HUT62940A - Process for the enzymatic hydrolysis of carboxylic acid derivatives - Google Patents

Description

A találmány olyan eljárásra vonatkozik, ami szerves karbonsavszármazékoknak valamilyen szerves oldószerben történő

I

- 2 enzimatikus hidrolízisére szolgál.

Igen nagy számú enzim képes karbonsavszármazékok többé-kevésbé specifikus hidrolizálására. A hidrolázok ezen tulajdonságát már hosszú ideje gazdaságilag hasznosítják. Ennek során figyelembe kell venni azt, hogy a hidrolázok normális körülmények között vizes oldatokban jó átalakítási fokkal működjenek és csak mérsékelt aktivitási veszteségük legyen, továbbá hogy vízben mégiscsak oldhatók, de vizes reakcióoldatokból csak ritkán lehetséges ezeket visszanyerni és újból felhasználni. A kovalens immobilizált hidrolázokat vizes oldatokból ugyan ismételten vissza lehet nyerni, de ezek átalakítási képessége már mérsékeltebb, aktivitásuk pedig rosszabb, mint az azonos mennyiségű hidrolázé, melyet nem immobilizált formában alkalmaznak. Ehhez hozzájön még az is, hogy az enzimimmobilizátumokból mindig enzim is kioldódik vizes rendszerekben.

Ezért már végeztek kísérleteket arra is, hogy enzimmel történő hidrolizálási műveleteket valamilyen szerves közegben valósítsanak meg. így a Pakistan Journal of Biochemistry, Vol. 10, Nr. 2, 1976 irodalmi helyen ismertetésre került, hogy karbonsav-észterek hidrolízisénél a kezdeti hidrolizisse.besség szerves közegben némely esetben magasabb értékű lehet, mint vizes közegben, mindamellett a hidroláz aktivitása szerves közegben gyorsan csökken, mivel a hidrolázok a szerves oldószerekkel szemben érzékenyek.

A Chemical Abstracts Vol. 112, 15438? z irodalmi helyen

J

- 5 ezért a hidrolázok kémiai módosítására tesznek javaslatot, hogy szerves oldószerekkel szembeni toleranciájukat növeljék.

A Chemical Abstracts Vol. 109, 188852η irodalmi helyen ismertetnek egy enzimatikus hidrolízist, melyet vizzel telitett benzolban végeznek, kémiailag módosított hidrolázzal.

Váratlan módon azt találtuk mármost, hogy egy szerves oldószerben valamilyen hidroláz jó átalakítási képesség! fokához, valamint megmaradóan magas szintű aktivitásához nincs szükség a hidroláz kémiai módosítására, ha olyan szerves oldószert alkalmazunk, ami vizzel csak igen kis mértékben elegyedik és egyúttal gondoskodunk arról, hogy a szerves oldószer a hidrolízis folyamán — amikor is a viz felhasználódik — vizzel telitett maradjon.

A találmány tárgya tehát eljárás valamilyen karbonsavszármazék enzimatikus hidrolízisére, azzal jellemezve, hogy a karbonsavszármazékot egy olyan szerves oldószerben oldjuk, ami vizzel csak kis mértékben elegyedőképes, ami után az oldatot vizzel telítjük és ezt egy hidrolázzal hozzuk érintkezésbe, mimellett viz felhasználódása közben hidrolízis következik be és ezután a szerves reakcióoldatot mindaddig ismételten vizzel telítjük és a hidrolázzal érintkezésbe hozzuk, amíg a kívánt átalakulási fokot elérjük.

A találmány szerinti eljárás olyan karbonsavszármazékok hidrolíziséhez alkalmas, melyeket valamilyen hidrolázzal en• · • · · • · ···· ····

- 4 zimatikusan hidrolizálni lehet. Ilyen karbonsavszármazékok például a karbonsav-észterek, -diészterek, -triészterek, a karbonsav-amidok, a karbonsav-tio-észterek stb., vagy pedig a felsoroltakkal analóg tiokarbonsav-származékok. Az eljárásnak különös jelentősége van az olyan karbonsavszármazékok hidrolízisénél, melyek akár a savrészben, akár a származékrészben helyettesítői ke)t hordoznak, ami egy királis centrum előfeltétele, vagy pedig melyekben hidrolízis folytán egy királis centrum keletkezik. Az ilyen királis vagy prokirális karbonsavszármazékokat valamilyen sztereospecifikus hidroláz segítségével optikailag aktív vegyületekké lehet hidrolizálni, melyekben az egyik lehetséges enantiomer — a hidroláz sztereospecifitásának megfelelően — legalábbis fel van dusulva, mimellett a királis karbonsavszármazékok fogalmába a racém elegyeket és az egyik lehetséges izomerre nézve dúsított elegyeket is bele kell érteni.

A karbonsavszármazékok közül előnyösek a királis karbonsav-észterek enantiomerjeit tartalmazó elegyek, különösen azok, melyekben a királis centrum a savrészben van. Kiemelkedően előnyösek a 2-helyzetben szubsztituált alkánkarbonsav-észterek, egészen kiemelkedően a 2-halogén-propionsav-észterek előnyösek.

Ennek megfelelően a hidrolízis termékeként karbonsavakat vagy tiokarbonsavakat, illetve alkoholokat, aminokat vagy tiolokat stb. kapunk, mimellett vagy a karbonsavaknak, vagy ····

- 5 pedig az alkoholoknak, aminoknak vagy tioloknak stb., illetőleg mind a két vegyületféleségnek előállítani kívánt és kinyer hető reakcióterméknek kell lenniük.

A találmány szerinti eljárás megvalósítása során először egy karbonsavszármazékot feloldunk valamilyen szerves oldószerben, amely vízzel csak igen kis mértékben elegyedik. Ilyen szerves oldószerként szolgálhatnak például a szénhidrogének, így a pentán, a hexán, a benzol és a toluol, továbbá a halogén-szénhidrogének, igy a metilén-diklorid, a kloroform, a tetraklór-metán és az etilén-diklorid, valamint az éterek, igy a dietil-éter és a diizopropil-éter, vagy pedig a felsoroltakból álló oldószerelegyek. Előnyös oldószerek az éterek és különösen előnyös a diizopropil-éter. Az oldószer megválasztásánál jelentősége lehet annak, hogy a reakció egy bizonyos oldószerben gyorsabban végbemehet, mint egy másikban. Bizonyos körülmények között előnyös lehet, ha a szerves oldószerhez csekély mennyiségben valamilyen vízzel elegyedő szerves társoldószert is adunk, hogy ezzel a karbonsavszármazék oldhatóságát az alkalmazott szerves oldószerben növeljük. Ilyen társoldószer például egy alkohol, mint pl. metanol, etanol, propanol, vagy valamilyen keton, mint pl. aceton stb. lehet. A hozzáadott társoldószer mennyiségének azonban olyan csekélynek kell lennie, hogy maga a szerves oldószer ezen társoldószer hozzáadásától ne váljon vízzel teljesen elegyedővé. Egy kívánt reakcióhoz szükséges oldószer megtalálása szakember számára egyszerű előkisérletekkel könnyen megoldható feladat.

τ i

- 6 A kiindulási anyagnak szerves oldószeres oldatát a lehető legtöményebben készítjük, mimellett a kiindulási anyag koncentrációja az oldószerben a mindenkori kiindulási anyagtól és az alkalmazott oldószertől függ.

A szerves oldatot ezt követően vízzel telítjük.

Vízzel történő telítés céljából az oldatot vagy egy kötött vizet tartalmazó rendszerrel hozzuk érintkezésbe, amelyképes arra» hogy szerves oldószerrel történő érintkezés során ezt a vizet leadja» vagy pedig az oldatot egy vizes fázissal hozzuk érintkezésbe.

A kötött vizet tartalmazó rendszerek példának okáért víztartalmú hidrogélek, mint pl. poli(akril-amid)-gélek, poliszacharid-gélek stb. lehetnek. A szerves oldathoz olyan menynyiségben adunk megkötött vizet, ami elég arra, hogy az oldatot vízzel telítse, mimellett a viz meghatározás alatt mind tiszta vizet, mind puffer- vagy sóoldatot is érteni kell. Az alkalmazott hidrogél mennyisége egyaránt függ a hidrogél, valamint a szerves oldószer vizfelvevő-képességétöl.

Vizes fázisként a tiszta viz, valamilyen pufferoldat vagy egy vizes sóoldat jön tekintetbe. Pufferoldatként célszerűen olyant alkalmazunk, melyben a hidroláz magas átalakítási aránynyal és nagyfokú specifitással fejti ki hatását. Vízzel történő telítés céljából a szerves oldatot közvetlenül bevezetjük a vizes fázisba, vagy pedig a szerves oldatot valamilyen vizes • « r

- 7 fázissal keverjük, majd hagyjuk leülepedni, amikor is két fázis képződik.

A vízzel telitett oldatot ezt követően egy hidrolázzal hozzuk érintkezésbe.

Hidrolázként a kiindulási anyagtól és a kívánt terméktől függően a mindenkori átalakulás szempontjából megfelelő hidrolázok jönnek tekintetbe. Ezen hidrolázokra példaképpen az észterázokat, a proteázokat, az amidázokat stb. említjük meg. A kívánt átalakulás szerint célszerűen olyan hidrolázt alkalmazunk, mellyel az átalakulást lehetőleg specifikusan — királis vagy prokirális karbonsavszármazékok esetén lehetőleg sztereospecifikusan — tudjuk véghezvinni. A találmány szerinti eljárásban előnyösen egy lipázt használunk. A találmány szerinti eljárás egyik előnye, hogy a hidrolázt nem kell kémiailag módosítani annak érdekében, hogy kémiai oldószerekkel szembeni toleranciáját növeljük. A találmány szerinti eljárásban azonban kémiailag módosított hidrolázokat is lehet alkalmazni. A hidroláz Önmagában, vagy valamilyen hordozóanyagra, igy Celitre, szilikagélre, porra, üveggyöngyre abszorbeált, illetve immobilizált állapotban alkalmazható. Előnyös, ha a hidrolázt valamilyen inért hordozóra — különösen előnyös módon Celitre — adszorbeálva használjuk, mimellett a hidroláznak Celitre történő adszorpciójához elegendő, ha a hidrolázt és a Celitet egyszerűen összekeverjük.

Lényeges előnye az eljárásnak, hogy a hidrolázt nem kell ·· 9

- 8 immobilízáltan előkészíteni, minthogy szerves oldószerekben nem oldódik.

Amennyiben a szerves oldat vízzel történő telítésére egy vizet tartalmazó hidrogélt alkalmaztunk, úgy a hidrolázt közvetlenül adjuk hozzá a vízzel telitett oldathoz, amely a hidrogélt is tartalmazza. A vízzel telitett oldatnak a hidrolázzal való érintkezésénél enzimspecifikus mértékben és enzimspecifikus szelektivitással végbemegy a hidrolízis, miközben a hidrolízis során felhasználódott viz a hidrogélből pótlódik, úgyhogy a szerves reakcióoldat állandóan telítve marad vízzel.

Ha valamilyen királis vagy prokirális karbonsavszármazékot reagáltatunk, úgy a reakciót a kívánt átalakulási fokig hagyjuk végbemenni és ezt az optikai forgatóképesség mérésével tudjuk meghatározni.

A kívánt átalakítási fok elérése után az enzimet és a hidrogélt kiszűrjük és az oldatot mindig a kívánt terméknek megfelelően, szokásos módon feldolgozzuk, mimellett a kívánt terméket extrahálással, átkristályositással, desztillációval vagy kromatografálással kaphatjuk meg és/vagy tisztíthatjuk.

Amennyiben a szerves oldat vízzel történő telítésére valamilyen vizes fázist alkalmazunk, úgy a hidrolázt egy reakcióedényben, például egy oszlopban helyezzük el és a vízzel telített szerves oldatot az edényen és igy a hidrolázon keresztül átszivattyúzzuk, úgyhogy a hidroláz nem jut érintkezésbe a vizes fázissal.

A vízzel telített szerves oldatnak a hidrolázzal való érintkezésekor a hidrolízis enzimspecifikus mértékben és enzimspecifikus szteroszelektivitással meg^végbe. Emellett a vízzel telitett oldatot folyamatosan átvezetjük a hidrolázon és ezt követően a vizes fázison keresztül, minthogy a hidroláznak a reakcióoldattal történő egyszeri érintkezésbe jutása révén a kívánt átalakulás mértékét általában még nem lehet elérni. Mivel a hidrolázok általában egy optikailag aktív karbonsavszármazéknak mind a két enantiomerjét képesek átalakítani, mimellett az egyik enantiomerre nézve az átalakítás előnyös, királis vagy prokirális karbonsavszármazékok esetében általában véve célirányos a reakcióoldat optikai forgatóképességét — ami a mindenkori enantiomertöbblet mértéke — folyamatosan mérni és a reakciót a hidroláz szempontjából előnyös enantiomer átalakítása után megszakítani annak érdekében, hogy lehetőleg enantiomerekre nézve tiszta termékeket kapjunk.

A vízzel telitett szerves oldatnak az enzimen keresztül történő folyamatos átszivattyúzásánál arra kell ügyelni, hogy az oldat az enzimmel való érintkezéskor mindig vízzel telitett legyen. Mivel a hidrolízis során a hasított kötés egy móljára számítva egy mól viz használódik fel, ezt a vizet pótolni kell, mielőtt a szerves oldatot újból érintkezésbe hoznánk a hidrolázzal.

A felhasználódott vizet úgy is pótolhatjuk, hogy a hidrolázzal történő érintkezést követően a szerves oldatot i

• ·· · valamilyen hidroxidionokat tartalmazó bázisos ágensen keresztül vezetjük át, ami például egy oszlopban van elhelyezve. Ennek során egy mól karbonsavból egy mól karbonsavsó és egy mól viz keletkezik, ezáltal a hidrolízisnél felhasználódott víz pótlást nyer és az oldat vízzel telitett marad. Bázisos ágensként például hidroxilformában levő ioncserélőket , továbbá alkálifém- vagy alkáliföldfém-hidroxidokat lehet alkalmazni.

Az oszlopot elhagyó oldat többé már nem tartalmaz enzimatikus reakció utján képződött karbonsavat, minthogy az a bázisos ágensen megkötve marad, ugyanakkor egy mólnyi karbonsavsó képződésekor egy mól viz keletkezik, ami az oldatot vízzel ismét telíti. A reakcióoldatot folyamatosan addig szivattyúzzuk (pumpáljuk) a hidrolázon, majd a hidroxilionokat tartalmazó ágenssel töltött oszlopon keresztül, amíg a kívánt átalakulási fokot elérjük. Vízzel történő telítés céljából azonban úgy is eljárhatunk, hogy a szerves reakcióoldatot a hidrolázzal való érintkezés után valamilyen vizes fázison átvezetjük, vagy pedig egy vizes fázissal keverjük és utána ülepedni hagyjuk. Ebben a tekintetben vizes fázisként a tiszta viz, továbbá valamilyen pufferoldat vagy sóoldat jön szóba. A vizes fázis pH-értéke a reakció folyamán keletkezett savtól csökken, ezért előnyösen egy bázis hozzáadásával a pH-t körülbelül ál landó értéken tartjuk, azt nem engedjük sem 5 alá süllyedni, sem 11 fölé növekedni. Előnyös az 5 és 10 közötti, különösen előnyös a 6 és 8 közötti pH-tartomány betartása.

• · ·· ·

-11Bázisként a semlegesítésre szokásosan alkalmazott bázisok, például az alkálifém- vagy az alkálifÖldfém-hidroxidok, -karbonátok, -hidrogén-karbonátok, továbbá az ammónium-hidroxid (NH^OH) stb. alkalmasak, mimellett előnyösen alkálifém-hidroxidokat, igy kálium- vagy nátrium-hidroxidot használunk. A bázis hozzáadását vizes oldat formájában és előnyösen valamilyen pH-értéket mérő berendezéssel, mint pl. hidrogénelektróddal kombinálva automatizált módon végezzük. A bázis hozzáadása által a karbonsav a hozzáadott bázissal sót képez, ami visszamarad a vizes fázisban, ennek folytán a keletkezett karbonsav a hidrolízis-egyensúly faktorai közül kiesik, miközben a szerves oldat csekély mértékű elegyedőképessége miatt elválik a vizes fázistól, ugyanakkor vízzel telítődik. A vízzel telített szerves oldatot azután ismét átvezetjük a hidrolázon. Ezt az eljárási módot mindaddig folytatjuk, amíg elérjük a kívánt átalakulási fokot. Ekkor a reakciót megszakítjuk és a reakcióterméket izoláljuk, majd 'adott esetben tisztítjuk.

Az eljárás folyamán képződött karbonsavat a fentiekben leírtak szerint só formájában izoláljuk és ebből savanyítással és adott esetben extrahálással nyerjük ki a szokásos módon, míg a tisztítás desztillációval, kromatográfálássál vagy átkristályositás utján történhet.

Amennyiben a kívánt terméx nem azonos az eljárás folyamán keletkezett karbonsavval, hanem a hidrolízis másik terméke, tehát például az alkohol, az amin vagy a tiol a kívánt termék,

ϊ *

• · · · illetőleg ha mind, a karbonsav, mind az alkohol, az amin vagy a tiol a kívánt termék, vagy pedig a szerves reakcióoldatnak vizzel történő telítésénél bázist nem adagolunk, úgy a reakció megszakítása után a kívánt terméke(ke)t a szerves reakcióoldatból a szokásos uton-módon, például extrahálással, desztillációval, kristályosítással, átkristályositással vagy kromatográfálással kapjuk meg és/vagy tisztítjuk.

Váratlan módon úgy találtuk, hogy az enzimaktivitást a hidroláznak az egyik reákcióciklus után és a következő reakcióciklus előtt kloroformmal végzett öblítésével jelentősen növelni lehet akkor is, ha a karbonsavszármazék szerves oldószereként nem kloroformot használunk. így egy lipáz specifikus aktivitását egyetlen reakcióciklusban 138-ról 339-re lehet növelni., mmól/óra/gramm lipáz dimenzióban kifejezve, ami után a lipáz aktivitása körülbelül állandó értéken marad.

Az eljárást célszerűen olyan hőmérsékleten valósítjuk meg, ahol a hidroláz a legnagyobb aktivitást mutatja. Emellett ez a hőmérséklet 0 és 40 °C között, előnyösen 20 és 30 °C között van és különösen d.őnyösen szobahőmérsékleten dolgozunk, de speciális esetben magasabb hőmérsékleten is végezhetjük a reakciót, de mindenképpen az oldószer forráspontjánál és az alkalmazott hidroláz dezaktiválódási hőmérsékleténél alacsonyabb hőmérséKleti értéken.

Az eljárást folyamatosan vagy szakaszosan lehet megvalósítani. A folyamatos módszer előnyös.

• · * · • · · ····

- 13 Abban az esetben, ha királis vagy prokirális karbonsavszármazékokat alkalmazunk kiindulási anyagként és a hidrolázzal végzett reagáltatással kapott termékben a hidroláz csekély mértékű sztereospecifitása folytán az egyik enantiomer többlete nem kielégítő, úgy az egy reakcióciklus után kapott terméket újból átalakítjuk karbonsavszármazékká és ezt használjuk a találmány szerinti eljárásban, amikor is a termékben a kívánt enantiomerre nézve további feldusulást érhetünk el. Nagyobb enantiomertisztaság elérése végett némely esetben célszerűnek bizonyult az is, ha az eljárást már kis átalakítási fok elérésekor megszakítjuk.

Az eljárásnak egy különleges megvalósítási formája szerint valamilyen optikailag aktív karbonsavszármazékot, különösen optikailag aktív karbonsav^sztert, melynek királis centruma a savrészben van — mimellett a kívánt termék túlnyomórészt egy optikailag aktív sav egyik enantiomerje — diizopropil-éterben vagy toluolban oldjuk a lehető legtöményebb oldat eléréséig, majd az oldatot egy gyűjtőtartályban, melyben valamilyen vizes fázist készítettünk elő, ezen vizes fázissal történő keverés utján vízzel telítjük. A vízzel telített szerves fázist egy szivattyú segítségével az inért hordozóanyagra adszorbeált és az említett gyűjtőtartálytól elkülönítetten levő edényben — célszerűen oszlopban — levő lipázon átvezetjük úgy, hogy a lipáz ne kerüljön érintkezésbe a gyűjtőtartály vizes fázisával. Eközben enzimspecifikus módon végbemegy a hidrolízis. Ezt követően a szerves reakcióoldatot visz14 szavezetjük a gyűjtőtartályban levő vizes fázisba. Ezen vizes fázis pH-ja a keletkezett karbonsav bevezetése folytán csökken. A pH-értéket nátrium-hidroxid- vagy kálium-hidroxid-oldat bevitelével kb. pH = 7 értéken tartjuk. Ezáltal a karbonsav sója képződik* ami visszamarad a vizes oldatban. A szabaddá vált alkohol, valamint a nem reagált kiindulási anyag oldott állapotban megmarad a szerves reakcióoldatban, ami vízzel való csekély mértékű elegyedőképessége miatt elkülönül a gyűjtőtartályban levő vizes fázistól és azt egy körfolyamatban addig vezetjük át ismételten a hidrolázon és a vizes fázison keresztül, amíg a kivánt átalakulási fokot elérjük. Ekkor a reakciót megszakítjuk és a vizes fázist elválasztjuk a szerves fázistól. A keletkezett karbonsav izolálása céljából a vizes fázist a szokásos módon megsavanyitjuk és a felszabadult karbonsavat extraháljuk. Ehhez kapcsolódhat ezután egy tisztítási művelet, ami lehet átkristályositás, desztillálás vagy kromatografálás, mimellett a kivánt enantiomerre nézve egy további dusulást is el lehet érni.

A találmány szerinti eljárásnak egy kiemelkedően előnyös megvalósítási módja szerint egy gyűjtőtartályban desztillált vizet készítünk elő és ehhez keverés közben hozzáadjuk egy olyan karbonsav-észter enantiomerjének diizopropil-éteres oldatát, melynek savrésze a 2-helyzetben előnyösen halogénatommal van helyettesítve, majd a keveréket ülepedni hagyjuk. A szerves fázist ezután Gelitre abszorbeált lipázon vezetjük át, amely a gyűjtőtartálytól különállóan egy oszlopban van elhe·*· • I

- 15 lyezve, majd a szerves fázist visszavezetjük a gyüjtőtartályban levő vizes fázisba, miközben a vizes fázis pH-értékét vizes alkálifém-hidroxid-oldat hozzáadásával állandó jelleggel 6 és 9 közötti értéktartományban tartjuk. Emellett a vizes fázist a gyűjtőtartályból ki lehet vezetni és azt friss vizes fázis hozzáadásával lehet pótolni. A szerves fázist, ami túlnyomórészt a királis karbonsav-észternek az enzim által át nem alakított enantiomerjeit, valamint a keletkezett alkoholt tartalmazza, a kívánt átalakulási fok elérése után ugyancsak kivezethetjük a gyűjtőtartályból és azt egy friss szerves fázissal pótolhatjuk. A vizes oldatból az optikailag aktív karbonsav tiszta vagy dúsított enantiomerjét úgy nyerjük ki, hogy a vizes oldatot megsavanyitjuk és a karbonsavat oldani képes oldószerrel extraháljuk.

A találmány szerinti eljárás segítségével egyszerű módon lehet egy karbonsavszármazékot szerves oldószeres oldatban enzimmel hidrolizálni és a kívánt terméket ugyancsak egyszerű módon izolálhatjuk. Emellett az enzimnek nem kell immobilizált állapotban lennie, továbbá különösképpen valamilyen királis kiindulási vegyület enantiomerjének elegyét — adott esetben több reakcióciklus alkalmazásával — az optikailag aktív vegyületre nézve igen nagy mértékben feldúsított enantiomerré alakíthatjuk át, még továbbá az oldószert mindig ismételten felhasználhatjuk és enzimveszteség vagy az enzim aktivitásának csökkenése még hosszú idő eltelte után sem lép fel. Mindezeken túlmenően nem keletkeznek környezet• · . . ··· · ···· ··* ..· ·..

- 16 károsító melléktermékek, melyeket újra kellene feldolgozni, vagy valamilyen módon gondoskodni kellene róluk. Az eljárás mindezek folytán a technikát gazdagítja.

1, példa

5,61 g S- és 14,44 g R-2-bróm-propionsav-2-etil-hexil-észterböl álló 20,05 g enantiomerelegyet, ami az R-enantiomer tekintetében 44 %-os felesleget jelent és amit a 2-bróm-propionsavak megfelelő enantiome re le gyének 2-etil-hexanollal végzett észterezésével állítottunk elő, diizopropil-éter-; ben oldunk úgy, hogy az oldat térfogata 170 ml legyen. Ezt az oldatot bevisszük egy tartályba, melyben 140 ml vizet és

5,5 ml etanolt készítettünk elő, majd az egészet összekeverjük.

Ekkor két fázis jön létre. Ezt követően a vízzel telített szerves fázist kb. 100 ml/perc szivattyuzási sebességgel átszivattyuzzuk egy olyan oszlopon, amely 1,5 g Candida cylindracea lipázt tartalmaz 12 g Celittel összekeverve, majd az oszlopon történő áthaladás után a szerves reakcióoldatot bevezetjük a fentiekben már említett tartályba, mimellett ez az oszlop a tartálytól függetlenül van elhelyezve. A vizes fázis pH-ját 2 mólos vizes nátrium-hidroxid-oldat automatizált hozzáadásával 5-8 közötti értéken tartjuk. Ilyen módon a reakció során keletkezett 2-bróm-propionsav nátriumsója képződik, ami a vizes oldatban marad, mig a szerves

- 17 reakcióoldat vizzel telítődik és a tartály vizes fázisától elkülönül. Az immár újra vizzel telitetté vált szerves fázist ismételten és folyamatosan a lipázon, majd a vizes fázison keresztül átszivattyuzzuk. Emellett 0,5 óra eltelte után 2,05 ml, mig 1,5 óra elmúltával 5>85 ml 2 mólos vizes nátrium-hidroxid-oldatot használunk fel és 15 %-os átalakulást érünk el. A vizes oldatot ezután kénsavval megsavanyitjuk és az igy felszabadított 2-bróm-propionsavat diizopropil-éterrel extraháljuk, majd az extrahálószer elpárologtatása révén izoláljuk. Ilyen módon 1,65 g R- és S-2-bróm-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek 'optikai forgatási értéke : [aJ_D ²⁰ = +25.4 °, ami az R-enantiomer tekintetében 90,4 %-os feleslegnek felel meg, vagyis 0,08 g S- és 1,57 g R-2-bróm-propionsav képződött. A lipáz specifikus aktivitása :

5.2 mmól/óra/gramm lipáz.

2. - 10. példa

A 2. -7. példát ugyanolyan,utón és módon valósítjuk meg, miként azt az 1. példában már leírtuk és ugyanannyi Candida cylindracea lipázt alkalmazunk, de a reakcióidőt kb. 4 órára megnöveljük és kb. 44 %-os átalakulási fok elérésekor a folyamatot megszakítjuk. A Candida cylindracea lipázzal töltött oszlopot minden reakcióciklus után diizopropil-éterrel öblítjük.

A 8. - 10. példát is ugyanolyan utón és módon valósítjuk meg, ahogyan azt az 1. példában már ismertettük, de a · ·· .·· ....

.· .·

......... ·..· ·· • ·

2-bróm-propionsav-2-etil-hexil-észter enantiomerelegyből, a diizopropil-éterből, a vízből és az etanolból hatszoros menynyiséget használunk, mig az alkalmazott Candida cylindracea lipáz mennyisége az 1. - 7. példa szerinti. A Candida cylindracea lipázt tartalmazó oszlopot minden reakcióciklus után diizopropil-éterrel öblítjük. A kapott eredményeket az 1. és a 2. Táblázatban foglaljuk össze.

1. Táblázat

	2.	5.	Példa	sorszáma
4.	5.	6.	7.	8.	9.	10.
h		Óránkénti átalakulás	i %-ban kifejezve
0,5	7,5		6,5		7,1	5,8	3,5	2,2	1,8
1,0	15,8				14,6
1,5		19,6	20,4	20,5
2,0		24,9		26,2	29,1
2,5	29,9	29,9	52,0	50,4	54,9	27,5	7,5	5,5
5,0		54,7			39,4
5,5	58,9
4,0	42,6		46,6
4,2	43,9	45,9		44,2	45,9
4,5						45,9
18,0									55,7
19,0								57,7
20,5							59,4
24,13							44,1
24,25								44,1	44,1

- 19 2. Táblázat

Példa	G (g)	a (°)	ee(%)	Akt
sorszáma
2.	4,66	+27,1	96,4	5,3
3·	4,67	+26,2	93,2	5,3
4.	4,91	+26,4	94,0	5,9
5.	4,66	+28,2	100,4	5,3
6.	4,68	+25,7	91,5	5,4
7.	4,60	+28,6	101,3	4,9
8.	28,0	+27,3	97,2	5,5
9«	27,7	+27,7	98,6	5,5
10.	28,03	+28,5	101,0	5,5

Az 1. példa szerinti Candida cylindracea lipázt tehát összesen mintegy 95 órán át használtuk anélkül, hogy aktivitásából veszített volna.

A fenti táblázatokban az egyes szimbólumok jelentése az alábbi :

h í reakcióidő (órákban kifejezve)

G(g) : kitermelés (grammokban kifejezve) a(°) : optikai forgatóképesség ; [a]^²⁰ ee(?ó) : a kapott R-2-bróm-propionsav enantiomer feleslege az S-enantiomerhez viszonyítva

Akt : a Candida cylindracea lipáz specifikus aktivitása, mmól/óra/gramm lipáz dimenzióban kifejezve.

Átalakulás: a 2-bróm-propionsav-2-etil-hexil-észter enantioinerelegyének átalakult hányada %-ban.

11. példa g R- és S-2-bróm-propionsav-2-etil-hexil-észterből álló racém elegyet feloldunk 150 ml diizopropil-éterben. Ezt az oldatot bevisszük egy tartályba, amelyben 7c ml viz van előkészítve és az egészet összekeverjük. Két fázisú rendszer keletkezik. Ezt követően a vizzel telitett szerves fázist kb. 100 ml/perc sebességgel átszivattyuzzuk egy olyan oszlo pon, amelyet a fenti tartálytól függetlenül helyeztünk el és ezen oszlop 5θ Candida cylindracea lipázt tartalmaz 2,8 g Celittel összekeverve. Az emlitett oszlopon való áthaladás után a szerves reakcióoldatot az 1. példában leirt módon kezeljük.

6,22 óra elteltével 29,17 7o-os átalakulást érünk el és ekkor a reakciót megszakítjuk. így 4,3 g R- és S-2-bróm-propion savból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképesség-értéke : [a]p « +20,6 , ami az R-enantiomer tekintetében 73»5 %-os felesleget (más szóval: többletet) jelent.

A lipáz specifikus aktivitása : 70,78 mmól/óra/^ramm lipáz.

12. - 17» példa

Az eljárás és a kiindulási anyagok mennyisége a 11. példában leírtakkal azonos, de az oszlopot — amely szintén a 11. példa szerinti lipázzal van töltve — minden újabb '··· ··

- 21 hajú anyagáradáskor kloroformmal öblítjük.

Ilyen módon a 3. Táblázatban szereplő eredményeket kapjuk.

3. Táblázat

Példa sorszáma	Átalakulás %-ban	Idő (órában)	[a] (°-ban)	(ee) %	Akt
12	29,8	3,25	+21,6	76,9	138,5
13	30	1,75	+22,1	78,6	258,3
14	29,8	2,23	+21,3	75>8	236,8
15	30	1,58	+ 22,7	80,8	285,5
16	30	1,33	+20,0	71,2	359>O
17	30	1,80	+ 17,2	61,2	251,1

18. példa

A 11. példában leirt módszert valósítjuk meg, de 45,1 g R- és S-bróm-propionsav-2-etil-hexil-észtert és ugyancsak 50 mg Candida cylindracea lipázt alkalmazunk. így 19,25 óra eltelte után 45 %-os átalakulást érünk el és 9,88 g R- és S-2-bróm-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk. Ennek optikai forgatóképessége s [a]p - +21,5 » ami az R-enantiomer tekintetében 76,5 %-os többletnek (feleslegnek)felel meg.

19» példa

A 18. példa szerint kapott 2-bróm-propionsavat 2-etil• ·· ·

- 22 -hexanollal kémiailag észterezzük, majd ezt az észtert a 18. példában leírtakkal analóg módon az említett példában szereplő lipázzal reagáltatjuk. 15,25 óra eltelte után igy 73,3 %-os átalakulási fokot érünk el és 6,62 g enantiomerelegyet kapunk, ami R- és S-2-bróm-propionsavból áll, melynek optikai forgatóképessége : [α]ρ = +26,4 . Ez az R-2-bróm-propionsavra nézve 94 %-os feleslegnek felel meg.

20. - 25. Példa

A 20. - 21., a 22. - 23· és a 24. - 25· példát a 18. -19· példában leirt módon és azonos mennyiségű kiindulási anyagok alkalmazásával valósítjuk meg, mimellett minden esetben a 18. példa szerinti Candida cylindracea lipázt használunk. Az eredményeket a 4. Táblázatban foglaljuk össze.

4. Táblázat

Példa sorszám	Átalakulás (%)	Idő (h)	Kitermelés (g)	[a] (°)	ee (%
20.	53,6	17	12,6	+18,7	66,5
21.	63,7	22	8,0	+26,2	93,2
22-	42,6	22	11,1	+17,8	63,3
23-	62,9	26,75	6,7	+26,2	93,2
24.	43,2	25,5	11,5	+ 15,9	56,6
25.	57,2	19,5	6,5	+27,2	96,8

26. példa

R- és S-2-klór-propionsav-butil-észter racém elegyéből 41 g-nyit feloldunk 360 ml diizopropil-éterben és az oldatot keverés közben hozzáadjuk egy külön tartályban előkészített 200 ml vízhez. Két fázis keletkezik. A felül elhelyezkedő szerves fázist 100 ml/perc szivattyuzási sebességgel átszivattyuzzuk egy oszlopon, amely 15 g Geotrichum. candidum lipázt tartalmaz 60 g Oelittel összekeverve és az említett oszlop a tartálytól elkülönítetten helyezkedik el. Ezt követően a szerves reakcióoldatot a tartályban levő vizes fázisba visszavezetjük és a vizes fázis pH-ját egy automatizált mérőberendezés segítségével adagolt 2 mólos nátrium-hidroxid-oldattal 6 és 8 közötti értéken tartjuk. Ilyen módon a reakció során keletkezett 2-klór-propionsav nátriumsója képződik, ami a vizes fázisban marad. A szerves reakcióoldat elváliK a vizes fázistól és az előbbit a lipázon át, majd újból a vizes fázison keresztül folyamatosan átszivattyuzzuk.

44,5 óra eltelte után igy 20,6 %-os átalakulási fokot érünk el, amikor is a reakciót megszakítjuk.

Ezt követően a vizes oldatot kénsav hozzáadásával megsavanyitjuk, majd kloroformmal extraháljuk, a szerves oldatot nátrium-szulfát felett szárítjuk és az oldószert elpárologtatjuk.

Ilyen módon 5»3 g enantiomerelegyet kapunk, amely R- és

- 24 S-2-klór-propionsavból áll és optixai forgatóképessége : [α]ρ²⁰ = -12 ⁰ . Ez az érték az S-enantiomerre nézve 75,2 %-os többletnek felel meg.

27. példa

R- és S-2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észter racém elegyéből 55 »5 g-ot feloldunk 560 ml diizopropil-éterben és az oldatot keverés közben 200 ml vízhez adjuk, ami egy tartályban van előkészítve. Két fázis keletkezik. A felül elhelyezkedő és vízzel telitett szerves fázist átvezetjük egy oszlopon, ami 1 g Candida cylindracea lipázt tartalmaz 10 g Celittel összekeverve, mimellett ez az oszlop az említett tartályhoz képest különállóan van szerelve. Ezt követően az

1. példában leirt módon járunk el. 52 %-os átalakulás elérése után a reakciót megszakítjuk. Ilyen módon egy R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége : [a]p = +6,9 °, ami az R-enantiomer tekintetében 42,1 %-os többletnek (feleslegnek) felel meg. A lipáz specifikus aktivitása : 11,58 mmól/óra/gramm lipáz.

28. példa

R- és S-2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észter racém elegyéből 55>5 g-ot feloldunk 580 ml diizopropil-éterben és az oldatot keverés közben 200 ml vízhez adjuk, ami egy tar- 25 tályban van előkészítve. Két fázis keletkezik. A felül elhelyezkedő és vízzel telitett szerves fázist 100 ml/perc szivattyuzási sebességgel átszivattyuzzuk egy oszlopon, melynek töltete 2 g Candida cylindracea lipáz és 15 g Celit keveréke, mimellett a lipázt előzőleg 2 ml 50 %-os diizopropil-éteres glutárdialdehiddel végzett keveréssel átnedvesitettük. Ezután az 1. példában leírtak szerint járunk el.

%-os átalakulás elérése után a reakciót megszakítjuk. Ilyen módon egy R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképességi értéke :

q/Λ λ [α]ρ « +7,5 » ami az R-enantiomer tekintetében 44,5 %-os többletnek (feleslegnek) felel meg. A lipáz specifikus aktivitása : 4,8 mmól/óra/gramm lipáz.

29. példa

2-Klór-propionsav-2-etil-hexil-észter racém enantiomerelegyének 55> 2 g-nyi mennyiségéből indulunk ki és diizopropil-éter helyett 400 ml hexánt, valamint 21 g Celittel összekeverve 5 g Candida cylindracea lipázt használunk, egyébként a 26. példában leirt uton-módon járunk el. így 19 óra eltelte után 78,6 %-os átalakulást érünk el. Ilyen módon R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképességi értéke : [aj^²⁰ = +2,5 °, ami az R-enantiomer tekintetében 15»2 %-os enantiomerfeleslegnek felel meg. Az át nem alakult észterre nézve az S-enantiomer többlete 56 %-ot tesz ki.

• · · ·

30. példa

294,1 g racém enantiomerelegyet, ami 2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észterből áll, továbbá a tiszta diizopropil-éter helyett 100 ml diizopropil-éterből és 20 ml acetohból álló elegyet, valamint 50 g Celittel összekeverve 10 g Candida cylindracea lipázt használunk és a 26. példában leirt uton-módon járunk el, amíg elérjük az 57 %-os átalakulási fokot, így R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége s [a]p = +6,1 , mely érték az R-enantiomer tekintetében 37 %-os R-enantiomertöbbletnek felel meg.

31» példa

R- és S-2-Klór-propionsav-fenil-etil-észter racém enantiomerelegyéből 57,2 g-nyi mennyiséget 400 ml diizopropil-éterben oldva 15 g Celittel összekeverve 3 g Candida cylindracea lipázzal reagáltatunk, a 26. példában leirt módon és eljárásnak megfelelően. 1,30 óra eltelte után 60 %-os átalakulási fokot érünk el. Az igy kapott R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegy optikai forgatóképessége : « = +6,1 °, mely érték az R-enantiomerre nézve 37 %-os enantiomertöbbletnek felel meg.

A lipáz specifikus aktivitása: 41,7 mmól/óra/gramm lipáz.

32. Példa

A 31. példában leirt eljárást valósítjuk meg, de 400 ml • *

- 27 diizopropil-éterben oldott 159 g R- és S-2-Klór-propionsav-fenil-etil-észter racém enantiomerelegyből indulunk ki és a

51. példa szerinti lipázt diizopropil-éterrel öblítjük. így

4,12 óra után 6? %-os átalakulási fokot érünk el, ekkor a reakciót megszakítjuk. Az igy kapott R- és S-2-klór-propion20 savból álló enantiomerelegy optikai forgatóképessége : [a]p = = +5,3 °, mely érték az R-enantiomer tekintetében 52,3 %-os többletnek felel meg.

A lipáz specifikus aktivitásának értéke : 40,8 mmól/óra/gramm lipáz.

• ···

33» -.33»

2-Klór-propionsav-butil-észter racém enantiomerelegyéből 41 g-ot feloldunk 56O ml oldószerben és azt keverés közben bevisszük egy tartályba, melyben 200 ml vizet készítettünk elő. Két fázis jön létre. A vízzel telitett szerves fázist átszivattyuzzuk egy oszlopon, amely 5 g Candida cylindracea lipázt tartalmaz 9 g Celittel összekeverve. A műveletet 53 %-os átalakulási fok eléréséig végezzük, majd mindenben az

1. példa szerint dolgozunk és igy az alábbi eredményeket kapjuk s

Példa	Oldószer	Akt	[*]°
sorszám
53.	diizopropil-éter	27,18	+ 5,4
54.	n-heptán	12,78	+ 5,2
35·	kloroform	2,17	+5,6

Akt : specifikus aktivitás,mmól/óra/gramm lipáz 20 [a] : optikai forgatóképesség értéke, [<*1_D

56. példa

A 2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észter racém elegyéből

55,2 g-nyit feloldunk 400 ml diizopropil-éterben és ezt keverés közben bevezetjük egy tartályba, melyben előzőleg 200 ml vizet készítettünk elő. Két fázis keletkezik és a vízzel telitett szerves fázist átvezetjük 6 g Humicola lanuginosa lipáz és 20 g Celit keverékén. Ezt követően az 1. példában leirt módon járunk el. 25 óra eltelte után 52,4 %-os átalakulási fokot érünk el, amikor is a reakciót megszakítjuk.

Mindezek folytán R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége :

o [a]jj = +8,9° . Ez az érték az R-enantiomer tekintetében egy

54,5 %-os enantiomertöbbletnek felel meg. A lipáz specifikus aktivitása : 0,54 mmól/óra/gramm lipáz.

37. példa

A 36. példa szerinti eljárást ismételjük meg, melynek során azonos kiindulási anyagból azonos anyagmennyiséget használunk, de a 36. példában ismertetett lipázt tartalmazó enzimtartalmu oszlopot diizopropil-éterrel átöblitjük. 48 óra eltelte után 64,8 %-os átalakulási fokot érünk el és a reakciót megszakítjuk. R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége : [a]p = = +4,7 °. Sz az érték az R-enantiomerre nézve 28,7 %-os enantiomertobbletnek felel meg és a lipáz specifikus aktivitása : 0,56 mmól/óra/gramm lipáz értékű.

38. példa

A 37. példa szerinti szerves fázis felhasználásával — ami 19,4 g 2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észtert tartalmaz — és 12,5 g Gelittel összekevert Pseudomonas fluorescens lipázzal,a 36· példában leirt uton-módon eljárva 8,6 óra reagáltatási idő után 35»8 %-os átalakulást érünk el. Ennek eredményeként R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet /·>/>

kapunk, melynek forgatóképessége : [a]p = -12,6 . Ez az érték az S-enantiomer tekintetében 76,8 %-os többletnek felel meg. A lipáz aktivitása : 1,48 mmól/óra/gramm. lipáz.

39· példa

102,5 g olyan R- és S-2-klór-propionsav-2-etil-hexil-

• · ·

- 30 -észterből indulunk ki, ami az S-enantiomerre nézve 58,5 ^a/°~ -os többletet tartalmaz és melyet a megfelelő 2-klór-propionsav-enantiomerek elegyének 2-etil-hexanollal történő észterezésével állítottunk elő. Ezt a 36. példában leirtaxkal azonos módon 4,8 mg Chromobacterium viscosum lipáz és 10 g Celit keverékével reagáltatjuk 22,5 %-os átalakulási fok eléréséig. Ilyen módon 4,7 g enantiomerelegyet kapunk, ami R- és S-2-klór20

-propionsavból áll és az optikai forgatóképessége : [ajp = -12,9 °. Ez az érték az S-enantiomerre vonatkoztatva 78,7 %-os többletnek (feleslegnek ) felel meg. A lipáz specifikus aktivitása : 1,04 mól/óra/gramm lipáz.

40. példa

A 27. példában leirt racém enantiomerelegyből 57»6 g-ot a 27. példában ismertetett uton-módon, de 0 + 1,5 °C hőmérsékleten reagáltatunk 6 g Gandida cylindracea lipázzal, amit 24 g Celittel kevertünk össze. 5 óra alatt 70 %-os átalakulás következik be, ez egy R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet eredményez, melynek optikai forgatóképessége :

- +4,3 °. Ez az érték 26 % enantiomertöbbletnek felel meg. A lipáz specifikus aktivitásának értéke : 5»83 mmól/óra/gramm lipáz.

41. példa

A 40. példában leirt eljárási módon, de 10 °C hőmérsékle-

- 31 ten dolgozunk és igy 2,8 óra alatt 70 %-os átalakulási fokot érünk el. A lipáz aktivitása : 10,3 mmól/óra/gramm lipáz. A keletkezett enantiomerelegy optikai forgatóképessége :

_ 4,4 ⁰ értékű.

42. példa

56,6 g racém enantiomerelegyet, ami 2-klór-propionsav-2-etil-hexil-észterből áll, feloldunk 400 ml diizopropil-éterben, amely vizzel telítve van. Az oldatot egy tartályban helyezzük el, majd 15 g Celittel összekevert 3 g Candida cylindracea lipázon átszivattyuzzuk, ezt követően az igy képződött reakcióoldatot átszivattyuzzuk egy olyan oszlopon, ami 10 g kaicium-hidroxidőt tartalmaz 20 g Celittel összekeverve. A reakció során keletkezett 2-klór-propionsavból só képződik, ami visszamarad az oszlopban. A szerves fázisban levő és a hidrolízis során felhasználódott vizet ismételten pótoljuk. A reakciót a továbbiakban folyamatosan, a fentiekben leirt uton-módon folytatjuk, amíg 4 óra eltelte után elérjük a

34,3 %-os átalakulási fokot. Ilyen módon egy R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége : [oc]p²⁰ = +7,0 °. Ez az érték az R-enantiomer tekintetében 43 %-os enantiomertöbbletnek felel meg.

43« példa

2-Klór-propionsav-butil-észter racém enantiomerelegyé···

- 32 bői 6,59 g-nyi mennyiséget feloldunk 75 ml diizopropil-éterben. Ezt hozzáadjuk 1,6 ml nátrium-foszfát puffer (pH = 7), vízben előre duzzasztott 0,1 g Sephadex G 50 ( a Pharmacia cég terméke), továbbá 6 g Celit és 6 g Geotrichum candidum lipáz keverékéhez, majd az egészet szobahőmérsékleten keverjük. 168,8 órás reagáltatás után 37,4 %-os átalakulási fokot érünk el és a reakciót megszakítjuk. R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet kapunk, melynek optikai forgatóképessége : [^a]jj = -8,8 . Ez az érték az S-enantiomerre vonatkoztatva 53»7 %-os enantiomertöbbletnek felel meg.

44. példa

A 4J. példában leirt módon járunk el, de 15 g 2-klór-propionsav-propil-észterből álló racém enantiomerelegyet, továbbá 5 g Geotrichum candidum lipázt, 5 g Celitet, 2,5 ml 10 mólos nátrium-foszfát puffért ( pH = 7), valamint vízben előzetesen duzzasztott 340 mg Hydrogel Evergreen 506-at (Chemie Linz AG. terméke) használunk. 118,5 óra eltelte után igy 24,5 %-os átalakulást érünk el. A kapott R- és S-klór-propionsav enantiomerelegy optikai forgatóképessége : [a = +3,0 °. Ez az érték az R-enantiomerre nézve 18,3 %-os enantiomertöbbletnek felel meg.

45« példa

Ugyancsak a 43· példa szerinti utat és módszert követjük, ···

- 33 de a Sephadex G 50 helyett vizben előzetesen duzzasztott

0,1 g Hydrogel Evergreen 50ű-at (Chemie Linz AG. terméke) alkalmazunk. 46,8 óra eltelte után 24 %-os átalakulási fokot érünK el. A kapott R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegy optikai forgatóképessége : = -11,7 °. Ez az érték az S-enantiomer tekintetében 71,3 %-os enantiomertöbbletnek felel meg.

46. példa

Racém 2-klór-propionsav-butil-észterből álló enantiomerelegyből 6,58 g-ot feloldunk 50 ml diizopropil-éterben és ehhez hozzáadunk 1 g Celitet, vizben előduzzasztott 0,1 g Sephadex G 50-et (Pharmacia cég terméke), 0,8 g 10 mmólos nátrium-foszfát ( pH = 7) pufferoldatot és 0,8 g Candida cylindracea lipázt, majd ezeket szobahőmérsékleten keverjük. 1,75 óra eltelte után az átalakulás foka : 34,5 %. A reakciót ekkor megszakítjuk és a hidrogélt, valamint a lipázt kiszűrjük. A reakcióoldat R- és S-2-klór-propionsavból álló enantiomerelegyet tartalmaz, melynek forgatóképessége : [a]p²⁰ =+4,3 °.

, Ez az érték az R-enantiomer tekintetében 26,2 %-os enantiomertöbbletnek felel meg. A lipáz aktivitása : 9,86 mmól/óra/gramm lipáz.

A példákban a kapott termékekre megadott specifikus optikai forgatóképességi értékeket — azaz [α]_β adatokat — valamennyi példára vonatkozóan 589 nm hullámhossznál (nátrium • ·

- 34 D-vonal), 20 °C hőmérsékleten és kloroformban c = 1 koncentrációban határoztuk meg.

A példákban szereplő Celit gyanánt a Fluka cég Celite Hyflo Super-Cel nevű és 2- 25 pm részecskenagyságu termékét alkalmaztuk.

47« - 52. példa

Minden egyes esetben 7,0 g R- és S-oktánsav-l-fenil-etil· -észter racém enantiomerelegyet feloldunk 300 ml diizopropil-éterben és ezt keverés közben bevisszük egy olyan tartályba, melyben előzőleg 200 ml vizet készítettünk elő. Két fázis keletkezik. A vízzel telitett szerves fázist az 1. példában leirt módon átszivattyúzzuk egy olyan oszlopon, amely töltetként 3 g Candida cylindracea lipázt ( a Meito cég terméke) tartalmaz 22 g Celittel összekeverve, mimellett a 47« - 52. példák mindegyikében ugyanezen lipáz kerül alkalmazásra. A vizes fázis pH-értékét az 1. példában leirt módon 5 és 8 között tartjuk. Körülbelül 30 %-os átalakulási fok elérése után a vizes fázist diizopropil-éterrel extrahaljuk és a reakciót megszakítjuk. A diizopropil-éter elpárologtatása után viszszamaradt maradékból vákuumdesztillálással izoláljuk az

1-fenil-etanolt. A kapott eredményeket az alábbi 5« Táblázatban foglaljuk össze :

5. Táblázat

Példa	Átalakulás	Eltelt idő	[a] ee Akt
sorszáma	(%-ban)	(órákban)	(°-ban) (%-ban)

47.	32	22,0	41,2	92	0,137
48.	30	22,0	-	-	0,128
49.	31	23,0	41,2	92	0,127
50.	26	20,5	-	-	0,119
51.	29	24,5	-	-	0,111
52.	29	26,5	39,7	88	0,103

A fentiekben

Akt : a Candida cylindracea lipáz specifikus aktivitása mmól/óra/gramm lipáz dimenzióban kifejezve, [a] : optikai forgatóképesség 539 nm hullámhossznál, °C hőmérsékleten és c = 1 koncentrációjú metanolos oldatban meghatározva, ee : a kapott R-l-fenil-etanol enantiomer az S-l-fenil-etanolhoz képest, a reakcióoldat nem került feldolgozásra.

Claims (10)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK:

   1. Eljárás valamilyen karbonsavszármazék enzimatikus hidrolízisére, azzal jellemezve, hogy a karbonsavszármazékot egy olyan szerves oldószerben oldjuk, ami vizzel csak kis mértékben elegyedőképes, ami után az oldatot vizzel telitjük és ezt egy hidrolázzal hozzuk érintkezésbe, mimellett viz felhasználódása Közben hidrolízis következiK be és ezután a szerves reakcióoldatot mindaddig ismételten vizzel telitjük és a hidrolázzal érintkezésbe hozzuk, amíg a kívánt átalakulási fokot elérjük.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szerves fázis vizzel történő telítését egy vizet tar talmazó hidrogél segítségével végezzük.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízis utáni vizzel történő telítést a szerves reakcióoldatnak hidroxidionokat tartalmazó ágenseken végzett átvezetésével valósítjuk meg, miközben a képződött karbonsavat a reakcióegyensulyból kivonjuk és a hidrolízis során fel használódott vizet pótoljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a karbonsavszármazékot egy szerves oldószerben oldjuk és a keletkezett szerves oldatot egy gyüjtőtartályban levő • ·

   - 37 vizes fázisba vezetjük be, ahol a szerves oldat vízzel telítődik majd a vizes fázistól elválik, ezután ezt a vízzel telített szerves oldatot egy hidrolázt tartalmazó reakcióedényen keresztül átszivattyuzzuk és az igy keletkezett szerves reakcióoldatot visszaszivattyuzzuk a gyűjtőtartályban levő vizes fázisba, melynek pH-ját valamilyen bázis hozzáadásával állandó értéken tartjuk és igy a képződött karbonsav a hozzáadott bázissal képezett sója formájában visszamarad a vizes fázisban és ilyen módon a hidrolízis-egyensúly szempontjából kivonódik, miközben a szerves fázist ismételten vízzel telítjük, a vizes fázistól elválasztjuk, ami után mindaddig átszivattyuzzuk a hidrolázon Keresztül, illetőleg a vizes fázisba, amig a kívánt átalakulási fokot elérjük.
5. 5· A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolázt egy reakcióciklus befejezése után kloroformmal öblítjük, mielőtt azt egy uj reakcióciklusban alkalmaznánk.
6. 6. Az 1. - 5· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamilyen királis vagy prokirális karbonsavszármazékot alkalmazunk.
7. 7. Az 1. - 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy halogén-propionsav-észter enantiomerjeinek elegyét alkalmazzuk.
8. 8. Az 1. - 7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szerves oldószerként valamilyen étert alkalmazunk.
9. 9. Az 1. - 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hidrolázként egy lipázt alkalmazunk.
10. 10. Az 1. - 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a hidrolázt valamilyen hordozóra adszorbeált formában alkalmazzuk.

    Rajz nélkül A bejelentő helyett a meghatalmazott : ,/ dcícuL Machytka János szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Budapesti Nemzetközi Szalia^üii Iroda H-lOfii tyuó'&esí, Dsiszínhí» : Í0 1