou vést také vodnou fází nebo je možno jej s vodnou fází smísit a nechat usadit, jako vodná fáze padá v úvahu čistá voda, roztok pufru nebo roztoky solí. S výhodouse pH vodné fáze,které stykem s kyselinou, vytvořenou při reakci klesá, udržuje přidáváním baze na stálé hodnotě. Hodnota pH by neměla klesnout pod 3 ani stoupnout nad 11. Výhodná hodnota pH je v rozmezí 5 až 10, zvláště 6 až 8.

baží je možno použít běžné baze, obvykle užívané k neutralizaci, například hydroxidy, uhličitany nebo hydrogenuhličitany alkalických kovů nebo kovů.alkalických zemin, amoniak apod., přičemž s výhodou se užijí hydroxidy alkalických kovů, jako hydroxid draselný nebo sodný. Bázi je možno užít ve formě vodného roztoku, s výhodou při použití zařízení pro měření pH, například vodíkové elektrody, s výhodou pracujícího automaticky. Přidáním baze dojde k vytvoření soli karboxylové kyseliny s přidanou baží a tato sůl zůstává ve vodné fázi, takže je možno vytvořenou karboxylovou kyselinu po dosažení rovnovážného stavu hydrolyzy oddělit, organický roztok se oddělí od vodné fáze v důsledku své omezené mísitelnosti s vodou a současně dochází k jeho nasycení vodou. Organický roztok, nasycený vodou, se pak opět vede přes hydrolázu. Tento postup se opakuje tak dlouho, dokud se nedosáhne požadovaného stupně přeměny. Pak se reakce přeruší a reakční produkty se izolují a popřípadě čistí.

Karboxylové kyselina, která se v průběhu postupu vytvoří se oddělí svrchu uvedeným způsobem ve formě soli a po okyselení a popřípadě po extrakci je možno ji oddělit a pak čistit destilací, chromatograficky nebo překrystalováním.

V případě, že požadovaným produktem není vznikající karboxylové kyselina, nýbrž druhý produkt hydrolyzy, to zna9 mená například alkohol, amin, thiol nebo jsou požadovanými produkty jak karboxylové kyselina, tak-alkohol, amin nebo thiol nebo v případě, že se při sycení vodou nepřidává k organickému reakčnímu roztoku žádná baze, je možno požadované produkty po ukončení reakce z organického reakčního roztoku získat běžným způsobem, například extrakcí, destilací, krystalizací nebo překrastalováním, popřípadě chromatograficky a obdobným způsobem je možno získané produkty teké dále čistit.

Neočekávaně se ukázalo, že enzymatickou účinnost hydrolázy je po proběhnutí jednoho reakčního cyklu a před začátkem druhého reakčního cyklu možno podstatně zvýšit' propláchnutím chloroforemem, nebyl-li chloroform již užit jako * organické rozpouštědlo pro derivát karboxylové ykseliny.Tak například bylo možno specifickou účinnost lipázy po několik reakčních cyklů zvýšit z hodnoty 138 na 339 mMol za hodinu v 1 gramu enzymu, přičemž účinnost lipázy zůstávala konstantní.

j Způsob podle vynálezu se s výhodou provádí při teplotě, při níž je účinnost lipázy nejvyšši. Tyto teploty leží obecně v rozmězí 0 až 40 °C , s výhodou v rozmezí 20 až 30 °C, a zvláště výhodné je provádět reakci při teplotě místnosti, ve zvláštních případech je možno použít také vyšších teplot, avšak vždy nižších, než je teplota varu rozpouštědla a nižší než je teplota deaktivace použité hydrolázy.

Způsob podle vynálezu je možno provádět kontinuálně nebo diskontinuálně, s výhodou se provádí kontinuálně.

V případě, že při použití chirálního nebo prochirálního derivátu karboxylové ykseliny není přebytek jednoho z enantiomerů v produktu, získaném působením hydrolázy dostatečný vzhledem k nízké stereospecifičnosti hydrolázy, je možno produkt, získaný po jednom reakčním cyklu znovu převést na derivát karboxylové kyseliny a znovu jej zpracovat způsobem podle vynálezu tak dlouho, až bude dosaženo dostatečného obohacení produktu o požadovaný enantiomer. Někdy je pro dosa žení vyšší čistoty enantiomerů účelné reakci přerušit již po krátké době jejího průběhu, a tím i při malém podílu přeměny výchozí látky.

Při zvláštním provedení způsobu podle vynálezu se postupuje tak, že se opticky aktivní derivát karboxylové kyseliny, zejména opticky aktivní ester akrboxylové kyseliny, obsahující střed chirality v kyselé části molekuly (přičemž požadovaným produktem je jeden z enantiomerů opticky aktivní karboxylové ykseliny), rozpustí v diisopropyléteru nebo v toluenu na pokud možno koncentrovaný roztok a v zásobníku, v němž se jako předloha nachází vodná fáze se za míchání s vodnou fází sytí vodou. Organická fáze, nasycená vodou se pomocí čerpadla ze zásobníku vede přes lipázu, adsorbovanou na inertní nosič a uloženou vně zásobníku s výhodou ve sloup ci, takže lipáza se nedostává do styku s vodnou fází v zásob niku. Tím dojde k hydrolyze, specifické pro použitý enzym. Organický reakční roztok se pak přivádí zpět. do vodné fáze v zásobníku. Přitom se pH vodné fáze, které klesá v důsledku přívodu vytvořené karboxylové ykseliny, udržuje přidáváním vodného roztoku hydroxidu sodného nebo draselného na hodnotě přibližně 7. Tím se z karboxylové ykseliny vytvoří sůl, která zůstane ve vodném roztoku. Uvolněný alkohol a nezreagovaná výchozí látka zůstanou rozpuštěné v organickém reakčním roztoku, který se v důsledku Své omezené mísitelnosti s vodou oddělí od vodné fáze v zásobníku a v tomto okruhu se tak dlouho vede přes hydrolázu a pak zpět do vodné fáze, až je dosaženo požadovaného stupně přeměny. Pak se reakce přeruší a vodná fáze se oddělí od organické fáze. K izolaci vytvořené karboxylové kyseliny se vodná fáze okyselí podle potřeby a uvolněná karboxylová kyselina se extrahuje. Pak může ná11 sledovat čištění překrystalováním, destilací nebo chromatografií, čímž je možno dosáhnout dalšího obohacení o požadovaný enantiomer.

Ve zvláště výhodném provedení způsobu podle vynálezu zuse destilovaná voda užije jako předloha v zásobníku a za míchání se přidá roztok enantiomerní směsi esteru karboxylové kyseliny, substituovaného v poloze 2 kyselé části, s výhodou atomem halogenu, s výhodou jde o roztok v isopropylétěru, načež se směs nechá usadit. Pak se organická fáze vede kontinuálně přes lipázu, adsorbovanou na celit vně zásobníku ve sloupci, pak se organická fáze přivádí zpět do vodné'fáze v zásobníku, přičemž se hodnota pH vodné fáze udržuje přidáváním vodného roztoku hydroxidu alkalického kovu v rozmezí 6 až 9. Vodnou fázi je také možno ze zásobníku vyjmout a nahradit čerstvou vodnou fází. Také organickou fázi, která obsahuje převážně enzymem nerozštěpené enantiomery chirálního esteru karboxylové ykseliny a vytvořený alkohol je možno po dosažení požadovaného stupně přeměny ze zásobníku vyjmout a nahradit čerstvou organickou fází. Čistý nebo obohacený enantiomer opticky aktivní karboxylové kyseliny je možno z vodného roztoku získat okyselením a extrakcí vodného roztoku organickým rozpouštědlem, rozpouštějícím karboxylovou kyselinu.

Způsobem podle vynálezu je možno snadno podrobit enzymatické hydrolyze derivát karboxylové kyseliny v organickém rozpouštědle a získaný produkt snadno izolovat, přičemž enzym není nutno užít v imobilizované formě, zejména je možno enantiomerní směs chirálni výchozí látky převést popřípadě při použití většího počtu reakčních cyklů na vysoce obohacené enantiomery opticky aktivní sloučeniny, přičemž rozpouštědlo je možno opakovaně použít, současně nedochází k prakticky žádným ztrátám enzymu nebo ztrátám jeho účinnosti v průběhu delšího časového období a také nevznikají žádné od12 padni produkty, které by byly škodlivé pro životní prostředí a které by bylo zapotřebí znovu zpracovávat nebo odkládat jako škodlivý odpad. Způsob podle vynálezu tedy představuje podstatný technický pokrok.

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno následujícími příklady

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

20,05 g enantiomerní směsi 5,51 g 2-ethylhexylesteru kyseliny S-2-brompropionové a 14,44 g odpovídajícího R-isomeru se rozpustí v diisopropyléteru na 170 ml roztoku. Přebytek použitého R-enantiomeru je 44 %, směs byla vyrobena esterifikací odpovídající směsi enantiomerů kyseliny 2-brompropionové působením 2-ethylhexanolu. Vzniklý roztok se vlije do 140 ml vody s 5,5 ml ethanolu, který se nachází v zásobníku jako předloha.

Vytvoří se dvě fáze. Vodou nasycená organická fáze se pomocí čerpadla vede přes 1,5 g lipázy z Candida cylindracea, uložené s 12 g celitu ve sloupci vně zásobníku, roztok se čerpá rychlostí 100 ml/min. Po průchodu sloupcem se organický roztok přivádí zpět do vodné fáze v zásobníku. Hodnota pH vodné fáze se automaticky udržuje přidáváním 2 M vodného roztoku hydroxidu sodného na hodnotě 5 až 8. Tím se vytvoří sodná sůl kyseliny 2-brompropionové, vytvořené při reakci a tato sůl zůstává ve vodném roztoku, zatímco se organický reakční roztok sytí vodou a pak oddělí od vodné fáze v zásobníku. Znovu vodou nasycený organický roztok se znovu kontinuálně vede přes lipázu a pak opět přes vodnou fázi.

Po 0,5 hodině se spotřebuje 2,05 ml, po 1 hodině 5,85 ml

2M vodného roztoku hydroxidu sodného a dosáhne se stupně pře13 měny 15 %. Nakonec se vodný roztok okyselí kyselinou sírovou, takto uvolněná kyselina 2-brompropionová se extrahuje diisopropyléterem a izoluje odpařením rozpouštědla. Tímto způsobem se získá 1,65 g směsi enantiomerů kyseliny R- a S-2-brornpropionové s optickou otáčivostí (alfa)p°+25,4 °, což odpovídá přebytku 90,4 % R-enantiomeru, směs tedy obsahuje 0,08 g S- a 1,57 g R-2-brompropionové kyseliny. Specifická účinnost lipázy je 5,2 mMol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklady 2 až 10

Příklady 2 až 7 byly provedeny obdobným způsobem jako příklad 1 při použití téže lipázy Candida cylindracea jako v příkladu 1, reakční doba byla prodloužena až na 4 ho‘ diny a reakce byla přerušena po dosažení stupně přeměny přibližně 44 %. Sloupec s obsahem lipázy Candida cylindracea byl po každém reakčním cyklu promyt diisopropyléterem.

Příklady 8 až 10 byly provedeny obdobným způsobem, jako příklad 1, bylo však užito šestinásobného množství enantiomerní směsi 2-ethylhexylesteru ykseliny 2-brompropionové, diisopropyléteru, vody a ethanolu při použití téže lipázy Candida cylindracea jako v příkladech 1 až 7. Sloupec, obsahující lipázu Candida cylindracea byl po každém reakčním cyklu promyt diisopropyléterem. Výsledky, získané svrchu uvedeným způsobem jsou shrnuty v následujících tabulkách 1 a 2.

Tabulka 1

Tabulka uvádí přeměnu výchozí látky v % v průběhu času

P.r i k 1 a d y

h	2	3	4	5	6	7	8	9	10
0,5	7,3		6,3		7,1	5,8	3,3	2,2	1,8
1,0	13,8				14,6
1,5		19,6	20,4	20,5
2,0		24,9		26,2	29,1
2,5	29,9	29,9	32,0	30,4	34,9	27,5	7,3	5,3
3,0		34,7			39,4
3,5	38,9
4,0	42,6		.. 46,6
4,2	43,9	43,9	f	44,2	43,9
4,5						43,9
18,0									35,7
19,0								37,7
20,5							39,4
24,13		..... . -	.................-	— . -	- . .	-------------	44,1	—----------------—
24,25								44,1	44,1

příklad	Tabulka	2
G (g)	alfa (°)	ee (%)	účinnost
2	4,66	+ 27,1	96,4	5,3
3	4,67	+ 26,2	93,2	5,3
4	4,91	+ 26,4	94,0	5,9
5	4,66	+ 28,2	100,4	5,3
6	4,68	+ 25,7	91,5	5,4
7	4,60	+ 28,6	101,3	4,9
8	28,0	+ 27,3	97,2	5,5
9	27,7	+ 27,7	98,6	5,5
10	28,03	+ 28,5	101,0	5,5

Vysvětlivky k tabulce 1 a 2:

G (g): výtěžek v gramech alfa (°): optická otáčivost (alfa)p⁰ ee (%) ; přebytek enantiomerů R- v poměru ke kyselině

S-2-brompropionové účinnost: specifická účinnost lipázy Candida cylindracea v mMolech za hodinu na 1 g lipázy h: doba reakce v hodinách přeměna v %:přeměněný podíl enantiomerní směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-brompropionové v gramech

Příklad 11 g racemické směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-brompropionové se rozpustí ve 150 ml diisopropyléteru. Roztok se pak přidá do zásobníku, v němž se nachází jako předloha 70 ml vody a obě složky se promíchají. Dojde k vytvoření dvou fází. Organická fáze, nasycená vodou se pak přečerpává přes 50 mg lipázy Candida cylindracea ve směsi s 2,8 g celitu ve sloupci vně zásobníku'rychlostí 100 ml/min. Po průchodu sloupcem se organický roztok zpracovává stejným způsobem jako v příkladu 1.

Po 6,22 hodinách bylo dosaženo stupně přeměny 29,17 % a reakce byla přerušena. Tímto způsobem bylo získáno 4,4 g enantiomerní směsi kyseliny R- a S-2-brompropionové s optickou otáčivostí (alfa)^ +20,6 , což odpovídá přebytku

R-enantiomeru 73,3 %.

Specifická účinnost lipázy byla 70,78 mmol za hodinu na 1 g lipázy.

Příklady 12 až 17

Postup byl prováděn obdobným způsobem jako v příkladu 11 při použití stejných výchozích množství složek, avšak sloupec, obsahující tutéž lipázu jako v příkladu 11 byl po každém průchodu roztoku promyt chloroformem.

Výsledky, získané tímto způsobem jsou uvedeny v následující tabulce 3

Tabulka 3

Příkl. č.	přeměna %	čas h	alfa (°)	ee (%)	účinnost
12	29,8	3,25	+21,6	76,9	138,5
13	30	1,75	+22,1	78,6	258,3
14	29,8	2,23	+21,3	75,8	236,8
15	30 )	1,58 ~	+ 22,7	80,8	285,5
16	30	1,33	+ 20,0	71,2	339,0
17	30	1,80	+ 17,2	61,2	251,1

Příklad 18

Postup byl prováděn obdobným způsobem jako v příkladu 11 při použití 45,1 g racemické směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-brompropionové a 50 mg lipázy Candida cylindracéa. Po 19,25 hodinách bylo dosaženo přeměny na 45 %. Bylo získáno 9,88 g enantiomerni směsi kyseliny Ra S-2-brompropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^° +21,5 oož odpovídá 76,5% přebytku R-enantiomeru.

Příklad 19

Kyselina 2-brompropionová, získaná v příkladu 18 byla chemicky esterifikována 2-ethylhexanolem. Vzniklý ester byl uveden do reakce s lipázou způsobem podle příkladu 18 při použití téže lipázy. Tímto způsobem bylo po 15,25 hodinách dosaženo stupně přeměny 72,3 %. Bylo získáno 5,62 g směsi enantiomerů kyselina R- a S-2-brompropionové s hodnotou op20 tické otáčivosti (alfa)^ +26,4, což odpovídá 94% přebytku kyseliny R-2-brompropionové.

fe

Příklady 20 až 25

Příklady 20 až 21, 22 až 23 a 24.až 25 byly prováděny obdobným způsobem jako příklady 18 až 19 při použití téhož
množství výchozích látek a téže lipázy Candida	cylindracea následující výtěžek %
z příkladu 18. Získané výsledky jsou tabulce 4	shrnuty v 4 ee '(%)
Příkl. č.	přeměna %	Tabulka
čas h	alfa(°)
20	53,6	17	+18,7	66,5	12,6
21	63,7	22	+26,2	93,2	8,0
22	42,6.	22	+17,8	63,3	11,1
23	62,9	26,75	+ 26,2	93,2	6,7
24	43,2	25,5	+ 15,9	56,6	11,5
25	57,2	19,5	+ 27,2	96,8	6,5

Příklad 26 g racemické směsi butylesteru ykseliny R- a S-2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyléteru a roztok se přidá do zásobníku, obsahujícího jako předlohu 200 ml vody a složky se promíchají. Vzniknou dvě fáze. Horní organická fáze se se čerpá přes 15 g lipázy Geotrichum candidum, smísené se 60 g celitu a uložené ve sloupci vně zásobníku, rychlost čerpání je 100 ml/min. Organický reakční roztok se pak přivádí zpět do vodné fáze v zásobníku, přičemž pH této vodné fáze se udržuje pomocí automatického zařízení přidáváním 2M vodného roztoku hydroxidu sodného při automatickém měření pH'na hodnotě 6 až 8.Tímto způsobem se vytvoří sodná sůl kyseliny 2-chlorpropionové, vznikající při reakci a tato sůl zůstává ve vodné fázi. organický reakční roztok se od vodné fáze oddělí a kontinuálně se čerpá přes lipázu a pak opět zpět do vodné fáze.

Po 44,5 hodinách se dosáhne stupně přeměny 20,6 % a reakce se přeruší.

Vodný roztok se okyselí přidáním kyseliny sírové a pak se extrahuje chloroformem a organické rozpouštědlo se vysuší síranem sodným a pak se odpaří.

Tímto způsobem se získá 5,3 g enantiomerní směsi kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^Q-12 °, což odpovídá 73,2% přebytku S-enantiomeru této kyseliny.

Příklad 27

55,5 g racemické směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyl19 éteru a pak se přidá do zásobníku, v nměž se nachází jako předloha 200 ml vody zá míchání. Vzniknou dvě fáze. Organická, vodou nasycená horní fáze se vede přes 1 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 10 g celitu ve sloupci vně zásobníku. Pak se postupuje stejně jako v příkladu 1. Po dosažení stupně přeměny 32 % se reakce přeruší. Tímto způsobem se získá enantiomerní směs kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s optickou otáčivostí (alfa)p +6,9 , což odpovídá 42,1% přebytku

R-eanntiomeru. Specifická účinnost lipázy je 11,58 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 28

55,5 g racemické směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny Ra S-2-chlorproppionové se rozpustí ve 360 ml diisopropyletheru a za míchání se roztok přidá do zásobníku, v němž se jako předloha nachází 200 ml vody. Vytvoří se dvě fáze.

Organická, vodou nasycená horní fáze se čerpá rychlostí 100 ml/min přes sloupec, obsahující 2 g lipázy Candida cylindracea, zasítěné působením 2 ml 50% glutaraldehydu v diisopropyletheru a smísené s 13 g celitu. Dále se postupuje stejně jako v příkladu 1.

Po dosažení stupně přeměny 32 % se reakce přeruší. Získá se směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s

Q Λ _ optickou otáčivostí (alfa)^ + 7,3 , což odpovídá 44,5% přebytku R-eanntiomeru. Specifická účinnost lipázy je 4,8 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 29

Při použití 55,2 g racemické směsi enantiomerů 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 400 ml hexanu místo diisopropyletheru a 3 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 21 g celitu se způsobem podle příkladu 26 dosáhne po 19 hodinách stupně přeměny 78,6 %. Tím se získá směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s optickou otáčivostí (alfa)p +2,5, což odpovídá 15,2% přebytku R-enantiomeru. Přebytek S-enantiomeru ve výchozím esteru před zpracováním lipázou byl 56 %.

Příklad 30

Při použití 294,1 g racemické směsi enantiomerů 2-ethyl hexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 100 ml diisopropylet heru a 20 ml acetonu místo čistého diisopropyletheru a 10 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 50 g celitu bylo způso bem podle příkladu 26 dosaženo stupně přeměny 57 %. Tím byla získána směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorprůpionové s hodnotou optické otáčivostí (alfa)^°+6,l °, což odpovídá 37% přebytku R-enantiomeru.

Příklad 31 ........

Při použití 57,2 g racemické směsi enantiomerů fenylethylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové v roztoku ve 400 ml diisopropyletheru a 3 g lipázy Candida cylindracea ve smě si s 15 g celitu bylo dosaženo způsobem podle příkladu 26 po 1,30 hodinách stupně přeměny 60 %. Tímto způsobem byla získána směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivostí (alfa)‘ +6,1, což odpovídá 37% přebytku R-eanntiomeru.

Specifická účinnost lipázy je v tomto případě 41,7 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 32

Postupuje se způsobem podle příkladu 31 při použití 159 g racemické směsi enantiomerů fenylethylesteru ykseliny R- a S-2-chlorpropionové jako výchozího materiálu v roztoku ve 400 ml diisopropyletheru a užije se tatáž lipáza jako v příkladu 31, která byla propláchnuta diisopropyletherem. Po 4,12 hodinách bylo dosaženo stupně přeměny 57 % a reakce byla přerušeny. Tímto způsobem byla získána směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčí20 vosti (alfa)^ +5,3, což odpovídá 32,3% přebytku R-enantiomeru uvedené kyseliny.

Příklady 33 až 35 g racemické.směsi enantiomerů butylesteru kysleiny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 360 ml rozpouštědla s roztok se za míchání přidá do zásobníku, v němž se jako předloha nachází 200 ml vody. Vytvoří se dvě fáze. Organická fáze, nasycená vodou se čerpá přes sloupec, obsahující 3 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 9 g celitu tak dlouho, až se dosáhne stupně přeměny 33 %. Pak se postupuje způsobem podle příkladu 1. Získané výsledky jsou shrnuty v následující tybulce:

Příklad	Rozpouštědlo	účinnost	spec. otáčivost
33	di isopropylether	27,18	+5,4
34	•n-heptan	12,78	+5,2
35	chloroform	2,17	+5,6

„ - - PO specifická otacivost je uvedena jako (alfa)^ účinnost je uvedena v mmol za hodinu na 1 gram lipázy

Příklad 36

55,2 g racemické směsi enantiomerů 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 400 ml diisopropyl etheru a za míchání se roztok přidá do zásobníku, obsahující ho jako předlohu 200 ml vody. Vytvoří se dvě fáze. Organická fáze, nasycená vodou se vede přes 6 g lipázy Humicola lanugi nosa ve směsi s 20 g celitu. Dále se postupuje stejně jako v příkladu 1. Po 25 hodinách se dosáhne stupně přeměny 32,4 % a reakce se přeruší.

Tímto způsobem se získá směs enantiomerů kyseliny R- a 20

S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)_D +8,9 °, což odpovídá 54,3% přebytku R-enantiomeru. Specifická účinnost lipázy je 0,54 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 37

Postupuje se stejně jakov příkladu 36při použití stěj riých výchozích látek a při použití téže lipázy jako v příkla du 36 po opakovaném propláchnutí sloupce s obsahem enzymu diisopropyletherem. Po 48 hodinách bylo dosaženo stupně přeměny 64,8 % a reakce byla přerušena. Tímto způsobem se získá směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^ +4,7 , což odpovídá 28,7% přebytku R-eanntiomeru. Specifická účinnost lipázy byla 0,56 mmol za hodinu na jeden gram liipázy.

Příklad 38

Při použití organické fáze z příkladu 37, obsahující 19,4 g 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové a lipázy Pseudomonas fluorescens ve směsi s 12,5 g celitu se postupuje způsobem podle příkladu 36 a po 8,6 hodinách se dosáh —

ne přeměny 35,8 %. Tímto způsobem se získá směs„enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)2θ-12,6 °, což odpovídá 76,8% přebytku S-enantiomeru. Specifická účinnost lipázy byla 1,48 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 39

Při použití 102,5 g enantiomerní směsi 2-ethylhexylesteru kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s přebytkem 58,5 % Senantiomeru, získané esterifikací odpovídajících enantiomerů kyseliny 2-chlorpropionové působením 2-ethylhexanolu a 4,8 mg lipásy Chromobacterium viscosum ve směsi s 10 g celitu bylo dosaženo způsobem podle příkladu 36 stupně přeměny

22,5 %. Tímto způsobem bylo získáno 4,7 g směsi enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčíO/“V λ vosti (alfa)_D -12,9 , což odpovídá 78,7% přebytku S-enantiomeru. Specifická účinnost lipázy byla 1,04 mol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 40

57,6 g recemické směsi enantiomerů z příkladu 27 se zpracovává způsobem, uvedeným v příkladu 27 s tím rozdílem, že se postup provádí při teplotě 0 ±1,5 °C při použití 6 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 24 g celitu, tímto způsobem se v průběhu 5 hodin dosáhne přeměny 70 % a získá se směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropionové a hodnotou optické otáčivosti (alfa)|°+4,3 °, což odpovídá 26% přebytku R-enantiomeru. Specifická účinnost lipázy je v tomto případě 5,83 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Příklad 41

Postupuje.se způsobem podle příkladu. 40avšak užije ..

se teploty 10 °G, čímž se po době 2,8 hodin dosáhne stupně přeměny 70 %. Specifická účinnost lipázy je 10,3 mmol za ho20 dinu na 1 gram lipázy. Hodnota optické otáčivosti (alfa)^ získané směsi enantiomerů je + 4,4

Příklad 42

56,6 g racemické směsi enantiomerů 2-ethylhexylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí ve 400 ml diisopřopyletheru, nasyceného vodou a uloží do zísobníku. Tento roztok se pak čerpá přes 3 g lipázy Candida cylindracea ve směsi s 15 g celitu. Takto získaný reakční roztok se pak přečerpává přes sloupec, obsahující směs 10 g hydroxidu vápenatého a 20 g celitu. Vzhledem ke tvorbě soli zůstává kyselina 2-chlorpropionová, vytvořená při reakci ve sloupci a současně docházi v organickém roztoku k náhradě vody, spotřebované při hydrolýze. Dále probíhá reakce kontinuálně svrchu uvedeným způsobem, po čtyřech hodinách se dosáhne stupně přeměny 34,3 %. Tímto způsobem se získá směs enantiomerů kyseliny R- a S-2chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^ +7,0 , což odpovídá 43% přebytku R-enantiomeru.

Příklad 43

6,59 g racemické směsi enantiomerů butylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí v 75 ml diisopropyletheru a roztok se smísí s 1,6 ml pufru s fosforečnanem sodným o pH 7, s 0,1 g Sephadexu G50 (Pharmacia), nabobtnaném předem ve vodě, 6 g celitu a 6 g lipázy Geotrichum candidum a výsledná směs se míchá přiteplotě místnosti. Po 168,8 hodinách se dodáhne stupně přeměny 37,4 % a reakce se přeruší. Tímto způ-..25 sobem se získá směs enantiomerů kyseliny R.- a S-2-chlorpro20 o pionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^ -8,8 , což odpovídá 53,7% přebytku S-enantiomeru.

Příklad 44

Postupuje se obdobným způsobem jako v příkladu 43, avšak užije se 15 g racemické směsi enantiomerů propylesteru kyseliny 2-chlorpropionové, 5 g lipázy Geotrichum candidum, g celitu, 2,5 ml 10 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 7, 340 mg Hydrogelu Evergreen 500 (Chemie Linz AG), předem nabobtnaného ve vodě, po 118,5 hodinách se dosáhne přeměny .24,5 %. Tímto způsobem se získá směs enantiomerů kyseliny , R- a S-2-chlorpropionové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)^ +3,0 , což odpovídá 18,3% přebytku R-enantiomeru uvedené kyseliny.

Příklad 45

Postupuje se způsobem, popsaným v příkladu 43, avšak místo Saphadexu G 50 se použije 0,1 g Hydrogelu Evergreen 500 (Chemie Linz AG), předem nabobtnaného ve vodě, čímž se po 46,8 hodinách dosáhne stupně přeměny 24 %. Tímto způsobem se získá směs enantiomerů kyseliny R- a S-2-chlorpropio20 o nové s hodnotou optické otáčivosti (alfa)p -11,7 , což odpovídá 71,3% přebytku S-enantiomeru uvedené kyseliny.

Příklad 46

6,58 g racemické směsi enantiomerů butylesteru kyseliny 2-chlorpropionové se rozpustí v 50 ml diisopropyletheru a roztok se smísí s 1 g celitu, 0,1 g Sephadexu G50 (Pharmacia) předem nabobtnaného ve vodě, 0,8 g 10 mM pufru s fosforečnanem sodným o pH 7 a 0,8 g lipásy Candida cylindracea a výsledná směs se míchá při teplotě místnosti. Po 1,75 hodině se dosáhne stupně přeměny 34,5 %. Reakce se přeruší a hydrogel a lipáza se odfiltrují. Reakční roztok obsahuje směs enantiomerů kyseliny R- a S-2.chlorpropionové s hodnotou optické 20 otáčivosti (alfa)p +4,3, což odpovídá 26,2% přebytku R-enantiomeru. Specifická účinnost lipázy je 9,86 mmol za hodinu na 1 gram lipázy.

Uváděné hodnoty specifické optické otáčivosti pro pro20 dukty ze všech příkladů (alfa)_D byly naměřeny při vlnové délce 589 nm (sodíková D-čára), při teplotě 20 °C a při c=l v chloroformu.

Jako celit byl ve všech příkladech užit celit Hyflo Super-Cel (Fluka) s velikostí částic 2 až 25 mikrometrů.

Příklady 47-52

Vždy 7,0 g racemické směsi enantiomeřů 1-fenylethylesteru kyseliny R- a S-oktanové se rozpustí ve 300 ml diisopropyl etheru a roztok se přidá za míchání do zásobníku, v němž se jako předloha nachází 200 ml vody. Vytvoří se dvě fáze. Organická, vodou nasycená fáze se stejně jako v příkladu 1 čerpá přes sloupec, obsahující 3 g lipázy Candida cylindracéa (Meito) ve směsi s 22 g celitu, tato lipáza byla užita pro všechny příklady 47 až 52. Hodnota pH vodné fáze byla stejně jako v příkladu 1 udržována na hodnotě 5 až 8. Po dosažení stupně přeměny 30 % se vodná fáze extrahuje diisopropyletherem a reakce se přeruší. Po odpaření diisopropyletheru se z odparku izoluje destilací ve vakuu 1-fenylethanol. Takto získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 5.

Tabulka.. 5

Příkl. č	přeměna %	doba h	alfa (°)	ee (%)	účinnost
47	32	22,0	41,1	92	0,137
48	30	22,0	-	-	0,128
49	31	23,0	41,2	92	0,127
50	26	20,5	-	-	0,119
51	29	24,5	-	-	0,111
52	29	26,5	39,7	88	0,103
účinnost	: specifická účinnost lipázy v mmol za hodinu na 1 gram	Candida lipázy	cylindracea
alfa:	hodnota optické otáčivosti délce 589 nm, při 20 °C, c··	, měřená při vlnové =1 v methanolu
ee:	přebytek	R-l-	fenylethanolu	oproti S	-isomerů
- :	reakční	roztok nebyl zpracován

Zastupuje:

Or. zdenk/korejzova o

- 28 •Z/d ?- ‘7 “σ χ><

C r— 73 > C7 to c·

Z. ^: o Ύ Ó o

o czx

Claims

NÁROKY derivátů karboxylových t í m. že se derivát

PATENTOVÉ

1. Způsob enzymatické hydrolyzy kyselin, vyznačující se karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouštědle, jen omezeně mísitelném s vodou, pak se roztok nasytí vodou a uvede se do styku s hydrolázou, přičemž se voda, spotřebovaná hydrolýzou nahrazuje opětným sycením organického rozpouštědla vodou a organický roztok se znovu uvádí do styku s hydrolázou až do dosažení požadovaného stupně přeměny.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se organická fáze sytí vodou při použití hydrogelu, obsahujícího vodu.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se t í m,. že se po hydrolyze organické rozpouštědlo opět sytí vodou vedením reakčního roztoku přes látky, obsahující hydroxidové ionty, přičemž se vytvořená karboxylová kyselina odvádí a vody, spotřebovaná při hydrolyze se - nahrazuje.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se derivát karboxylové kyseliny rozpustí v organickém rozpouštědle a vzniklý organický roztok se přivádí do vodné fáze v zásobníku, přičemž se organický roztok sytí vodou a oddělí se od vodné fáze, načež se organický roztok,nasycený vodou čerpá přes reakční nádobu s obsahem hydrolázy a vytvořený organický reakční roztok se převádí zpět do vodné fáze v zásobníku, jejíž pH se udržuje na stálé hodnotě přidáváním baze a vytvořená karboxylová kyselina zůstává ve vodné fázi ve formě soli s přidanou baží a z vodné fáze se odvádí, kdežto organická fáze se znovu sytí vodou, oddělí se od vodné fáze a pak se opět tak dlouho přečerpává přes hydíl rolázu a pak opět přes vodnou fázi, až se dosáhne požadované ho stupně přeměny.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačující se tím, že se hydroláza po ukončení reakčního cyklu propláchne chloroforemem před použitím v následujícím reakčním cyklu
6. Způsob podle nároku I až 5, vyznačuj íc i se t i m, že se užije chirální nebo prochirální derivát karboxylové kyseliny.
7. Způsob podle nároků 1 až 6, vyznačuj íc-í se t i m, že se užije směs enantiomerů es^ru halogenpro, pionové kyseliny.
8. Způsob podle nároků 1 až 7, vyznačuj íc i se t i m, že se jako organické rozpouštědlo užije ether.
9. Způsob podle nároků 1 až 8, vyznačuj ící ·' s e tím, že se jako hydroláza užije lipáza.
10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačuj ící se t i m, že se užije hydroláza, adsorbovaná na nosiči.

Zastupuje: