SK116593A3 - Method of detection and measuring of neurotrophin activity - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu detekcie a merania účinnosti neurotrofinu alebo identifikácie látok s účinnosťou, podobnou účinnosti neurotrofinu. Vynález je založený na zistení, že protoonkogén trkB je kódom pre receptor tyrozínkinázy, ktorý môže slúžiť ako funkčná väzná bielkovina pre BDNF a NT-3. Vynález sa týka aj diagnostických a liečebných metód, založených na interakcii medzi BDNF a/alebo NT-3 a trkB a celého radu receptorových molekúl.

Doterajší stav techniky

Vývoj a udržovanie nervového systému stavovcov závisí na špecifických bielkovinách, označených ako neurotrofné faktory a pôvodne definovaných schopnostiach podporovať prežívanie populácie neurónov podľa Snider a Johnson, 1989, Ann. Neurol., 26, 489. Neurotrofné faktory sa zúčastňujú aj proliferácie a diferenciácie neurónov podľa Cattaneo a McKay, 1990, Náture 347, 762 až 765 a Lindsay a Harmar, 1989, Náture 337, 362 až 364 a okrem toho môžu mať ešte ďalšiu, doteraz celkom neobjasnenú úlohu v nervovom systéme aj mimo neho. V prípade neurotrofného faktora, odvodeného od mozgového tkaniva (BDNF) a neurotrofinu-3 (NT-3) bolo v poslednej dobe vykonané molekulárne klonovanie a bolo dokázané, že tieto látky sú štruktúrne príbuzné prototypu faktorov, pod porujúcich prežívanie buniek, faktoru rastu nervových buniek

NGF, ako bolo opísané v Leibrock a ďalší, 1989, 341, 149 až 152, Hohn a ďalší, 1990, Náture 344, 339 až 341, Maisonpierre a ďalší, 1990,

Science 247, 1446 až 1451, Rosenthal a ďalší,

1990, Neurón

4, 767 až 773, Ernfors a ďalší, 1990,

Proc. Νειΐΐ. Acad. Sci. , USA, 87, 5454 až 5458, Jones a Reichardt, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 8060 až 8064. Tieto tri príbuzné faktory, označované ako neurotrofíny nemajú žiadnu štruktrúrnu homológiu so štvrtým neurotrofným faktorom, ciliárnym neurotrofným faktorom CNTF, ako bolo opísané v Lin a ďalší, 1989, Science, 246, 1023 až 1025, Stockli a ďalší, 1989, Náture 342, 920 - 923.

Prenos cestou receptora alebo prenosy signálov v prípade NGF boli veľmi podrobne študované, prevážne vzhľadom na dostupnosť bunkovej línie pheochromocytómu PC12, u ktorej dochádza pri reakcii na NGF k diferenciácii podľa Greene a Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 2424. Tieto štúdie viedli ku klonovaniu transmembránovej bielkoviny, označovanej LNGRF pre svoju nízku afinitu receptora NGF, táto bielkovina viaže NGF s pomerne nízkou aktivitou, ako bolo opísané v Chao a ďalší 1986, Science 232, 518 až 521, Radeke a ďalší, 1987, Náture 325, 593 až 597. Okrem LNGRF je zrejmé potrebná ďalšia bielkovina, označovaná ako HNGRF pre svoju vysokú afinitu k receptoru NGF, táto bielkovina sa zúčastňuje tvorby miesta s vyššou afinitou pre väzbu NGF a je nutná na zahájenie prenosu signálu, vyvolaného pôsobením NGF, ako bolo opísané v Zimmerman a ďalší, 1978, J. Supramol. Strúc., 9, 351 až 361, Sutter a ďalší, 1979, Transmembrane Signalling, N. Y. Alan Liss, str. 659 až 667, Bernd a Greene, 1984, J. Bio, Chem. 259, 15509 až 15516, Hempstead a ďalší, 1989, Science 243, 373 až 375. Táto látka, HNGFR, je fosforylovaná na tyrozíne v dôsledku pôsobenia NGF a zjavne obsahuje vnútornú tyrozinkinázovú účinnosť podľa Meakina a. Shootera, 1991, Neurón 6, 153 až 163. Okrem toho sprostredkovávajú kinázy ERK, uvádzané aj ako kinázy MAP2, ktoré sú včasnými medziproduktmi v kaskádach signálu, aktivovaných tyrozínkinázou fosforyláciou tyrozínu ako odpoveď na pôsobenie NGF. To znamená, že rovnako ako v prípade odpovede na ďalšie rastové faktory, môže byť prenos signálu NGF zahájený aktiváciou tyrozinkinázy, viazanej na receptor.

Štúdie z poslednej doby preukázali, že produkt protoonkogénu trk, napodobňujúci receptor rastového faktora (to znamená, že ide o transmembránovú bielkovinu, obsahujúcu intracytoplazmatickú oblasť tyrozinkinázy), pre ktorý nebola identifikovaná žiadna väzbová molekula, je rýchle fosforylo vaný v dôsledku pôsobenia NGF na bunky PC12, ako bolo opísané v Kaplan a ďalší, 1991, Náture, 350, 156 až 160, Klein a ďalší, 1991, Celí 65, 189 až 197 a okrem toho dochádza k priamej väzbe NGF s pomerne vysokou afinitou v prípade expresie v heterológnych bunkách, ako bolo taktiež opísané vo vyššie uvedenej publikácii Kleina a ďalších. Toto zistenie spolu s obmedzenou neurónovou distribúciou bielkoviny trk v živom organizme naznačuje, že trk môže byť zložkou HNGRF, zodpovednou za zahájenie prenosu signálu NGF.

Na rozdiel od široko rozpracovaných štúdií receptorov pre NGF a preštudovaných ciest pre prenos signálov boli receptory a cesty prenosu signálu v prípade ostatných neurotrofných faktorov ešte nedostatočne objasnené a štúdie sa zahajujú až v poslednej dobe. Avšak zdá sa, že sa BDNF viaže na LNGRF s afinitou, podobnou afinite NGF podľa publikácie Rodriguez-Tebar a ďalší, 1990, Neurón 4, 487 až 492. Napriek tomu, že na neurónoch, zodpovedajúcich na pôsobenie BDNF sa nachádzajú receptory s nízkou aj s vysokou aktivitou, je možné predpokladať podľa dosiahnutých výsledkov, že BDNF a NGF pôsobia na odlišné neuróny, pričom u neurónov, reagujúcich na pôsobenie NGF nedochádza k expresii receptorov s vysokou afinitou pre BDNF, takže BDNF zrejme využíva odlišný receptor s vysokou afinitou než NGF podľa Rodriguez-Tebar a Barde, 1988, J. Neurosc. 8, 337 až 3342.

Rad výsledkov podporuje príbuznosť pôsobenia BDNF a NT-3 a súčasne oba tieto neurotrofíny odlišuje od NGF. NT-3 a BDNF avšak nie NGF, sú faktory, u ktorých pri expresii dochádza v priebehu vývoja k nápadnému recipročnému pôsobeniu, pričom k expresii NT-3 dochádza vo väčšej miere vo včasnom štádiu a k prevážnej expresii BDNF dochádza v neskoršom štádiu vývoja tých oblastí mozgu podľa Maisonpierre a ďalší, 1990, Neurón, 5, 501 až 509. Je zaujímavé, že profily distribúcie pre BDNF a NT-3, avšak nie pre NGF sú v rôznych oblastiach dospelého mozgu veľmi podobné. V periférnych gangliách majú BDNF a NT-3, avšak nie NGF, hlavný účinok na ganglia dorsálnych koreňov a na nodosné ganglia, napriek tomu, že NT-3 má zrejme o ganglia sympatiku podľa Maisonpierre 247, 1446 až 1451. Naproti tomu niečo menší účinok na a ďalší, 1990, Science NGF prevažne pôsobí na ganglia dorsálnych koreňov a na ganglia sympatiku.

Tieto skutočnosti viedli k názoru, že BDNF a NT-3 by v niektorých prípadoch mohli pôsobiť na rovnaké skupiny neurónov a že pôsobenie NT-3 na tieto neuróny vo včasnom štádiu by mohlo byť neskoršie nahradené účinkom BDNF podľa Maisonpierre a ďalší, 1990b, Neurón, 5, 501 až 509. Okrem toho zistenie, že BDNF a NT-3 sú na rozdiel od NGF vysoko konzervované rastové faktory, dokonca až dosial najkonzervovanej šie opísané faktory, vedie k názoru, že by oba tieto faktory mohli spolupôsobiť s rôznymi receptormi a že ich konzervácia bola nutná práve z toho dôvodu, aby bolo možné udržať špecifickosť ich pôsobenia na tieto rôzne receptory.

Klein a ďalší, 1989, EMBO J., 8, 3701 až 3709 opísali izoláciu trkB, ktorý je kódom pre novú zlúčeninu zo skupiny látok, obsahujúcich tyrozínkinázu a receptorov, veľmi príbuzných ľudskému protoonkogénu trk. Na úrovni aminokyselín bolo dokázané, že trk a trkB majú 57% homológiu extracelulárnych oblastí a to včítane 9 z 11 cysteínových zvyškov, prítomných v trk. Táto homológia je zvýšená na 88 % v oblasti na katalytickú tyrozínkinázu. Bolo dokázané, že k expresii trkB u dospelých myší dochádza prednostne v mozgovom tkanive, aj napriek tomu, že pomerne vysokú hladinu RNA pre trkB je možné dokázať aj v pľúcach, svaloch a vaječníkoch. Okrem toho bolo možné preukázať transkripty trkB v,embryách v strednom a neskorom období gestácie. Pri analýze hybridizácie in situ v myších embryách vo veku 14 a 18 dni bolo preukázané, že transkripty trkB boli lokalizované v centrálnom aj periférnom nervovom systéme včítane mozgu, miechy, miechových a mozgových ganglií, paravertebrálneho reťazca sympatického nervového systému a tiež v rôznych dráhach pre nervové zásobenie, takže je možné, že produktom génu trkB môže byť receptor, ktorý sa zúčastňuje neurogenézie a včasného nervového vývoja a okrem toho môže hrať úlohu aj v nervovom systéme dospelých.

Klein a ďalší, 1990, Celí 61, 647 až 656 uvádzajú, že trkB myší je kódom pre aspoň dve skupiny molekúl, ktoré sú t* TI podobné receptorom a ktoré boli označené gpl45 a gp95^1:r^^B. Tieto molekuly majú zrejmé identické mimobunkové *t t* 1c fí a transmembránové oblasti, avšak len v prípade gpl45 bola preukázaná dlhá cytoplazmatická oblasť, ktorá zahrňuje katalytickú oblasť kinázy bielkovín. Transkripty trkB, ktoré sú kódom pre túto bielkovinu, bolo možné preukázať v mozgovej kôre a vo vrstve pyramídových buniek v hippokampe, ale transkripty, ktoré sú kódom pre gp95^tr^^B bolo možné preukázať v ependymovej vrstve, vystielajúcej mozgové komory a v plexus choroideus. Okrem toho sa v publikácii Middlemas a ďalší, 1991, Mol. Celí. Biol. 11, 143 až 153 opisuje existencia dvoch od seba odlišných, na C-zakončenie skrátených receptorov so spoločnou extracelulárnou oblasťou s transmembránovou oblasťou gpl45^tr^^B, obe látky sú však odlišné od gpl45^tr^^B (táto látka bola až dosial jednoducho označovaná ako trkB), pokiaľ ide o krátke cytoplazmatické zakončenia.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvorí spôsob detekcie a merania účinnosti neurotrofínu alebo identifikácie látok s účinnosťou, podobnou účinnosti neurotrofínu a aj systémy, ktoré je možné na toto stanovenie použiť. Spôsob podľa vynálezu je aspoň sčasti založený na zistení, že protoonkogén trkB je kódom pre receptor tyrozinkinázy, ktorý môže slúžiť ako funkčná väzbová bielkovina pre BDNF a pre NT-3. Systém tohto typu môže mať svoju zvláštnu hodnotu pri identifikácii nových látok zo skupiny neurotrofínov alebo látok s účinnosťou, podobnou účinnosti neurotrofínov. V rôznych vykonaniach je možné použiť metódy podľa vynálezu a zodpovedajúce systémy na detekciu a/alebo na meranie väzby neurotrofínu na bielkovinu trkB za použitia priameho štúdia väzby alebo pri detekcii sekundárnych účinkov väzby trkB na neurotrofín.

Podstatu vynálezu tvoria aj systémy, ktoré je možné použiť pri stanovaní vopred známych látok a tiež na preukázanie nových látok, ktoré môžu pôsobiť na receptor tyrozínkinázy. V niektorých prípadoch bude zrejmé možné tento systém využiť na preukázanie nových, dosial neznámych receptorov, ktoré môžu sprostredkovať odpoveď na už známe faktory. Vynález je aspoň sčasti založený na zistení, že protoonkogén trkB je kódom pre receptor tyrozínkinázy, ktorý je schopný nielen sprostredkovať prežívanie a diferenciáciu neurónov, závislých na BDNF/NT-3, ale je schopný okrem prežívania a diferenciácie, ale nie proliferárie neurónových buniek, v ktorých k jeho expresii dochádza, spôsobiť aj prežívanie a proliferáciu buniek, závislých na BDNF/NT-3 v prípade, že k jeho stálej expresii dochádza v zvláštnom klone bunkovej línie fibroplastov, označovaných NIH3T3.

Znamená to, že expresia receptora tyrozínkinázy vo fibroblastoch môže umožniť použitie týchto buniek pri skúškach na prežívanie a proliferáciu a to tak v prípade známych látok, napríklad neurotrofínov, ako aj pri objavovaní nových zlúčenín, ktoré sa taktiež môžu viazať na tento receptor tyrozínkinázy alebo na iné receptory tyrozínkinázy, pre ktoré až doposiaľ neexistuje žiadna známa väzná látka. Tieto systémy je možné použiť aj spoločne so systémami receptor/väzná látka (napríklad receptory trk a neurotrofíny), ktoré nemusia za bežných podmienok sprostredkovávať bunkovú proliferáciu. Hneď ako dôjde k tomu, že určitý systém receptor/väzná látka je definovaný tak, ako tomu je v prípade trkB a BDNF/NT-3, je možné využiť aj celý rad ďalších špecifických pokusných systémov.

Vynález sa ďalej týka celého radu samostatných molekúl, podobných receptoru tyrozínkinázy včítane piatich molekúl, ktoré sú homológne receptoru trk a látkam zo skupiny inzulínových receptorov a ďalších štyroch molekúl, ktoré sú homológne CSF1R/PDGFR, ret, eck (alfa) a eck (beta). Vynález sa taktiež týka spôsobu identifikácie receptorových molekúl, pričom môže ísť o molekuly s dosial neznámou väznou látkou, rovnako ako o ďalšie typy receptorov, ktoré je možné identifikovať uvedeným spôsobom.

Vynález je možné využiť na diagnostické aj liečebné účely. V zvláštnych vykonaniach je možné využiť nepravidelnosti vo funkcii trkB alebo expresiu tejto látky pri diagnóze rôznych neurologických porúch. V ďalších vykonaniach je možné využiť manipuláciu interakcie medzi trkB a neurotrofínom na liečenie rôznych neurologických ochorení, ako sú Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a amyotrofická laterálna skleróza (Lou Gehrigova choroba).

Použité skratky

BDNF	neurotrofný faktor z mozgového tkaniva
BSA	sérový albumín hovädzieho dobytka
CNTF	ciliárny neurotrofný faktor
DSS	disukcínimidylsuberát
HNGFR	receptor s vysokou afinitou pre faktor nervového rastu
LNGFR	receptor s nízkou afinitou pre faktor nervového rastu
HGF	faktor rastu nervov
NT-3	neurotrofin-3
pCMX-LNGFR	pCMX-vektor na expresiu receptora s nízkou afinitou pre faktor nervového rastu
p-CMX-trkB	pCMX-vektor na expresiu, modifikovaný na expresiu úplnej cDNA pre trkB potkany
pCMX-trkB(del)	modifikovaná forma pCMX-trkB, upravená na expresiu skrátenej formy trkB,

pT24-ras v ktorej chýba väčšina oblasti pre intracytoplazmatickú tyrozinkinázu plazmid, obsahujúci mutovanú (aktivovanú) verziu onkogénu ras.

Prehľad obrázkov na výkresoch obr. 1 všetky tri neurotrofiny sú schopné sa špecificky skrižene viazať na LNGFR, ku ktorého expresii dochádza v bunkách COS.

A. Žiadny z neurotrofínov nevykazuje kompetitivnu skríženú väzbu na bunky COS po transfekcii kontrolným vektorom, p-CMX. Rádioaktívne značená väzná látka, využitá pre každú dvojicu dráh je označená na vrchole dráhy (každá rádioaktívne značená väzná látka má koncentráciu v rozmedzí 0,1 až

0,25 nM) , znamená neprítomnosť a + znamená prítomnosť neznačenej homológnej väznej látky v Preukázateľné pásy, ktoré je možné koncentrácii 500 nM. pozorovať v prípade použitia rádioaktívne značeného NGF sa menili od pokusu k pokusu a neboli v kompetícii s neznačeným NGF, ako už bolo uvedené.

B. Všetky tri rádioaktívne značené neurotrofiny majú kompetitivnu schopnosť skríženej väzby (za vzniku komplexu s molekulovou hmotnosťou približne 100 000, ako je možné očakávať pre LNGFR) v bunkách COS po transfekcii pCMX-LNGFR. Dráhy sú označené rovnako ako v prípade A.

C. Zosietené látky v bunkách COS po transfekcii pomocou pCMX-LNGFR sa pohybujú spoločne so zosietenými väznými látkami v bunkách ľudského melanómu A875. Rádioaktívne značená väzná láitka bola v tomto prípade BDNF, použité bunky na zosietenie sú uvedené na hornej časti každej dvoj ice dráh a označenie a + je rovnaké ako v prípade A.

Obr. 2 Indukcia rastu neuritov v včasné expresie génov v bunkách PC12 ako reakcie na NGF, avšak nie na BDNF alebo NT-3.

A. Bunky PC12 boli pestované podľa doporučenia Greene a ďalší, 1987, Methods Enzymol. 147, 207 až 216 v prítomnosti 100 ng/ml BSA, NT-3, BDNF alebo NGF, ako je vyznačené. Boli použité rôzne koncentrácie neurotrofínov, znázornené sú koncentrácie, ktoré pre NGF zrejme znamenajú nasýtenie.

B. Transkripty fos a jun s 2,2 a 2,7 kb boli identifikované analýzou Northern blot celkovej bunkovej RNA z buniek PC12, pestovaných ako je uvedené vyššie v neprítomnosti exogénneho neurotrofného faktora, potom boli bunky podrobené počas 30 minút pôsobeniu 100 ng/ml BSA, NT-3, BDNF alebo NGF, ako j e uvedené.

Obr. 3 BDNF a NT-3, avšak nie NGF sa špecificky viaže na trkB po jeho expresii v bunkách COS.

A. Bunky COS boli podrobené transfekcii pri použití pCMX-trkB a chemicky zosietené za použitia každého z troch rádioaktívne značených neurotrofínov. Rádioaktívne značená väzná látka, použitá pre každú dvojicu dráh je uvedená v hornej časti dráh, každá z nich bola použitá v koncentrácii v rozmedzí 0,1 až 0,25 nM. - znamená neprítomnosť, + znamená prítomnosť neznačenej homológnej väznej látky v koncentrácii 500 nM. Zátvorka z hviezdička označujú zosietenú látku, zodpovedajúcu bielkovine trkB s molekulovou hmotnosťou približne 160 000 až 180 000.

B. Zosietenie v prípade rádioaktívne značeného NT-3 v neprítomnosti alebo v prítomnosti ( + ) neznačeného

NT-3 v koncentrácii 500 nM, bunky COS boli použité po transfekcii vektorom na expresiu skrátenej formy trkB, pCMX-trkB(del), ktorej chýba oblasť pre tyrozínkinázu. Zátvorka a hviezdička označuje zosietenú látku, ktorá zodpovedá skrátenej verzii trkB, táto mutanta s vypustením časti reťazca rná molekulovú hmotnosť 120 000 až 150 000.

Obr. 4 Zosietenie a väzba ^^^U-NT-3 a LNGFR je špecificky blokovaná všetkými troma neurotrofínmi, zatiaľ čo zosietenie a väzba NT-3 na trkB je špecificky blokovaná len pôsobením BDNF a NT-3.

A. Bunky COS boli podrobené transfekcii pôsobením pCMX-LNGFR a zosietené rádioaktívne značeným NT-3 v koncentrácii 0,1 až 0,25 nM. Neznačený neurotrofin, použitý ako kompetitívna látka je uvedený v hornej časti každej trojice dráh, pred dráhou je uvedená koncentrácia v nM.

B. Bunky COS boli podrobené a zosietené pôsobením rádioaktívne centrácia väznej látky v prípade A.

a označenie transfekcii pCMX-trkB značeného

NT-3. Kondráh bolo rovnaké ako

C. Bunky COS boli podrobené transfekcii za použitia pCMX-LNGFR pri väzných pokusoch s rádioaktívne značeným NT-3 v koncentrácii v rozmedzí 0,1 až 0,25 nM, graficky je znázornená kompetícia za použitia rôznych koncentrácií neznačeného NT-3, BDNF a NGF.

D. Bunky COS boli podrobené transfekcii pôsobením pCMX-trkB pri väzných pokusoch s rádioaktívne značeným NT-3 v koncentrácii v rozmedzí 0,1 až 0,25 nM. graficky je znázornená kompetícia za použitia rôznych koncentrácií neznačeného NT-3, BDNF a NGF. Uvedené údaje znamenajú priemer z dvoch skúšok a uvádzajú percento väznej látky v impulzoch za minútu.

Obr. 5 Diferenciácia buniek PC-12 po transfekcii vPMX-trkB v prítomnosti BDNF a NT-3.

A. Bunky PC12 po prechodnej transfekcii kontrolným plazmidom pT24-ras a po spracovaní pôsobením 100 ng/ml BSA, stanovený je počet buniek po prechodnej transfekcii v každom pokuse (podrobnosti budú ďalej uvedené).

B, C, D a E. Bunky PC12 boli podrobené prechodnej transfekcii pCMX-trkB a potom podrobené pôsobeniu 100 ng/ml NGF (obr. 5B), BSA (obr. 5C), NT-3 (obr. 5D) alebo BDNF (obr. 5E). Čísla v zátvorkách na spodnej strane každého obrázku označujú počet buniek PC12, u ktorých došlo k diferenciácii, to znamená buniek, ktorých neurity sú aspoň dvakrát dlhšie než je telo bunky, pozorované vo vyhĺbení s priemerom 35 mm po každom spracovaní. Aj napriek tomu, že sa absolútny počet buniek v priebehu troch vykonaných transfekciách menil, pomer diferencovaných buniek po rôznom spracovaní zostal vo všetkých troch nezávislých pokusoch stály. Žiadne diferencované bunky nebolo možné preukázať v bunkách PC12 po transfekcii pCMX-trkB po pôsobení BSA v troch oddelených pokusoch. Po otvorení pórov pôsobením elektrického prúdu boli bunky priamo nanesené na platne z plastickej hmoty bez povlaku tak, aby bolo možné vylúčiť akýkoľvek rast neuritov tak, ako bude ďalej opísané.

Obr. 6 Bunky ľudského neuroblastómu SH-SY5Y reagujú na NGF a BDNF, avšak nie na NT-3 a nedochádza u nich k expresii trkB.

A. Transkripty fos boli identifikované analýzou Northern blot v celkovej bunkovej RNA, pripravenej z buniek DH-SY5Y, pestovaných bez akéhokoľvek pridaného faktora a potom boli podrobené na dobu 30 minút pôsobeniu 100 ng/ml BSA, NGF, NT-3 alebo BDNF podľa označenia.

B. Transkripty trkB sú identifikované analýzou Northern blot za použitia 10 mikrogramov celkovej bunkovej RNA z mozočka dospelých potkanov (označené CB), avšak nie je možné ich preukázať v 10 mikrogramoch celkovej bunkovej RNA z buniek SH-SY5Y. Úplná kódová oblasť trkB bola použitá ako sonda, ktorou je možné identifikovať väčší počet transkriptov trkB podlá Kleina a ďalších, 1989, EMBO J. 8, 3701 až 3709. Dráha pre mozoček sa javí ako náter vzhľadom na príliš veľkú expozíciu v snahe preukázať transkripty v bunkách SH-SY5Y.

Obr. 7 Expresia LNGFR a trkB v pôvodných bunkách a v bunkách NIH3T3 po transfekcii pLTR-trkB.

A. Bolo vykonané chemické zosietenie rádioaktívne zna- čeného NT-3 s bunkami COS po transfekcii vektorom na expresiu podľa Squinto a ďalších, 1991, Celí 65, 1 až 20, zosietenie s pôvodnými bunkami NIH3T3 je znázornené v dráhach 3 a 4 a s bunkami NIH3T3 po transfekcii pLTR-trkB v dráhach 5 a 6. znamenajú neprítomnosť a + znamenajú prítomnosť neznačeného NT-3 v koncentrácii 500 nM. Zosietený LNGFR a trkB sú označené zátvorkami a ich vzhľad je veľmi podobný ako vzhľad zosietených materiálov podľa Squinto a ďalších, 1991, Celí 65, 1 až 20.

B. Analýza Northern blot expresie LNGFR v bunkách NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, v pôvodných bunkách NIH3T3, v bunkách PC12 a v bunkách SH-SY5Y. 10 mikrogramov celkovej RNA, pripravenej z každej z uvedených bunkových línií bolo frakcionovaných na formaldehydovom géli s výnimkou dráhy, ktorá je označená (PC12), v ktorej bolo 0,5 mikrogramov bunkovej RNA buniek PC12 zriedených 10 pg RNA buniek NIH3T3. Potom boli bunky prenesené na nylonovú membránu a hybridizované za použitia rádioaktívne značených sond pre LNGFR (hore) alebo pre trkB (dole).

Obr.8 znázorňuje schému transfekcie a selekcie, ktoré boli použité na získanie a na skúšky s bunkami NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB.

Bunky NIH3T3 boli podrobené transfekcii za použitia 5 mikrogramov pLTR-trkB, 1 mikrogramu pLTR-Hyg a 20 mikrogra mov ľudskej DNA ako nosiča, ako je opísané v príkladovej časti. Rovnaké podiely buniek po transfekcii boli nanesené na platne s určitým prostredím, obsahujúce uvedené faktory v koncentrácii 5 nM alebo boli bunky podrobené selekcii za použitia prostredia, obsahujúceho 10 % teľacieho séra a hygromycín. Bunky, odolné proti hygromycínu potom boli nanesené na definované živné prostredia rovnako ako je uvedené vyššie. Len malé množstvá kolónií bolo možné preukázať pri priamej selekcii na prostrediach, doplnených BDNF alebo NT-3, spojitú vrstvu buniek bolo možné preukázať na oboch týchto prostrediach za použitia buniek, odolných proti hygromycínu. V tabuľke znamená CONFL vytvorenie spojitej vrstvy buniek.

Obr. 9 Prežívanie buniek NIH3T3 a toho typu buniek, u ktorého dochádza k expresii trkB na prostrediach, doplnených bFGF alebo neurotrofínmi.

A. Pôvodné bunky (horný rad) alebo bunky NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB (spodný rad), boli pestované až do vytvorenia 20% spoj itej vrstvy a potom udržované na definovaných živných prostrediach bez uvedených faktorov alebo v ich prítomnosti v koncentrácii 5 nM celkom 5 dni.

B. Bunky NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB bo- li udržované pri rôznych koncentráciách BDNF, NT-3 alebo bFGF. znamená takmer úplné vyhynutie buniek, podobne ako k nemu dochádza v pôvodných bunkách NIH3T3 v neprítomnosti faktorov na obr. 9, +++ označuje prežívanie spojitej vrstvy buniek, zodpovedajúcej bunkám NIH3T3 v prítomnosti 5 nM bFGF na obr. 9A a + alebo ++ znamenajú stredný stupeň prežívania.

Obr. 10 Príjem tymidínu a proliferácie pri skúškach s fibroblastami, u ktorých dochádza k expresii trkB, ide o závislosť, podobnú závislosti na dávke neurotrofínov u primárnych neurónov.

A. Bola vykonaná skúška na príjem tymidínu u fibroplastov NIH3T3 v závislosti na vyznačených koncentráciách bFGF, NGF, BDNF a NT-3. Príjem tymidínu je vyjadrený v impulzoch za minútu v bunkách, odobratých z jedného vyhĺbenia platne obsahujúcej 24 vyhĺbení. Údaje o chybe nie sú vyznačené za použitia koncentrácie 5 nM každej väznej látky vzhľadom na to,že tieto skúšky neboli uskutočnené v dvojakom vykonaní.

B. Príjem tymidínu u fibroplastov NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB v prítomnosti uvedených koncentrácií pFGF, NGF, BDNF a NT-3.

C. Bola sledovaná proliferácia buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB v závislosti na rôznych koncentráciách bFGF, BDNF a NT-3. Do každého vyhĺbenia bolo vložených 5000 buniek, uvádza sa konečný počet buniek vo vyhĺbení.

D. Bolo sledované v disociovanej kultúre v ciách BDNF spôsobom podľa De. Biol., 112 : 30 až 48.

prežívanie primárnych neurónov závislosti na rôznych koncentrápublikácie Lindsay a Rohre, 1985,

Neuróny boli izolované z ganglia dorsálnych koreňov kuracích embryí vo veku 9 dní.

Obr. 11. Rýchla indukcia fosforylácie tyrozínu u fibroblastov, u ktorých dochádza k expresii trkB v prítomnosti BDNF a NT-3.

A. Fosforylácia tyrozínu v bielkovine s molekulovou hmotnosťou 145 000, ktorá je zrejmé trkB a je označená šípkou, je rýchlo vyvolaná v bunkách NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB po stimulácii pôsobením BDNF alebo NT-3. Bola vykonaná imunoprecipitácia rozrušených celých buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB a ktoré boli vystavené pôsobeniu uvedených faktorov počas 5 minút. Imunoprecipitácia bola uskutočnená za použitia antifosfotyrozínovej monoklonálnej protilátky, konjugovanej na agarózové guľôčky po frakcionácii elektroforézou na akrylamidovom géli s následným vykonaním imunoblotovej skúšky za použitia monoklonálnej protilátky, špecifickej pre fosfotyrozín.

B. Fosforyláciu tyrozínu v bielkovine s molekulovou hmotnosťou 41 000, ktorá je zrejme ERK2, je možné rýchlo vyvolať pôsobením bFGF, NT-3 a BDNF na bunky NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB. Lyzáty celých buniek, a to pôvodných buniek aj buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, boli vystavené pôsobeniu uvedených faktorov po dobu 5 minút, potom frakcionované elektroforézou na polyakrylamidovom géli a podrobené imunoblotovej skúške za použitia monoklonálnej protilátky, špecifickej proti fosfotyrosínu.

Obr. 12

A. Sú uvedené PCR-priméry, použité na amplifikáciu reťazcov, homológne so známymi molekulami tyrozínkinázy.

B. Je znázornený reťazec aminokyselín pre novú klonovanú tyrozínkinázu.

C. Reťazec nukleových kyselín a minokyselín pre klony tyrozínkinázy Rtk-1, Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8 a Rtk-9, uvedené sú aj zdroje cDNA a priméry, použité v PCR-reakcii a porovnanie s homológnymi molekulami.

D. Porovnanie reťazca Rtk-1 z cDNA potkana s reťazcom pre trkA a trkB.

E. Oblasti homológie tyrozínkinázy tak, ako boli identifikované v publikácii Hans a ďalší, 1988, Science 241, 42 až 52.

Obr. 13

A. Porovnanie oblasti tyrozínkinázy receptorov trk a podskupiny inzulínových receptorov.

B. Reťazce nukleových kyselín a aminokyselín pre Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5.

C. Porovnanie odvodených reťazcov aminokyselín pre a Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5 s reťazcom ľudského trk.

* D. Porovnanie odvodeného reťazca aminokyselín pre

Rtk-2 s ľudským trk, potkaním trkB, receptorom pre rastový faktor, príbuzným receptoru inzulínu a receptorom pre inzulín .

Obr. 14 Je znázornený nukleotidový reťazec a odvodený reťazec aminokyselín pre Rtk-2.

Obr. 15 Je znázornený nukleotidový reťazec a reťazec aminokyselín pre Rtk-3.

Obr. 16 Sú porovnané reťazce Rtk-3 s reťazcami pre Rtk-2, trk, trkB, receptor pre rastový faktor, príbuzný receptoru pre inzulín (IGF-R) a receptor pre inzulín (INS-R).

o

Obr. 17 Graficky je znázornený účinok neurotrofínu NGF, BDNF . a NT-3 na rast neuritov v gangliách dorsálnych koreňov embrya potkana vo veku 14 dní. Koncentrácia neurotrofínov sa pohybovala v rozmedzí 0,05 pg/ml až 50 ng/ml, doba pestovania bola 24 hodín.

Obr. 18 Embryonálne DRG boli pestované 24 hodín v prítomnosti 50 ng/ml NGF a potom bola zistená koncentrácia mRNA pre trkA a trkB. Ako kontrola boli odobrané DRG z potkana bez následného pestovania.

Obr. 19 Embryálne DRG boli pestované v prítomnosti BDNF 50 ng/ml alebo NT-3 50 ng/ml celkom 24 hodín, potom bo la stanovená koncentrácia mRNA pre trkA, B a C. Úroveň tohoto materiálu bola skúmaná aj v mediodorsálnej a ventrálnej mieche potkaních embryí vo veku 14 dní.

Z dôvodu lepšieho vysvetlenia podstaty vynálezu ⁴ uvádzame aj nasledujúce odstavce:

• i) systémy s metódy na vykonávanie skúšok, ii) pokusné modelové systémy, iii) diagnostické metódy, iv) liečebné metódy,

v) systémy na skúmanie a dôkaz látok, pôsobiacich na receptor tyrozínkinázy a nové receptory tyrozínkinázy.

Systémy íl metódy na vykonávanie skúšok

Metódy

Vynález sa týka systémov a metód, ktoré môžu byť použité na detekciu a/alebo meranie účinnosti neurotrofínov alebo na identifikáciu látok s podobnou účinnosťou. Pod pojmom účinnosť neurotrofínov sa rozumie účinnosť BDNF alebo _t NT-3 alebo ďalších, až dosial neidentifikovaných neurotrofných faktorov alebo iných, neneurotrofných faktorov včítane , peptidov a nepeptidových molekúl, ktoré sú schopné sa viazať na trkB. Látky, ktoré majú neurotrofínovú účinnosť zahrňujú, avšak nie sú obmedzené na neurotrofné a neneurotrofné faktory včítane peptidových a nepeptidových molekúl, ktoré majú biologickú účinnosť, podobnú BDNF a/alebo NT-3, pokiaľ ide o včasnú indukciu génu, ovplyvnenie bunkových typov, vyvolaných javov a podobne. Biologické účinky BDNF a NT-3, boli opísané v PCT patentových prihláškach č. PCT/US90/04915 a PCT/US90/04916. Na účely vynálezu budú neurotrofíny a látky s účinnosťou neurotrofínov označované ako skúmané látky.

Vynález navrhuje spôsob detekcie alebo merania neurotrofinovej účinnosti, ktorý spočíva v tom, že sa

i) bunka, u ktorej dochádza k expresii trkB vystaví pôsobeniu skúmané látky a ii) merá sa alebo sa dokazuje špecifická väzba skúmanej látky na trkB, pričom špecifická väzba na trkB je v pozitívnej korelácii s neurotrofnou účinnosťou.

Bunka, u ktorej dochádza k expresii trkB môže byť buď bunka, u ktorej k tejto expresii dochádza prirodzene alebo bunka, získaná genetickým inžinierstvom tak, aby u nej k tejto expresii dochádzalo. Je napríklad možné zaviesť do bunky reťazec nukleovej kyseliny, ktorý je kódovým reťazcom pre trkB a bol získaný napríklad spôsobom podľa odstavca (Klonovanie trkB potkana, expresia u cicavcov, konštrukcia a prechodná transfekcia) a to transfekciou, transdukciou, mikroinjekciou, otvorením pórov pomocou elektrického prúdu, cez transgénneho živočícha a podobne za použitia akéhokoľvek známeho postupu. Transfekcia buniek COS a buniek PC12 bude napríklad opísaná v odstavci 6, opis použitého systému je opísaný v odstavci (Systémy).

Špecifickú väzbu skúmanej látky na trkB je možné merať celým radom postupov. Napríklad väzbu skúmanej látky na bunky, u ktorých dochádza k expresii trkB je možné preukázať alebo merať tak, že sa preukazuje alebo meria:

i) skúmaná látka, viazaná na povrch neporušených,buniek, ii) skúmaná látka, viazaná skríženou väzbou na bielkovinu trkB v materiáli z rozrušených buniek alebo iii) skúmaná látka, viazaná na trkB in vitro.

Špecifická interakcia medzi skúmanou látkou a trkB môže byť vyhodnotená za použitia reakčných činidiel, ktoré preukazujú špecifické vlastnosti tejto interakcie. Bolo naprík lad preukázané spôsobom podlá vynálezu (odstavec Gén pre trkB je kódom pre funkčný receptor pre BDNF a NT-3, avšak nie pre NGF), že BDNF a NT-3 sú schopné sa viazať na trkB, avšak NGF nie je schopné sa viazať. To znamená, že špecifická väzba skúmanej látky na trkB m)že byť kompetitivne inhibovaná pôsobením BDNF alebo NT-3, avšak nie pôsobením NGF).

Ďalej bude uvedený špecifický príklad spôsobu podlá vynálezu, ktorý však nemá slúžiť na obmedzenie vynálezu. Uvažuje sa prípad, ktorý však nemá slúžiť na obmedzenie vynálezu. Uvažuje sa prípad, v ktorom je potrebné merať vo vzorke množstvo neurotrofínu, napríklad BDNF. V tomto prípade je možné vystaviť bunkám rôzne riedenia vzorky so skúmanou látkou, okrem toho sa použije negatívna kontrola NC bez obsahu účinnosti typu BDNF a pozitívna kontrola PC, ktorá obsahuje známe množstvo BDNF, použijú sa bunky, u ktorých dochádza k expresii trkB v prítomnosti zistiteľné značeného BDNF, v tomto prípade BDNF, značeného rádioaktívnym jódom. Množstvo BDNF v skúmanej vzorke je možné preukázať tak, že sa stanoví množstvo I-značeného BDNF, ktoré sa viaže na jednotlivé kontroly v každom riedení a potom sa porovnáva so štandardnou krivkou hodnota pre skúmanú vzorku. Čím viac BDNF sa nachádza vo vzorke, tým menšie množstvo I-BDNF sa bude viazať na trkB. Množstvo viazaného značeného BDNF je možné preukázať meraním rádioaktivity v bunke alebo väzbou BDNF na bielkoviny bunkového povrchu za použitia DSS podlá publikácie Meakin a Shooter, 1991, Neurón, 6, 153 až 163 s následnou detekciou množstva značenej bielkoviny v bunkových extraktoch napríklad za použitia elektroforézy na SDS-polyakrylamidovom géli, čím je možné preukázať značené bielkoviny s velkosťou molekuly, zodpovedajúcej BDNF, viazanému na trkB. Špecifická interakcia skúmanej látky a trkB môže byť ďalej skúmaná tak, že sa k vzorke pridá neznačený NGF v rôznom zriedení. Táto látka by nemala mať žiadny podstatný vplyv na kompetíciu medzi značeným BDNF a skúmanou látkou pri väzbe na trk. Je tiež možné použiť látku, o ktorej je známe, že je schopná prerušiť väzbu neurotrofín/trkB, napríklad neznačený NT-3 alebo protilátku proti trkB, čím je 1 O <

možné dosiahnuť kompetíciu medzi ^{LZ J}I-BDNF a skúmanou látkou pri väzbe na trkB.

Zistiteľné značený neurotrofín zahrňuje napríklad neurotrofín, viazaný kovalentne alebo nekovalentne na rádio• aktívnu látku, fluorescenčnú látku, látku s enzymatickým účinkom, látku ktorá môže byť substrátom pre určitý enzým (pričom sa dáva prednosť enzýmom a substrátom, u ktorých je možné priebeh reakcie dokázať kolorimetricky) alebo látku, ktorú je možné rozpoznať molekulou protilátky, s výhodou zistiteľné značenou molekulou protilátky.

Špecifickú väzbu skúmanej látky na trkB je možné preukázať aj tak, že sa vyhodnotia sekundárne biologické účinky väzby neurotrofínu na trkB, ide napríklad o indukciu rastu nervových látok, včasnú expresiu génu alebo fosforyláciu trkB tak, ako je znázornená na obr. 11. Napríklad schopnosť skúmanej látky vyvolať rast nervových vlákien je možné skúmať na bunkách, ktoré neobsahujú trkB a na porovnateľných bunkách, u ktorých k expresii trkB dochádza. Rast nervových látok v bunkách, u ktorých dochádza k expresii trkB, avšak nie v porovnateľných bunkách, ktorým trkB chýba, môže poukazovať na špecifickú interakciu medzi skúmanou látkou a trkB. Podobnú analýzu je možné vykonať tak, že sa stanoví včasná _Λ tvorba génu (napríklad fos a jun) v bunkách trkB-mínus a trkB-plus alebo tak, že sa preukazuje fosforylácia trkB za použitia štandardných skúšok na fosforyláciu, ako sa všeobecne vykonávajú. Analýzy tohoto typu môžu byť vhodné na identifikáciu agonistov alebo antagonistov neurotrofínu, ktorý sa neviaže kompetitívne na trkB.

Môže byť napríklad žiaduce stanoviť, či určitá skúmaná vzorka obsahuje BDNF. V bunkách, dobre charakterizovanej bunkovej línie neuroblastómu nedochádza k vyrastaniu nervových vlákien po pôsobení BDNF, ako bude ďalej podrobnejšie uvedené v príkladoch a ako je znázornené na obr. 2A. Avšak v bunkách PC12 po transfekcii trkB dochádza k vyrastaniu nervových vlákien po pôsobení BDNF, ako bude taktiež Ďalej opísané v príkladoch a ako je znázornené na obr. 5. Je teda možné normálne bunky PC12 (trkB-mínus) a bunky PC12 po transfekcii trkB (trkB-plus) vystaviť pôsobeniu vzorky (skúmanej látky) a potom je možné hodnotiť mikroskopicky, či vyrastajú alebo nevyrastajú nervové vlákna. V ďalšom možnom príklade vykonania je možné merať množstvo BDNF v skúmanej vzorke tak, že sa stanoví množstvo vyrastajúcich nervových látok alebo miera indukcie génu vo včasnom štádiu a získané hodnoty sa porovnávajú so štandardnou krivkou závislosti účinku na dávke určitého neurotrofínu, v tomto prípade BDNF.

Vynález sa týka aj spôsobu identifikácie zlúčeniny s účinnosťou neurotrofínu, postup spočíva v tom, že sa

i) bunka, u ktorej dochádza k expresii trkB vystaví pôsobeniu skúmanej látky, a na to sa ii) preukáže špecifická väzba skúmanej látky na trkB.

V tomto prípade je špecifická väzba na trkB v pozitívnej korelácii s účinnosťou, podobnou účinnosti neurotrofínu. Špecifickú väzbu je možné preukázať buď priamym stanovením väzby alebo sekundárnymi biologickými účinkami, ku ktorých dochádza v dôsledku tejto väzby, ako už bolo vyššie uvedené. Tento postup môže byť zvlášť vhodný na identifikáciu nových látok zo skupiny neurotrofínov alebo vo farmaceutickom priemysle na sledovanie veľkého množstva peptidových a nepeptidových látok, napríklad peptidomimetík, na účinnosť, podobnú účinnosti neurotrofínov. Vo výhodnom špecifickom vykonaní spôsobu podľa vynálezu je možné pripraviť veľké množstvo platní s vyhĺbeniami, ktoré v jednotlivých radoch striedavo obsahujú bunky PC12 alebo fibroblasty, ktoré sú buď trkB-mínus alebo po genetickom spracovaní trkB-plus. Potom je možné pridávať rad skúmaných látok tak, že v každom stĺpci platne alebo v stanovenej časti tohoto stĺpca bude obsiahnutá odlišná skúmaná látka. Potom sa v každom vyhĺbení stanoví prítomnosť alebo neprítomnosť vyrastajúcich nervových látok. Týmto spôsobom je možné preukázať veľký počet neznámych látok na neurotrofínovú účinnosť.

V ďalšom vykonaní sa vynález týka aj spôsobu detekcie merania neurotrofínovej účinnosti alebo spôsobu identifikácie zlúčeniny ako látky s neurotrofínovým účinkom, tento postup spočíva v tom, že sa

i) skúmaná látka vystaví pôsobeniu bielkoviny trkB in vitro za podmienok, pri ktorých môže dôjsť k väzbe a potom sa ii) preukazuje väzba skúmanej látky na bielkovinu trkB, pričom väzba skúmanej látky na trkB je v priamej korelácii s neurotrofínovým účinkom alebo účinkom, podobným účinku neurotrofínu. Pri vykonávaní týchto postupov môže, avšak nemusí, byť použitá v podstate čistá bielkovina trkB, okrem toho môže byť uvedená bielkovina viazaná na tuhý nosič, napríklad na stĺpec pre afinitnú chromatografiu alebo vo forme skúšky ELISA alebo môže byť bielkovina uložená na umelo vytvorenú membránu. Väzba skúmanej látky na bielkovinu trkB môže byť vyhodnotená akýmkoľvek bežným spôsobom. Vo výhodnom uskutočnení môže byť väzba skúmanej látky vyhodnotená alebo zmeraná vyhodnotením schopnosti kompetície so zistiteľné značenými známymi látkami, schopnými sa viazať na trkB.

Vynález sa týka aj spôsobu detekcie schopnosti skúmanej zlúčeniny pôsobiť ako antagonista účinku neurotrofínu, postup spočíva v tom, že sa dokazuje schopnosť zlúčeniny spôsobiť inhibíciu vplyvu väzby neurotrofínu na trkB v bunke, u ktorej dochádza k expresii trkB. Antagonista tohoto typu môže, avšak nemusí brániť väzbe trkB na neurotrofín. Účinky väzby neurotrofínu na trkB sú obvykle biologické alebo biochemické, ide napríklad o vyvolanie rastu nervových vlákien, podporu prežívania buniek alebo ich proliferáciu, vyvolanie transformácie buniek, vyvolanie tvorby génu vo včasnom štádiu alebo vyvolanie fosforylácie trkB. je napríklad možné postupovať tak, že sa bunky PC12, fibroblasty alebo iné bunky po transfekcii trkB vystavia účinku účinného množstva BDNF alebo účinného množstva BDNF spolu so skúmanou látkou, ktorej antagonistický účinok na BDNF by mal byť preukázaný. Potom sa porovnáva vyrastanie nervových vlákien u týchto dvoch skupín buniek a vyrastanie vlákien v bunkách, ktoré neboli podrobené transfekcii, avšak boli vystavené pôsobeniu BDNF alebo BDNF a skúmanej látky alebo NGF alebo NGF a skúmanej látky. V prípade že antagonižujúca látka spôsobuje špecifickú inhibíciu BDNF, malo by k inhibícii vyrastania nervových látok dôjsť len v bunkách trkB-plus po pôsobení BDNF spolu so skúmanou látkou v porovnaní s bunkami trkB-plus, vystavenými len pôsobeniu BDNF a malo by dôjsť len k malej alebo by nemalo dôjsť k žiadnej inhibícii rastu nervových látok v bunkách trkB-mínus po pôsobení NGF a skúmanej látky v porovnaní s bunkami trkB-mínus, napríklad s bunkami PC12 po pôsobení samotného neurotrofinu NGF.

Systémy

Vynález sa týka aj systémov, ktoré je možné používať na vykonávanie vyššie opísaných postupov. Tieto systémy môžu spočívať v príprave trkB in vitro napríklad vo forme, viazanej na tuhý nosič alebo môžu byť tvorené bunkami, u ktorých dochádza k expresii bielkoviny trkB.

Bunky, u ktorých dochádza k expresii bielkoviny trkB, majú túto svoju funkciu prirodzene alebo ju môžu získať po úprave genetickým inžinierstvom tak, aby produkovali trkB napríklad po transfekcii, transdukcii, otvorením pórov pomocou elektrického prúdu, mikroinjekcií, využitím tränsgénneho živočícha a podobne použitím kódovej nukleovej kyseliny pre trkB, uloženej do vhodného vektora na expresiu.

Je možné použiť akýkoľvek v danej oblasti techniky zná my postup na uloženie fragmentu DNA do vektora a tak uskutočniť konštrukciu vektora na expresiu s kódovým reťazcom pre trkB. Vektor môže obsahovať chimérny gén, obsahujúci aj príslušné riadiace signály na transkripciu a transláciu a okrem toho kódový reťazec pre uvedenú bielkovinu. Postupy môžu spočívať v rekombinácii DNA in vitro a v genetických rekombinačných postupoch in vivo. Expresiu reťazca nukleovej kyseliny, ktorý je kódovým reťazcom pre bielkovinu trkB alebo jej peptidový fragment je možné riadiť pomocou druhého reťazca nukleovej kyseliny tak, aby v rekombinantnej molekule DNA bola obsiahnutá molekula, umožňujúca expresiu bielkoviny trkB alebo jej peptidového fragmentu v transformovanom hostiteľovi. Expresiu trkB je možné riadiť napríklad akýmkoľvek známym prvkom, ako je promótor alebo zosilňovač transkripcie. Promótory, ktoré je možné využiť na riadenie expresie trkB zahrňujú napríklad dlhé opakované koncové reťazce, opísané v publikácii Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20, oblasť promótora SV40 podľa Bernoist a Chambon, 1981, Náture 290, 304 až 310, promótor CMV, terminálne opakovanie M-MuLV 5’ promótora, obsiahnutého v 3’-dlhej terminálnej repetícii vírusu Rousovho sarkómu podľa Yamamoto a ďalších, 1980, Celí 22, 787 až 797, promótor na tymidínkinázu vo víruse oparu podľa Vagner a ďalší, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 144 až 145, riadiaci reťazec metalotioneínového génu podľa Brinster a ďalší, 1982, Náture 296, 39 až 42, prokaryotické vektory na expresiu, napríklad promótor pre *I704*12*b*1704*10*-laktamázu podľa Villa-Kamaroff a ďalší, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 3728 až 3731 alebo tac-promótor podľa DeBoer a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 21 až 25 a tiež Useful.proteins from recombinant bacteria, Scientific Američan, 1980, 242, 74 až 94, ďalej je možné použiť promótory z kvasiniek alebo iných húb, napríklad promótor Gal 4, promótor ADH pre alkoholdehydrogenázu, promótor PGK pre fosfoglycerolkinázu, promótor pre alkalickú fosfatázu a tiež ďalšie riadiace oblasti na transkripciu u rôznych živočíchov, ktoré sú špecifické pre určité tkanivá a boli už použité u transgénnych živo číchov, je to napríklad riadiaca oblasť génu pre elastázu I, ktorá je účinná u acinárnych buniek slinivky brušnej podľa Swift a ďalší, 1984, Celí 38, 639 až 646, Ornitz a ďalší,

1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399 až 409, MacDonald, 1987, Hepatology 7, 425 až 515, riadiaca oblasť génu pre inzulín, ktorá je účinná v bunkách beta slinivky brušnej podľa Hanahan, 1985, Náture 315, 115 až 122, riadiaca oblasť imunoglobulínového génu, ktorá je účinná v lymfoidných bunkách podľa Grosschedl a ďalší, 1984, Celí 38, 647 až 658. Adames a ďalší, 1985, Náture 318, 533 až 538, Alexander a ďalší, 1987, Mol. Celí. Biol. 7, 1436 až 1444, riadiaca oblasť vírusu nádoru mliečnej žľazy myši, ktorá je aktívna v bunkách varlat, mliečnej žľazy, v lymfoidných a tukových bunkách podľa Leder a ďalší, 1986, Celí 45, 485 až 495, riadiaca oblasť génu pre albumín, ktorá je aktívna v pečeni podľa Pinkert a ďalší 1987, Genes and Devel. 1, 268 až 276, riadiaca oblasť génu pre alfa-fetoproteín, ktorá je aktívna v pečeni podľa Krumlauf a ďalší, 1985, Mol. Celí. Biol. 5, 1639 až 1648, Hammer a ďalší, 1987, Science 235, 53 až 58, riadiaca oblasť génu pre alfa-l-antitrypsín, ktorá je aktívna v pečeni podľa Kelsey a ďalší, 1987, Genes and Devel. 1, 161 až 171, riadiaca oblasť génu pre beta-globin, ktorá je aktívna v myeloidných bunkách podľa Morgam a ďalší, 1985, Náture 315, 338 až 340, Kollians a ďalší, 1986, Celí 46, 89 až 94, riadiaca oblasť génu pre bázický myelín, ktorá je účinná v oligodendrocytoch mozgu podľa Readhead a ďalší,

1987, Celí 48, 703 až 712, riadiaca oblasť génu pre ľahký reťazec 2 myozínu, ktorá je účinná v kostérnych svaloch podľa Sani, 1985, Náture 314, 283 až 286 a riadiaca oblasť génu na uvoľnenie gonadotropného hormónu, ktorá je účinná v hypotalame podľa Mason a ďalší, 1986. Science 234, 1372 až 1378.

Vektory na expresiu, ktoré obsahujú uložený gén pre trkB je možné identifikovať troma odlišnými postupmi:

a) hybridizáciou DNA-DNA,

b) prítomnosťou alebo neprítomnosťou funkcie značiaceho génu alebo

c) expresiou uloženého reťazca.

Pri vykonaní prvého postupu je možné preukázať prítomnosť cudzorodého génu, uloženého do vektora na expresiu pomocou hybridizácie DNA-DNA za použitia sond s obsahom reťazcov, ktoré sú homológne s reťazcom uloženého génu trkB. Pri vykonávaní druhého postupu je možné identifikovať a podrobiť selekcii systém rekombinantného vektora a hostiteľa v závislosti na prítomnosti alebo neprítomnosti funkcie určitého značiaceho génu, ako je účinnosť tymidínkinázy, odolnosť voči antibiotikám, transformovaný fenotyp, tvorba oklúznych teliesok v baculovíruse a podobne, tieto funkcie vznikajú v dôsledku uloženia cudzorodého génu do vektora. Napríklad v prípade, že sa do reťazca značiaceho génu vo vektore uloží gén trkB, je možné identifikovať rekombinanty, ktoré tento vložený gén obsahujúci na základe neprítomnosti funkcie značiaceho génu. Podľa tretieho postupu je možné identifikovať rekombinantné vektory na expresiu tak, že sa identifikuje produkt cudzorodého génu, ku ktorého expresii dochádza u hostiteľa po uložení rekombinantného vektora. Tieto skúšky môžu byť založené napríklad na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach produktu génu trkB, napríklad na základe väzby receptora a neurotrofného faktora alebo pomocou protilátky, ktorá je schopná priamo rozpoznať trkB. Bunky, získané podľa vynálezu môžu byť transformované tak, že u nich prechodne alebo s výhodou konštitutívne a trvalé dochádza k expresii trkB.

Vo výhodnom uskutočnení sa vynález týka aj buniek, u ktorých dochádza k expresii trkB a ktoré obsahujú aj rekombinantnú nukleovú kyselinu, obsahujúcu promótor génu, vznikajúceho vo včasnom štádiu, ide napríklad o promótory fos alebo jun podľa Gilman a ďalší, 1986, Mol. Celí, Biol. 6, 4305 až 4316. V prípade, že sa takáto bunka vystaví pôsobeniu neurotrofínu, je možné očakávať, že sa neurotrofin bude viazať na trkB a sekundárne vyvolá transkripciu včasné ho promótora. Bunku tohto typu je možné použiť na detekciu väzby neurotrofínu a trkB meraním účinnosti transkripcie promótora včasné vytváraného génu, napríklad analýzou jadier, analýzou Northern blot alebo meraním množstva génu, riadeného promótorom. Včasný promótor je možné použiť na riadenie expresie génu fos alebo jun alebo akéhokoľvek zistiteľného produktu génu, napríklad včítane akéhokoľvek známeho zistiteľného génu, ako génu na odolnosť proti hydromycínu podľa Murphy a Efstratiadis, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84, 8277 až 8281, génu pre chloramfenikolacetyltransferázy CAT, neomycínfosfotransferázu neo, beta-galaktozidázu, beta-glukoronidázu a podobne. V špecifickom vykonaní je možné očakávať, že pri väzbe neurotrofínu a trkB v bunke, v ktorej dochádza k expresii trkB a ktorá obsahuje gén pre ľudský rastový hormón, pod riadením promótora génu fos dôjde k produkcii rekombinantného ľudského rastového hormónu, ako bolo opísané v Seldon a ďalší, 1986, Mo. Celí. Biol., 6, 3173 až 3179. V ďalšom možnom vykonaní je možné využiť expresiu trkB ako značiaci gén a uložiť ho pod riadením včasného promótora naviac k trkB, k expresii ktorého dochádza konštitutívne, čím je možné dosiahnuť amplifikovanú odpoveď na neurotrofin. Takto uložený gén na expresiu trkB a bunková línia, ktorá ho obsahuje môžu predstavovať výnimočne citlivý a účinný systém na detekciu alebo meranie účinnosti neurotrof ínov .

Okrem toho je možné ako pokusný systém pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu použiť bunky nervového systému, vynález však nie je na tento typ buniek obmedzený. Napríklad v špecifickom vykonaní je možné ako základ systému,na dôkaz neurotrofínu použiť fibroblasty, závislé na rastovom faktore, ako bude ďalej uvedené v príklade 2. Transfekciu génom trkB je napríklad možné použiť v bunkovej línii fibroblastov, závislých na rastovom faktore, v prostredí, zbavenom séra, napríklad podľa publikácie Zham a Goldfarb, 1986, Mol. Celí. Biol. 6, 3541 až 3544, je napríklad možné použiť fosforečnan vápenatý spolu s 5 mikrogramami vektora na expresiu na báze príslušnej DNA a promótora CMV v prítomnosti génu pre trkB potkana a spolu s 1 mikrogramom vektora na expresiu génu na odolnosť proti hydromycínu. Po 48 hodinách je potom možné bunky podrobiť selekcii podľa odolnosti proti hydromycínu a tak identifikovať bunky, u ktorých došlo k pozitívnej transfekcii. Tieto bunky je potom možné pestovať približne 3 týždne v prítomnosti hydromycínu odolné. Získané bunky sa potom naočkujú na platne na pestovanie tkanivových kultúr, vybavené povlakom poly-D-lyzínu a ľudského fibronectínu a bunky sa nechajú rásť približne 4 hodiny na prostredí DMEM s 10 % teľacieho séra tak, aby došlo k väzbe buniek na platne. Potom sa prostredie s obsahom séra odsaje a bunky sa trikrát premyjú PBS na odstránenie akéhokoľvek zvyšku séra. Potom sa bunky prenesú buď do definovaného prostredia, ktoré je zbavené séra (zmes DMEM a Gams F12 v pomere 3:1, doplnená 8 mM hydrogénuhličitanu sodného, 15 mM GEPES, 4 x 10^ M chloridu manganatého, 3 mM histidínu, 10“^ M etanolamínu, 10 M selenitu sodného, 5 mg transferínu na liter, 200 mg komplexu sérového albumínu a kyselinu linoleínovú na liter, ďalej obsahuje prostredie gentamycínu, penicilínu a streptomycínu a 20 mM L-glutamínu). Bunky, získané týmto spôsobom sa potom inkubujú v prítomnosti neurotrofínu, napríklad 100 ng/ml NT-3 alebo BDNF a po 5 dňoch pestovania, pri ktorom sa každých 48 hodín použije čerstvé živné prostredie s rastovými faktormi, je možné očakávať rast a vývoj buniek. Bunky v prítomnosti NGF v koncentrácii 100 ng/ml alebo bunky v prostredí, zbavenom séra, by sa však nemali vyvíjať, ako je zrejmé aj z obr. 7. Ako bude ďalej podrobnejšie vysvetlené v príklade 1, získané výsledky naznačujú, že v bunkách SH-SY5Y zrejmé dochádza k expresii ďalšieho receptora pre BDNF, ktorý je odlišný od trkB. Vynález sa týka aj systémov a postupov, pri ktorých sa využívajú receptory, odlišné od trkB spôsobom, ktorý je analogicky postupom, pri ktorých sa receptor trkB využíva.

Pokusné modelové systémy

Vynález sa týka aj pokusných modelových systémov na štúdium fyziologickej úlohy látok zo skupiny génov pre neurotrofiny. V týchto pokusných modelových systémoch môže byť bielkovina trkB, jej peptidové fragmenty alebo jej deriváty do systému dosávané alebo môžu byť v tomto systéme produkované. Pokusné modelové systémy je možné použiť na štúdium prebytku neurotrofínu alebo jeho nedostatku. Tieto pokusné systémy je tiež možné použiť na štúdium vplyvu zvýšenej alebo zníženej odpovede na neurotrofín v bunke, v tkanivovej kultúre alebo u neporušených živočíchov, zvlášť v bunkách alebo tkanivách neporušených živočíchov alebo v tkanivových kultúrach v priebehu špecifických časových období včítane embryonálneho vývoja. Ide najmä v vykonania, v ktorých je expresia trkB riadená indukovatelným alebo vývojovo riadeným promótorom. V špecifickom vykonaní vynálezu je možné použiť promótor CMV na riadenie expresie trkB u transgénických živočíchov. Pod uvedeným pojmom sa v priebehu prihlášky rozumie transgénický živočích, odlišný od človeka, ktorý v sebe nesie a to v niektorých svojich bunkách alebo vo všetkých, cudzorodý gén. Tieto živočíchy, odlišné od človeka je možné získať rôznymi známymi postupmi, napríklad mikroinjekciou, fúziou buniek, transfekciou, otvorením pórov pôsobením elektrického prúdu a podobne. Napríklad živočíchy je možné získať mikroinjekciou zygot známymi postupmi, napríklad spôsobom podlá publikácie Brinster a ďalší, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4438 až 4442.

Vynález sa týka aj modelových systémov na štúdium autoimunologických ochorení, u ktorých je autoimunologická odpoveď smerovaná proti trkB. Týmto modelom môžu byť napríklad živočíchy, ktoré boli imunizované imunogénnym množstvom trkB a u ktorých je s výhodou možné preukázať tvorbu protilátok proti trkB a/alebo vznik bunkovo sprostredkovanej imunity. Na získanie takéhoto modelového systému môže byť vhodné podávať trkB spolu s pomocným činidlom na zvýšenie imunologickej odpovede, ako je napríklad Bacillus Calmette Guerin (BCG).

Modely na štúdium zvýšenej účinnosti neurotrofínu

Pokusný modelový systém na toto použitie je napríklad možné vytvoriť tak, aby ho bolo možné použiť na štúdium zvýšenej účinnosti neurotrofĺnov. V takomto systéme je možné odpoveď na neurotrofin zvýšiť tak, že sa skonštruuje zvýšený počet molekúl trkB v bunkách modelového systému v porovnaní s nespracovanými bunkami. Môže byť vhodné použiť zvýšený počet neurotrofínu selektívne v bunkách, u ktorých k expresii neurotrofínov za obvyklých podmienok dochádza.

Bunky je možné skonštruovať tak, aby dochádzalo k produkcii zvýšeného množstva bielkoviny trkB po infekcii vírusom, ktorý nesie gén trkB podľa vynálezu. Gén trkB je možné do buniek dodať aj transfekciou.

V prípade, že modelovým systémom má byť živočích, je možné do buniek tohto živočícha uložiť rekombinantný gén pre trkB infekciou vírusom, ktorý uvedený gén nesie. Je tiež možné vytvoriť transgénického živočícha, ktorý bude niesť gén trkB ako cudzorodý gén.

Aby bolo možné zaistiť expresiu trkB, je potrebné uložiť gén pre trkB pod riadením vhodného promótora. Môže byť žiaduce uložiť gén pre trkB pod riadením konštitutívneho promótora a/alebo promótora, špecifického pre určité tkanivo, napríklad môže ísť o promótor, špecifický na enolázu neurónov CNS, promótor pre nervové vlákna alebo pre tyrozínhydroxylázu alebo môže ísť o indukovateľný promótor, napríklad metalotioneínový promótor alebo promótor, ku ktorého aktivácii dochádza pomocou ultrafialového svetla v dlhej terminálnej repetícii vírusu HIV podľa Valeri a ďalší, 1988, Náture 333, 78 až 81 alebo tiež o promótor CMV, ktorý je obsiahnutý v plazmide pCMX, ako bude ďalej opísané alebo aj o vývojovo riadený promótor.

Odpoveď na endogénny neurotrofín je možné zvýšiť aj zvýšením počtu molekúl trkB v bunke. V prípade, že modelový systém obsahuje príliš malé množstvo neurotrofínu alebo neurotrofín neobsahuje, je možné túto látku do systému pridať.

Môže byť žiaduce pridať do modelového systému ďalší neurotrofín na vyhodnotenie účinku príliš rotrofínu. Aj príliš veľká expresia vhodnou metódou na sledovanie vplyvu vysokej aktivity neuneurotrofínu môže byť zvýšenej hladiny neurotrofínu na bunky, u ktorých už dochádza k expresii trkB. Ešte výhodnejšia je expresia trkB vo všetkých bunkách (všeobecná expresia), potom sa stanoví, ktoré z týchto buniek potom funkčne odpovedajú na neurotrofín, čo umožní potenciálnu identifikáciu druhej zložky receptora v prípade, že táto zložka existuje.

Modely na štúdium zníženej účinnosti neurotrofínu

Pokusný model, vhodný na toto použitie je napríklad možné vytvoriť tak, aby bol vhodný na sledovanie vplyvu zníženej účinnosti neurotrofínu. Takýto systém môže umožniť identifikáciu pochodov alebo neurónov, ktoré vyžadujú prítomnosť neurotrofínu a ktoré by mohli predstavovať potenciálne liečebné ciele. V systémoch tohoto typu môže byť odpoveď na neurotrofín znížená tak, že sa pripravia rekombinantné bielkoviny trkB, ktoré nie sú spojené s povrchom bunky alebo ktoré sú skonštruované tak, aby boli celkom neúčinné pri prevode odpovede na neurotrofín.

Je napríklad možné bielkovinu trkB, peptid alebo derivát do systému priviesť tak, aby pridaný receptor mohol byť v kompetícii s endogénnym trkB pri väzbe na neurotrofný, takže dôjde k zmenšeniu odpovede na neurotrofín. Bielkovinu trkB je možné pridať ako receptor, zbavený buniek alebo môže byť v systéme priamo produkovaný. Napríklad je možné získať bielkovinu trkB, zbavenú transmembránovej oblasti z buniek vo vnútri systému, ktoré môžu túto látku vylučovať bez oblasti pre zakotvenie. Okrem toho, je tiež možné bielkovinu trkB, peptidový fragment alebo derivát do systému pridávať •tak, že sa dostane do extracelulárneho priestoru.

V ďalšom možnom uskutočnení vynálezu je možné použiť rekombinantný gén pre trkB na inaktiváciu alebo odstránenie účinku endogénneho génu homológnou rekombináciou, čím dôjde k vytvoreniu bunky, tkaniva alebo živočícha, v ktorých chýba trkB. Je napríklad možné vytvoriť rekombinantný gén pre trkB tak, aby obsahoval mutáciu, napríklad gén neo, ktorý trkB inaktivuje. Takúto konštrukciu je možné uložiť do bunky pod riadením vhodného promótora, napríklad bunky základného embryonálneho kmeňa pomocou transfekcie, transdukcie, injekcie a pod. Bunky, ktoré túto konštrukciu obsahujú, je potom možné podrobiť selekcii na základe odolnosti proti G418. Potom je možné identifikovať bunky, ktorým chýba neporušený gén trkB napríklad metódou Southern blot alebo Northern blot alebo na základe expresie. Bunky, ktorým chýba neporušený gén trkB je potom možné spojiť pomocou fúzie s včasnými embryonálnymi bunkami za vzniku transgénických živočíchov, ktorí nevytvárajú trkB. Pri porovnaní takého živočícha so živočíchom, u ktorého nedochádza k expresii endogénneho neurotrofínu potom bude možné preukázať, či si oba fenotypy úplne odpovedajú alebo či si neodpovedajú, čím by bolo možné preukázať prítomnosť prípadných ďalších látok typu neurotrofínu alebo receptorov pre tieto látky.

Živočíchy tohto typu je možné použiť na definovanie špecifickej populácii neurónov alebo akýchkoľvek iných postupov in vivo, obvykle závislých na prítomnosti neurotrofínu. Je teda možné očakávať, že tieto pochody alebo bunkové populácie budú ovplyvnené v prípade, že u živočícha nedôjde k expresii trkB, takže nebude môcť dôjsť ani k žiadnej odpovedi na prítomnosť neurotrofínu.

Okrem toho môže dochádzať k expresii rekombinantnej bielkoviny trkB, jej peptidového fragmentu alebo derivátu, ktorý je v kompetícii s endogénnym receptorom pre neurotrofín aj na povrchu buniek v systéme, avšak táto rekombinantná bielkovina môže byť konštruovaná tak, aby neprenášala odpoveď na väzbu neurotrofínu.

Rekombinantné bielkoviny trkB, ich peptidové fragmenty alebo ich deriváty sa môžu viazať na neurotrofín s afinitou, ktorá je obdobná alebo je odlišná od afinity endogénneho trkB k neurotrofínu. Aby bolo možné účinnejšie znížiť odpoveď na neurotrofin, môže sa táto bielkovina trkB, jej peptidový fragment alebo derivát s výhodou viazať na neurotrofín s afinitou väčšou, než má pre túto látku natívny receptor.

V prípade, že je bielkovina trkB, jej peptidový fragment alebo jej derivát produkovaný v modelovom systéme, môže byť kódová nukleová kyselina pre bielkovinu trkB, jej peptidový fragment alebo jej derivát do systému privádzaná infekciou, transdukciou, transfekciou a podobne ako cudzorodý gén. Ako už bolo vyššie uvedené, je možné gén pre trkB uložiť pod riadenie vhodného promótora, ktorým môže byť napríklad promótor alebo aj vývoj ovo riadený promótor.

V špecifickom uskutočnení vynálezu je možné nahradiť endogénny gén trkB v bunke mutovaným génom trkB homológnou rekombináciou. V ďalšom možnom uskutočnení vynálezu je možné pokusné živočíchy imunizovať proti trkB.

V ešte ďalšom uskutočnení je možné dosiahnuť zníženie expresie trkB tak, že sa do buniek, u ktorých dochádza k expresii tohoto receptora uloží určité množstvo antimediátorovej RNA alebo DNA, ktorá je schopná znížiť expresiu bielkoviny trkB.

Diagnostické použitie

Pri vykonávaní vynálezu je možné použiť sondy trkB na identifikáciu buniek a tkanív, ktoré reagujú na neurotrofín v zdravom alebo chorobne zmenenom tkanive. Vynález sa teda týka aj spôsobu diagnostiky neurologických porúch u chorých, spôsob spočíva v tom, že sa porovnáva úroveň expresie receptoru trkB u chorých s úrovňou expresie toho istého receptora v porovnateľnej skupine zdravých ľudí, pričom rozdiel v úrovni expresie receptora trkB u chorých a u zdravých ľudí dokazuje, že porucha u chorých môže byť primárne alebo sekundárne viazaná na metabolizmus trkB. Chorým orgánom môže byť bunka, tkanivo alebo môže ísť o zmenu v zložení telesnej tekutiny, s výhodou ide o tkanivo nervového systému alebo o mozgomiechový mok. Vynález sa týka aj spôsobu identifikácie buniek, ktoré sú schopné reagovať na neurotrofin, postup spočíva v detekcii expresie receptoru trkB v týchto bunkách. Expresiu trkB je možné dokázať transkripciou mRNA pre trkB alebo produkciou bielkoviny trkB. Expresiu génu pre trkB je možné zistiť použitím sond, ktoré sú schopné identifikovať nukleovú kyselinu pre trkB alebo priamo receptor vo forme bielkoviny.

Ďalšou sondou, ktorú je možné použiť je protilátka proti trkB alebo proti fragmentu tejto bielkoviny, ktorá obsahuj e väznú oblasť.

Podľa vynálezu je možné použiť bielkovinu trkB, jej fragmenty alebo jej deriváty ako imunogénne látky na získanie protilátok proti receptoru trkB. Na tento účel je potrebné mať k dispozícii väčšie množstvo receptora, avšak rekombinantnou technikou syntézy bielkovín, ktorá je založená na reťazci nukleovej kyseliny pre trkB je možné získať pomerne značné množstvo bielkoviny trkB, takže problém obmedzených množstiev tejto bielkoviny bol odstránený.

Aby bolo možné ďalej zvýšiť pravdepodobnosť vzniku imunologickej odpovede ako reakcie na trkB, je možné analyzovať reťazec aminokyselín trkB tak, aby bolo možné identifikovať tie časti molekuly, ktoré by mohli byť spojené so zvýšenou imunogenitou. Je napríklad možné podrobiť reťazec aminokyselín počítačovej analýze na identifikáciu povrchových epitópov a tak získať počítačové údaje, týkajúce sa hydrofilnos ti, povrchu, flexibility, indexu antigenity, amfifilnej skrutkovice, plošnej amfifilnosti a sekundárnej štruktúry uvedenej bielkoviny. Je možné postupovať aj tak, že sa porovnáva odvodený reťazec aminokyselín pre trkB z rôznych živočíšnych druhoch a identifikujú sa pomerne nehomológne oblasti. Tieto nehomológne oblasti budú zrejmé ľahšie vyvolávať imunitnú reakciu u iných živočíšnych druhov.

Pri príprave monoklonálnych protilátok proti receptoru trkB je možné použiť akýkoľvek postup, ktorým je možné dosiahnuť produkciu molekúl protilátok v kontinuálnej bunkovej línii, pestovanej v kultúre. Je napríklad možné použiť techniku hybridómu, pôvodne opísanú v publikácii Kohler a Milstein, 1975, Náture 256, 495 až 497, rovnako ako techniku triómu, hybridómu ľudských B-buniek podľa publikácie Kozbor a ďalší,, 1983, Immunology Today 4, 72, ďalej techniku EBVhybridómu na získanie ľudských monoklonálnych protilátok podľa publikácie Cóle a ďalší, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. Str. 77 až 96, všetky tieto postupy a ďalšie podobné postupy je možné pri uskutočňovaní vynálezu využiť.

Monoklonálne protilátky na liečebné použitie môžu byť ľudské monoklonálne protilátky alebo aj chimérne protilátky človeka a myší alebo iného živočíšneho druhu. Ľudské monoklonálne protilátky je možné pripraviť akýmkoľvek z celého radu známych postupov, napríklad spôsobom podľa publikácií Teng a ďalší, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 7308 až 7312, Kozbor a ďalší, 1983, Immunology Today 4, 72 až 79, Olsson a ďalší, 1982, Meth. Enzymol, 92, 3 až 16..Chimérne molekuly protilátok je možné pripraviť aj tak, aby obsahovali oblasť pre väzbu antigénu z myší a ľudskej konštantnej oblasti, ako bolo opísané v Morrison a ďalší, 1984, Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 81, 6851, Takeda a ďalší, 1985, Náture 314, 452.

Na získanie polyklonálnych protilátok proti rôznym epi tópom receptora trkB je taktiež možné použiť celý rad známych postupov. Na získanie protilátok je možné imunizovať rôzne hostiteľské živočíchy injekciou bielkoviny trkB alebo jeho fragmentu alebo derivátu, zo živočíchov je možné použiť napríklad králiky, myši, potkany a podobne. Na zvýšenie imunologickej odpovede je možné ešte použiť rôzne pomocné prostriedky v závislosti na druhu hostiteľa, môže ísť napríklad o Freundov úplný a neúplný pomocný prostriedok, o rôzne gély anorganického pôvodu, napríklad hydroxid hlinitý, o povrchovo aktívne látky, napríklad lyzolecitín, polyóly typu pluronic, polyanióny, peptidy, emulzie oleja, hemokyaníny, dinitrofenol a niektoré pomocné látky, používané u človeka, napríklad BCG (Bacillus Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.

Molekulárny kloň protilátky proti epitopu trkB je možné pripraviť taktiež známym spôsobom. Na konštrukciu reťazcov nukleových kyselín, ktoré sú kódovými reťazcami pre molekulu monoklonálnej protilátky alebo pre jej oblasť pre väzbu antigénu je možné použiť postup s využitím rekombinantnej DNA tak, ako boli opísané v publikácii Maniatis a ďalší, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

Molekuly protilátok je možné čistiť známymi postupmi, napríklad imunoabsorpciou alebo imunoafinitnou chromatografiou a aj ďalšími chromatografickými postupmi, ako vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou HPLC, kombináciou rôznych uvedených postupov a podobne.

Vynález sa týka aj molekúl protilátok a fragmentov týchto molekúl. Fragmenty protilátok, ktoré obsahujú idiotyp molekuly je možné vytvoriť známym spôsobom. Tieto fragmenty zahrňujú napríklad fragment F(ab’)2> ktorý je možné získať rozštiepením molekuly protilátky pôsobením pepsínu, fragmenty Fab’, ktoré možno získať redukciou disulfidových mostíkov vo fragmente F(ab’)2 a fragmenty Fab, ktoré je možné vytvo riť spracovaním molekuly protilátky pôsobením papaínu a redukčného činidla.

Vyššie uvedené sondy je možné experimentálne využiť aj na identifikáciu buniek alebo tkanív, u ktorých zatiaľ nebola expresia trkB preukázaná.

Okrem toho je možné tieto postupy využiť na identifikáciu expresie trkB aberantnými tkanivami, napríklad tkanivami zhubných nádorov. V ďalších možných vykonaniach je možné použiť tieto postupy diagnosticky na porovnanie expresie trkB v rôznych bunkách, tkanivových tekutinách alebo v tkanivách chorých, trpiacich určitou poruchou a v porovnateľných bunkách, telesných tekutinách alebo tkanivách zdravých ľudí. Telesnou tekutinou sa v tomto zmysle rozumie akákoľvek telesná tekutina, zvlášť však krv alebo mozgomiechový mok. Rozdiel v úrovni expresie trkB u chorého v porovnaní s úrovňou expresie u zdravých ľudí môže dokazovať, že porucha u chorého sa môže primárne alebo sekundárne vzťahovať na metabolizmus trkB. Napríklad vzostup množstva trkB by mohol ukazovať na to, že porucha u chorého je spojená so zvýšenou citlivosťou na normálne hladiny neurotrofínu alebo môže ísť tiež o prípad, že hladiny neurotrofínov u chorého sú také nízke, že došlo k zvýšeniu množstva receptorov na kompenzáciu tohto javu. Obe etiológie je možné od seba odlíšiť tak, že sa chorému podá neurotrofín. V prípade, že sa jeho stav zhorší, môže chorý trpieť zvýšenou citlivosťou na neurotrofín. V prípade, že dôjde k zlepšeniu stavu, môže chorý trpieť nedostatkom neurotrofínu. V zásade je tak možné podľa uvedeného výsledku voliť liečbu, ktorá spočíva buď,v podaní neurotrofínu alebo látky, ktorá účinok neurotrofínu antagonizuje. Rozdiely v expresii je možné dokázať na úrovni bielkoviny a/alebo na úrovni RNA, to znamená priamym meraním množstva bielkoviny trkB alebo meraním RNA pre trkB u chorého a u zdravých ľudí s následným porovnaním získaných hodnôt.

Vyššie uvedené sondy je možné použiť aj na selekciu buniek, schopných reagovať na prítomnosť neurotrofínov na použitie v rôznych systémoch tak, ako boli opísané vyššie alebo v systéme, opísanom v US patentovej prihláške č. 07/532 285, podanej 1. júna 1990 alebo akýmkoľvek ďalším postupom, ktorý sa týka selekcie buniek.

Liečebné použitie

Vynález sa týka aj spôsobu liečenia chorých, ktorí trpia neurologickými poruchami. Postup spočíva v tom, že sa chorým podáva účinné množstvo bielkoviny trkB, jej peptidového fragmentu alebo jej derivátu, schopného sa viazať na neurotrofin. Liečebné postupy, týkajúce sa podávania trkB, antagonistov tohto receptora a látok, ktoré antagonizujú účinok receptora kompetíciou o endogénny neurotrofin, podávania antagonistov trkB alebo protilátok proti receptoru, taktiež patria do oblasti vynálezu.

Vynález sa týka aj farmaceutických prostriedkov, ktoré ako svoju účinnú zložku obsahujú bielkovinu trkB, jej peptidový fragment alebo jej derivát spolu s vhodným farmaceutickým nosičom.

Bielkovinu trkB, jej peptidový fragment alebo jej derivát je možné podávať systematicky alebo miestne. Príslušný spôsob podania sa volí zo známych postupov, ide teda napríklad vnútrožilové, intratekálne, intraarteriálne, o padanie nosnou sliznicou, perorálne podanie, podanie podkožné, intraperitoneálne, miestne podanie pomocou injekcie alebo vo forme chirurgického implantantu. Je možné použiť aj prostriedky s riadeným uvoľnením účinnej látky.

S postupom výskumov, ktoré vedú k lepšiemu pozorumeniu neurodegeneratívnych ochorení a poškodenia nervovej sústavy je stále jasnejšie, že v niektorých prípadoch by bolo žiaduce znížiť trofický účinok endogénneho neurotrofínu. V oblas tiach poškodenia nervového systému by preto mohlo byť žiaduce použitie antagonistov neurotrofinu včítane rozpustných foriem trkB, ktoré sa môžu dostávať do kompetície s endogénnym bunkovým receptorom pri väzbe neurotrofinu. Za uvedených okolností môže byť žiaduce skôr miestne použitie antagonistov neurotrofinu v mieste poškodenia než jeho systemické použitie. Môže byť použitý aj implantát, obsahujúci trkB.

V ďalšom možnom vykonaní môže byť určitý chorobný stav priaznivo ovplyvnený zvýšením citlivosti na neurotrofin. V tomto prípade môže byť žiaduce zvýšiť počet molekúl receptora alebo zvýšiť afinitu väzby trkB u chorých s uvedenými poruchami. Tento cieľ by bolo možné dosiahnuť privádzaním príslušného génu. Selektívnu expresiu rekombinantného receptora trkB v príslušných bunkách možno dosiahnuť za použitia génu pre trkB, riadeného promótormi, ktoré sú pre tkanivo špecifické alebo indukovateľné alebo vyvolaním lokalizovanej infekcie vírusom s defektnou replikáciou, nesúcim rekombinantný gén pre trkB. Poruchami, ktoré by bolo možné zlepšiť zvýšenou citlivosťou na neurotrofin sú najmä poruchy motorických neurónov včítane amyotrofnej laterálnej sklerózy, Verding-Hoffmanovho ochorenia, chronickej proximálnej spinálnej svalovej atrofie a syndrómu Guillain-Barre. Rovnaký liečebný postup by mohol byť použitý aj v prípade neurologických porúch pri cukrovke, Parkinsonovej choroby, Alzheimerovej choroby a Huntingtonovej chorey.

Systémy na stanovenie a vyhľadávanie látok, ktoré pôsobia na receptor tyrozinkinázy a postupy na vyhľadávanie nových receptorov tyrozinkinázy

Vynález sa týka aj systémov, ktoré je možné všeobecne použiť pri stanovení vopred definovaných látok a na vyhľadávanie nových látok, pôsobiacich na receptor tyrozinkinázy. Ten istý postup podľa vynálezu a ten istý systém je možné použiť aj na dôkaz dosiaľ neznámych receptorov, sprostredkujúcich odpoveď na niektoré známe faktory. Hneď ako je defi novaný určitý systém receptora a väznej látky, napríklad v tomto prípade trkB a BDNF/NT-3, je možné využiť aj rad ďalších špecifických systémov, ako už bolo vyššie podrobnejšie vysvetlené.

Bolo dokázané, že v prípade, že sa receptor pre tyrozínkinázu uloží do buniek, v ktorých za bežných podmienok k expresii tohto receptora nedochádza, môžu uvedené bunky reagovať ľahko zistiteľným spôsobom na väznú látku, ktorá sa na uvedený receptor viaže. Bolo tiež dokázané, že typ vznikajúci odpoveďou závisí na type použitej bunky a nie na špecifickom receptore, ktorý bol do bunky vložený. To znamená, že pri vložení receptora trkB do buniek PC12 pheochromocytómu má za následok závislosť diferenciácie týchto buniek na BDNF/NT-3, kým po vložení toho istého receptora do fibroblastov dôjde k závislosti prežívania a diferenciácie týchto buniek na BDNF alebo NT-3. Je teda možné zvoliť príslušnú bunkovú líniu na dosiahnutie odpovede, ktorú bude možné najlepšie využiť na stanovenie alebo na vyhľadávanie látok, schopných spolupôsobiť s receptorom tyrozínkinázy. Touto látkou môže byť akákoľvek molekula včítane peptidových a nepeptidových molekúl, ktorá je schopná pôsobiť v týchto systémoch spôsobom, špecifickým pre receptor. Jedným z vhodných systémov, ktorý by mal byť skúmaný, zahrňuje privádzanie požadovaného receptora, napríklad trkB do bunkovej línie fibroblastov, napríklad do určitého klonu buniek NIH3T3, ktorý bude ďalej podrobnejšie opísaný v príklade 2. To znamená, že receptor, ktorý za obvyklých podmienok nesprostredkováva proliferatívnu odpoveď, môže byť po zavedení do fibroblastov preukazovaný rôznymi známymi postupmi, ktoré vedú ku kvantitatívnemu stanoveniu účinkov rastových faktorov pre fibroblasty, ide napríklad o príjem tymidínu alebo ďalšie typy skúšok na proliferáciu tak, ako boli opísané v publikáciách van Zoelen 1990, The Use of Biological Assays For Detection of Polypeptide Growth Factors, Progress Factor Research, zv. 2, str. 131 až 152, Zhan a M. Goldfarb, 1986, Mol. Celí. Biol., zv. 6, str. 3541 až 3544. Tieto skúšky ma jú tú ďalšiu výhodu, že ten istý prostriedok je možné sledovať tak na bunkovej línii s uloženým receptorom, ako aj na pôvodnej bunkovej línii, ktorá receptor neobsahuje. Len špecifické účinky na bunkovú líniu s receptorom sú považované za účinky, sprostredkované uloženým receptorom.

Systémy tohoto typy nie sú obmedzené na skúmanie známych väzných látok pre známe receptory, je možné ich použiť aj na identifikáciu nových látok, ktoré by mohli pôsobiť na tieto alebo akékoľvek ďalšie receptory. Napríklad bunková línia s uloženým receptorom aj pôvodná bunková línia be z receptora môžu byť vystavené akémukoľvek potenciálnemu zdroju látky, ktorá by mohla pôsobiť cez uvedený receptor. Akékoľvek špecifické účinky, napríklad prežívanie buniek alebo ich proliferáciu v prípade bunkovej línie s uloženým receptorom je možné použiť na identifikáciu zdrojov látok, schopných cez tento receptor pôsobiť a zistenú látku je prípadne možné ďalej čistiť.

Receptory nemusia byť obmedzené na tie, pre ktoré už existuje známa väzná látka. Tento systém môže umožniť identifikáciu väzných látok pre receptory, ktoré zatiaľ nemajú známu väznú látku. To znamená, že fibroblasty, u ktorých dochádza k expresii trkB by bolo možné v takýchto systémoch využiť na identifikáciu a prípadne na čistenie väzných látok, napríklad BDNF a NT-3, ktoré za obvyklých podmienok aktivujú trkB. Teraz je však možné ich využiť aj na identifikáciu ďalších peptidových väzných látok alebo aj iných látok, napríklad molekúl nepeptidovej povahy, ktoré by taktiež mohli cez tieto receptory pôsobiť. Zdroje skúmaných látok môžu zahrňovať napríklad extrakty z rôznych tkanív a rôznych organizmov alebo supernatantu z buniek po transfekcii za použitia DNA genómu alebo bánk na expresiu cDNA. Vo zvláštnom vykonaní vynálezu je možné podrobiť fibroblasty, u ktorých dochádza k expresii vloženého receptora, pre ktorý sa hľadá väzná látka, expresii pomocou banky cDNA, odvodenej od potenciálneho zdroja takejto väznej látky. Bun ky, ktoré by prežívali a vytvárali kolónie na definovanom prostredí, neobsahujúcom rastové faktory pre fibroblasty podlá publikácie Zhan a Goldfarb, 1986, Mol. Celí. Biol., zv. 6, str. 3541 až 3544 by pravdepodobne vytvárali rastový faktor, ktorý by splnil ich bežné požiadavky na prítomnosť tohto faktora. Aby bolo možné dokázať, že uvažovaný rastový faktor pôsobí cez skúmaný receptor, bolo by potrebné supernatanty týchto buniek skúmať na pôvodnej bunkovej línii tak, aby bolo možné preukázať, že supernatant pôsobí len na bunkovú líniu, u ktorej dochádza k expresii skúmaného receptora. Potom by bolo možné izolovať tú časť DNA, použitej na transfekciu, ktorá je kódovým reťazcom pre tento nový účinok za použitia známych postupov.

Vynález sa týka aj spôsobu klonovania aspoň časti génu pre receptor tyrozínkinázy, ktorú je potom možné využiť na identifikáciu dvojíc väzná látka/receptor tak, ako bolo uvedené vyššie. Postup spočíva v tom, že sa

i) reťazec nukleovej kyseliny, ktorá je kódom pre tyrozínkinázu amplifikuje PCR-reakciou za použitia zostavy molekúl cDNA, napríklad knižnice cDNA ako matrice pri použití oligonukleotidových primérov, ktoré zodpovedajú tým oblastiam známej molekuly tyrozínkinázy, ktoré sú spojené s účinnosťou tyrozínkinázy a potom sa ii) amplifikovaná nukleová kyselina klonuje vo vhodnej molekule vektora, napríklad v plazmide, bakteriofágu a podobne.

Vynález sa týka génu pre tyrozínkinázu a jeho častí, ktoré boli klonované uvedeným spôsobom. Vo zvláštnom špecifickom vykonaní, ktoré bude podrobnejšie uvedené v príklade 4, je možné využiť oligonukleotidové priméry, ktoré sú uvedené na obr. 12A alebo v ďalej uvedenej tabuľke II.

Potom je možné stanoviť reťazec DNA, amlifikovanej a klonovanéj uvedeným spôsobom za použitia štandardných pos tupov. Výsledné reťazce je potom možné porovnávať s reťazcami známych molekúl tyrozínkinázy tak, aby bolo možné identifikovať zvlášť zaujímavé klony. Vynález sa týka aj identifikovaných reťazcov klonovaných nukleových kyselín, ktoré boli získané uvedeným spôsobom, ako bude ďalej podrobnejšie vysvetlené v príklade 4 a peptidov a bielkovín, pre ktoré je kódom cDNA, ktorá tieto reťazce obsahuje. Vynález sa týka aj v podstate čistých rekombinantných molekúl nukleových kyselín, ktoré zahrňujú reťazce nukleových kyselín

i) tak, ako boli uvedené na obr. 12C pre Rtk-1, Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8 a Rtk-9,

ii)	tak,	ako	sú uvedené na obr.	13B pre Rtk-4 a Rtk-5,
iii)	tak,	ako	sú uvedené na obr.	14 pre Rtk-2 a
iv)	tak,	ako	sú uvedené na obr.	15 pre Rtk-3.

Vynález sa týka takisto častí uvedených molekúl, ktoré obsahujú aspoň 10 zvyškov nukleových kyselín. Vynález zahrňuje aj nukleové kyseliny, obsiahnuté v plazmide pBluescript SK s obsahom Rtk-2 alebo s obsahom Rtk-3 tak, ako boli tieto plazmidy uložené vo verejnej zbierke Američan Type Culture Collection pod číslami.............a......... Vynález sa ďalej týka v podstate čistých molekúl bielkovín, ktoré obsahujú reťazec aminokyselín

i)	tak, ako bol uvedený na obr, Rtk-7, Rtk-8 a Rtk-9,	. 12C pre Rtk-1,	Rtk-6,
ii)	tak, ako j e uvedený na obr.	13B pre Rtk-4 a	Rtk-5,
iii)	tak, ako j e uvedený na obr.	14 pre Rtk-2 a
iv)	tak, ako je uvedený na obr.	15 pre Rtk-3.
	Vynález zahrňuje aj časti týchto bielkovín,	obsahujúce

aspoň šesť zvyškov aminokyselín alebo funkčne ekvivalentné molekuly. Funkčne ekvivalentnými molekulami sú také moleku44 ly, v ktorých sú niektoré zvyšky aminokyselín nahradené inými zvyškami tak, že vzniká tichá mutácia. Je napríklad možné nahradiť jeden alebo väčší počet zvyškov aminokyselín v reťazci inou aminokyselinou s rovnakou polaritou, ktorá pôsobí ako funkčný ekvivalent, takže sa zmena vo funkcii neprejaví. Aminokyseliny pre uvedenú náhradu v reťazci je možné voliť z iných aminokyselín v rovnakej skupine, do ktorej nahradená aminokyselina patrí. Napríklad nepoláme hydrofóbne aminokyseliny sú alanín, leucín, izoleucín, valín, prolín, fenylalanín, tryptofan a metionín. Polárne neutrálne aminokyseliny sú glycín, serín, tronín, cysteín, tyrozín, asparagín a glutamin. Bázické kyseliny s pozitívnym nábojom sú arginín, lyzín a hystidín. Kyslé aminokyseliny s negatívnym nábojom sú kyselina asparágová a kyselina glutamová. Vynález zahrňuje aj bielkoviny, ich fragmenty alebo ich deriváty, ktoré sú rôzne modifikované v priebehu translácie alebo po ukončenej translácii napríklad glykozyláciou, proteolytickým štiepením, väzbou na molekulu protilátky alebo iné bunkové väzné látky a podobne.

Vynález sa týka aj buniek a mikroorganizmov, ktoré nesú rekombinantné molekuly nukleových kyselín tak, ako boli vyššie opísané, včítane Rtk-l, Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8, Rtk-9, Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5. Vo zvláštnom vykonaní môžu byť bunkami, nesúcimi rekombinantnú nukleovú kyselinu fibroblasty. V inom vykonaní môže byť takouto bunkou aj baktéria.

Amplifikované fragmenty nukleových kyselín je potom možné použiť na identifikáciu klonov cDNA s plnou dĺžkou. Vo výhodných vykonaniach vynálezu je možné použiť amplifikovaný fragment DNA na identifikáciu tkaniva alebo bunkovej línie, u ktorej dochádza k expresii pomerne veľkého množstva zodpovedajúcej mRNA, napríklad za použitia analýzy Northern blot alebo dt-blot. Takéto tkanivo alebo bunková línia môže byť využitá na vytvorenie banky cDNA, ktorá môže slúžiť ako velmi vhodný zdroj cDNA s plnou dĺžkou, obsahujúci reťazec a amplifikovaný fragment.

Obrátený postup môže byť použitý pri molekulárnom klonovaní receptora pre látku, pre ktorú receptor dosiaľ nie je známy, môže ísť napríklad o neurotrofnú bielkovinu, pre ktorú zatiaľ nebol izolovaný príslušný receptor. Fibroblasty, vystavené pôsobeniu tohto faktora by za obvyklých podmienok nemali na prítomnosť tohto faktora reagovať, avšak po transfekcii pomocou banky cDNA, pripravenej z buniek, u ktorých by mohlo dochádzať k expresii takého receptora, by mohli byť získané bunky po transfekcii, u ktorých by k expresii takéhoto receptora skutočne dochádzalo a ktoré by teda reagovali na prítomnosť uvedeného faktora. Potom by bolo možné využiť účinné mechanizmy na selekciu, napríklad schopnosti vytvárať kolónie na definovaných živných prostrediach v prítomnosti uvedeného faktora, čím by bolo možné identifikovať bunky, u ktorých po transfekcii dochádza k expresii hľadaného receptora. Potom by bolo možné obvyklým spôsobom izolovať aj gén, ktorý je kódovým reťazcom pre tento receptor.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Gén pre trkB je kódom pre funkčný receptor, pre BDNF a NT-3, avšak nie pre NGF

Materiály a metódy

A) Bunkové kultúry, neurotrofíny a značenie neurotrofínov rádioaktívnym jódom

Bunky COS-M5 boli pestované v Eaglovom živnom prostredí DMEM v Dulbeccovej modifikácii, obsahujúcom 10 % fetálneho séra hovädzieho dobytka FBS, 1 % penicilínu a streptomycínu

P/S a 2 mM glutamínu v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Bunky PC12 boli pestované na prostredie DMEM, obsahujúcom 6 % FBS, 6 % konského séra, P/S a 2 mM glutamínu na platniach Costar pre tkanivové kultúry v atmosfére s obsahom

7,5 % oxidu uhličitého. Bunky PC12 (Dr. L. A. Greene’s Laboratory) boli použité v pokusoch, znázornených na obr. 2, bunky PC12 (Dr. E. M. Shooter’s Laboratory) boli použité v pokusoch, znázornených na obr. 5. Bunková línia ľudského neuroblastómu SH-SY5Y (June Biedler, Sloan-Kettering) boli pestované na Eaglovom minimálnom základnom prostredí EMEM s 10 % FBS, (P/S) a 2 mM glutamínu.

2,5S myší NGF bol získaný od Bioproducts for Science (Indianapolis, IN). Ľudský BDNF a NT-3 boli produkované bunkami CHO a čistené zo živného prostredia, v ktorom boli tieto bunky pestované až do homogenity a potom boli tieto látky stanovené na polyakrylamidovom géli pri farbení striebrom a boli analyzované reťazce aminokyselín. Potom boli čistené neurotrofíny NGF, BDNF a NT-3 značené rádioaktívnym jódom za použitia laktoperoxidázy podľa publikácie Hempdtead a ďalší, 1989, Science, 243, 373 až 375. Jódované neurotrofíny boli oddelené od nezabudovaného rádioaktívneho jódu za použitia filtrov Centriflo CF50A (Amicon, Beverly, MA). Zhluky boli odstránené filtráciou na géli S200.

B) Klonovanie trkB potkana, expresia u cicavcov, konštrukcia a prechodná transfekcia

Kloň cDNA pre trkB potkana s plnou dĺžkou bol získaný analýzou banky cDNA potkanieho mozgu vo vektore lambda ZAP2 (Stratagene) za použitia špecifických oligonukleotidov pre trkB potkana, zodpovedajúcich väčšine 5’- a 3’-kódových oblastí trkB. Ako ľudský LNGFR podľa Johnson a ďalší, 1986, Celí 47, 545 až 554, tk cDNA pre trkB potkana boli subklonované v cicavčom vektore na expresiu, pCMX za vzniku pCMXLNGFR alebo pCNX-trkB. Plazmid pCMX-trkB(del) bol vytvorený rozštiepením plazmidu pCMX-trkB enzýmom Apal, ktorý štiepi tesne za transmembránovou oblasťou trkB a enzýmom Notl, ktorý štiepi tesne za kódovou oblasťou pre trkB v reťazci vektora, obe zakončenia boli vyplnené a plazmid bol znovu naviazaný, takto vzniknutá kódová oblasť trkB obsahuje extra celulárnu a transmembránovú oblasť trkB, avšak neobsahuje 320 C-terminálnych aminokyselín.

Bunky COS-M5 boli podrobené prechodnej transfekcii plazmidom pCMX-LNGFR, pCMX-trkB alebo kontrolným vektorom pCMX transfekcii za použitia DEAE-dextránu. Postup bol vykonaný tak, že bunky COS-M5 boli naočkované v množstve 1,5 a 10^ buniek na platne s priemerom 100 mm 24 hodín pred transfekciou. Na prevedenie transfekcie boli bunky pestované v prostredí DMEM, zbavenom séra a obsahujúcom 400 gg/ml DEAE-dextránu, ΙμΜ chlorochínu, 2 mM glutamínu, 20 pg/ml inzulínu, 5 gg/ml transferínu, 33 nM selenitu sodného a 5μg príslušnej DNA, v tomto prostredí sa zmes inkubuje 3 hodiny a 15 minút pri teplote 37 °C v atmosfére s 5 % oxidu uhličitého. Potom sa prostredie, použité na transfekciu odsaje a nahradí chloridom sodným s fosfátovým pufrom a s 10 % DMSO na 2 minúty. Po tomto DMSO šoku sa bunky COS-M5 uložia do prostredia DMEM s 10 % FBS a s 1 % penicilínu i streptomycínu a s glutamínom v konečnej koncentrácii 2 mM na 48 hodín.

Bunky PC12 boli podrobené prechodnej transfekcii otvorením pórov pôsobením elektrického prúdu. Pred transfekciou boli bunky premyté ľadovo chladným roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom, zbaveným vápnika a horčíka a obsahujúcim 2 mg/ml glukózy (Dulbecco), potom sa bunky znova vložia od suspenzie v tom istom pufri pri hustote buniek 1,5 x 10 buniek na ml v prítomnosti 40 mikrogramov príslušnej DNA. Bunky PC12 boli podrobené transfekcii pôsobením plazmidov pCMX, pCMX-trkB alebo pT24-ras opísaných v publikácii Yancopoulos a ďalší 1985 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:5455 až 5459. Bunková zmes sa inkubuje 10 minút v ľade a potom sa nechá rýchle otepliť na teplotu miestnosti a póry sa otvoria pôsobením elektrického prúdu v celkovom objeme 1 ml pri pôsobení 1150 V/cm a 500 μΡ. Potom sa bunky inkubujú v ľade ešte 30 minút a na to sa nanesú na platne s prostredím DMEM so 6 % FBS, 6 % konského séra, 1 % penicilínu i streptomycínu a 2 mM glutamínu. Použijú sa platne Costar z plastickej hmoty bez akéhokoľvek predbežného povlaku. 48 hodín po transfekcii sa na bunky pôsobí 10 ng/ml neurotrofínu alebo BSA tak, ako je uvedené v opise k obr. 5 a po ďalších 48 hodinách sa vyhodnotí rast nervových vlákien.

C) Chemické zosietenie

Bunky sa odoberú do roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrom, ktorý ďalej obsahuje 1 mM EDTA, 1 mg/ml glukózy a 25 mM HEPES (PBS-versene) a potom sa bunky znova vložia do suspenzie pri vhodnej hustote, obvykle 1 x 10^ buniek/ml v ľadovo väznom pufri A, ide o PBS s obsahom 1 mg/ml BSA a glukózy. Plazmidy cPMX-trkB alebo pCMX, použité na transfekciu buniek COS-M5 v množstve 4 x 10^ buniek boli s bunkami inkubovanými v ľade v prítomnosti -značených neurotrof ínov, ktoré boli použité v konečnej koncentrácii v rozmedzí 0,1 až 0,25 nM, inkubácia bola vykonávaná 90 minút v neprítomnosti alebo v prítomnosti neznačeného NGF, BDNF alebo NT-3, ako je znázornené na obr. 1 a 3. Chemická látka na zosietenie DSS (Pierce, Rockford, IL) bola použitá za podmienok, opísaných v publikácii Meakin a Shooter, 1991, Neurón 6, 153 až 163. Reakcia na zosietenie bola ukončená po 90 minútach a zastavená pridaním 12 ml 50 mM tris pufra s obsahom 160 mM chloridu sodného. Bunky boli odstredené 5 minút pri 300 g a potom 2 x premyté vždy 12 ml pufra A. Usadenina buniek potom bola rozpustená v SDS s obsahom 2 % 2-merkaptoetanolu, zmes bola 5 minút povarená a rádioaktívne značené zosietené bielkoviny boli potom delené na 7% polyakrylamidovom géli a ich množstvo bolo odčítané pomocou autorádiografie po expozícii suchého gélu za použitia filmu Kodak X-Omat pri teplote -70 °C.

D) 125j-NT-3 kompetičné väzné skúšky

Väzba na bunky COS-M5 po transfekcii plazmidom pCMX-LNGFR, p-CMX-trkB alebo kontrolným vektorom pCMX bola stanovená na bunkách v suspenzii. Bunky potom boli odobrané do PBS-versene a potom znova uvedené do suspenzie vo väznom pufri A, tak ako bolo opísané vyššie na chemické zosietenie. Bunky boli inkubované s I-NT-3 v koncentrácii 0,1 až 0,25 mM v neprítomnosti alebo v prítomnosti zvyšujúcich sa koncentrácií neznačeného NT-3, BDNF alebo NGF v koncentrácii 0,3 až 30 nM v prípade NGF a 1 až 100 nM v prípade BDNF a NT-3, ako je uvedené v opisoch k obr. 4C a 4D. Väzné reakcie boli vykonávané 90 minút v ľadovom kúpeli. Voľný -19 c

I bol oddelený od väznej látky rýchlym odstredením počas 30 sekúnd za použitia sacharózového gradienta, vytvoreného v skúmavke pre mikroodstredivku v jej predĺženej spodnej časti. Skúmavky boli okamžite zmrazené v zmesi suchého ľadu a etanolu. Spodná časť skúmavky bola odrezaná a výsledok bol odčítaný na počítači gamma-žiarenia.

E) Izolácia RNA a analýza northern blot

Celková bunková RNA ,izolovaná z buniek SH-SY5Y a zo spracovaných alebo nespracovaných buniek PC12 bola frakcionovaná na agarózovom géli s 1 % formaldehydom, potom bol materiál prenesený na nylonové membrány a hybridizovaný za použitia sondy v-fos, značenej p alebo sondy c-jun, značenej rovnakým spôsobom, ako bolo opísané v publikácii Squinto a ďalší, 1990, Neurón, 5, 757 až 766. Expresia trkB bola sledovaná za použitia sondy potkanieho trkB, značeného ^^p z oblasti, ktorá je kódovou oblasťou pre intracytoplazmatickú tyrozínkinázu.

Výsledky

A) Väzba všetkých troch neurotrofínov na LNGFR, BDNF a NT-3 nepôsobí cez HNGFR

Aby bolo možné stanoviť, či NT-3 sa rovnako ako NGF a BDNF môže viazať na LNGFR, ako bolo opísané v publikácii Rodriquez-Tebar, 1990, Neurón, 4, 487 až 492, boli všetky tri neurotrofiny skúmané na svoju schopnosť chemického zo sietenia s bielkovinou LNGFR po jej prechodnej expresii v bunkách COS. Každý z troch rádioaktívne značených neurotrofínov môže byť špecificky zosietený s bielkovinou s molekulovou hmotnosťou, aká je očakávaná pre LNGFR, uvádza sa, že zosietený komplex, znázornený na obr. 1B má veľkosť približne 100 kb podľa publikácie Hosang a Shooter, J. Biol. Chem., 260, 655 až 662. zosietený produkt nebolo možné dokázať v bunkách COS, u ktorých nedochádzalo k expresii bielkoviny LNGFR, ako je zrejmé z obr. 1A. Okrem toho, ako bolo možné očakávať v prípade špecifickej väzby, bolo možné vzniku zosietených produktov účinne zabrániť kompetíciou s prebytkom zodpovedajúceho neznačeného neurotrofínu, ako je zrejmé z obr. 1B. Kompetitívne zosietenie s polypeptidom zodpovedajúceho rozmeru bolo možné pozorovať aj v bunkovej línii melanómu A875, o ktorej je známe, že u nej dochádza k stálej expresii veľkých množstiev LNGFR, ako je zrejmé z obr. 1C.

Hneď ako bolo dokázané, že sa všetky tri neurotrofíny môžu viazať na bielkovinu LNGFR, bola skúmaná schopnosť BDNF a NT-3 pôsobiť cez receptory NGF s nízkou alebo vysokou afinitou. Bunky PC12, u ktorých dochádza k expresii oboch skupín receptorov NGF poskytujú význačnú odpoveď pokiaľ ide o rast nervových látok a pokiaľ ide o indukciu skupiny takzvaných včasných génov po transkripcii ako odpovede na NGF, ako bolo opísané v publikácii Greene a Tischler, 1976, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 73, 2424 až 2428 a Greenberg a ďalší, 1985, J. Biol. Chem. 260, 14101 až 14110 a ako je zrejmé aj z obr. 2A a 2B. Avšak v prípade, že sa bunky PC12 inkubujú v prítomnosti BDNF alebo NT-3 v koncentrácii, ktorá je príliš nízka alebo v koncentrácii, ktorá je vyššia než koncentrácia nasýtenia na odpoveď na NGF, nedochádza k morfologickým zmenám ani za podmienok, ktoré sú optimálne na rast nervových látok a nedochádza tiež k indukcii expresie včasných génov podľa obr. 2A a 2B. Z týchto výsledkov je možné usudzovať, že receptory s nízkou alebo vysokou afinitou pre NGF nestačia na funkčnú odpoveď na BDNF a NT-3, na túto odpoveď je zrejmé nevyhnutná aspoň jedna zložka receptora, ktorý sa v bunkách PC12 obvykle nevyskytuje.

B) BDNF a NT-3, avšak nie NGF sú schopné väzby na trk-B s plnou dĺžkou alebo v skrátenej forme

K expresii trk-B v bunkách PC12 nedochádza, ako bolo opísané v Kaplan a ďalší, 1991, Náture 350, 158 až 160. Bunkové línie, u ktorých by dochádzalo k expresii trk-B ešte neboli opísané. Bola izolovaná cDNA pre trkB s plnou dĺžkou a bola dosiahnutá jej prechodná expresia v bunkách COS a potom boli vykonávané pokusy so zosietením za použitia neurotrofínov, značených rádioaktívnym jódom. Ako je zrejmé z obr. 3A, môžu byť BDNF a NT-3, avšak nie NGF zosietené s polypeptidom s približnou veľkosťou pre produkt génu trkB. Bolo možné pozorovať určitú heterogenitu zosieteného materiálu, ako bolo už skôr opísané pre HNGFR, zosietený s NGF v publikácii Meakin a Shooter, 1991, Neurón, 6, 153 až 163. Zosietenie značeného BDNF alebo NT-3 s predpokladaným produktom génu trkB nebolo možné pozorovať v prítomnosti prebytku neznačenej homológnej väznej látky, ako je zrejmé na obr. 3A v dráhach, označených +. Aby bolo možné overiť, že bielkovina zosietená BDNF alebo NT-3 skutočne zodpovedá produktu génu trkB a aby bolo možné stanoviť, či určité skrátené formy tejto bielkoviny sú taktiež schopné sa viazať na väznú látku, bola skonštruovaná mutanta trkB, v ktorej chýba intracytoplazmatická oblasť pre tyrozínkinázu a bola dosiahnutá expresia tejto mutanty v bunkách COS. Ako je znázornené na obr. 3B, bola rádioaktívne značená väzná látka, v tomto prípade NT-3 účinné zosietená s povrchovou zložkou buniek, u ktorých dochádzalo k expresii produktu trkB so skráteným reťazcom. Okrem toho výrazný posun v pohyblivosti, ktorý je pozorovaný medzi zosieteným materiálom s plnou dĺžkou alebo so skráteným reťazcom a ktorý zodpovedá molekulovej hmotnosti približne 35 000 je v súlade so známym rozsahom vypustenej časti.

C) BDNF a NT-3, avšak nie NGF môžu byť v kompetícii na väzbu trkB a majú vyššiu afinitu väzby k trkB než LNGFR

Špecifickosť a relatívna afinita väzby neurotrofínov na LNGFR a trkB bola porovnaná v kompetičných skúškach. Každý z troch neznačených neurotrofínov bol účinne schopný špecificky blokovať zosietenie rádioaktívne značeného NT-3 na LNGFR po jeho expresii v bunkách COS v koncentrácii 500 nM, avšak nie v koncentrácii 1 až 5 nM, ako je zrejmé z obr. 4A. V súlade s týmito výsledkami bola väzba rádioaktívne značeného NT-3 na LNGFR po jeho expresii v bunkách COS dovŕšená obdobným spôsobom v prípade všetkých troch neznačených neurotrofínov, ako je zrejmé z obr. 4C. Kompetičné krivky ukazujú, že disociačné konštanty by pre všetky tri neurotrofíny mali ležať v oblasti nanomolov, čo znamená, že predchádzajúce pozorovanie platí aj pre NGF a BDNF podlá publikácie Rodriguez-Tebar a ďalší, 1990, Neurón, 4, 487 až 492.

Na rozdiel od pomerne vysokého množstva neznačených väzných látok, ktoré sú potrebné na špecifickú inhibíciu väzby na LNGFR, stačí ovela nižšie množstvo neznačeného BDNF a NT-3 na účinnú inhibíciu väzby rádioaktívne značeného NT-3 na trkB, ako je možné dokázať buď pomocou zosietenia podľa obr. 4B alebo priamou analýzou väzby podľa obr. 4D. NGF nie je ani v molárnom prebytku 500 až 1000 v kompetícii na väzbu rádioaktívne značeného NT-3 na trkB pri žiadnej z uvedených skúšok, ako je zrejmé z obr. 4B a 4D. Vzhľadom na množstvo neznačeného BDNF a NT-3, ktoré je potrebné na úplnú inhibíciu väzby rádioaktívne značeného NT-3_tna trkB, ktoré je 10 až 100 x nižšie než množstvo, ktoré je potrebné na blokovanie väzby NT-3 na LNGFR, je možné sa domnievať, že trkB má podstatne vyššiu aktivitu pre BDNF a NT-3, než je afinita LNGFR pre tieto látky.

D) trkB môže sprostredkovať rast nervových látok v bunkách. PC12 po pôsobení BDNF a NT-3

Bunky PC12 vyvinú charakteristickú morfologickú odpoveď po vystavení pôsobeniu NGF, táto odpoveď spočíva v predĺžení nervových látok a je dôkazom diferenciácie na zrelší fenotyp. Ako už bolo vyššie dokázané, uvedené bunky nereagujú na pôsobenie BDNF alebo NT-3. Aby bolo možné dokázať, či trkB môže sprostredkovať biologicky relevantnú odpoveď na BDNF alebo NT-3, boli bunky PC12 podrobené prechodnej transfekcii vektorom na expresiu trkB, cCMX-trkB a potom boli inkubované s jednotlivými neurotrofínmi. Aby bolo možné znížiť na čo najmenšiu mieru vplyv pozadia, boli bunky po transfekcii pestované na štandardných platniach na pestovanie tkanivových kultúr z plastickej hmoty a nie na platniach, vybavených povlakom kolagénu alebo povlakom Primária. Za týchto podmienok, ktoré sú suboptimálne na predĺženie nervových vlákien podlá publikácií Greene a ďalší, 1987, Meth. Enzymol. , 147, 207 až 216, Vhem a ďalší, 1990, Celí Growth, 1, 79 až 85, vyvolá NGF rast krátkych neurónov v kontrolných bunkách PC12 i v bunkách po transfekcii trkB, ako je zrejmé z obr. 5B. V prípade, že sa nepridá žiadny neurotrofný faktor, nedôjde v kultúrach po transfekcii trkB k rastu nervových vlákien, ako je zrejmé z obr. 5C. Avšak celý rad buniek v kultúrach buniek PC12 po transfekcii trkB vyvinie robustné nervové vlákna v prítomnosti NT-3 alebo BDNF, ako je zrejmé z obr. 5D a 5E. Žiadne bunky s neuritmi nie je možné pozorovať v prípade buniek PC12 po prechodnej transfekcii kontrolnými vektormi a po pôsobení BDNF alebo NT-3. Aby bolo možné získať pozitívnu kontrolu na odhad účinnosti transfekcie, boli bunky PC12 podrobené transfekcii aktivovaným génom H-ras, pričom sa ukázalo, že v prítomnosti tohoto génu dochádza k diferenciácii buniek PC12, ktorá je nezávislá na prítomnosti väzných látok. Počet diferencovaných buniek, ktorý je možné diferencovať v kultúrach po transfekcii génom H-ras je ukazovateľom počtu buniek PC12, u ktorých skutočne došlo k prechodnej transfekcii. Vzhľadom na to, že počet diferencovaných buniek, ktoré sú pozorované po pôsobení BDNF na bunky PC12 po transfekcii pCMX-trkB je porovnateľný s počtom diferencovaných buniek, ktoré je možné dokázať v bunkovej populácii po transfekcii génom H-ras, ako je zrejmé z obr. 5A a 5E, je možné sa domnievať, že každá bunka PC12, u ktorej dochádza k expresii trkB môže reagovať na BDNF avšak menšia časť týchto buniek môže odpovedať aj na NT-3, ako je zrejmé z rastu neuritov na obr. 5D. Je zrejmé, že bude potrebný starostlivejší výskum závislosti odpovede na dávke, aby bolo možné vyhodnotiť zrejmý rozdiel medzi pôsobením DBNF a NT-3 pri týchto pokusoch. Ako je znázornené na obr. 5, je veľmi prekvapujúce, že extenzívny rast neuritov v bunkách PC12 po transfekcii H-ras alebo v bunkách PC12 po transfekcii pCMX-trkB a po pôsobení BDNF alebo NT-3 bol kvalitatívne odlišný od rastu neuritov, ktorý je za obvyklých podmienok možné v týchto kultúrach pozorovať po pôsobení NGF.

E) Bunky SH-SH5Y ľudského neuroblastómu reagujú na BDNF, avšak nie na NT-3 a nedochádza u nich k expresii trkB, dôkaz ďalšieho receptora pre neurotrofín

Indukcia expresie včasného génu bola použitá ako skúška na vyhľadávanie bunkových línií nádorových buniek nervového tkaniva, ktoré by boli schopné reagovať na BDNF, NT-3 a NGF podľa Equinto a ďalší, 1990, Neurón, 5, 757 až 766. Bolo preukázané, že napríklad bunková línia SH-SY5Y reaguje expresiou mRNA c-fos na pôsobenie NGF, ako už bolo skôr opísané a aj na pôsobenie BDNF, avšak nie na pôsobenie NT-3, ako je zrejmé z obr. 6A. Ďalšími pokusmi bolo overené, že BDNF, avšak nie NT-3 má na bunky SH-HY5Y ešte ďalšie funkčné účinky. BDNF napríklad chráni tieto bunky pred oxidačným poškodením. Hoci bolo dokázané, že v uvedených bunkách dochádza k expresii malých množstiev receptorov NGF s nízkou aj vysokou afinitou podľa Chem a ďalší, 1990, Celí Growth Diff., 1, 79 až 85 ak expresii zistiteľných množstiev mRNA trkA, nedochádza k expresii zistiteľných množstiev mRNA pre trkB, ako je zrejmé z obr. 6B. Zrejmý nedostatok expresie trkB v bunkovej línii, reagujúcej na BDNF a neschopnosť tejto bunkovej línie reagovať na NT-3 vedie k predpokladu, že existujú ďalšie modulátory LNGFR alebo trkA, ktoré umožnia reakciu na BDNF alebo že existuje ešte ďalší funkčný receptor pre neurotrofin, ktorý je špecifický pre BDNF.

Diskusia

Je možné uzavrieť, že trkB je kódom pre podstatnú zložku funkčného receptora pre BDNF a NT-3, avšak nie pre tretiu látku zo skupiny neurotrofínov, NGF. V súčasných publikáciách sa uvádza, protoonkogén trkA, ktorý je naj príbuznej ši trkB, je podobne kódom pre podstatnú zložku receptora s vysokou afinitou pre NGF, napríklad podlá publikácií Kaplan a ďalší, 1991, Náture, 350, 158 až 160, Klein a ďalší, 1991, EMBO J., 8, 3701 až 3709. Súčasné pozorovania, že bunky PC12 za normálnych podmienok nereagujú na BDNF alebo NT-3, ukazujú na to, že trkA, ku ktorého expresii v bunkách PC12 dochádza, je aktivovaný len jedinou známou látkou zo skupiny neurotrofínov a to NGF.

Je možné preukázať, že BDNF a NT-3 sú schopné sa viazať na trkB v neprítomnosti LNGFR a to s vyššou aktivitou než na LNGFR. Podobne v publikácii Klein a ďalší, 1991, Celí, 65, 189 až 197 sa opisuje, že NGF sa môže viazať s vysokou afinitou na trkA v bunkách, u ktorých nedochádza k expresii LNGFR. Funkcia LNGFR zostáva nejasná. Skoršie pozorovania, zhrnuté v publikácii Rodriquez-Tebar a ďalší, 1990, Neurón, 4 487 až 492 je možné rozšíriť o dôkaz, že všetky tri neurotrof í ny sú schopné sa viazať na LNGFR s približne rovnakou, aj keď pomerne nízkou afinitou. Zachovanie tejto vlastnosti je zrejmé spôsobené dôležitou biologickou úlohou. Je taktiež možné, že LNGFR mení prevod signálu cez nezávislý spôsob prevodu ale bo sa môže priamo zúčastniť začiatku tohto prevodu. Mohol by napríklad lokalizovať, koncentrovať a zachytiť neurotrofin na povrchu buniek, u ktorých k expresii LNGFR dochádza. Z tohoto hľadiska by mohlo byť zaujímavé, že podporné nervové bunky, napríklad Schwannove bunky, ktoré neodpovedajú na NGF vykazujú expresiu LNGFR a menia ju v prípade poškodenia, ako bolo opísané v publikácii Johnson a ďalší, 1988, TINS 11, 299 až 304, takže je možné, že tieto bunky predstavujú tuhú matricu alebo cestu na koncentrovanie a prívod neurotrofínov k regenerujúcim nervovým bunkám. Je tiež možné, že LNGFR pôsobí ako receptor, ktorý znižuje hladinu neurotrofínov, voľných alebo obiehajúcich. Vyskytuje sa totiž tak v centrálnom nervovom systéme, ako aj na periférii, ako bolo opísané v Mainsompierre a ďalší, 1990, Neurón, 5, 501 až 509. Vylučované formy LNGFR, opísané v DiStefano a Johnson, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 270 až 274 môžu napomáhať tomuto mechanizmu. Pokiaľ ide o niektoré pravdepodobné úlohy LNGFR, môže ísť o podobné mechanizmy, ktoré sú špecifické pre BDNF a NT-3 tak, ako je možné ich preukázať pri použití skrátených foriem trkB. Spoločná lokalizácia BDNF a transkriptov skrátených foriem trkB okrem nervového systému, prevážne v pľúcach a v kostrovom svalstve vyvoláva otázky, týkajúce sa úlohy BDNF, trkB a ďalších potenciálnych receptorov BDNF v iných než nervových tkanivách.

Skutočnosť, že BNDF a NT-3 majú spoločný funkčný receptor trkB, je v súlade s vyššie uvedeným predpokladom, že distribúcia a prekrývajúca sa špecifickosť účinnosti BDNF a NT-3 pre neuróny spája úlohu týchto dvoch neurotrofínov aspoň v centrálnom nervovom systéme. V priebehu dozrievania rôznych oblastí mozgu dochádza k znižovaniu koncentrácie NT-3 a postupnému zvyšovaniu koncentrácie BDNF, avšak expresia trkB zostáva pomerne stála. Avšak identifikácia bunkovej línie, ktorá reaguje na BDNF, avšak nie na NT-3 a u ktorej nedochádza k preukázateľnej expresii trkB naznačuje, že tieto dva neurotrofíny nie je možné zameniť a že môžu existovať ďalšie receptory alebo modulačné zložky, ktoré dovoľujú odlíšiť odpoveď na BDNF alebo NT-3. Takáto modulácia by napríklad mohla vysvetliť odlišné účinky NT-3 a BDNF na bunky PC12 po transfekcii trkB, tak ako boli vyššie uvedené alebo na neuróny sympatika, ako bolo opísané v publikácii Maisonpierre a ďalší, 1990, Science, 247, 1446 až 1451. Je známe, že u neurónov sympatika dochádza k expresii trkB, aj napriek tomu, že údaje, ktoré sú k dispozícií na základe hybridizácie in situ neodlišujú prítomnosť funkčných a nefunkčných transkriptov trkB v týchto neurónoch, ako bolo opísané v Klein a ďalší, 1989, EMBO, 8, 3701 až 3709. Vývojové porovnanie BDNF a NT-3 vedie k predpovedi, že tieto dva neurotrof íny boli pevne konzervované tak, aby si uchovali svoje špecifické interakcie s väčším počtom receptorov. Hoci NGF je dobre vývojovo konzervovaný v porovnaní s väčšinou vylučovaných faktorov, jeho konzervácia nie je taká veľká ako konzervácia BDNF a NT-3, čo pravdepodobne naznačuje, že táto látka nie je v interakcii s takým množstvom receptorov ako ostatné dva neurotrofíny. Uvedené výsledky zaraďujú neurotrof í ny do zväčšujúcej sa skupiny systémov receptorov a väzných látok, v ktorých sa mnohopočetné receptory sú schopné viazať na niekoľko rôznych príbuzných väzných látok, údaje sú zhrnuté v publikácii Cross a Dexter, 1991, Celí, 64, 271 až 280.

Väzba a aktivácia receptorov pre tyrozínkinázu pôsobením neurotrofínov dokazuje, že tieto faktory využívajú signálne dráhy, ktoré sú veľmi podobné dráham, aktivovaným mitogénnymi rastovými faktormi. Tento poznatok je v súlade s výsledkami posledných výskumov, ktoré uvádzajú, že neurotrofné faktory môžu v určitých súvislostiach pôsobiť ako mitogény, ako bolo opísané v publikácii Cattaneo a McKay, 1990, Náture, 347, 762 až 765. Okrem toho potom bolo dokázané, že signály, ktoré zahajujú aktiváciu receptora tyrozínkinázy, sú za bežných podmienok integrované do nemitogénnych ciest na prevod v nervových bunkách. Aj napriek rozdielom v cieľovom jave, ktorým je mitogenéza, prežívanie alebo diferenciácia, sú aspoň niektoré z včasných medziproduktov v signalizačnej kaskáde tyrozínkinázy, ako skupina ERK bielkovinových kináz podobným spôsobom aktivované v nervových a iných bunkách. Ďalším príkladom toho, že aktivácia tyrozínkinázy v nervových bunkách môže viesť k nemitogénnym dôsledkom, môže byť bielkovina z Frosophila sevenless, kto rej aktivácia je nutná na diferenciáciu buniek fotoreceptorov podľa publikácie Basler a ďalší, 1991, Celí, 64, 1069 až 1081.

Príklad 2 trk môže sprostredkovať prežívanie v závislosti na BDNF/NT-3 a proliferáciu u fibroblastov, ktorým chýba receptor NGF s nízkou afinitou

Materiály a metódy

A) Bunky, bunkové kultúry a transfekcia DNA

Bunky NIH3T3 boli pestované v Eaglovom prostredí DMEM v Dulbeccovej modifikácii, obsahujúcom 10 % teľacieho séra, 1 % penicilínu a streptomycínu (P/S) a 2 mM glutamínu v atmosfére s obsahom 5 % oxidu uhličitého. Na skúšky na definovaných prostrediach boli tieto prostredia pripravené podľa publikácie Zhan a ďalší, 1987, Oncogene, 1, 369 až 376. Aj keď bolo preukázané, že bunky NIH3T3 strácajú svoju životnosť v neprítomnosti rastového faktora, ako bolo opísané v Zhan a ďalší, Oncogene, 1, 369 až 376, Zhan a Goldfarb, 1986, Mol, Celí, Biol., 6, 3541 až 3544, je nutné sa zmieniť o tom, že niektoré iné varianty buniek NIH3T3 životnosť nestrácajú, avšak v rovnakých prostrediach zachovávajú kľudový stav. Transfekcia DNA v týchto bunkách za použitia konštrukcií pLTR-trkB a pLTR-hyg, opísaných v Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20, bola uskutočnená podľa publikácie Vigler a ďalší, 1979, Celí 16, 777 až 785. Bunkové kultúry buniek COS a transfekcia pomocou pCMX-LNGFR boli vykonávané podľa Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20. Skúšky na prežívanie neurónov za použitia neurónov ganglií dorsálnych koreňov kurčaťa boli vykonávané podľa publikácie Rodriquez-Tebar a Barde, 1988, The Journal of Neuroscience 8, 3337 až 3342.

B) Faktory

Príprava, čistenie a rádioaktívne značenie rekombinantného ľudského BDNF a NT-3, produkovaného v bunkách CHO boli opísané v publikácii Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20. NGF myší bol získaný od Bioproducts, Indianapolis, IN. Faktor bFGF bol získaný od R a D Systems, Inc., Minneapolis, MN.

C) Skúšky na prežívanie, proliferáciu a príjem tymidínu

Skúšky na prežívanie a proliferáciu boli vykonávané v podstate spôsobom podľa publikácií Zhan a ďalší, 1987, Oncogene, 1, 369 až 376, Zhan a Goldfarb, 1986, Mol. Celí. Biol., 6, 3541 až 3544. Skúšky na prežívanie boli vykonávané tak, že bunky boli nanesené na platne, vybavené povlakom poly-D-lyzínu/fibronectínu, pestované až do získania 20% súvislej vrstvy a potom pestované 5 dní v definovanom prostredí v prítomnosti alebo neprítomnosti faktora. Stupeň prežívania bol hodnotený mikroskopicky stupnicou v prípade, že žiadne bunky neprežili až do +++ v prípade súvislej vrstvy prežívajúcich buniek. Pri skúškach na proliferáciu boli bunky nanesené na platne do približne 0,5% súvislej vrstvy, boli použité platne, vybavené povlakom poly-D-lyzínu/f ibrolactínu a bunky boli pestované 8 dní bez pridania faktora alebo v prítomnosti faktora a potom boli bunky počítané po rozrušení vrstvy trypsínom na počítacom zariadení Coulter counter. Pri skúškach syntézy DNA boli bunky nanesené na platne v prostredí s obsahom 3 % teľacieho séra a po dosiahnutí rovnovážneho stavu boli na 14 dní pridané rôzne

Q faktory. Potom bolo prostredie doplnené ^JH-tymidínom v množstve 1 mikroCurie na 1 ml na dobu 2 hodiny. Potom bolo stanovené zaradenie rádioaktívne značeného materiálu do materiálu, nerozpustného v TCA podľa publikácie Cavalieri a Goldfarb 1987, Mol. Celí. Biol., 7, 3544 až 3560.

D) Izolácia RNA a analýza northerm blot

Uvedené skúšky boli vykonávané spôsobom, opísaným v publikácii Maisonpierre a ďalší, 1990, Neurón, 5, 501 až 509.

E) Izolácia bielkoviny a analýza western blot

Za účelom detekcie zmien fosforylácie tyrozínu v závislosti na pridávaní jednotlivých faktorov, boli bunky uložené na 1 hodinu do definovaného prostredia, zbaveného séra, potom boli na 5 minút pridané označené faktory. Potom boli bunky premyté roztokom chloridu sodného s fosfátovým pufrom (PBS) s 1 mM ortovanadičnanom a rozrušené v pufri RIPA (PBS s obsahom 1 % NP40, 0,1 % SDS, 0,5 % deoxycholátu, 1 mM

PMSF, 1 mM ortovanadičnanu a 0,14 jednotiek/ml aprotinínu). Pri vykonávaní pokusov z obr. 11A, bol materiál z rozrušených buniek vyzrážaný pomocou monoklonálnej protilátky proti fosfotyrozínu, konjugovanej s agarózou a označenej 4G10 (FOXNY Sp2-derivát myelómu x slezinné bunky BALB/c), materiál bol získaný od Upstate Biotechnologies, Inc. Imunologický vyzrážaný materiál bol premytý pufrom, v ktorom boli bunky rozrušené, potom bol za varu uvedený do suspenzie v pufri, obsahujúcom SDS a v tomto pufri bol nanesený na 6% SDS-akrylamidový gél a podrobený imunoblotovej analýze za použitia protilátky proti fosfotyrozínu 4G10. V prípade pokusov podlá obr. 11B bol rozrušený bunkový materiál priamo podrobený elektroforéze na 8% SDS-akrylamidovom géli a potom bola vykonaná imunoblotová skúška za použitia protilátky 4G10. Skúšky boli vykonané za použitia membrán Immobilon-P. Po aplikácii primárnej antifosfotyrozínovej protilátky 4G10 bola na detekciu použitá kozia polyklonálna protilátka proti myším tkanivám, značená I.

Výsledky

A) BDNF a NT-3 ako faktory, nutné na prežívanie buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, v neprítomnosti LNGFR

Aby bolo možné preskúmať funkčné schopnosti receptora trk pri jeho expresii v bunkách, odlišných od nervových buniek, bola vykonaná súčasna transfekcia vyššie uvedeného variantu buniek NIH3T3 za použitia konštrukcie trkB na expresiu, pLTR-trkB podľa publikácie Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20 a značiaceho génu pre hygromycín na uľahčenie selekcie, pLTR-hyg podľa Murphy a Efstratiadis, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 8277 až 8281. V uvedenom variante buniek NIH3T3 nedochádza k expresii zistiteľného množstva LNGFR, ako je možné dokázať priamym zosietením s rádioaktívne značeným faktorom NT-3, ako je zrejmé z obr. 7A, v ktorom sú bunky, u ktorých dochádza k expresii LNGFR v dráhach 1 a 2 porovnané s bunkami NIH3T3 v dráhach 3 a 4.

i 2S

Je tiež možné vykonať väzbu ^JI-NGF na neporušených bunkách. Pri analýze northern blot taktiež nebolo možné dokázať mRNA pre LNGFR v bunkách NIH3T3, hoci túto mRNA bolo možné ľahko dokázať v bunkách PC12, kde bolo zrejmé prítomných 100 000 molekúl LNGFR v jednej bunke alebo v bunkách SH-SY5Y, u ktorých dochádza k expresii sotva preukázateľných množstiev LNGFR podľa publikácií Chao a ďalší, 1986, Science 232, 518 až 521, Sonnenfeld a Ishii, 1982, J. Neurosci.

Res., 8, 375 až 391 a ako je znázornené aj v hornej časti na obr. 7B. Po súčasnej transfekcii pomocou pLTR-trkB . a pLTR-hyg boli bunky NIH3T3 znovu nanesené na platne do

20% súvislej vrstvy a potom buď podrobené selekcii na defi' novanom prostredí alebo bolo toto prostredie doplnené 5 nM niektorého z faktorov bFGF, NGF, BDNF alebo NT-3 alebo boli bunky pestované v úplnom prostredí, obsahujúcom hygromycín a teľacie sérum, ako je znázornené na obr. 8. Priama selekcia na definovanom prostredí dokázala, že všetky pestované bunky prežili v prípade, že prostredie bolo doplnené faktorom bFGF, ako bolo očakávané. Okrem toho nebolo možné dokázať tvorbu žiadnych kolónií v prípade, že definované prostredie nebolo nikým doplnené alebo bolo doplnené len NGF, čo poukazuje na to, že pridaním trkB nie je možné zaistiť rastový signál bez jeho stimulácie väznými látkami. Na rozdiel od tohto pozorovania bolo možné preukázať niekoľko kolónii v prípade, že bunky po transfekcii pLTR-trkB boli pestované na definovanom prostredí, doplnenom BDNF alebo NT-3. 0 niečo väčšie množstvo kolónií bolo možné preukázať po pridaní BDNF v porovnaní s pridaním NT-3, ako je zrejmé z ľavej strany obr. 8. Žiadne kolónie nebolo možné pozorovať v prípade buniek NIH3T3 bez transfekcie, v bunkách po transfekcii len za použitia pLTR-hyg alebo v bunkách, obsahujúcich konštrukciu na expresiu LNGFR. To znamená, že v prípade transfekcie buniek NIH3T3 pomocou konštrukcie pLTR-trkB bolo možné získať bunky, ktoré vytvárajú rastúcu kolóniu pôsobením BDNF alebo NT-3.

Aby bolo možné stanoviť, či väčšina buniek po transfekcii trkB môže odpovedať na BDNF alebo na NT-3 alebo či vyššie uvedené kolónie sú tvorené vzácnymi klonmi bunkovej populácie po transfekcii, boli bunky po transfekcii trkB najskôr podrobené selekcii na prostredí, obsahujúcom 10 % teľacieho séra a hygromycín. V týchto bunkách dochádza k expresii väčšieho množstva transkriptov trkB, ako je zrejmé zo spodnej časti obr. 9B a k expresii preukázateľného množstva bielkoviny trkB, ako je možné preukázať chemickým zosietením s rádioaktívne značeným NT-3 a ako je zrejmé z obr. 7A, dráhy 5 a 6. Počet receptorov trkB v týchto bunkách je nízky v porovnaní s počtom molekúl LNGFR, k expresii ktorých dochádza v bunkách COS po prechodnej transfekcii konštrukcií na expresiu LNGFR, ako je zrejmé z obr. 7A pri porovnaní dráh 1, 2 a 5, 6. Bunky, v ktorých dochádza k expresii trkB potom boli skúmané na prežívanie pri pokusoch, pri ktorých boli bunky nanášané na platne živného prostredia s pomerne vysokou hustotou, do 20%,súvislej vrstvy a to na definovanom prostredí alebo na definovanom prostredí, doplnenom 5 nM bFGF alebo jednotlivých neurotrofínov. V priebehu niekoľkých dní bolo možné pozorovať na definovanom nedoplnenom prostredí alebo na prostredí, doplnenom len NGF, takmer úplné uhynutie buniek, ako je znázornené na obr. 9A. Prežívanie buniek bolo podporované bFGF, avšak nie ostatnými neurotrofínmi v kultúrach pôvodných buniek NIH3T3, ako je zrejmé z hornej časti obr. 9A, v kultúrach buniek, u ktorých bola vykonaná transfekcia len za použitia samotného pLTR-hyg a v kultúrach buniek, obsahujúcich vektor na expresiu LNGFR.

Skúšky na závislosť účinku na dávke pri prežívaní buniek ukázali, že koncentrácie bFGF, BDNF a NT-3 rádu pikomolov boli účinné, pričom účinnosť bFGF a BDNF bola zrejmá v rozmedzí 0,5 až 5 pM a účinnosť NT-3 bola rozoznateľná pri 50 pM, ako je zrejmé z obr. 9B. Avšak NGF nebol účinný ani pri 100 až 1000-krát vyššej koncentrácii, ako je zrejmé z obr. 9A. To znamená, že BDNF bol takmer rovnako účinný ako bFGF pri podpore prežívania buniek NIH3T3 po transfekcii trkB, kým NT-3 bol pri tejto skúške aspoň 10 x menej účinný než BDNF.

B) BDNF a NT-3 ako proliferatívne faktory pre bunky NIH3T3, v ktorých dochádza k expresii trkB

Aby bolo možné stanoviť, či aktivácia trkB pôsobením BDNF a/alebo NT-3 má mitogénne účinky alebo či má nejaký vplyv na prežívanie buniek NIH3T3, boli obidve uvedené látky skúšané na svoju schopnosť vyvolať syntézu DNA v bunkách, v ktorých dochádza k expresii trkB, pri skúškach na príjem tymidínu. Bunky boli pestované až do vzniku súvislej vrstvy v 3% sére, po dosiahnutí súvislej vrstvy už nebolo možné pozorovať mitotické bunky. Za týchto podmienok tiež nedochádzalo k uhynutiu buniek. Potom boli priamo do prostredia pridávané rôzne faktory a 12 hodín po ich pridaní bol sledoo vaný príjem tymidínu, značeného H. Ako je zrejmé z obr. 10A, len faktor bFGF bol schopný vyvolať syntézu DNA v pôvodných bunkách NIH3T3, účinná syntéza DNA bola vyvolaná aj pôsobením pikomolárnych koncentrácií BDNF a NT-3 v bunkách NIH3T3, v ktorých dochádza k expresii trkB, ako je zrejmé z obr. 10B. Závislosť dávky na účinku pre BDNF a NT-3 pri týchto skúškach zväčša zodpovedá závislosti, pozorovanej u týchto látok pri skúškach na prežívanie, ako je zrejmé z porovnania obr. 9B a 10B. NGF nevyvolá syntézu DNA ani v pôvodných bunkách ani v bunkách, v ktorých dochádza k expresii trkB, ako je zrejmé z obr. 10A a 10B.

BDNF a NT-3 boli skúšané aj na svoju schopnosť vyvolať dlhodobú proliferáciu buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB. Pri týchto skúškach boli jednotlivé faktory skúmané na svoju schopnosť zvýšiť rýchlosť rastu v bunkách, u ktorých dochádza k expresii trkB a ktoré boli velmi riedko nanesené na platne so živným prostredím. Na rozdiel od uhynutia buniek, ktoré je možné pozorovať pri nanášaní týchto buniek s veľkou hustotou na definované živné prostredie bez mitogénov je na tomto prostredí pri riedko nanesených bunkách možné pozorovať kontinuálnu proliferáciu bez pozorovateľného uhynutia buniek, napríklad pri 0,5% vytvorení súvislej vrstvy. Okrem očakávanej odpovede na bFGF je možné u buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, pozorovať v závislosti na pôsobení BDNF a NT-3, ako 10C. Pôvodné bunky NIH3T3 reagujú len na Aj v tomto prípade je závislosť účinku na a NT-3 v prípade proliferácie obdobná ako bola pozorovaná pri skúškach na prežívanie ako je zrejmé z porovnania obr. 9B, urýchlenie je zrejmé prítomnosť dávke pre i závislosť, a na príjem rastu z obr. bFGF.

BDNF ktorá tymidínu,

10B a 10C.

C) U fibroblastov, u ktorých dochádza k expresii trkB a u primárnych neurónov, závislých na BDNF je možné pozorovať pre BDNF obdobné krivky závislosti účinku na dávke

Aby bolo možné stanoviť, či k účinkom BDNF na.prežívanie a na rast buniek u fibroblastov s expresiou trkB dochádza v oblasti fyziologicky prijateľných koncentrácií neurotrofínu, bola sledovaná koncentrácia BDNF, nutná ria dosiahnutie týchto účinkov s koncentráciou, ktorá je potrebná pri klasickej skúške na prežívanie nervových buniek za použitia neurónov, závislých na BDNF, izolovaných z ganglií dorsálnych koreňov DRG. Použitím rekombinantného ľudského BDNF bola získaná takmer nerozoznateľná krivka závislosti účinku na dávke na prežívanie neutrónov (obr. 10B), rovnako ako to bolo opísané pre BDNF, čistenie z mozgu prasaťa podľa publikácie Rodriquez-Tebar a Barde, 1988, The Journal of Neuroscience 8, 3337 až 3342. Táto krivka závislosti odpovede na dávke je u primárnych neurónov veľmi podobná vyššie opísanej krivke na prežívanie a proliferáciu u fibroblastov, ako je zrejmé z porovnania obr. 10D s obr. 9B, 10B a 10C. To znamená, že u fibroblastov, u ktorých dochádza k expresii trkB v neprítomnosti LNGFR je možné predpokladať citlivosť k BDNF, ktorá je podobná citlivosti primárnych nervových buniek, závislých na BDNF.

D) BDNF a NT-3 aktivujú fosforyláciu tyrozínu v bunkách NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB sledovať signálne neurotrofínov na v bunkách NIH3T3, pôsobení bFGF alebo na spusteniu sledovaná dráhy, k trkB, bola u ktorých dochádza alebo neurotrofínov. Na bunky, u ktorých dochádza sa pri tejto skúške pôsobí 5 minút určitým vykonáva sa imunoprecifosfotyrozínu. VyzrážaAby bolo možné ktorých dôjde väzbou fosforylácia tyrozínu k expresii trkB, po pôvodné bunky NIH3T3 k expresii trkB faktorom, potom sa bunky rozrušia a pitácia za použitia protilátky proti né bielkoviny sa oddelia elektroforézou na géli a preukazujú imunoblotovou skúškou za použitia protilátok proti fosfotyrozínu. V bunkách NIH3T3, v ktorých dochádza k expresii trkB je po pôsobení BDNF alebo NT-3 možné preukázať hlavný produkt fosforylácie tyrozínu s molekulovou hmotnosťou približne 145 000, z obr. 11B. bunkách po v bunkách, vystavené 11A. Tieto čo zodpovedá známej veľkosti trkB, ako je zrejmé Tento produkt nie je možné pozorovať v pôvodných pôsobení ktoréhokoľvek z uvedených faktorov ani u ktorých dochádza k expresii pôsobeniu bFGF údaje ukazujú, s molekulovou hmotnosťou pôsobením BDNF a NT-3, je trkB a ktoré boli alebo NGF, ako je zrejmé z obr. že hlavným produktom fosforylácie 145 000, ktorý je možné získať trkB.

Pôsobením BDNF a NT-3 na bunky NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, dochádza aj k fosforylácii tyrozínu za vzniku bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 41 000, ako je zrejmé z obr. 11B. Pôsobením bFGF dochádza tiež k fosforylácii bielkoviny s molekulovou hmotnosťou 41 000 ako v bunkách NIH3T3, tak v bunkách s expresiou trkB, ako je taktiež zrejmé z obr. 11B. Podľa výsledkov, opísaných v publikácii Boulton a ďalší, 1991, Celí, 65, 663 až 677, môže tento fosfoproteín zodpovedať ERK2, ide o serín/treonín kinázu, ktorá je aktivovaná, k fosforylácii tyrozínu v bunkách PC12 dochádza pôsobením NGF. Tieto údaje sú v súlade s pozorovaním, že neurotrofín a receptory rastového faktora fosforylujú niektoré rovnaké cieľové látky v nervových bunkách aj v bunkách odlišného pôvodu.

Diskusia

Bolo preukázané, že trkB po expresii v bunkách PC12, pozitívnych na LNGFR môže sprostredkovať rast nervových vlákien ako odpoveď na pôsobenie BDNF a NT-3 podľa publikácie Squinto a ďalší, 1991, Celí, 65, 1 až 20. Ako bolo vyššie uvedené, je teraz možné preukázať, že látka zo skupiny trk môže sprostredkovať biologickú odpoveď na neurotrofíny bez súčasného pôsobenia LNGFR. BDNF a NT-3 môžu pôsobiť na prežívanie a rast buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB, avšak nie na preukázateľnú produkciu LNGFR. Tieto vplyvy na prežívanie a rast buniek je možné pozorovať zo závislosti účinku na dávke, ktorá je veľmi podobná závislostiam, pozorovaným pri prežívaní primárnych neurónov v kultúre. Okrem toho je aj pôsobenie BDNF a NT-3 na fibroblasty, u ktorých dochádza k expresii trkB biologicky aj biochemický analogické pôsobeniu známeho rastového faktora, bFGF.

Uvedené poznatky potvrdzujú, že receptory pre neurotrofíny nie sú neobvyklým javom medzi receptormi pre tyrozínkinázu a to tak pokiaľ ide o ich požiadavky na interakcie s ostatnými zložkami receptorov, ako aj pokiaľ ide ide o typy signálov, ktoré sú schopné vykonávať. To znamená, že zjavne jedinečné pôsobenie neurotrofinov, ktorým je podpora prežívania nervových buniek a ich diferenciácia, je pravdepodobne možné pripísať pomerne obmedzenej distribúcii receptorov trk v nervových bunkách po mitóze, skôr než výnimočným vlastnostiam receptorového systému. Na druhej strane je možné zo získaných informácii usúdiť, že zjavné neurotrofné účinky tradičných rastových faktorov včítane látok zo skupiny FGF sú sprostredkované prevodom signálu, ktorý sa prekrýva s prevodom, využívaným v prípade neurotrofinov.

Identifikácia receptorov, využívaných neurotrofinov a vytvorenie neneurónových bunkových línií, taktiež reagujúcich prežívaním a rastom na tieto faktory, by malo zlepšiť porozumenie situácie, pri ktorej tie isté signály môžu byť nakoniec v neurónoch a neneurónových bunkách interpretované odlišným spôsobom. Je nutné uviesť, že bunky NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii trkB sú prvým príkladom immortalizovanej bunkovej línie, ktorá je schopná reagovať na neurotrof íny v koncentrácii, podobnej fyziologickým koncentráciám. U buniek PC12 je na odpoveď potrebné približne stonásobné množstvo NGF, než aké je potrebné na vyvolanie odpovede u primárnych neurónov. Tieto štúdie ukazujú, že skúšky na proliferáciu a prežívanie buniek NIH3T3, u ktorých dochádza k expresii nového receptora tyrozínkinázy je možné využiť ako veľmi vhodného systému na molekulárne klonovanie väzných látok pre tieto receptory. Okrem toho môže systém za použitia týchto buniek tiež podávať informáciu o tom, ako môžu neurotrofné faktory zabrániť uhynutiu nervových buniek. Teraz je teda možné preukázať, či sú v prípade neurotrofinov využívané tie isté alebo odlišné cesty na zabránenie uhynutia nervových buniek a buniek odlišného pôvodu.

Dôležitá informácia, ktorá vyplýva zo získaných údajov sa týka úlohy LNGFR s väzným miestom s nízkou afinitou pre všetky známe neurotrofíny. Rad štúdií ukazuje, že pri zavedení LNGFR do buniek, odlišných od nervových buniek ne68 dochádza k reakcii na neurotrofiny v týchto bunkách, ako bolo opísané v publikáciách Hemstead a ďalší, 1988, Mol. Celí. Biol., 8, 2242 až 2246. Najpriamejší dôkaz, týkajúci sa funkčnej úlohy LNGFR pri sprostredkovaní prevodu signálu bol získaný v pokuse, v ktorom bol LNGFR znova zavedený do mutanty buniek PC12, ktorá zjavne stratila všetku schopnosť » viazať NGF a odpovedať na prítomnosť tohto faktora, ako bolo opísané v Hemstead a ďalší, 1989, Science 243, 373 až 375, ^J Sehgal a ďalší, 188, Mol. Celí. Biol., 8, 2242 až 2246. Výsledné bunky po transfekcii obsahovali väzné miesta s vysokou aj nízkou afinitou pre NGF a boli tiež trochu schopné reagovať na prítomnosť NGF. Predpokladalo sa, že tento pokus dokazuje, že LNGFR je jedinou väznou molekulou pre NGF, k expresii ktorej dochádza v bunkách PC12 a že táto molekula spolupracuje s ďalšou časťou bez väznej schopnosti pre NGF, ale so schopnosťou prevádzať LNGFR na receptor s vysokou afinitou, schopný prevádzať signál. Pozorovanie, že bielkoviny trk sú schopné viazať neurotrofíny a že u buniek PC12 za bežných podmienok dochádza k expresii trkA teda vyžaduje reinterpretáciu uvedeného pokusu. Publikácie, vydané v súčasnej dobe sa nezhodujú v názore, či trkA vyžaduje LNGFR na vznik väzných miest pre NGF s vysokou afinitou. Je nutné zdôrazniť, že len jedinú bielkovinu, o ktorej je teraz _t známe, že zodpovedá trkA je možné zosietiť s NGF za vysoko afinitných podmienok väzby, ako bolo opísané v Hosang

- a Shooter, 1985, J. Biol. Chem., 260, 655 až 662. Okrem toho protilátka, ktorá účinne bráni väzbe NGF na LNGFR blokuje všetku nízkoafinitnú väzbu, avšak nie všetku vysoko afinitnú väzbu NGF a nebráni odpovedi buniek PC12, vyvolanej NGF, ako bolo opísané v Veskamp a Reichardt, 1991, Neurón, 6, 649 až 663. Vyššie uvedené funkčné údaje teda presvedčivo preukazujú, že LNGFR zrejme nie je nevyhnutný na odpoveď na fyziologické dávky BDNF a NT-3, sprostredkovanou trkB. Te však možné, že LNGFR by tiež mohol hrať signálnu úlohu pri prenose, v ktorom nie sú zahrnuté faktory typu trk, hoci zjavná neschopnosť BDNF alebo NT-3 vyvolať odpoveď u buniek PC12, robí túto možnosť menej pravdepodobnou, ako bolo opísané v Squinto a ďalší, 1991, Celí 65, 1 až 20. Zistenie, že LNGFR má širšiu distribúciu než faktory trk podlá Bothwell, 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 165, 63 až 70, zvlášť v prípade cielových tkanív na inerváciu, ktoré produkujú neurotrofíny, avšak o ktorých nie je známe, že by na nich reagovali, zrejme podporuje skôr imunomobilizačnú alebo » podobnú úlohu než signálnu úlohu LNGFR.

* Vyššie uvedené výsledky priraďujú neurotrofíny a bielkoviny zo skupiny trk k zväčšujúcej sa skupine systémov faktora a receptora, v ktorých na ten istý receptor môže pôsobiť celá skupina príbuzných väzných látok, ako bolo opísané v Cross a Dexter, 1991, Celí, 64, 271 až 281. K expresii

NT-3 a BDNF dochádza v priebehu vývoja dramaticky recipročným spôsobom, ako bolo opísané v Maisonpierre a ďalší, 1990a, Neurón, 5, 501 až 509. K expresii génu pre NT-3 dochádza vo včasnom vývoj i na ďaleko vyššej úrovni než k expresii génu pre BDNF a potom sa táto expresia znižuje, kým expresia génu pre BDNF sa zvyšuje. Tento recipročný vzťah medzi expresiou NT-3 a BDNF je zvlášť zaujímavý v prípade, že sa berie do úvahy zistenie, že trkB môže pôsobiť ako receptor BNDF a v menšej miere aj ako receptor NT-3. Vyššie množstvo NT-3 vo včasnom vývoji môže umožniť jeho _x všeobecnejšie pôsobenie na receptor trkB a po poklese expresie potom zrejme len na neidentifikované receptory, špecifické pre NT-3.

Príklad 3

Klonovanie molekúl receptora pre tyrozínkinázu

Materiály a metódy

Na obr. 12E označujú rímske číslice oblasti homológie tyrozínkinázy tak, ako boli opísané v publikácii Hanks a ďalší, 1988, Science, 241, 42 až 52. Preukázané oblasti homológie reťazca na obr. 12E, ktoré sú podtrhnuté a ktoré sú uložené v katalytickej oblasti týchto bielkovín boli použité pri konštrukcii degenerovaných oligonukleotidových primérov, ktoré potom boli použité pri PCR-reakcii za použitia cDNA z mozgu potkana, a to buď dospelého potkana alebo v embryonálnom štádiu E13. Výsledné amplifikované fragmenty DNA boli klonované po uložení do plazmidov, bol analyzovaný ich reťazec a takto získané reťazce DNA potom boli porovnané s reťazcami všetkých dosiaľ známych tyrozínkináz.

Matrice cDNA boli pripravené reverznou transkripciou RNA z mozgu potkana, a to dospelého potkana aj potkana v štádiu E13 za použitia oligo-d(T)-primérov. Kombinačné PCR-reakcie s obidvoma skupinami cDNA boli vykonávané za použitia šiestich kombinácií v smere reťazca aj v opačnom smere, ako je uvedené v nasledujúcej tabuľke I a na obr. 12A, priméry boli naväzované pri teplote 40 až 45 °C. Podiely materiálu z PCR-reakcii boli podrobené elektroforéze na agarózovom géli, potom boli použité vnútorné rádioaktívne značené degenerované oligonukleotidy, homológne k oblasti VII homológie. V závislosti na relatívnej intenzite získaných hybridizačných signálov bolo pre ďalšiu analýzu vybra-

ných päť nosťami.	PCR-reakcii, ktoré	sa vyznačovali	uvedenými vlast-
	T a b u ľ k	a I
PCR č.	teplota °C	zdroj cDNA	priméry
1	40	E13	DLATRN-DWSLG
2	40	dospelá	DLATRN-DVVSYG
3	40	E13	DLATRN-DWSYG
4	40	E13	DLAARN-DWSLG
5	40	E13	DLAARN-DWSLG

Amplifikované fragmenty DNA z týchto PCR-reakcii, rozdelené podľa veľkosti boli klonované v plazmidoch nasledujú71 ± 25 bola z piatich spojených vzoriek PCR bola enzýmov Xhol a SstI na rozštiepenie primérov tak, ako bude ďalej uvedené elektroforéza na 6% polyakrylovom bp po štiepení Xhol/SstI a po farbečistená elúciou z príslušných vyreDNA po elúcii mieste pôsobenia enzýmov II KS(-), uloženom do pórov pôsobením elektricnanesený na platne

200 bakteriálnych kolónií, proti ampicilínu bolo z každej transformácie PCR ení polyakrylamidového gélu.

v kompatibilnom

Bluescript otvorenia mikroorganizmus Približne cim spôsobom: každá rozštiepená pomocou miest na zakončenie a potom bola vykonaná géli: DNA s 225 bp ní etidiumbromidom zaných fragmentov bola klonovaná

Xhol/SstI v plazmide DHSalfa E. coli pomocou kého prúdu, potom bol agaru na selekciu, odolných naočkovaných na mikrotitračné platne, obsahujúce 96 vyhĺb a boli skladované v glycerole pri teplote -80 ’C. Jednotlivé kolónie z vyššie uvedených piatich vzoriek PCR klonov boli analyzované analýzou reťazca DNA plazmidu po čistení bežnými postupmi.

Výsledky a diskusie

Oligonukleotidové priméry, zodpovedajúce konzervovaným oblastiam známych molekúl tyrozínkinázy boli použité na amplifikáciu a klonovanie kódových reťazcov DNA pre nové molekuly receptora tyrozínkinázy. Reťazce aminokyselín, vybrané zo skupiny tyrozínkináz a opísané v publikácii Hanks a ďalší, 1988, Science, 241, 42 až 52, boli porovnané, ako je zrejmé z obr. 12E a boli identifikované oblasti homológie v katalytickej oblasti týchto bielkovín a použité na konštrukciu degenerovaných oligonukleotidových primérov tak, ako bolo vyššie uvedené v tabuľke I a na obr. 12A. Potom boli priméry použité na uskutočnenie PCR-reakcie, ako matrica bola použitá cDNA z mozgu dospelých potkanov alebo z mozgu potkanov v embryonálnom štádiu E13. Výsledné amplifikované fragmenty DNA potom boli klonované v plazmide Bluescript II KS(-), bol analyzovaný ich reťazec a reťazce DNA boli porovnané s reťazcami známych tyrozínkináz.

Na obr. 12B je znázornený ktorý sú kódom uvedené klony, reťazcov známych tyrozínkináz. z obr. 12B má homológiu s trk, eck(alfa) a eck(beta),

Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8 a Rtk-9. DNA pre každý z týchto uvedené aj informácie o zdroji amplifikáciu každého klonu. reťazcov DNA a príbuznosť reťazec aminokyselín, pre reťazce sú homológne radu Päť klonovaných molekúl zostavou CSF1R/PDGFT, ret, boli označené Rtk-1, 12C sú uvedené reťazce tyrozínkinázy a sú použité na týchto zrej má j e tieto reťazce

Na obr.

piatich klonov cDNA a priméry, Uvedené je aj porovnanie ich aminokyselinových reťazcov, rôznych reťazcov tyrozínkináz.

Na obr. 12B sú uvedené reťazce aminokyselín, získané za použitia cDNA potkanieho mozgu po jeho získaní použitím sondy cDNA Rtk-1 tak, ako je znázornené na obr, 12C. Kloň cDNA obsahuje reťazce, totožné s Rtk-1 a ďalší segment génu pre reťazec 1440 aminokyselín, ktorý je založený na porovnaní trkA a trkB, tento reťazec môže zodpovedať karboxyterminálnemu zakončeniu produktu génu Rtk-1.

Príklad 4

Klonovanie molekuly receptoru, podobné trk

Materiály a metódy

Klonovanie pomocou PCR bolo vykonané v podstate rovnako ako je uvedené vyššie, avšak bola použitá cDNA z bunkovej línie ľudského neuroblastomu SY5Y ako matrica a ďalej boli použité oligonukleotidové priméry z tabuľky II.

Výsledky a diskusia

Cieľom tejto práce bola identifikácia reťazcov DNA, blízko príbuzných génom trk a trkB pomocou PCR. Z tohto dôvodu boli skonštruované oligodeoxynukleotidové priméry, zodpovedajúce bielkovinovým oblastiam, silne konzervovaným u všetkých proteínkináz, avšak tak, aby súčasne došlo k amplifikačnej reakcii v zmysle reťazcov, podobných trk. Napríklad primér trk-10 na obr. 13A zodpovedá reťazcu -PIRVMPPE-, ktorý je totožný pre trk a trkB, avšak aj najbližšie príbuzné látky, to znamená inzulín a inzulínu podobné receptory rastových faktorov už v tomto mieste obsahujú ₄ dve substitúcie aminokyselín. Na obr. 13A je znázornené porovnanie oblasti tyrozínkinázy u členov skupiny inzulíno> vých receptorov, u ktorých už boli identifikované konzervované oblasti reťazca a je uvedené uloženie všetkých primérov, ktoré boli použité.

Pri použití cDNA z bunkovej línie ľudského neuroblastómu SY5Y ako matrice bola vykonaná PCR-reakcia s rôznymi kombináciami primérov. Produkty DNA potom boli rozštiepené reštrikčnými enzýmami, schopnými štiepiť reťazce trk a trkB a odolný materiál bol znova amplifikovaný a klonovaný. Reťazce jednotlivých klonov potom boli analyzované. Reťazce aminokyselín, odvodené od týchto reťazcov DNA preukázali prítomnosť fragmentov štyroch nových potenciálnych receptorov. Tieto fragmenty, ktoré boli označené Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5 boli znázornené na obr. 13B (Rtk-4 a Rtk-5), na obr. 14 (Rtk-2) a na obr. 15 (Rtk-3) a boli porovnané so zodpovedajúcimi oblasťami ľudského trk na obr. 13C. Rtk-2 je znázornený na porovnanie spolu s ľudským trk, trkB potkana, , receptorom pre rastový faktor inzulínového typu a inzulínovým receptorom na obr. 13D.

Oligodeoxynukleotidové priméry, uvedené v nasledujúcej tabuľke II boli použité pri príprave PCR-fragmentov (zakončenie miesta reštrikčného pôsobenia, ktoré bolo použité na klonovanie je znázornené veľkými písmenami a degenerácia v určitej polohe je znázornená tak, že príslušné písmená sú uvedené v zátvorke):

Tabuľka II

Rtk-2 a Rtk-3

TRK-9 ACGTCTCGAG-GC(TCAG) -GG(TCAG) -ATG-GT(TCAG)TA(TC) - (TC)T

TRK-IOr CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG) -C(GT) (AGT) AT (TCAG) - GG

Rtk-4

TRK-5 ACGTCTCGAG-AA(AG) -AT(TCA) -GG(TCAG) -GA(TC) TT(TC) -GG

TRK-IOr CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG) -C(GT) (AGT) - AT (TCAG) - GG

TRK-9 ACGTCTCGAG-GC(TCAG) -GG(TCAG) -ATG-GT(TCAG) TA(TC) - (TC) T

TRK-6r CATGTCTAGA-CC- (GA)AA- (GA)TC- (CTGA)CC(TGA)AT- (CT)TT.

Zvlášť zaujímavé sú Rtk-2 a Rtk-3. V prípade, že odvodené reťazce aminokyselín boli použité pri analýze génovej knižnice, boli získané hodnoty 67,0 (03/91) a modifikovaná hodnota EMBL 26,0 (02/91) za použitia TFASTA, najvyššie hodnoty na homológiu boli získané pre trkB a pre ostatné reťazce typu trk. Rtk-2 a Rtk-3 obsahujú reťazec YxxDYY, ktorý je charakteristický pre podskupinu trk/inzulín-R. Oba reťazce majú substitúciu L namiesto F v skupine DFG, ktorá je veľmi silne konzervovaná vo všetkých kinázach.

V prípade, že boli sondy Rtk-2 a Rtk-3 hybridizované metódou northern blot, nebol získaný za použitia RNA SY5Y žiaden signál. Reťazec Rtk-2 hybridizoval s pásom so 6 až 7 kb s RNA z iných línií, najmä z buniek CHP100, SKES a LAN5. Reťazec Rtk-3 hybridizoval s pásom s 5 kb s RNA z buniek SKN-SH a LAN5. Pri vyšetrení 1,5 x 10^ klonov z banky cDNA SY5Y v lambda ZPA II za použitia sondy Rtk-2 bolo získaných päť pozitívnych klonov s uloženými reťazcami v rozmedzí 1,4 až 3 kb.

Údaje o reťazci Rtk-2, tak ako sú znázornené na obr. 14 ukazujú, že nukleotidy 801 až 875 sú zrejmé kódovými reťazcami pre transmembránovú oblasť, nukleotidy 1002 až 1850 obsahujú oblasť pre tyrozínkinázu a nukleotidy 1 až 800 sú kódovým reťazcom na kontinuálne otvorenie čítacieho rámca, zahrňujúce oblasť pre väzbu väzných látok. Za oblasťou pre tyrozínkinázu nasleduje predĺženie, obsahujúce 180 aminokyselín na rozdiel od látok typu trk, ktoré končia krátko za oblasťou pre tyrozínkinázu.

Čiastočný reťazec aminokyselín pre trk-3 je znázornený na obr. 15, kde je znázornená aj prítomnosť uvedeného predĺženia za oblasťou pre tyrozínkinázu, zjavná je silná homológia s Rtk-2.

Porovnanie reťazca Rtk-3 s reťazcami pre Rtk-2, zlúčeniny zo skupiny trk, IGFR a receptor inzulínu tak, ako je uvedené na obr. 16 ukazuje, že reťazce Rtk-2 a Rtk-3 vykazujú najvyššiu homológiu a ide teda zrejmé o novú podskupinu receptorov tyrozínkinázy.

Funkčné spojenie trk s neurotrofínmi v gangliách dorsálnych koreňov u potkanieho embrya

Materiály a metódy

Ganglia dorsálnych koreňov DRG potkanieho embrya E14 boli vybraté z uložené do prostredia F14, doplneného 5 % konského séra podľa publikácie Linsay a ďalší, 1985, Deb. Biol., 112, 319. Pre skúšky na explantátoch boli ganglia uložené na misky s priemerom 35 mm, vopred vybavené povlakom polyornitínu 1 mg/ml a laminínu 50 mikrogramov/ml. Ganglia boli pestované v prítomnosti alebo v neprítomnosti neurotrofínov pri teplote 37 °C pri vysokej vlhkosti v atmosfére s obsahom 3 % oxidu uhličitého. Rast nervových vlákien bol

- 76 hodnotený stupnicou 0 až 5. Na konci pestovania boli ganglia opláchnuté PBS a potom bola pripravená RNA za použitia guanidíniumtiokyanátu podľa publikácie Chomczynski a Sacchi 1987, Analytical Biochem. 162, 156. Pri skúškach na disociovaných bunkách boli ganglia inkubované 30 minút s 0,1% trypsínom pri teplote 37 ’C, potom boli ganglia rozotreté a znovu nanesené na 2,5 hodiny na živné prostredie. Potom boli nervové bunky oddelené a rozdelené do vyhĺbení s priemerom 16 mm, vopred vybavených povlakom 100 mikrogramov/ml polyornitínu a 50 mikrogramov/ml laminínu. Nervové bunky boli pestované 24 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti neurotrof ínov a bol zaznamenaný počet buniek. RNA z tkanív boli pripravené za použitia bežných postupov.

Výsledky

Pri inkubácii DRG s NGF v rôznych koncentráciách došlo k masívnemu rastu nervových vlákien z explantátov, účinok bol závislý na dávke, ako je zrejmé z obr. 17. Podobné výsledky boli získané za použitia NT-3. K nasýteniu koncentrácie pre túto odpoveď dochádza približne pri 5 ng/ml pre NGF alebo NT-3. Na druhej strane BDNF vyvoláva slabšiu, avšak homogénnejšiu odpoveď u explantátov DRG, ako je zrejmé z obr. 17.

V gangliách, pestovaných v prítomnosti alebo v neprítomnosti rôznych neurotrofínov bola sledovaná aj úroveň mRNA pre trkA, B a C. V kontrolných DRG, odobratých z potkaních embryí E14 je možné dokázať mRNA pre trkA, B a C, ako je zrejmé z obr. 18 a 19. Ako je znázornené na. obr. 18A, bolo v gangliách, inkubovaných v prítomnosti 50 ng/ml NGF možné preukázať značnú úroveň mRNA pre trkB, avšaik nebolo možné preukázať mRNA pre trkB, ako je zrejmé z obr. 18B. Na druhej strane v gangliách, inkubovaných v prítomnosti 50 ng/ml BDNF bolo možné dokázať značné množstvo mRNA pre trkB, ako je zrejmé z obr. 19B, avšak veľmi malé množstvo tohto materiálu pre trkA, ako je zrejmé z obr. 19A a žiadny materiál pre trkC, ako je zrejmé z obr. 19C. Konečne po pôsobení 50 ng/ml NT-3 bolo možné v gangliách dokázať značné množstvo mRNA pre trkC a trkA, avšak veľmi nízke množstvo tohto materiálu pre trkB. Tieto výsledky dokazujú, že populácia nervových buniek, ktorá v prítomnosti týchto neurotrofínov prežíva obsahuje špecifické receptory pre každý z uvedených neurotrof ínov. Znamená to, že po inkubácii s BDNF prežívajú len neuróny, obsahujúce trkB, kým po pôsobení NGF prežívajú len neuróny, obsahujúce trkA. Po pôsobení NT-3 zrejme prežívajú tak neuróny, obsahujúce trkC, ako aj tie, ktoré obsahujú trkA. Skutočnosť, že v určitých bunkových typoch sa nachádzajú špecifické receptory pre určité neurotrofíny poukazuje na to, že tieto neurotrofíny je možné použiť na podporu prežitia určitých skupín buniek v periférnom nervovom systéme.

Uloženie mikroorganizmov

Vo verejnej zbierke kultúr Američan Type Culture Collection, ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, boli uložené nasledujúce mikroorganizmy:

číslo pBluescript SK, obsahujúci Rtk-2 pBluescript SK, obsahujúci Rtk-3

75052

75053

Vynález nemá byť obmedzený na opísané špecifické vykonania. Je zrejmé, že bolo možné uskutočniť ešte rad modifikácií takisto patriacich do rozsahu vynálezu.

Claims (73)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob detekcie a meranie účinnosti neurotrofínov, vyznačujúci sa tým, že sa

   i) bunka, v ktorej dochádza k expresii trkB, vystaví pôsobeniu skúmanej látky, potom sa ii) dokáže alebo meria špecifická väzba skúmanej látky na trkB, ktorá je v pozitívnej korelácii s účinnosťou neurotrof ínu.
2. 2. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že bunka obsahuje rekombinantný gén s kódovým reťazcom pre trkB.
3. 3. Spôsob podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že bunka ďalej obsahuje referenčný gén pod riadením včasného promótora génu.
4. 4. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že bunka ako včasný promótor obsahuje promótor fos.
5. 5. Spôsob podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že bunka ako včasný promótor obsahuje promótor jun.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preuka zuje alebo merá dôkazom alebo meraním väzby skúmanej látky na povrch bunky.
7. 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním schopnosti tejto látky zosietiť trkB vo forme bielkoviny.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním schopnosti kompetície tejto látky so značeným neurotrofinom o väzbu na trkB.
9. 9. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním sekundárnych biologických účinkov väzby neurotrofinu na trkB.
10. 10. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je rast nervových vlákien.
11. 11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je indukcia včasného génu.
12. 12. Spôsob detekcie a meranie účinnosti neurotrofínov, vyznačujúci sa tým, že sa

    i) bunka, v ktorej dochádza k expresii trkB, vystaví pôsobeniu skúmanej látky a ii) preukazuje sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB, ktorá je v pozitívnej korelácii s účinkom typu neurotrof inu .
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že bunka obsahuje rekombinantný gén s kódovým reťazcom pre trkB.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že bunka ďalej obsahuje referenčný gén pod riadením včasného promótora génu.
15. 15. Spôsob m, že bunka podľa nároku 14, v ako včasný promótor yznačuj úc obsahuje promótor i s f os.
16. 16. Spôsob m, že bunka podľa nároku 14, v ako včasný promótor yznačuj úc obsahuje promótor jun.
17. 17. Spôsob podľa nároku 12, v yznačuj úc a

    m, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukat žuje alebo merá dôkazom alebo meraním väzby skúmanej látky na bunkový povrch.
18. 18. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním schopnosti tejto látky zosietiť bielkovinu trkB.
19. 19. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že špecifická väzba skúmanej látky na trkB sa preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním schopnosti kompetície tejto látky so značeným neurotrofinom o väzbu na trkB.
20. 20. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že sa špecifická väzba skúmanej látky na trkB preukazuje alebo merá dôkazom alebo meraním sekundárneho biologického účinku väzby neurotrofínu na trkB.
21. 21. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je tvorba nervových vlákien.
22. 22. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je indukcia včasného génu.
23. 23. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je prežívanie buniek .
24. 24. Spôsob podlá nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je proliferácia buniek.
25. 25. Spôsob podlá nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je transformácia buniek.
26. 26. Spôsob podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že sekundárnym biologickým účinkom je fosforylácia trkB.
27. 27. Spôsob detekcie a meranie účinnosti neurotrofínu vyznačujúci sa tým, že sa

    i) skúmaná látka uvedie in vitro do styku s bielkovinou trkB za podmienok, pri ktorých môže dôjsť k väzbe a ii) preukáže sa väzba skúmanej látky na bielkovinu trkB, ktorá je v pozitívnej korelácii s neurotrofínovým alebo podobným účinkom.
28. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že skúmaná látka uvedie do styku s bielkovinou, viazanou na tuhý nosič.
29. 29. Spôsob identifikácie látky s neurotrofínovým účinkom, vyznačujúci sa tým, že sa

    i) skúmaná látka uvedie in vitro do styku s bielkovinou trkB za podmienok, pri ktorých môže dôjsť k väzbe a ii) preukáže sa väzba skúmanej látky na bielkovinu trkB, ktorá je v pozitívnej korelácii s neurotrofínovým alebo podobným účinkom.
30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že sa skúmaná látka uvádza do styku s bielkovinou trkB, viazanou na tuhý nosič.
31. 31. Bunka, ktorá

    i) je schopná expresie rekombinantnej bielkoviny trkB a ii) obsahuj e včasného rekombinantnú nukleovú promótora génu.

    kyselinu s obsahom génu
32. 32. Bunka je promótor fos.

    podľa nároku 31, v ktorej promótorom včasného génu
33. 33. Bunka podľa nároku 31, v je promótor jun.

    ktorej promótorom včasného

    34. Bunka podľa bunkovej línie PC12. 35. bunkovej Bunka podľa línie NIH3T3. 36. Bunková línia

    nároku 31, nároku 31,

    32 alebo 33, odvodená od

    32 alebo 33, odvodená od dový gén na rozlíšiteľné riadením včasného podľa nároku 27, označenie, promótora génu.

    ďalej obsahujúca kóschopný expresie pod

    37.

    Bunková séra na línia fibroblastov, prítomnosť rastového zbavenom kódovú rekombinantnú nukleovú kyselinu závislá faktora pre trkB.

    v prostredí, a obsahujúca
34. 38. TrkB deficientná bunka, získaná ingiktiváciou endogénneho génu pre trkB homológnou rekombináciou.
35. 39. TrkB deficientný živočích, získaný inaktiváciou endogénneho génu pre trkB homológnou rekombináciou.
36. 40. TrkB deficientný živočích, získaný imunizáciou pokusného živočícha proti trkB.
37. 41. Spôsob diagnózy neurologickej poruchy u chorých, vyznačujúci sa tým, že sa porovnáva úroveň expresie trkB zo skúšobnej vzorky chorého s úrovňou expresie trkB v porovnateľnej vzorke zdravého človeka, pričom rozdiel medzi úrovňou expresie trkB u chorého a u zdravého človeka, ktorý je ukazovateľom tejto poruchy je primárne alebo sekundárne vo vzťahu k metabolizmu trkB.
38. 42. Spôsob liečenia chorého, trpiaceho neurologickou poruchou, vyznačujúci sa tým, že sa chorému podá účinné množstvo bielkoviny trkB alebo jej peptidového fragmentu alebo jej derivátu, schopného sa viazať na neurotrof in.
39. 43. Účinná látka, tvorená v podstate čistou molekulou, čistenou spôsobom podľa nároku 12.
40. 44. Spôsob detekcie schopnosti skúmanej látky pôsobiť ako antagonista účinnosti neurotrofínu, vyznačuj ú ci sa tým, že sa preukazuje schopnosť tejto zlúčeniny spôsobiť inhibíciu účinku neurotrofínu, ktorý sa viaže na trkB v bunke, v ktorej dochádza k expresii trkB.
41. 45. Spôsob detekcie schopnosti skúmanej látky pôsobiť ako antagonista účinnosti neurotrofínu, vyznačuj ú ci sa tým, že sa preukazuje schopnosť tejto zlúčeniny zvýšiť účinok neurotrofínu, ktorý sa viaže na trkB.v bunke, v ktorej dochádza k expresii trkB.
42. 46. Spôsob klonovania aspoň časti génu pre receptor tyrozínkinázy, vyznačujúci sa tým, že sa

    i) amplifikuje kódový reťazec nukleovej kyseliny pre tyrozínkinázu pomocou PCR-reakcie za použitia zmesi cDNA molekúl ako matrice a pri použití oligonukleotidových primérov, zodpovedajúcich oblastiam v známej molekule tyrozínkinázy, pričom tieto oblasti sú spojené s účinnosťou tyrozínkinázy, potom sa ii) amplifikovaná nukleová kyselina klonuje za použitia príslušného vektora.
43. 47. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden z oligonukleotidových primérov obsahuje v smere expresie génu primér s reťazcom, uvedeným pre primér

    1 na obr. 12A.
44. 48. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden z oligonukleotidových primérov obsahuje v smere expresie génu primér s reťazcom, uvedeným pre primér

    2 na obr. 12A.
45. 49. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden z oligonukleotidových primérov obsahuje v protismere expresie génu primér s reťazcom, uvedeným pre primér 3 na obr. 12A.
46. 50. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden z oligonukleotidových primérov obsahuje v protismere expresie génu primér s reťazcom, uvedeným pre primér 4 na obr. 12A.
47. 51. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že jeden z oligonukleotidových primérov obsahuje v protismere expresie génu primér s reťazcom, uvedeným pre primér 5 na obr. 12A.
48. 52. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidové priméry sú tvorené párom primérov trk-9 a trk-10r z tabuľky II.
49. 53. Spôsob podlá nároku 46, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidové priméry sú tvorené párom primérov trk-5 a trk-10r z tabulky II.
50. 54. Spôsob podlá nároku 46, vyznačujúci sa tým, že oligonukleotidové priméry sú tvorené párom primérov trk-9 a trk-6r z tabulky II.
51. 55. V podstate čistená nukleová kyselina, klonovaná spôsobom podlá nároku 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 alebo 54.
52. 56. V podstate čistená rekombinantná molekula nukleovej kyseliny, tvorená reťazcom nukleovej kyseliny, klonovaným spôsobom podľa nároku 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 a 54.
53. 57. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 12C uvedený pre Rtk-1 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
54. 58. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 12C uvedený pre Rtk-6 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
55. 59. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 12C uvedený pre Rtk-7 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
56. 60. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 12C uvedený pre Rtk-8 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
57. 61. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 12C uvedený pre Rtk-9 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
58. 62. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr.

    14 uvedený pre Rtk-2 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
59. 63. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr.

    15 uvedený pre Rtk-3 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
60. 64. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 13B uvedený pre Rtk-4 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
61. 65. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, obsahujúca reťazec nukleovej kyseliny, tak ako je na obr. 13B uvedený pre Rtk-5 alebo jeho časť, obsahujúci aspoň desať zvyškov nukleových kyselín.
62. 66. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 12C pre Rtk-l alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
63. 67. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 12C pre Rtk-6 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
64. 68. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 12C pre Rtk-7 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
65. 69. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 12C pre Rtk-8 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
66. 70. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 12C pre Rtk-9 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
67. 71. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 14 pre Rtk-2 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
68. 72. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 15 pre Rtk-3 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
69. 73. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 13B pre Rtk-4 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
70. 74. V podstate čistená bielkovina, obsahujúca reťazec aminokyselín tak, ako je uvedený na obr. 13B pre Rtk-5 alebo fragment s obsahom aspoň šiestich aminokyselín alebo jeho funkčný ekvivalent.
71. 75. Bunka, obsahujúca molekulu nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 alebo 65.
72. 76. Mikroorganizmus, obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podlá niektorého z nárokov 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 alebo 65.
73. 77. V podstate čistená molekula nukleovej kyseliny, tvorená kódovým reťazcom pre bielkovinu podlá niektorého z nárokov 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 alebo 74.