CZ223793A3 - Method of detecting and measuring activity of neurotrophins, method of cloning a gene for tyrosinkinase and a recombinant molecule of nucleic acid, cell, micro-organisms and protein thereof - Google Patents

Method of detecting and measuring activity of neurotrophins, method of cloning a gene for tyrosinkinase and a recombinant molecule of nucleic acid, cell, micro-organisms and protein thereof Download PDF

Info

Publication number
CZ223793A3
CZ223793A3 CS932237A CS223793A CZ223793A3 CZ 223793 A3 CZ223793 A3 CZ 223793A3 CS 932237 A CS932237 A CS 932237A CS 223793 A CS223793 A CS 223793A CZ 223793 A3 CZ223793 A3 CZ 223793A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
trkb
cell
nucleic acid
cells
rtk
Prior art date
Application number
CS932237A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen P Squinto
David Glass
Thomas H Aldrich
Peter Distephano
Trevor Stitt
Mark E Furth
George D Yancopoulos
Peter C Maisonpierre
Piotr Masiakowski
Nancy Ip
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of CZ223793A3 publication Critical patent/CZ223793A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

(54) Způsob detekce a měření aktivity neurotrofinů, způsob klonování genu pro receptor tyrosinkinásy a rekombinantní molekula nukleové kyseliny její buňka, mokroorganismus a bílkovina (57) Způsob detekce a měření účinnosti neurotrofinu nebo pro identifikaci látek, které mají účinnost, podobnou účinnosti neurotrfinu. Postup je založen na zjištění, že protoonkogen trkB je kódem pro receptor tyrosinkinázy, který může sloužit pro funkční vazbu BDNF a NT-3. Diagnostické a léčebné metody jsou založeny na interakci mezi BDHF a/nebo NT-3 a trkB, popřípadě na interakci s dalšími receptorovými molekulami.
Způsob d a měření účinnosti neurotrofinu ^/ο*Οřezepíor -4,yrt>$tί ktmsy *. re-ko>*,&,'**.*-£*.<.' #oiz~ b, >,/'«. b//&>
techniky etekc f>r° ''fi^kí-e.we. kjse./f'*y j<j·
1· ObidS !
Vynalož se zýká způsobu detekce a měření účinnosti neurotrofinu nebo identifikace lázek s účinností/ podobnou účinnosti neurotrofinu. Vynález je založen na zjištění, že protoonkogen trkB je kódem pro recepccr tyrosinkinázy, který může sloužit jako funkční vazná bíl.ovina pro BDN? a NT-3. Vynález se rovněž týká diagnostických a léčebných metod· , založených na inzerakci mezi BDN? a/nebo NT-2 a trkB a celé řady receptorových molekul.
2. Dosavadní stav techniky
Vývoj a udržování nervového systému obratlovců závisí na specifických bílkovinách, označovaných jako neutrotrofní faktory a původně definovaných schopností podporovat přežívání populací neuronů podle Snider a Johnson, 1989, Ann. Neurol., 25, 489. Neurotrofní faktory se rovněž účastní proliferace a diferenciace neuronů podle Cattaneo a McXay, 1990, Nátuře 347, 762 - 765 a Lindsay a Harmar, 1989, Nátuře 337,
I ,
362 - 364 a mimoto mohou mít ještě další, prozatím zcela neobjasněnou úlohu v nervovém systému i mimo něj. V případě neurotrof ního faktoru, odvozeného od mozkové tkáně (BDN?) a neurotrofinu-3 (NT-3) bylo v poslední době provedeno molekulární klonování a bylo prokázáno, že tyto látky jsou strukturně příbuzné prototypu faktorů, podporujících přežívání buněk, faktoru růstu nervových buněk NGF, jak bylo popsáno v Leibrock a další, 1989, 341:149 - 152, Hohn a další, 1990, Nátuře 344, 339 - 341, Maisonpierre a další, 1990, Science 247, 1446 1451, Rosenthal a další, 1990, Neuron 4, 767 - 773, Ernfors a další, 1990, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 87, 5454 - 5458,
Jones a Reichardt, 1930, Proč. Nati. Ac3d. Sci., USA, 87, 3050 - 8054.Tyto tři příbuzné faktory, označované jako neurotrofiny nemají žádnou strukturní homologii se čtvrtým neurotrofním faktorem, oiliárním neurocrofním faktorem CNTF, jak bylo popsáno v Lín a další, 1239, Science, 245, 1023 - 1025, Stoc.-cli a další, 1989, Nátuře 342, 920 - 923.
Přenos cestou receptoru nebo přenosy signálů v případě NGF byl vel.ni podrobně studován, převážně vzhledem k dostupnosti buněčné linie pheochromocytomu PC12, u níž dochází při reakci na NGF k diferenciaci podle Greene a Tischler, 1375, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 73, 2424. Tyto studie vedly ke klonování transmembránové bílkoviny, označované LNGR? pro svou nízkou afinitu receptoru NGF, tato bílkovina váže NGF s poměrně nízkou aktivitou, jak bylo popsáno v Chao a další 1936, Science 232, 513 - 521, Radeke a další, 1937, Nátuře 325, 593 - 597. Kromě LNGFR je zřejmě zapotřebí ještě další bílkovina, označovaná jako HNGFR pro svou vysokou afinitu k receptoru NGF, tato bílkovina se účastní tvorby místa s vyšší afinitou pro vazbu NGF a je nutná k zahájení přenosu signálu, vyvolaného působením NGF, jak bylo popsáno v Zimmerman a další, 1978, J. Supramol. Struc., 9, 351 - 351, Sutter a 'další, 1979, Transmembrane Signalling, ·Ν. Y. Alan Liss, str. 659 - 667, Bernd a Greene, 1984, J. Bio. Chám. 259, 15509 - 15516, Hempstead a další, 1989, Science 243,
373 - 375. Tato látka, HNG5FR, je fosforylována na tyrosinu v důsledku působení NGF a zjevné obsahuje vnitřní tyrosinkinásovou účinnost podle Meakin a Shooter, 1991, Neuron 6, 153 - 163. Mimoto zprostředkovávají kinázy ERK, uváděné také jako kinázy MAP2, které jsou časnými meziprodukty v kaskádách signálu, aktivovaných tyrosinkinázou fosforylaci tyrosinu jako odpověd na působení NGF. To znamená, že stejně jako v případě odpovědi na další růstově faktory může být přenos signálu NGF zahájen aktivací tyrosinkinázy, vázané na receptor.
i
Studia z poslední doby prokázaly, že produkt protocnxogenu trk, napodobující receptor růstového faktoru (to znamená, že jde o transmembránovcu bílkovinu, obsahující i.otracy toplasmatickou oblast tyrosinkinázy), pro nějž nebyla identifikována žádná vazná molekula, je rychle fosforylován v důsledku působení NGF na buňky PC12, jak bylo popsáno v Kaplan a další, 1991, Náturo, 350, 156 - 160, Klein a další, 1991, Cell 65, 189 - 137 a mimoto dochází k přímé vazbě NGF s poměrně vysokou afinitou v případě exprese v heterologníoh buňkách, jak bylo rovněž popsáno ve svrchu uvedené publikaci Kleina a dalších. Toto zjištění spolu s omezenou neuronovou distribucí bílkoviny trk v živém organismu napovídá, že trk může být složkou HNGFR, zodpovědnou za zahájení přenosu signálu NGF.
Na rozdíl k široce rozpracovaným studiím receptorů pro NGF a prostudovaným cestám pro přenos signálů byly recaotory a cesty přenosu signálu v případě ostatních neurotrofních faktorů ještě nedostatečně objasněny a studie se zahajují až v poslední době. Avšak zdá se, že se BDNF váže na LNGFR s afinitou, podobnou afinitě NGF podle publikace Rodriguez-Tebar a další, 1990, Neuron 4, 487 - 492. Přesto že na neúronech, odpovídajících na působení BDNF se nacházejí receptory s nízkou i s vysokou aktivitou, je možno předpokládat podle dosažených výsledků, že BDNF a NGF působí na odlišné neurony, přičemž u neuronů, reagujících na působení NGF nedochází k expresi receptorů s vysokou afinitou pro BDNF, takže BDNF patrně využívá odlišný receptor s vysokou afinitou než NGF podle Rodrigues-Tebar a Barde, 1988, J. Neurose. 8, 3337 - 3342.
Řada výsledků podporuje příbuznost působení BDNF a NT-3 a současně oba tyto neurotrofiny odlišuje od NGF. NT-3 a BDNF avšak nikoliv NGF, jsou faktory, u nichž při expresi dochází <
v průběhu vývoje k nápadnému recopročnímu působení, přičemž k expresi NT—3 dochází ve větší míře v časném stadiu a k převážné expresi BDNF dochází v pozdějším stadiu vývoje týchž oblastí mozku podle Maisonpierre a další, 1390, Neuron 5, 501 - 509. Je zajímavé, že profily distribuce pro BDNF a NT-3, avšak nikoliv pro NGF jsou v různých oblastech dospělého mozku velmi podobné. V periferních gangliích mají 3DNF a NT-3, avšax nikoliv NGF hlavní účinek na ganglia dorsálních kořenů a na nodosní ganglia, přesto, že NT-3 má zřejmě poněkud menší účinek na ganglia sympatiku podle Maisonpierre a další, 1990, Science 247, 1445 - 1451. Naproti tomu NGF převážně působí na ganglia dorsálních kořenů a na ganglia sympatiku.
Tyto skutečnosti vedly k názoru, že BDNF a NR-3 by v některých případech mohly působit na stejné skupiny neuronů a že působením NT-3 na tyto neurony v časném stadiu by mohlo později být nahrazeno účinkem BDNF podle Maisonpierre a další, 1990b, Neurons 5, 501 - 509. Mimoto zjištění, že BDNF a NT-3 jsou na rozdíl od NGF vysoce konzervované růstové faktory, dokonce až dosud nejkonzervovanější popsané faktory vede k názoru, že by oba tyto faktory mohly spolupůsobit s různými rěceptory a že jejich konzervace byla-nutná právě z toho důvodu, aby bylo možno udržet specifičnost jejich působení na tyto různé receptory.
Klein a další, 1989, EMBO J., 8, 3701 - 3709 popsali izolaci trkB, který je kódem pro novou sloučeninu ze skupiny látek, obsahujících tyrosinkinázu a recaptorů, velmi příbuzných lidskému protoonkogenu trk. Na úrovni aminokyselin bylo prokázáno, že trk a trkB mají 57% homologii extracelulárních oblastí, a to včetně 9 z 11 cysteinových zbytků, přítomných v trk. Tato homologie je zvýšena na 83 % v oblasti pro katalytickou tyrosinkinázu. Bylo prokázáno, že k expresi trkB u i
dospalých myší dochází přednostně v mozkové tkáni, přestože poměrně vyso.-tou hladinu RNA pro trx3 je možno prokázat také v plicích, sválách a vaječnícíoh. Mimoto bylo možno orokázat transkripty trkE u embryí ve středním a pozdním období gesta-3. ?ri analýze hybridizace in sítu u myších embryí ve scíří 14 a ld dnů bylo prokázáno, že transkripty trkB byly lokalizovány v centrálním i periferním nervovém systému včetně mozku, míchy, míšních i mozkových ganglií, paravertebrálním řetězci sympatického nervového systému a také v různých drahácn pro nervové zásobení, takže je možno, že produktem genu trkB může být receptor, který se účastní neurogenese a časného nervového vývoje a mimoto může hrát úlohu taká v nervovém systému dospělých.
Klein a další, 1990, Cell 61, 547 - 556 uvádějí, že trkE myši je kódem pro alespoň dvě skupiny molakul»které g jsou podobné recsptorům a které byly označeny gpl45 a gp95'1· . Tyto molekuly mají patrně identické mimobuněčnč a transmembránové oblasti, avšak pouze v případě gpl45 ' byla prokázána dlouhá cytoplasmatická oblast, která zahrnuje katalytickou oblast kinázy bílkovin. Transkripty trkB, které jsou kódem pro tuto bílkovinu, bylo možno prokázat v mozkové kůře a ve vrstvě pyramidových buněk v hippbkampu, kdežto transkripty, které jsou kódem pro gp95 ‘ bylo možno prokázat v ependymové vrstvě, vystýlající mozkové komory a v plexus chcroideus. Mimoto se v publikaci Middlemas a další, 1991, Mol. Cell. Biol. 11, 143 - 153 popisuje existence dvou od sebe odlišných, na C-zakončení zkrácených receptorů se společnou extracelulární oblastí a transmembránovou oblastí gpl45tr<B, obě látky jsou však odlišné od gp!45trkE (tato látka byla až dosud jednoduše označována jako trkB), pokud jde o krátká cytoplasmatická zakončení.
<
3. Podstata vynálezu
Podstata vynálezu tvoří způsob detekce a maření účinnosti neurotrofinu nebo identifikace látek s účinností, podobnou účinnosti neurotrofinu a také systémy, jichž je možno pro tato stanovení použít. Způsob podle vynálezu je alespOiž z části založen na zjištění, že protoenkogen trkB je kódem pro receptor tyrosinkinázy, který může sloužit jako funkční vazná bílkovina pro BDNF a pro NT-3. Systém tohoto typu raůže mít svou zvláštní hodnotu při identifikaci nových látek ze skupiny neurotrofinu nebo látek s účinností, podobnou účinnosti neurotrofinu. V různých provedeních je možno použít metody podle vynálezu a odpovídající systémy k detekci a/nebo k měření vazby neutrofinu na bílkovinu trkB při použití přímého studia vazby nebo při detekci sekundárních účinxů vazby trkB na neurotrofin.
Podstatu vynálezu tvoří také systémy, které je možno užít při stanovení předem známých látek a také k průkazu .1 nových látek, které mohou působit na receptor tyrosinkinázy.
V některých případech bude patrně možno tento systém využít k průkazu nových, dosud neznámých receptorů, které mohou zprostředkovat odpověó na již známé faktory. Vynález je alespoň z části založen na zjištění, že protoonkogen trkB je kódem pro receptor tyrosinkinázy, který je schopen nejen zprostředkovat přežívání a diferenciaci neuronů, závislých na BDNF/HT-3, nýbrž je schopen taká kromě přežívání a diferenciace, nikoliv však prolyferace neuronových buněk, v nichž k jeho expresi dochází způsobit také přežívání a prolyferaci buněk, závislých na BDNF/NT-3 v případě, že k jeho stálé expresi dochází ve zvláštním klonu buněčné linie fibroblastů, označované NIH3T3.
Znamená to, že exprese receptorů tyrosinkinázy ve fibroblastech může umožnit použití těchto buněk při zkouškách <
na přežívání a prolifaraci, a to jak v případě známých látex, napríxlad nsurotrofinů, tak oři objevování nových sloučenin, ktara sa rovněž mohou vázat na tento reoeptor tyrosi.nkmazy nebo na jiná receotory cyrosinkinázy, pro něž až dosuoh neexistuje žádná známá vazná látka. Tyto systémy ja možno použit i společně sa systémy raoeptor/vazná látka (například raoeptory trk a nsurotrofiny), která nemusí za bažných podmínek zprostředkovávat buněčnou prolifaraci. Jakmile dojde k tomu, že určitý systém recaptor/vazná látka je definován, tak jako tomu je v případě trkB a BDtJF/NT-3, je možno využít také celou řadu dalších specifických pokusných systémů.
Vynález se dále týká celé řady samostatných molekul, podobných receptorů tyrosinkinázy včetně pěti molekul, které jsou homologní receptorů trk a látkám ze skupiny insulinových receptorů a dalších čtyř molekul, které jsou homologní CSF12/PDGFR, rsc, eck (alfa) a eck (beta). Vynález sa rovněž týká způsobu identifikace receptorových molekul, přičemž může jít o molekuly s dosud neznámou vaznou látkou stejně jako o další typy receptorů, které je možno identifikovat uvedeným způsobem.
Vynález je možno využít k diagnostickým·, i k léčebným účelům. Ve zvláštních provedeních je možno využít nepravidelností ve funkci trkB nebo exprese této látky při diagnose různých neurologických poruch. V dalších provedeních je možno využít manipulací interakce mezi trkB a neurotrofinu pro léčení různýcíi neurologických onemocnění, jako jsou Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba a amyotrofická laterální sklerosa (Lou Gehrigova nemoc).
3.1. Použité zkratky
BDX? neurotrofní faktor z mozkové tkáně
Ξ5Α sérový albumin Skotu
GMTF ciliární neurotrofní faktor
Dúo disukcinimiáylsuberát
HNGFR receotor s vysokou afinitou pro faktor nervováno růstu
LilijFR receotor s nízkou afinitou pro faktor nervového růstu
HGF faktor růstu nervů
NT-3 neurotrofin-3,
pCMX-LÍIGFR pCMX-vektor pro expresi receptoru s nízkou afinitou pro faktor nervového růstu
ρ—C*iX— cr x3 pCííX-vektor pro expresi, modifikovaný pro expresi úplné cDNA pro trkB krysy
pCMX-trk3(del) modifikovaná forma pCMX-trkB, upravená
• pro expresi zkrácené formy trkB, v níž chybí většina oblasti přo intracytoplasmatickou tyrosinkinázu ·
pT24-ras plasmid, obsahující mutovanou (aktivovanou) verzi onkogenu ras.
4. Popis výkresů
Obr. 1: všechny tři neurotrofiny jsou schopny se specificky zkříženě vázat na LNGFí^ ke jehož expresi dochází v buňkách COS.
<
A. Žádný z neurotrofinů nevykazuje kompetitivní zkříženou vazbu na buňky CCS oo transfekci kontrolním vektorem, p-CMX. Radioaktivně značená vazná látka, využitá pro každou dvojici drán je označena na vrcholu drány (každá radioaktivně značena vazná látka má koncentraci v rozmezí 0,1 až C,25 níl), znamená neořítomn;
znamena oritomnoeo neznačené hcmologní vazné látky v koncentraci 500 níí. Prokazatelná pásy, které je možno pozorovat v případě použití radioaktivně značeného NGF se měnily od pokusu k pokusu a nebyly v kompetici s neznačeným NGF, jak již bylo uvedeno.
B. Všechny tři radioaktivně značené neurotrofiny mají kompetitivní schopnost zkřížené vazby (za vzniku komplexu s molekulovou hmotností přibližně 100 000, jak je možno očekávat pro LNGFR) v buňkách COS po transfekci pCMX-LNGFR. Dráhy jsou označeny stejně jako v případě A.
C. Zesítěné látky v buňkách COS po transfekci pomocí pCílX-LNGFR se pohybují společně se zesítěnými vaznými látkami v buňkách lidského melanomu A075. Radioaktivně značená vazná látka byla v tomto případě BDNF, použité buňky pro zesítšní js,ou uvedeny na horní části každé dvojice, drah a ozna čaní a 2+” je stejné jako v případě A.
Obr. 2: Indukce růstu neuritů a časné exprese genů v buňkách PC12 jako reakce na NGF, avšak nikoliv na BDNF nebo NT-3.
A. Buňky PC12 byly pěstovány podle doporučení Greene a další, 1987, Methods Enzymol. 147, 2q7 - 216 v přítomnosti 100 ng/ml BSA, ΝΓ-3, BDNF nebo NGF, jak ja vyznačeno. Byly užity různé koncentrace neurotrofinu, znázorněny jsou končen trace, které pro NGF patrně znamenají nasycení.
2,2 a 2,7 kb byly identicelkové buněčná RNA z buněx nepřítomnosti exogenního ns3. Transkripty fos a jun o fixovány analýzou Northern blot PC12, pastovaných jako svrchu v urotrofního faxtoru, pak byly buňky podrobeny na 30 minut působení 100 ng/ml BSA, NR-3, 3311? nebo MG?, jak je uvedeno.
Obr. 3: BDN? a NT-3, avšak nikoliv MG? se specificky váže na trkB po jeho expresi v buňkách COS.
A. Buňky COS byly podrobeny transfekci při použití pCMM-trkB a chemicky zesítšny při použití každého ze tří radioaktivně značených neurctrofinů. Radioaktivně značená vazná látka, užitá pro každou dvojici drah je uvedena v horní části drah , každá z nich byla užita v koncentraci v rozmezí 0,1 až 0,25 nM. znamená nepřítomnost, + znamená přítomnost neznačené homologní vazné látky v koncentraci
500 nM. Závorka a hvězdička označují zesítěnou látku, odpovídající bílkovině trkB 5 molekulovou hmotností přibližně 150 000 až 130 000.
B. Zesítění v případě radioaktivně značeného NT-3 v nepřítomnosti (-) nebo v přítomnosti (+) neznačeného » ·
NT-3 v koncentraci 500 nM, buňky COS byly užity po transfekci vektorem pro expresi zkrácené formy trkB, pCMX-trkB(del), jíž chybí oblast pro tyrosinxinázu. Závorka a hvězdička označují zesítěnou látku, která odpovídá zkrácené verzi trkB, tato mutanta s vypuštěním části řetězce má molekulovou hmotnost 120 000 až 150 000.
125
Obr. 4: Zesítění a vazba I-NT-3 na LNGFR je specificky blokována všemi třemi neurotrofiny, kdežto zesítění a vazba MT-3 na trkB je specificky blokována pouze působením BDN? a NT-3.
<
A. Buňky COS byly podrobeny transfekci působením pCMX-LNGFR a zesíteny radioaktivně značeným NT-3 v koncentraci 0,1 až 0,25 nM. Neznačený neurotrofin, užitý jako kompeeitivní látka je uveden v horní části každá trojice drah, před drahou je uvedena koncentrace v nM.
B. Buňky CCS byly podrobeny transfekci pCMX-trkB a zesíteny působením radioaktivně značeného NT-3. Koncentrace vazná látky a označení drah bylo stejná jako v případě A.
C. Buňky COS byly podrobeny transfekci při použití pCMX-LNGFR při vazných pokusech s radioaktivně značeným NT-3 v koncentraci v rozmezí 0,1 až 0,25 nM, graficky je znázorněna kompetice při použití různých koncentrací neznačeného NT-3, BDNF a NGF.
D. Buňky COS byly podrobeny transfekci působením pCMX-trkB při vazných pokusech s radioaktivně značeným NT-3 v koncentraci v rozmezí 0,1 až 0,25 nM, graficky je znázorněna kompetice při použití různých koncentrací neznačeného NT-3, BDNF a NGF. uvedené údaje znamenají průměr ze dvou zkoušek a uvádějí procento vázaná látky v impulsech za minutu'.
Obr. 5: Diferenciace buněk PC-12 po transfekci pCMX-trkB v přítomnosti BDNF a NT-3.
A. Buňky PC12 po přechodné transfekci kontrolním plasmidem pT24-ras a po zpracování působením 100 ng/ml BSA, stanoven je počet buněk po přechodné transfekci v každém pokusu (podrobnosti budou dále uvedeny).
B, C, D a E. Buňky PC12 byly podrobeny přechodné transfekci pCMX-trkB a pak podrobeny působení 100 ng/ml NGF <
(obr. 53), 3SA (obr. 53), Ϊ1Τ-3 (obr. 5D) nebo 3DN7 (obr. 5E). Čísla v závorkách na spodní strano každého obrázku označují počat buněk PC12, u nichž došlo k dif ere.nciaci, to znamená buněk, jajichč naurity jsou alaspoň dvakrát další než je tělo buňky, pozorováno ve vyhloubaní s průměrem 35 mm po každém zpracování. Přesto, ža sa absolutní počat buněk v průběhu tří provedených transfakcí měnil, poměr diferanciovaných buněk po různém zpracování zůstal va všech třech nezávislých pokusech stálý. Žádné diferanciované buňky nabylo možno prokázat u buněk PC12 po transfekci pCilK-trkE po působení B3A va třacn oddělaných pokusech. Po otevření pórů působením elektrického proudu byly buňky přímo naneseny na plotny z plastické hmoty bez povlaku tak, aby bylo možno vyloučit jakýkoliv růst nsuritů tak, jak bude dále popsáno.
Obr. 5: Buňky lidského neuroblastomu SH-3Y5Y reagují na NGF a BDNP, avšak nikoliv na NT-3 a nedochází u nich k expresi trkB.
A. Transkripty fos byly identifikovány analýzou Northern blot v celkové buněčné RNA, připravené z buněk DH-SY5Y, pěstovaných bez jakéhokoliv přidaného faktoru a pak byly podrobeny na 30 minut působení 100 ng/rnl B3A, NGF, NT-3 nebo BDNP podle označení.
B. Transkripty trkB jsou identifikovány analýzou Norther blot při použití 10 mikrogramů celkové buněčné RNA z mozečku dospělých krys (označeno CB), avěak není možno je prokázat v 10 mikrogramech celkové buněčné RIIA z buněk SH-SY5Y. Úplná kódová oblast trkB byla užita jako sonda, kterou je možno iden tifikovat větší počet transkriptů trkB podle Klein a další, 1939, ΞΜΒΟ J. 8, 3701 - 3709. Dráha pro mozeček se jeví jako nátěr vzhledem k příliš velké expozici ve snaze prokázat trans kripty v buňkách SH-3Y5Y.
i
Ocr. 7: Express LNGFR a trkB v původních baňkách a v buňkách NIH3T3 po transfekci pLYR-trkB.
A. Bylo provedeno chemické zesítění radioaktivně znaceneno N'x-3 s bunxami CCS po transfekci vektorem pro exoresi LNGFR podlá Squinto a další, 1991, Cell 53, 1 - 20, zesíteni 5 původními buňkami NIH3T3 je znázorněno v drahách 3 a 4 a s buňkami NIH3T3 po transfekci pLTR-trkB v drahách 5 a 5.
znamenají nepřítomnost a + přítomnost neznačeného NT-3 v koncentraci 500 nl-l. Zesítěný LNGFR a trkB jsou označeny závorkami a jejich vzhled je velmi podobný jako vzhled zesítěných materiálů podle Squinto a další, 1991, Cell 65, 1-20
3. .Analýza Northern blot exprese LNGFR v buňkách NIH3T3 u nichž dochází k expresi trxB, v původních buňkách NIH3T3, v buňkách PC12 a v buňkách SH-SY5Y. 10 mikrogramů celkové RNA, připravené z každé z uvedených buněčných linií bylo frakcionováno na formaldehydovém gelu s výjimkou dráhy, která je ozna cena (PC12), v níž bylo 0,5 mikrogramů buněčné RNA buněk PC12 zředěno 10 mikrogramy RNA buněk NIH3T3. Pak byly buňky přeneseny na nylonovou membránu a hybridizovány při použití radioaktivně značených sond pro LNGFR (nahoře) nebo pro trkB (dole). '
Obr. 8 znázorňuje schéma transfekce a selekce, které byly užity k získání a ke zkouškám s buňkami NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB. Buňky NIH3T3 byly podrobeny transfakci při použití 5 mikrogramů pLTR-trkB, 1 mikrogramů pLTR-Hyg a 20 mikrogramů lidské DNA jako nosiče, jak je popsáno v příkladové části. Stejné podíly buněk po transfekci byly naneseny na plotny s určitým prostředím, obsahující uvedená faktory v koncentraci 5 ní-1 nebo byly buňky podrobeny selekci při použití prostředí, obsahujícího 10 % telecího séra a hygromycin. Buňky, odolné proti hygromycinu pak byly naneseny na <
definovaná živná prostředí stejně jako množství kolonií bylo možno prokázal p □vrchu. Jan malá i přímá selekci na prostředích/ doplněných BDNF naho NT-3, spojitou vrstva baněk bylo možno prokázal na oboa těchto prostředích při použití buněk, odolných proti hygromycinu. V tabulce znamená C3NFL vytvoření spojioé vrszvy buněk.
Obr
Přežívání dochází k bFGF nebo buněk NIH3T3 a téhož typu buněk, u něhož expresi trk3 na prostředích, doplněných neurotrofiny.
A. Původní buňky (horní řada) nebo buňky NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB (spodní řada), byly pěstovány až do vytvoření 20% spojitě vrstvy a pak udržovány na definovaných živných prostředích bez uvedených faktorů nebo v jejich přítomnosti v koncentraci 5 níl celkem 5 dnů.
B. Buňky NIH3T3, u nichž dochází k expresi trk3 byly udržovány při tužných koncentracích BDNF , NT-3 nebo bFGF.
znamená téměř úplné uhynutí buněk, podobně jak k němu dochází u původních buněk NIH3T3 v nepřítomnosti faktorů na obr. SA, +++ označuje přežívání spojité vrstvy buněk, odpovídající buňkám NIH3T3 v přítomnosti 5 níl bFGF na obr. 9A a +” nebo ++ znamenají střední stupně přežívání.
Obr. 10: Příjem thymidinu a proliferace při zkouškách s fibroblasty, u nichž dochází k expresi trkB, jde o závislost, podobnou závislosti na dávce neurotrofinů u primárních neuronů.
A. Byla provedena zkouška na příjem thymidinu u fibroblastů NIH3T3 v závislosti na vyznačených koncentracích bFGF, NGF, BDNF a NT-3. Příjem thymidinu je vyjádřen v im<
pulsecn za minutu v buňkách, odebraných z jednoho vyhloubeni plotny obsahující 24 vyhloubaní. Údaje c chyba nejsou vyznačeny při použití koncentrace 5 pil každá vazná látky vzhledem k tomu, že tyto zkoušky nebyly uskutečněny ve dvojím provedení.
B. Příjem thvmidinu u fibroblastů NIH3 chází k expresi trkB v přítomnosti uvedených NGF, EDNF a NT-3.
2, u nichž dokoncentrací pFGF,
C. Byla sledována prolíferace buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB v závislostí na různých koncentracích oFGF, BDNF a NT-3. Do každého vyhloubení bylo uloženo 5000 buněk, uvádí se konečný počet buněk ve vyhloubení.
D. Bylo sledováno přežívání primárních neuronů v disociované kultuře v závislosti na různých koncentracích BDNF způsobem podle publikace Lindsay a Rohrer, 1935, Dev. Biol., 112 : 30-48. Neurony byly izolovány z ganglia dorsálních kořenů kuřecích embryí ve stáří 9 dnů.
Obr. 11: Rychlá indukce fosforylace tyrosinu u fibroblastů, u nichž dochází k expresi trkB v přítomnosti BDNF a NT-3.
A. Fosforylace tyrosinu v bílkovině o molekulové hmotnosti 145 000, která je patrně trkB a je označena šipkou, je rychle vyvolána u buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB po stimulaci působením EDNF nebo NT-3. Byla provedena imunoprecipitace rozrušených celých buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkE a které byly vystaveny působením uvedených faktorů po dobu 5 minut. Imunoprecipitace byla uskutečněna při použití antifosfotyrosinové monoklonální protilátky, konjugované na agarosové kuličky po frakcionaci elek16 troforěsou za akrylamidovém gelu s následným provedením imunoblotcvé zkoušky s použitím moncklonální protilátky, specifické pro fosfotyrosin.
B. Posforylace tyrosinu v bílkovině o molekulové
2RX2, je možno rychle buňky NIH3T3 a působením u nichž dochází k exprepůvodních buněk i buněx trkB, byly vystaveny půhmotnosti 41 000, která je patrně vyvolat působením bPGP na původní bFGP, NT-3 a BDNP na buňky NIH3T3, si trkB. Lyoáty celých buněk, a to NIH2T3, u nichž dochází k expresi sobení uvedených faktorů po dobu 5 minut, pak frakcionovány alektrořořežou na polyakrylamidovém gelu a podrobeny imunoblotové zkoušce při použití monoklonální protilátky, specifické proti fosfotyrosinu.
Obr
12:
A. Jsou uvedeny PCR-primery, užité k amplifikaci řetězců, homologní se známými molekulami tyrosinkinázy.
3. Je znázorněn řetězec aminokyselin pro novou klonovanou tyrosinkinázu.
C. Řetězec nukleových kyselin a aminokyselin pro klony tyrosinkinázy Rtk-1, Rtk-~6, Rtk-7, Rtk-3 a Rtk-9, uvedeny jsou také zdroje cDNA a primery, užité v PCR-reakci a srovnání s homologními molekulami.
D. Srovnání řetězce Rtk-1 z cDNA krysy s řetězcem pro trkA a trkB.
E. Oblasti homologis tyrosinkinázy, tak jak byly iden tifikovány v publikaci Hanks a další, 1938, Science 241,
- 52.
Srovnání oblasti tyrosinkinázy receptorů trk a p< insulinových receptorů.
Řetězce nukleovvoh <VS<=>1 i a a ·.i n~·.>= ,a 1 i i -»r.Obr. 13:
A.
skupiny
3.
Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5.
C. Srovnání odvozených řetězců aminokyselin pro Rtk-2,
Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5 s řetězcem lidského trk.
D. Srovnání odvozeného řetězce aminokyselin pro Rtk-2 s lidským trk, krysím trkB, receptorem pro růstový faktor, příbuzným receptoru insulinu a receptorem pro insulin.
Obr. 14: Je znázorněn nukleotidový řetězec a odvozený řetězec aminokyselin pro Rtk-2.
Obr. 15: Je znázorněn nukleotidový řetězec a řetězec aminokyselin pro Rtk-3.
Obr. 1S: Jsou srovnány řetězce Rck-3 s řetězci pro Rtk-2, trk, trk3, receptor pro růstový faktor, příbuzný receptoru pro insulin (IGF-R) a receptor pro -insulin (INS-R).
Obr. 17: Graficky je znázorněn účinek neurotrofinů NGF, BDNF a N'f-3 na růst neuritů v gangliích dorsálních kořenů embrya krysy ve stáří 14 dnů. Koncentrace neurotrofinů se pohybovaly v rozmezí 0,05 pg/ml až 50 ng/ml, doba pěstování byla 24 hodin.
Obr. 13: Embryonální DRG byly pěstovány 24 hodin v přítomnosti 50 ng/ml NGF a pak byla sledována koncentrace mRNA <
pro trkA a trkB. Jako kontrola byly odebrány DRG z krysy bez následného pěstování.
Obr
19: Embryonální DRG byly pěstovány v přítomnosti SDNF 50 ng/ml nebo NT-3 50 ng/mi oelkem 24 hodin, pak byla stanovena koncentrace mRNA pro trkA, B a C. Úroveň tohoto maceriálu byla znoumána také v mediodorsální a ventrální míše krysích ambryí ve stáří 14 dnů.
5. Podrobný popis vynálezu
Pro větší jasnost je podrobný popis vynálezu rozdělen do následujících odstavců:
i) systémy a metody k provádění zkoušek, ii) pokusné modelové systémy, iii) diagnostické metody, iv) léčebné metody,
v) systémy pro zkoumání a průkaz látek, působících na receptor tyrosinkinázy a nové receptory tyrosinkinázy.
5.1. Systémy a metody k provádění zkoušek
5.1.1 Metody
Vynález se týká systémů a metod, které mohou být použity k detekci a/nebo měření účinnosti neurotrofinů nebo k identifikaci látek s podobnou účinností. Pod pojmem účinnost neurotrofinů se rozumí účinnost BDNF nebo NT-3 nebo dalších, až ciósud neidentifikovaných neurotrofních faktorů nebo i jiných, neneurotrofních faktorů včetně peptidů a nepaptidových molakul, které jsou schopné se vázat na <
trkB. Látky, která mají neurotrofinovou účinnost zahrnují, avšak nejsou omezeny na neurotrofní a neneurotrofní faktory včetně peptidových a nepeptidových molekul, které mají biologickou účinnost, podobnou BDNF a/nebo NT-3, pokud jde o časnou indukci genu, ovlivnění buněčných typů, vyvolaných jevů a podobně. Biologické účinky BD2IF a NT-3, byly popsány v ?CT patentových přihláškách č. PCT/US30/04315 a PCT/US30/ /04316. Pro účely vynálezu budou neurotrofiny i lárky s účinností neurotrofinů společně označovány jako zkoumaná látky.
Vynález navrhuje způsob d tekoe nebo měření neurotrofinová účinnosti, který spočívá v tom, že se
i) buňka, u níž dochází k expresi trkB vystaví působení zkoumaná látky a ii) měří se nebo se prokazuje specifická vazba zkoumané látky na trkB, přičemž specifická vazba na trkB je v positivní korelaci s neurotrofní účinností.
Buňka, u níž dochází k expresi trkB může být bud buňka, u níž k této expresi dochází přirozeně nebo buňka, získaná genetickým inženýrstvím tak, aby u ní k této expresi docházelo* Je například možno zavést do buňky řetězec nukleová kyseliny, který je kódovým řetězcem pro trkB a byl získán například způsobem podle odstavce 6.1.2, a to transfekcí, transdukcí, mikroinjekcí, otevřením pórů pomocí elektrického proudu, přes transgenního živočicha a podobně při použití jakéhokoliv známého postupu. Transfekce buněk COS a buněk PC12 bude například popsána v odstavci 6, popis použitého systému je popsán v odstavci 5.1.2.
Specifickou vazbu zkoumané látky na trkB je možno měřit celou řadou postupů. Například vazbu zkoumané látky na buňky, u nichž dochází k expresi trkB je možno prokázat nebo <
měřit tak, že se prokazuje nebo měří:
i) zkoumaná látka, vázaná aa povrch neporušených buněk, ii) zkoumaná látka, vázaná zkříženou vazbou na bílkovinu trkB v materiálu z rozrušených buněk nebo iii) zkoumaná látka, vázaná na trkB in vitro.
Specifická interakce mezi zkoumanou látkou a trkB může být vyhodnocena při použití raakčních činidel, které prohazují specifické vlastnosti téoo interakce. Bylo například prokázáno způsobem podle vynálezu (odstavec 5), že BDNF a NT-3 jsou schopné se vázat na trkB, avšak NGF není schopné se vázat. To znamená, že specifická vazba zkoumaná látky na trkB může být kompetitivně inhibována působením BDNF nebo NT-3, avšak nikoliv oůscbením NGF.
Dále bude uveden specifický příklad způsobu podle vynálezu, který však nemá sloužit k omezení vynálezu. Uvažuje se případ, v níž je zapotřebí měřit ve vzorku množství neuro trofinu, například BDNF. V tomto případě je možno vystavit buňkám různá ředění vzorku se zkoumanou látkou, mimoto se užije negativní kontrola NC bez obsahu účinnosti typu BDNF a positivní kontrola PC, která obsahuje známé množství BDNF, užijí se buňky, u nichž dochází k expresi trkB v‘přítomnosti zjistitelně značeného BDNF, v tomto případě BDNF, značeného radioaktivním jodem. Množství BDNF ve zkoumaném vzorku je možno prokázat tak, ze se stanoví množství I-znacenáho BDNF, které se váže na jednotlivé kontroly v každém ředění a pak se srovnává se standardní křivkou hodnota pro zkoumaný vzorek. Čím více BDNF se nachází ve vzorku, tím menší množ125 ství I-BDNF se bude vázat na trkB. Množství vázaného značeného BDNF je možno prokázat měřením radioaktivity v buňce nebo vazbou BDNF na bílkoviny buněčného povrchu při použití DS3 podle publikace Meakin a Shooter, 1991, Neuron 6, 153 <
az 163 s následnou detekcí množství značené bílkoviny v buněčných extraktech například při použití elektroforézy na 3D3-polyakrylamidovém gelu, čímž je možno prokázat značené bíxkoviny s velikostí molekuly, odpovídající BDNf, vázanému na trkB. Specifická interakce zkoumané látky a trkB může být dala zkoumána tak, že se ke vzorku přidá neznačený NG7 v různem zředění. Tato látka by nemela mít žádný podstatný vliv na kompetici mezi značeným BDNF a zkoumanou látkou při vazbě na trk. Je také možno použít látku, o níž je známo, že je schopna přerušit vazbu neurotrofin/trkB, například naznačený
NT-3 nebe protilátku proti trkB, čímž je možno dosáhnout kom.125 petice mezi I-BDM7 a zkoumanou látkou při vazbě na trkB.
Zjistitelně značený neurotrofin zahrnuje například neurotrofin, vázaný kovalentně nebo nekovalentně na radioaktivní látku, fluorescenční látku, látku s enzymatickým účinkem, látku, která může být substrátem pro určitý enzym (přičemž se dává přednost enzymům a substrátům, u nichž je možno průběh reakce prokázat kolorimetricky) nebo látku, kterou je možno rozpoznat molekulou protilátky, 3 výhodou zjistitelně značenou molexulou protilátky.
Spécificxou vazbu zkoumané látky na trkB jě možno prokázat také tak, že sa vyhodnotí sekundární biologické účinky vazby neurotrofinu na trkB, jde například o indukci růstu nervových látek, časnou expresi genu nebo fosforylaci trkB, tak jak je znázorněna na obr. 11. Například schopnost zkoumané látky vyvolat růst nervových vláken je možno zkoumat na buňkách, které neobsahují trkB a na srovnatelných buňkách, u nichž k expresi trkB dochází. Růst nervových látek v buňkách, u nichž dochází k expresi trkB, avšak nikoliv ve srovnatelných buňkách, kterým trkB chybí, může ukazovat na specifickou interakci mezi zkoumanou látkou a trkB. Podobnou analýzu je možno provést tak, že se stanoví časná tvorba genu (napří22 klad fcs a jun) v buňkách trkB-minus a trk3-?lus nebe tak, že se prokazuje fosforylace trk3 při použití standardních zkoušek na fosforylaci, jak se obecně provádějí. Analýzy tohoto typu mohou být vhodné pro identifikaci agcnisců nebo antagonistu neurotrofinu, kcerý se neváže kompetitivně na trk3.
Může například být žádoucí stanovit, zda určitý zkoumaný vzorek obsahuje BDNF. U buněk PC12, dobře charakterizované buněčné linie neuroblastomu nedochází k vyrůstání nervových vláken po působení BDNF, jak bude dále podrobněji uvedeno v odstavci 6 a jak je znázorněno na obr. 2A. Avšak u buněk PC12 po transfekci trkB dochází k vyrůstání nervových vláken po působení BDNF, jak bude rovněž dále popsáno v odstavci 5 a jak je znázorněno na obr. 5. Je tedy možno normální buňky PC12 (trkB-minus) a buňky PC12 po transfekci trkS (trkB-plus) vystavit působení vzorku (zkoumané látky) a pak je možno hodnotit mikroskopicky, zda vyrůstají nebo nevyrůstají nervová vlákna. V dalším možném provedení je možno měřit množství BDNF ve zkoumaném vzorku tak, že se stanoví množství vyrůstajících nervových látek nebo míra indukce genu v časném stádiu a získané hodnoty se srovnávají se stan dardní křivkou závislosti účinku na dávce určitéřio neurotrofinu, v tomto případě BDNF.
Vynález se týká také způsobu identifikace sloučeniny s účinností neurotrofinu, postup spočívá v tom, že se
i) buňka, u níž dochází k expresi trkB vystaví působení zkoumané látky, načež se ii) prokáže specifická vazba zkoumané látky na trkB.
V tomto případě je specifická vazba na trkB v positivní korelaci s účinností, podobnou účinnosti neurotrofinu. Specifickou vazbu je možno prokázat bud přímým stanovením vazby nebe sekundárními biologickými účinky, k nimž dochází v důsledku této vazby, jak již bylo svrchu uvedeno. Tento postup může být zvláště vhodný oro identifikaci nových látek ze skupiny nsurotrofinů nebo ve farmaceutickém průmyslu ke sledování velkého množství peptidcvých a nepeptidcvých látek, například peptidomimetik, na účinnost, podobnou účinnosti nsurotrofinů. Ve výhodném specifickém provedení způsobu podle vynálezu je možno připravit velké množství ploten s vyhloubeními, které v jednotlivých řadách střídavě obsahují buňky PC12 nebo fibroblasty, která jsou bu<5 trkB-minus nebo po genetickém zpracování trkB-plus. Pak je možno přidávat řadu zkoumaných látek tak, že v každém sloupci plotny nebo ve stanovené části tohoto sloupce bude obsažena odlišná zkoumaná látka. Pak se v každém vyhloubení stanoví přítomnost nebo nepřítomnost vyrůstajících nervových látek. Tímto způsobem je možno prozkoumat veliký počet neznámých látek na neurotrofinovou účinnost.
V dalším provedení se vynález týká také způsobu detekce nebo měření neuroerofinové účinnosti nebo způsobu identifikace sloučeniny jako látky s neurotrofinovým účinkem, tento postup spočívá v tom, že se
I ,
i) zkoumaná látka vystaví působení bílkoviny trkB in vitro za podmínek, při nichž může dojít k vazbě a pak se ii) prokazuje vazba zkoumané látky na bílkovinu trkB, přičemž vazba zkoumané látky na trkB je v přímé korelaci s neurotrofinovým účinkem nebo účinkem, podobným účinku naurotrofinu. Pří provádění těchto postupů může, avšak nemusí, být použito v podstatě čisté bílkoviny trkB, mimoto může být uvedená bílkovina vázána na pevný nosič, například na sloupec pro afinitní chromatografii nebo ve formě zkoušky ELI3A, nebo může být bílkovina uložena na uměle vytvořenou membránu. Vazba zkoumané látky na bílkovinu trkB může být vyhodnocena jakýmkoliv běžným způsobem. Ve výhodném provedení může být vazba zkoumané látky vyhodnocena nebo změřena vy.nodnooením schopnosti komp-etice se zjistitelně značenými známými látkami, scnopnými se vázat na trk3.
Vynález se rovněž týká způsobu detekce schopnosti zkoumané sloučeniny působit jako antagonista účinku neurotrofinu, postup spočívá v tom, že se prokazuje schopnost sloučeniny způsobit inhibici vlivu vazby neurotrofinu na trkE v buňce, u níž dochází k expresi trkB. Antagonisté tohoto typu může, avšak nemusí bránit vazbě trkB na neurotrofin. Účinky vazby neurotrofinu na trkB jsou obvykle biologické nebo biochemické, jde například o vyvolání růstu nervových vláken, podporu přežívání buněk nebo jejich proliferace, vyvolání transformace buněk, vyvolání tvorby genu v časném stádiu nebo vyvolání fosforylace trkB. Je například možno postupovat tak, že se buňky PC12, fibroblasty nebo jiné buňky po transfekci trkB vystaví účinku účinného množství BDNF nebo účinného množství BDNF spolu se zkoumanou látkou, jejíž antagonistický účinek na BDNF by měl být prokázán. Pak se srovnává vyrůstání nervových vláken u těchto dvou skupin buněk a vyrůstání vláken u buněk, které nebyly podrobeny stransfekci, avšak byly vystaveny působení BDNF nebo BDNF a zkoumané látky, nebo NGF nebo NGF a zkoumané látky. V případě, že antagonizující látka působí specifickou inhibici BDNF mělo by k inhibici vyrůstání nervových látek dojít pouze v buňkách trkB-plus po působení BDNF spolu se zkoumanou látkou ve srovnání s buňkami trkB-plus, vystavenými pouze působení BDNF a melo by dojít jen k malé nebo by nemělo dojít k žádné inhibici růstu nervových látek v buňkách trkB-minus po působení NGF a zkoumané látky ve srovnání s buňkami trkB-minus, například s buňkami PC12 po působení samotného neurotro finu NGF.
5.1.2 Systémy
Vynález se užít k provádění mohou ssočívat v rovněž týká systémů, které je možno posvrciiu popsaných postupů. Tyto systémy přípravě trkB in vitro například ve formě, vázáné na pevný nosič nebo mohou být tvořeny ouňkami, u nichž dochází k expresi bílkoviny trk3.
Buňky, u nichž dochází k expresi bílkoviny trkB mají tuto svou funkci přirozeně nebo ji mohou získat po úpravě genetickým inženýrstvím tak, aby produkovaly trkB například po transfekci, transdukoi, otevření pórů pomocí elektrického proudu , mikroinjekoí, využitím transgenního živočicha a podobně při použití kódově nuxleové kyseliny pro trkB, uložené do vhodného vektoru pro expresi.
Je možno užít jakýkoliv v oboru známý postup pro uložení fragmentu DNA do vektoru a tak uskutečnit konstrukci vektoru pro expresi s kódovým řetězcem pro trkB. Vektor může obsahovat chimérní gen, obsahující také příslušné řídící signály pro transkripci a translaci a mimoto kódový řetězec pro uvedenou bílkovinu. Postupy mohou spočívat v rekombinaci DNA in vitro a v genetických rekombinačních postupech in vivo. Expresi řetězce nukleové kyseliny, který je kódovým řetězcem pro bílkovinu trkB nebo její peptidový fragment je možno řídit pomocí druhého řetězce nukleové kyseliny tak, aby v rekombinantní molekule DNA byla obsažena informace, umožňující expresi bílkoviny trkB nebo jejího peptidového fragmentu v transformovaném hostiteli. Expresi trkB je možno řídit například jakýmkoliv známým prvkem, jako je promotor nebo zesilovač transkripce. Promotory, které je možno využít k řízení exprese trkB zahrnují například dlouhé opakované koncové řetězce, popsané v publikaci Squinto a další, 1991, Cell, 65, 1 - 20, oblast promotoru
SV40 podle Bernoisf a Chambon, 1931, Nátuře 290, 304 - 310, promotor CMV, terminální opakování M-MuLV 5' promotoru, obsaženého v 3'-dlouhé terminální repeoici viru Rousova sarkomu podle Yamamoto a další, 1930, Cell 22, 737 - 797, promotor pro thymidinkinázu ve viru oparu podle Wagner a další, 1931, Proč.Nati. Acad. Sci., USA, 73, 144 - 145, řídící řetězec metalLothioneinového genu podle Brinster a další, 1932, Nátuře 295, 39 - 42, prokaryotické vektory pro expresi, například promotor pro xI704xl2xbfíl704říl0x-laktamázu podle Villa-Romaroff a další, 1978, Proč. Nati. Acad. Soi., USA, 75,
3727 - 3731, nebo tac-promotor podle DeBoer a další, 1933, Proč.Nati. Acad. Sci., USA, 80, 21 - 25, a také Useful proteins from recombinant bacteria, Scie.ntific American, 1930, 242, 74 - 94, dále je možno užít promotory z kvasinek nebo jiných hub, například promotor Gal 4, promotor ADIí pro alkcholdehydrogenázu, promotor PGK pro fosfoglycerolkinázu, promotor pro alkalickou fosfatázu a také další řídící oblasti pro transkripci u různých živočichů, které jsou specifické pro určité tkáně a byly již užity u transgenních živočichů, jsou to například řídící oblast genu pro elastázu I, která je účinná u acinárních buněk slinivky břišní podle Swift a další, 1934, Cell 33, 639 - 645, Ornitz a další, 1936, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399 - 409, MacDonald, 1937, Hepatology 7, 425 - 515, řídící oblast genu pro insulin, která je účinná u buněk beta slinivky břišní podle Hanahan, 1935, Nátuře 315, 115 - 122, řídící oblast imunoglobulinovéhogenu, která je účinná v lymfoidních buykách podle Grosschedl a další, 1934, Cell 33, 647 - 658, Adames a další, 1985, Nátuře 318, 533 - 533, Alexander a další,
1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436 - 1444, řídící oblast viru nádoru mléčné žlázy myši, která je aktivní u buněk varlat, mléčné žlázy, u lymfoidních a tukových buněk podle Leder a další, 1985, Cell 45, 485 - 495, řídící oblast genu pro albumin, která je aktivní v játrech podle Pinkert a další,
1987, Genes and Davši. 1, 263 - 276, řídící oblast genu pro alfa-fetoprotein, která ja aktivní v játrech podle Krumlauf a další, 1985, Mol.Cell. Biol. 5, 1639 - 1548, Hammer a další, 1937, Science 235, 53 - 53, řídící oblast genu pro alfa-1-antizrycsin, která je aktivní v játrech podle Kelsey a další, 1937, Genes and Devel. 1, 161 - 171, řídící oblast genu pro beta-globin, která je aktivní v myelodiních buňkách podle Mogram a další, 1285, Mazure 315, 333 - 340, Kollians a další, 1985, Cell 45, 89 - 34, řídící oblast genu pro basický myelin, která je účinná v oligodendrocytecn mozku podle Readhead a další, 1987, Cell 43, 703 - 712, řídící oblast genu pro lehký řetězec 2 myosinu, která je účinná v kosterních svalech podle Sani, 1935, Natu re 314, 233 - 286, a řídící oblast genu pro uvolnění gonado tropního hormonu, která je účinná v hypothalamu podle Mason a další, 1985. Science 234, 1372 -1378.
Vektory pro expresi, které obsahují uložený gen pro trkB je možno identifikovat třemi odlišnými postupy:
a) hybridizací DNA-DNA,
b) přítomností nebo nepřítomností funkce značícího genu nebo
c) expresí uloženého řetězce.
Při provádění prvního postupu je možno prokázat přítomnost cizorodého genu, uloženého do vektoru pro expresi pomocí hybridisace DNA-DNA při použití sond s obsahem řetězců, které jsou homologní s řetězcem uloženého genu trkB. Při provádění druhého postupu je možno identifikovat a podrobit selekci systém rekombinantního vektoru a hostitele v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti funkce určitého značícího genu, jako je účinnost thimidinkinázy, odolnost proti antibiotikům , transformovaný fenotyp, tvorba okluzních tělísek u baculoviru a podobně, tyto funkce vznikají v důsledku uložení cizorodého genu do vektoru. Například v případě, že se do řetězce značícího genu ve vektoru uloží gen trkB, je možno identifikovat rekombinanty, které tento vložený gen oosanují na základě nepřítomnosti funkce značícího genu. Podle třetího postupu je možno identifikovat rekombinantní vektory pro expresi tak, že se identifikuje produkt cizorodého genu, k jehož expresi dochází u hostitele po uložení rekomoinantníno vektoru. Tyto zkoušky mohou být založeny například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech produktu genu trkli, například na základě vazby receptoru a neurotrofního faktoru nebo pomocí protilátky, která je schopna přímo rozpoznat trkB. Buňky, získané podle vynálezu mohou být transformovány tak, že u nich přechodně nebo s výhodou konstitutivně a trvale dochází k exoresi trk3.
Ve výhodném provedení se vynález týká taká buněk, u nichž dochází k expresi trk3 a které také obsahují rekombinantní nukleovou kyselinu, obsahující promotor genu, vznikajícího v časném stádiu, jde například o promotory fos nebo jun podle Gilman a další, 1986, Mol. Cell, 3iol. 6, 4305 4315. V případě, že se taková buňka vystaví působení neurotrofinu, je možno očekávat, že se neurotrofin·. bude vázat na trkB a sekundárně vyvolá transkripci časného promotoru. Buňku tohoto typu je možno užít k detekci vazby neurotrofinu a trkB měřením účinnosti transkripce promotoru časně vytvářeného genu, například analýzou jader, analýzou Northern blot, nebo měřením množství genu, řízeného promotorem. Časný promotor je možno užít k řízení exprese genu fos nebo jun nebo jakéhokoliv zjistitelného produktu genu, například včetně jakéhokoliv známého zjistitelného genu, jako genu pro odolnost proti hygromycinu podle Murphy a Efstratiadis, 1937, Proč.Nati. Acad. Sci., USA, 84, 8277 - 8281, genu pro chloramfenikolacetyltransferázy CA?, neomycinfosfotransferázu <
nec, beta-galaktosidázu, beta-glukuronidázu a podobná. Va specifickém provedení je možno očekávat, že při vazbě naurotrofinu a trkB v buňce, v níž dochází k expresi trkB a která obsahuje gen pro lidský růstový hormon pod řízením promotoru genu fos dojde k produkci rekomoinantního lidského růstového hormonu , jak bylo popsáno v Seldon a další, 1SSS,
Mol. Cell. Biol., S, 3173 - 3179. V dalším možném provedení je možno využít exprese trkB jako značící gen a uložit jej pod řízením časného promotoru navíc k trxB, k jehož expresi dochází konstitutivně, čímž je možno dosáhnout amplifikované odpovědi na neurotrofin. Takto uložený gen pro expresi trkB a buněčná linie, která jej obsahuje mohou představovat výjimečně citlivý a účinný systém pro detekci nebo měření účinnosti neurotrofinů.
Mimoto je možno jako pokusný systém při provádění způsobu podle vynálezu použít buňky nervového systému, vynález vsak není na tento typ buněk omezen. Například ve specifickém provedení je možno jako základ systému pro průkaz neuro> trofinu užít fibroblasty, závislé na rlstovém faktoru, jak bude dále uvedeno v odstavci 7. Transfekci genem trkB je například možno použít u buněčné linie fibroblastů, závislých na růstovém faktoru, v prostředí, prostém séra, například podle publikace Zham a Goldfarfct, 1935, Mol. Cell. Biol. 5, 3541 - 3544, je například možno použít fosforečnan vápenatý spolu s 5 mikrogramy vektoru pro expresi na bázi příslušné DNA a promotoru CMV v přítomnosti genu pro trkB krysy a spolu s 1 mikrogramem vektoru pro expresi genu pro odolnost proti hygromycinu. Po 48 hodinách je pak možno buňky podrobit selekci podle odolnosti proti hygromycinu a tak identifikovat buňky, u nichž došlo k positivní transfekci. Tyto buňky je pak možno pěstovat přibližně 3 týdny v přítomnosti hygromycinu, načež se spojí kolonie, které jsou proti hygromycinu odolné. Získané buňky se pak naočkují na plotny pro pěstování <
tkáňových kultur, opatřené povlakem pcly-D-lysi.nu a lidského fobronectinu a buňky se nechají růst přibližně 4 hodiny na prostředí DiiBM s 10 % telecího séra tax, aby došlo k vazbě buněk na plotny. Pak se prostředí s obsahem séra odsaje a buňky se třikrát promyjí PB3 k odstranění jakéhokoliv zbytku séra. Pak se buňky přenesou bud do definovaného prostředí, které je proscé séra (směs Dí-iBM a
Gams F12 v poměru 3 ., doplněná 8 mil hydrogenuhličitanu sodného, 15 ml-l GBPES, 4 x 10 0 M chloridu manganatého, “3 -7 mM histidinu, 10 3M sthanolaminu, 10 M selanitu sodného, 5 mg transferinu na litr, 200 mg komplexu sérového albuminu a kyselinu linoleinové na litr, dále obsahuje prostředí gentamycin, penicilín a streptomycin a 20 mM L-glutami.nu). Euňky, získané tímto způsobem se pak inkubují v přítomnosti neurotrofinu, například 100 ng/ml NT-3 nebo BDtIF a po 5 dnech pěstování, při němž se každých 43 hodin užije čerstvé živné prostředí s růstovými faktory, je možno očekávat růst a vývoj buněk. Buňky v přítomnosti NGF v koncentraci 100 ng/ml nebo buňky v prostředí, prostém séra by se však neměly vyvíjet, jak je zřejmé také z obr. 7. Jak bude dále podrobněji vysvětleno v odstavci 6, získané výsled ky napovídají, že v buňkách SH-SY5Y patrně dochází k expresi dalšího ťeceptoru pro BDNF, který je odlišný od trkB. Vynález se týká rovněž systémů a postupů, při nichž se využívá receptorů, odlišných od trkB způsobem, který je analogický postupům, při nichž se receptor trkB využívá.
5.2 Pokusné modelové systémy
Vynález se rovněž týká pokusných modelových systémů pro studium fyziologické úlohy látek ze skupiny genů pro neurotrofiny. V těchto pokusných modelových systémech mohou být bílkovina trkB, její peptidové fragmenty nebo její deriváty do systému dodávány nebo mohou být v tomto systému orcaukovány. Pokusné modelové systémy je možno použít oro studium přebytku neurotrořinu nebo jeho nedostatku. Tyto pokusné systémy je také možno použít ke studiu vlivu zvýšené nebo snížené odpovědi na neurotrofin v buňce, ve tkáňové kultuře nebo u neporušených živočichů, zvláště v buňkách nebo tkáních neporušených živočichů nebo v tkáňových Kulturách v průběhu specifických časových období včezně embryonálního vývoje. Jde zejména o provedení, v nichž je exprese trkB řízena indukovatelným nebo vývojově řízeným promotorem. Ve specifickém provedení vynálezu je možno užít promotor CMV k řízení exprese trkB u transgenických živočichů. Pod uvedeným pojmem se v průběhu přihlášky rozumí transgenický živočich, odlišný od člověka, který v sobě nese, a to v některých svých buňkách nebo ve všech cizorodý gen. Tyto živočichy, odlišné od člověka je možno získat různými známými postupy, například mikroinjekcí, fúzí buněk, transfekcí, otevřením pórů působením elektrického proudu a podobně. Například živočichy je možno získat mikroinjekcí zygotů známými postupy, například způsobem podle publikace Brinstsr a další, 1389, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82,
4433 - 4442.
Vynalez se rovněž týká modelových systémů pro studium autoimunologických onemocnění, u nichž je autoimunologická odpověd směrována proti trkB. Tímto modelem mohou být například živočichové, kteří byli imunizováni imunogenním množstvím trkB a u nichž je s výhodou možno prokázat tvorbu protilátek proti trkB a/nebo vznik buněčně zprostředkované imunity. K získání takového modelového systému může být vhod né podávat trkB spolu s pomocným činidlem pro zvýšení imunologické odpovědi, jako je například Bacillus Calmette Guerin (BCG).
<
5.2.1 Modely pro studium zvýšené účinnosti neurotrofinu
Pokusný modelový systém pro toto použití je například možno vytvořit tak, aby jej bylo možno použít pro studium účinku zvýšené účinnosti neurotrofinů. V takovém systému je možno odpověď na neurotrofin zvýšit tak, če se zkonstruuje zvýšený počet molekul trk3 v buňkách modelového systému ve srovnání s nezpracovanými buňkami. Může být vhodné použít zvýšený počet neurotrofinu selektivně u bunčn, u nichž k expresi neurotrofinu za obvyklých podmínek dochází.
Buňky je možno zkonstruovat tak, aby docházelo k produkci zvýšeného množství bílkoviny trkE po infekci virem, který nese gen trkB podle vynálezu. Gen trkB je možno do buněk dodat také transfekci.
V případě, že modelovým systémem má být živočich, je možno do buněk tohoto živočicha uložit rekombinantní gen pro trkB infekcí virem, který uvedený gen nese. Je také možno vytvořit transgenického živočicha, který bude nést gen trkB-jako cizorodý gen.
Aby bylo možno zajistit expresi trkB, je zapotřebí uložit gen pro trk3 pod řízením vhodného řetězce promotoru. Může být žádoucí uložit gen pro trkB pod řízením konstitutivního promotoru a/nabo promotoru, specifického pro určitou tkáň, například může jít o promotor, specifický pro enolázu neuronů CMS, promotor pro nervová vlákna nebo pro tyrosinhydroxylázu, nebo může jít o indukovatelný promotor, například metallothioneinový promotor nebo promotor, k jehož aktivaci dochází pomocí ultrafialového světla v dlouhé terminální repetici viru HIV podle Valeri a další, 1933, i
Nátuře 333, 78 - 31, nebo také o promotor CMV, který je obsazen v olasmidu pCZlX, jak bude dále popsáno, nebo také o vývojové řízený promotor.
Cdpověo na endogenní neurotrofin ie možno zvvsit ;ake zvýšením počtu molekul trk3 v buňce. V oříoadě, že modelový systém obsahuje příliš malé množství neurotrofinu nebo neurotrofin neobsahuje, je možno tuto látku do syscéaiu přidat. Může být taká žádoucí přidat do modelového systému další neurotrofin oro vyhodnocení účinku příliš vysoká aktivity neurotrofinu. Také příliš velká exprese neurotrofinu nebo příliš velké množství vylučovaného neurotrofinu může být vhodnou metodou pro sledování vlivu zvýšená hladiny neurotrofinu na buňky, u nichž již dochází k expresi trkB. Ještě výhodnější je exprese trkB ve všech buňkách (všeobecná exprese), pak se stanoví, které z těchco buněk pak funkčně odpovídají na neurotrofin, což umožní potenciální identifikaci druhé složky receotoru v případě, že tato složka existuje.
5.2.2 Modely pro studium snížené účinnosti neurotrofinu
Pokusný model, vhodný pro toto použití je například možno vytvořit tak, aby byl vhodný pro sladování vlivu snížené účinnosti neurotrofinu. Takový systém může umožnit identifikaci pochodů nebo neuronů, která vyžadují přítomnost neurotrofinu a které by mohly představovat potenciální léčeb né cíle. V systémech tohoto typu může být odpověá na neurotrofin snížena tak, že se připraví rekombinantní bílkoviny trkB, které nejsou spojeny s povrchem buňky nebo které jsou zkonstruovány tak, aby byly zcela neúčinná při převodu odpovědi na neurotrofin.
<
Je například možno bílkovinu trkB, paptid nebo derivát do systému přivést tak, aby přidaný receptor mohl být v kompetici s endogenním trk3 při vazbě na neurotrofní, takže dojde ke zmenšení odpovědi na neurotrofin. Bílkovinu trkB je možno přidat jako receptor, prostý buněk nebo může být v systému přímo produkován. Například je možno získat bílkovinu trkB, prostou transmembránové oblasti z buněk uvnitř systému, které mohou tuto látku vylučovat bez oblasti pro zakotvení. Mimoto je také možno bílkovinu trk3, peptidový fragment nebo derivát do systému přidávat tak, že se dostane do extracelulárního prostoru.
V dalším možném provedení vynálezu je možno použít rekombinantní gen pro trkB k inakrivaoi nebo k odstranění účinku endogenního genu homologní rekombinací, čímž dojde k vytvoření buňky, tkáno nebo živočicha, v nichž chybí trkB, Je například možno vytvořit rekombinantní gen pro trkB tak, aby obsahoval mutaci, například gen neo, který trkB inaktivuje. Takovou konstrukci je možno uložit do buňky pod řízením vhodného promotoru, například buňky základního embryonálního kmene pomocí transfekce, transdukce, injekce a pod, Buňky, které tuto konstrukci obsahují, je pak možno podrobit selekci na základě odolnosti proti G413. Pak je možno identifikovat buňky, jimž chybí neporušený gen trkB například metodou Southern blot nebo Northern blot nebo na základě exprese. Buňky, jimž chybí neporušený gen TrkB je pak možno spojit pomocí fúze s časnými embryonálními buňkami za vzniku transgenických živočichů, kteří nevytvářejí trkB.
Při srovnání takového živočicha s živočichem, u nějž nedochází k expresi endogenního neurotrofinu pak bude možno prokázat, zda si oba fenotypy úplně odpovídají nebo zda si neodpovídají, čímž by bylo možno prokázat přítomnost případných dalších Látek typu neurotrofinu nebo receptorů pro tyto látky.
Živočichy tohoto typu je možno užít k definování specifických populací neuronů nebo jakýchkoliv jiných postupů in vivo, obvykle závislých na přítomnosti neurotrofinu. Je tedy možno očekávat, že tyto pochody nebo buněčné populace budou ovlivněny v případě, že u živočiona nedojde k expresi crk3, takže nebude moci dojít ani k žádné odpovědi na přítomnost neurotrofinu.
Mimoto může docházet k euoresi rekombinantní bílkoviny trkB, jejího peptidcvoho fragmentu nebo v kompetici s endogenním receptorem pro na povrchu buněk v systému, avšak tato vina může být konstruována tak, aby nep derivátu, který je neurotrofín také rekombinantní bílkořenášela odpověa na vazbu neurotrofinů.
Rekombinantní bílkoviny trkB, jejich peptidové fragmen ty . nebo jejich deriváty se mohou vázat na neurotrofín s afinitou, která je obdobná nebo je odlišná od afinity endogenního trkB k neurotrofinů. Aby bylo možno účinněji snížit odpověd na neurotrofín, může se tato bílkovina trkB, její peptidový fragment nebo derivát s výhodou vázat na neurotrofín s afinitou větší, než má pro tuto látku natývní receptor.'
V případě, že je bílkovina trkB, její peptidový fragment nebo její derivát produkován v modelovém systému, může být kódová nukleová kyselina pro bílkovinu trkB, její peptidový fragment nebo její derivát do systému přiváděna infekcí transdukcí, transfekcí a podobně jako cizorodý gen. Jak již bylo svrchu uvedeno, je možno gen pro trkB uložit pod řízení vhodného promotoru, kterým může být například promotor, specifický pro určitou tkáň nebo redukovatelný promotor nebo také vývojově řízený promotor.
Ve specifickém provedení vynálezu je možno nahradit endogenní gen trkB v buňce mutovaným genem trkB homologní rekombinací. V dalším možném provedení vynálezu je možno pokusné živočichy imunisovat proti trkE.
V ješte dalším provedení je možno dosáhnout snížení exprese trkB tak, že se do buněk, u nichž dochází k expresi tohoto receptoru uloží určité množství antimediátorové RNA nebo DNA, která je schopna snížit expresi bílkoviny trk3.
5.3 Diagnostické použití
Při provádění vynálezu je možno použít sondy trkB k identifikaci buněk a tkání, které reagují na neurotrofin ve zdravé nebo chorobně změněné tkáni. Vynález se tedy týká také způsobu diagnostiky neurologických poruch u nemocných, způsob spočívá v tom, že se srovnává úroveň exprese receptoru trkB u nemocných s úrovní exprese téhož receptoru ve srovnatelné skupině zdravých lidí, přičemž rozdíl v úrovni exprese receptoru trkB u nemocných a u zdravých lidí prokazuje, že porucha u nemocných může být primárně nebo sekundárně vázána na metabolismus trkB. Nemocným orgánem může být buňka, tkáň nebo může jít o změnu ve složení tělesné tekutiny, s výhodou jde o tkáň nervového systému nebo o mozkomíšní mok. Vynález se týká také způsobu identifikace buněk které jsou schopné reagovat na neurotrofin, postup spočívá v detekci exprese receptoru trkB v těchto buňkách. Expresi trkB je možno prokázat transkripcí mRNA pro trkB nebo produk cí bílkoviny trkB. Expresi genu pro trkB je možno zjistit s použitím sond, které jsou schopné identifikovat nukleovou kyselinu pro trkB nebo přímo receptor ve formě bílkoviny.
Další sondou, kterou je možno použít je protilátka proti trkB nebo proti fragmentu této bílkoviny, která obsahuje vaznou oblast.
Podle vynálezu je možno použít bílkovinu trkB, její fragmenty nebo její deriváty jako imunogenní látky k získání protilátek proti receptorů trkB. X tomuto účelu je zapotřebí mít k dispozici větší množství receptorů, avšak rekombinantní technikou syntézy bílkovin, která je založena na řetezci nukleové kyseliny pro trkB je možno získat poměrně značná množství bílkoviny trkB, takže problém omezených množství táto bílkoviny byl odstraněn.
Aby bylo možno dále zvýšit pravděpodobnost vzniku imunologické odpovědi jako reakce na trkB, je možno analyzovat řetězec aminokyselin trkB tak, aby bylo možno identifikovat ty části molekuly, které by mohly být spojeny se zvýšenou imunogenitou. Je například možno podrobit řetězec aminokyselin počítačové analýze k identifikaci povrchových apitopů a tak získat počítačové údaje, týkající se hydrofilnosti, povrchu, flexibility, indexu antigenity, amfifilní šroubovice, plošné amfifilnosti a sekundární struktury uvedené bílkoviny. Je možno postupovat také tak, že se srovnává. odvozený řetězec aminokyselin pro trkB z různých živočišných druhů a identifikují se poměrně nehomologní oblasti. Tyto nehomologní oblasti budou patrně snáze vyvolávat imunitni reakci u jiných živočišných druhů.
Při přípravě monoklonálních protilátek proti raceptoru trkB je možno použít jakýkoliv postup, jímž je možno dosáhnout produkce molekul protilátek u kontinuální buněčné linie, pěstované v kultuře. Je například možno užít techniku hybridomu, původně popsanou v publikaci Kohler a Milstein, 1975, Nátuře 256, 495 - 497, stejně jako techniku triomu, hybridomu lidských B-bunak podle publikace Kozbor a další, 1933, Immunology Today 4, 72, dále techniku EBV-hybridomu k získání lidských monoklonálních protilátek podle publikace Cole a další, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancsr Therapy, <
Alan R. Liss, lne. str. 77 -96, všechny tyto postupy a další podobné postupy je možno při provádění vynálezu využít.
Monoklonální protilátky pro léčebné použití mohou být lidské monoklonální protilátky nebo také chimérní protilátky člověka a myši nebo jiného živočišného druhu. Lidské monoklonální protilátky je možno připravit jakýmkoliv z celé řady známých postupů, například způsobem podle publikací Teng a další, 1983, Proč. Nati. Acad.Sci., USA, 80, 7308 až 7312, Xozbor a další, 1983, Immunology Today 4, 72 - 79, Olsson a další, 1982, Meth. Enzymol, 92, 3 - 16. Chimérní molekuly protilátek je možno připravit také tak, aby obsaho vály oblast pro vazbu antigenu z myši a lidské konstantní oblasti, jak bylo popsáno v Morrison a další, 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 81, 6851, Takeda a další, 1985, Nátuře 314, 452.
X získání polyklonálních protilátek proti různým epitopům receptoru trkB je rovněž možno použít celou řadu známých postupů. Pro získání protilátek je možno imunizovat různé hostitelské živočichy injekcí bílkoviny trkB nebo jeI . * jího fragmentu nebo derivátu, z živočichů je možno použít například králíky, myši, krysy a podobně. Ke zvýšení imunologické odpovědi je možno ještě použít různé pomocné prostředky v závislosti na druhu hostitele, může jít například o Freundův úplný i neúplný pomocný prostředek, o různé gely anorganického původu, například hydroxid hlinitý, o povrcho vě aktivní látky, například lysolecitin, polyoly typu pluro nic, polyanionty, peptidy, emulze oleje, hemocyaniny, dinitrofenol a některé pomocné látky, užívané u člověka, například BCG (Bacillus Calmette-Guerin) a Corynebacterium parvum.
Molekulární klon protilátky proti epitopu trkB je rovněž možno připravit známým způsobem. Ke konstrukci řetězců nukleových kyselin, které jsou kódovými řetězci pro molekulu monoklonální protilátky nebo pro její oblast pro vazbu antigenu je možno užít postupu s využitím reko.mbina.ntni DMA, tak jak byly popsány v publikaci Maniatis a další, 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Barbor, New York.
Molekuly protilátek je možno čistit známými postupy, například imunoabsorpcí nebo imunoafinitní chromatografií a také dalšími chromatografickými postupy, jako vysokotlakou kapalinovou chromatografií H?LC, kombinací různých uvedených postupů a podobně.
Vynález se týká také molekul protilátek a fragmentů těchto molekul. Fragmenty protilátek, které obsahují idiotyp molekuly je možno vytvořit známým způsobem. Tyto fragmenty zahrnují například fragment Ftab'^, který je možno získat rozštěpením molekuly protilátky působením pepsinu, fragmenty Fab', které lze získat redukcí disulfidových můstků ve fragmentu Fíab'^ a fragmenty Fab, které je možno vytvořit zpracováním molekuly protilátky působením papainu’a redukčního činidla.
Svrchu uvedené sondy je možno experimentálně využít taká k identifikaci buněk nebo tkání, u nichž zatím nebyla exprese trkB prokázána.
Mimoto je možno tyto postupy využít k identifikaci exprese trkB aberantními tkáněmi, například tkáněmi zhoubných nádorů. V dalších možných provedeních ja možno použít tyto postupy diagnosticky ke srovnávání exprese trkB v různých buňkách, tkáňových tekutinách nebo tkáních u nemocných, <
trpících určitou poruchou a ve srovnatelných buňkách, tělesných tekutinách nebo tkáních zdravých lidí. Tělesnou tekutinou se v tomto smyslu rozumí jakákoliv tělesná tekutina, zvláště však krev nebo mozkomíšní mok. Rozdíl v úrovni exprese trkB u nemocného ve srovnání s úrovní exprese u zdravých lidí může prokazovat, že porucha u nemocného se může primárně nebo sekundárně vztahovat na metabolismus trkB. Například vzestup množství trkB by mohl ukazovat na to, že porucha u nemocného je spojena se zvýšenou citlivostí na normální hladiny neurotrofinu nebo také může jít o případ, že jladiny neurotrofinu u nemocného jsou tak nízké, že došlo ke zvýšení množství receptorů ke kompenzaci tohoto jevu. Obě etiologie je možno od sebe odlišit tak, že se nemocnému podá neurotrofin. V případě, že se jeho stav zhorší, může nemocný trpět zvýšenou citlivostí na neurotrofin. V případě, že dojde ke zlepšení stavu, může nemocný trpět nedostatkem neurotrofinu. V zásadě je tak možno podle uvedeného výsledku volit léčbu, která spočívá bud v podání neurotrofinu nebo látky, která účinek neurotrofinu antagonisuje. Rozdíly v expresi je možno prokázat na úrovni bílkoviny a/nebo na úrovni RNA, to znamená přímým měřením množství bílkoviny trkB, nebo měřením RNA pro trkB u nemocného a u zdravých lidí s následným srovnáním získaných hodnot.
Svrchu uvedené sondy je možno použít také pro selekci buněk, schopných reagovat na přítomnost neurotrofinu pro použití v různých systémech, tak jak byly popsány svrchu nebo v systému, popsaném v US patentové přihlášce č. 07/532 285, podané 1. června 1990 nebo jakýmkoliv dalším postupem, který se týká selekce buněk.
<
5.4 Léčebné použití
Vynález se rovněž týká způsobu léčení nemocných, kteří trpí neurologickými poruchami. Postup spočívá v tom, že se nemocným podá účinné množství bílkoviny trkB, jejího peptidového fragmentu nebo jejího derivátu, schopného se vázat na neurotrofin. Léčebné postupy, týkající se podávání trkB, antagonistů tohoto receptoru a látek, které antagonizují účinek receptoru kompeticí o endogenní neurotrofin, podávání agonistů trkB nebo protilátek proti receptoru rovněž spadají do oboru vynálezu.
Vynález se rovněž týká farmaceutických prostředků, která jako svou účinnou složku obsahují bílkovinu trkB, její peptidový fragment nebo její derivát spolu s vhodným farmaceutickým nosičem.
Bílkovinu trkB, její peptidový fragment nebo její derivát je možno podávat systemicky nebo místně. Příslušný způsob podání se volí ze známých postupů, jde tedy například o podání nitrožilní, intrathekální, intraarteriální, o podání nosní sliznicí, perorální podání, podání podkožní, intraperitoneální, místní podání pomocí injekce nebo ve formě chirurgického implantátu. Je možno použít také prostředky s řízeným uvolněním účinné látky.
S postupem výzkumů, které vedou k lepšímu porozumění neurodegenerativním onemocněním a poškozením nervové soustavy je stále jasnější, že v některých případech by bylo žádoucí snížit trofický účinek endogenního neurotrofinu. V oblastech poškození nervového systému by proto mohlo být žádoucí použití antagonistů neurotrofinu včetně rozpustných forem trkB, které se mohou dostávat do kompetice s endogenním buněčným receptorem při vazbě neurotrofinu. Za uvedených okolností může být žádoucí spíše místní použití antagonisty neurotrofinu v místě poškození než jeho systemické použití. Může být použit také implantát, obsahující trkB.
V dalším možném provedení může být určitý chorobný stav příznivě ovlivněn zvýšením citlivosti na neurotrofin.
V tomto případě může být žádoucí zvýšit počet molekul receptoru nebo zvýšit afinitu vazby trk3 u nemocných s uvedenými poruchami. Tohoto cíle by bylo možno dosáhnout přiváděním příslušného genu. Selektivní exprese rekombinantního receptoru trkB v příslušných buňkách lze dosáhnout při použití genu pro trkB, řízeného promotory, které jsou pro tkáň specifické nebo indukovatelné nebo vyvoláním lokalizované infekce virem s defektní replikací, nesoucím rekombinantní gen pro trkB. Poruchami, které by bylo možno zlepšit zvýšenou citlivostí na neurotrofin jsou zejména poruchy motorických neuronů včetně amyotrofní laterální sklerosy, Werding-Hoffman nova onemocnění, chronická proximální spinální svalová atrofie a syndrom Guillain-Barre. Stejného léčebného postupu by mělo být mošno použít také v případě neurologických poruch u cukrovky, Parkinsonovy choroby, Alzheimerovy choroby a Huntingtonovy chorey.
I ,
5.5. Systémy pro stanovení a vyhledávání látek, které působí na receptor tyrosinkinázy a postupy pro vyhledávání nových receptorů tyrosinkinázy
Vynález se rovněž týká systémů, které je obecně možno použít při stanovení předem definovaných látek a k vyhledávání nových látek, působících na receptor tyrosinkinázy.
Téhož postupu pocle vynálezu a téhož systému je možno užít také k průkazu dosud neznámých receptorů, zprostředkovávajících odpověď na některé známé faktory. Jakmile je defino ván určitý systém receptoru a vazné látky, například v tomto případe trkB a BDNF/NT-3, je možno využít taká řadu dalších specifických systémů, jak již bylo svrchu podrobněji vysvětleno.
Bylo prokázáno, že v případe, že se receptor pro tyrosinkinázu uloží do buněk, v nichž za běžných podmínek k expresi tohoto receptoru nedochází, mohou uvedené buňky reagovat snadno zjistitelným způsobem na vaznou látku, která se na uvedený receptor váže. Bylo také prokázáno, že typ vznikající odpovědi závisí na typu použité buňky a nikoliv na specifickém receptoru, který byl do buňky uložen. To znamená, že při uložení receptoru trkB do buněk PC12 pheochromocytomu má za následek závislost diferenciace těchto buněk na BDNF/NT-3, kdežto po uložení téhož receptoru do fibroblastů dojde k závislosti přežívání a diferenciace těchto buněk na BDNF nebo NT-3. Je tedy možno zvolit příslušnou buněčnou linii k dosažení odpovědi, kterou bude možno nejlépe využít pro stanovení nebo pro vyhledávání látek, schopných spolupůsobit s receptorem tyrosinkinázy. Touto látkou může být jakákoliv molekula včetně peptidových a nepeptidových molekul, která je schopna působit v těchto systémech způsobem, specifickým pro receptor. Jedním z vhodných systémů, který by měl být zkoumán, zahrnuje přivádění požadovaného receptoru, například trkB do buněčné linie fibroblastů, například do určitého klonu buněk NIH3T3, který bude dále podrobněji popsán v odstavci 7. To znamená, že receptor, který za obvyklých podmínek nezprostředkovává proliferativní odpověčl, může být po zavedení do fibroblastů prokazován různými známými postupy, které vedou ke kvantitativnímu stanovení účinků růstových faktorů pro fibroblasty, jde například o příjem thymidinu nebo další typy zkoušek na proliferaci, tak jak byly popsány v publikacích van Zoelen 1990, The Use of Biological Assays For Detection Of Polypeptide Growth Factors, Progress Factor
Research, sv. 2, str. 131 - 152, Zhan a M. Goldfarh, 1985, Mol. Cell. Biol., sv. 6, str. 3541 - 3544. Tyto zkoušky mají tu další výhodu, že tentýž prostředek je možno sledovat jak na buněčné linii s uloženým rsceptorem, tak na původní buněčné linii, která reoeptor neobsahuje. Pouze specifická účinky na buněčnou linii s receptorem jsou považovány za účinky, zprostředkované uloženým receptorem.
Systémy tohoto typu nejsou omezeny na zkoumání známých vazných látek pro známé receptory, je možno je použít také k identifikaci nových látek, která by mohly působit na tyto nebo jakékoliv další receptory. Například buněčná linie s uloženým receptorem i původní buněčná linie bez receptorů mohou být vystaveny jakémukoliv potenciálnímu zdroji látky, která by mohla působit přes uvedený receptor. Jakékoliv specifické účinky, například přežívání buněk nebo jejich proliferaci v případě buněčné linie s uloženým receptorem je možno použít k identifikaci zdrojů látek, schopných přes tento receptor působit a zjištěnou látku je popřípadě možno* dála čistit.
Receptory nemusí být omezeny na ty, pro něž již existuje známá vazná látka. Tento systém může umožnit identifikaci vazných látek pro receptory, které zatím nemají známou vaznou látku. To znamená, že fibroblasty, u nichž dochází k expresi trkB by bylo možno v takových systémech využít pro identifikaci a popřípadě k čištění vazných látek, například BDNF a NT-3, které za obvyklých podmínek aktivují trkB. Nyní je však možno je využít také k identifikaci dalších peptidových vazných látek nebo i jiných látek, například molekul nepeptidové povahy, které by rovněž mohly přes tyto receptory působit. Zdroje zkoumaných látek mohou zahrnovat například extrakty z různých tkání a různých organismů nebo supernatantu z buněk po transfekci při použití DNA genomu <
nebo bank pro expresi cDNA. Ve zvláštním provedení vynálezu ja možno podrobit fibroblasty, u nichž dochází k expresi vloženého receptoru, pro nějž se hledá vazná látka, expresi pomocí banky cDNA, odvozené od potenciálního zdroje taková vazné látky. Buňky, které by přežívaly a vytvářely kolonie na definovaném prostředí, naobsahujícím růstové faktory pro fibroblasty podle publikace Zhan a Goldfarb, 1936, Mol. Cell Biol., sv. 6, str. 3541 - 3544 by pravděpodobně vytvářely růstový faktor, který by splnil jejich běžné požadavky na přítomnost tohoto faktoru. Aby bylo možno prokázat, že uvažovaný růstový faktor působí přes zkoumaný receptor, bylo by zapotřebí suparnatanty těchto buněk zkoumat na původní buněč né linii tak, aby bylo možno prokázat, že supernatant působí pouze na buněčnou linii, u níž dochází k expresi zkoumaného receptoru. Pak by bylo možno izolovat tu část DNA, použité k transfekci, která je kódovým řetězcem pro tento nový účinek při použití známých postupů.
Vynález se rovněž týká způsobu klonování alespoň části genu pro receptor tyrosinkinázy, kterou je pak možno využít k identifikaci dvojic vazná látka/receotor, tak jak bylo uve děno svrchu. Postup spočívá v tom, že se
i) řeóězec nukleové kyseliny, která je kódem pro tyrosinkinázu amplifikuje PCR-reakcí při použití se stavy molekul cDNA, například knihovny cDNA jako matrice při použití oligonukleotidových primerů, které odpovídají těm oblastem známé molekuly tyrosinkinázy, které jsou spojeny s účinností tyrosinkinázy, načež se ii) amplifikovaná nukleová kyselina klonuje ve vhodné molekule vektoru, například v plasmidu, bakteriofágu a podobně.
Vynález se rovněž týká genu pro tyrosinkinázu a jeho částí, které byly klonovány uvedeným způsobem. Ve zvláštním, <
specifickém provedení, které bude podrobněji uvedeno v odstavcích 9 a 10 je možno využít oligonukleotidových primerů, které jsou uvedeny na obr. 12A n-ebo v dále uvedené tabulce II.
Pak je možno stanovit řetězec DNA, amplifikovane a klonované uvedeným způsobem při použití standardních postupů. Výsledná řetězce je pak možno srovnávat s řetězci známých molekul tyrosinkinázy tak, aby bylo možno identifikovat zvláště zajímavá klony. Vynález se rovněž týká identifikovaných řetězců klonovaných nukleových kyselin, které byly získány uvedeným způsobem, jak bude dále podrobněji vysvětleno v odstavcích 9 a 10 a peptidů a bílkovin, pro něž je kódem cDNA, která tyto řetězce obsahuje. Vynález se týká také v podstatě čistých rekombinantních molekul nuklecvých kyselin, které zahrnují řetězce nukleových kyselin
i) tak jak byly uvedeny na obr. 12C pro Rtk-1, Rtk-6,
Rtk-7, Rtk-3 a Rtk-9, ii) tak jak jsou uvedeny na obr. 13B pro Rtk-4’a Rtk-5, iii) tak jak jsou uvedeny na obr. 14 pro Rtk-2 a iv) tak jak jsou uvedeny na obr. 15 pro Rtk-3.
I ·
Vynález se rovněž týká částí uvedených molekul, které obsahují alespoň 10 zbytků nukleových kyselin. Vynález zahrnuje také nukleové kyseliny, obsažené v plasmidu pBluescript SK s obsahem Rtk-2 nebo s obsahem Rtk-3, tak jak byly tyto plasmidy uloženy ve veřejné sbírce American Type
Culture Collection pcd čísly ........... a ........ Vynález se dále týká v podstatě čistých molekul bílkovin, které obsahují řetězec aminokyselin
i) tak jak byl uveden na obr. 12C pro Rtk-1, Rtk-6, Rtk-7,
Rtk-8 a Rtk-9, ii) tak jak je uveden na obr. 13B, pro Rtk-4 a Rtk-5, iii) tak jak je uveden na obr. 14 pro Rtk-2 a iv) tak jak js uveden na obr. 15 .pro Rtk-3.
Vynález zahrnuje také části těchto bílkovin, obsahující alespoň šest zbytků aminokyselin nebo funkčně ekvivalentní molekuly. Funkčně ekvivalentními molekulami jsou takové molekuly, v nichž jsou některé zbytxy aminokyselin nahrazeny jinými zbytky tak, že vzniká tichá mutace. Je například možno nahradit jeden nebo větší počet zbytků aminokyselin v řetězci jinou aminokyselinou se stejnou polaritou, která působí jako funkční ekvivalent, takže se změna ve funk ci neprojeví. Aminokyseliny pro uvedenou náhradu v řetězci je možno volit z jiných aminokyselin ve stejné skupině, do které nahrazená aminokyselina náleží. Například nepolární hydrofóbní aminokyseliny jsou alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a metnionin. Polární neutrální aminokyseliny jsou glycin,serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. Bazické kyseliny s pozitivním nábojem jsou argiain, lysin a hystidin. Kyselé aminokyseliny s negativním nábojem jsou kyselina asparagová a kyselina glu tamová. Vynález zahrnuje také bílkoviny, jejich fragmenty ne bo jejich deriváty, které jsou různě modifikovány v průběhu translace nebo po ukončené translaci například glykosylací, proteolytickým štěpením, vazbou na molekulu protilátky nebo jiné buněčné vazné látky a podobně.
Vynález se rovněž týká buněk a mikroorganismů, které nesou rekombinantní molekuly nukleových kyselin, tak jak byly svrchu popsány, včetně Rtk-1, Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8, Rtk-9, Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4, a Rtk-5. Ve zvláštním provedení mohou být buňkami, nesoucími rekombinantní nukleovou kyselinu fibroblasty. V jiném provedení může být takovou buňkou také bak teris.
i
Amplifikované fragmenty nukleových kyselin je pak možno použít k identifikaci klenů cDNA s plnou délkou.
Ve výhodných provedeních vynálezu je možno užít amplifikovaný fragment DNA k identifikaci tkáně nebo buněčné linie, u níž dochází k expresi poměrně značného množství odpovídající mRNA, například při použití analýzy Northern blot nebo dot-blot. Taková tkáň nebo buněčná linie může být využita k vytvoření banky cDNA, která může sloužit jako velmi vhodný zdroj cDNA s plnou délkou, obsahující řetězec a amplifikovaný fragment.
Obrácený postup může být použit při molekulárním klonování receptoru pro látku, pro niž receptor dosud není znám, může jít například o naurotrofní bílkovinu, pro niž zatím nebyl izolován příslušný receptor. Fibroblasty, vystavené působení tohoto faktoru by za obvyklých podmínek neměly na přítomnost tohoto faktoru reagovat, avšak po transfekci pomocí banky cDNA, připravené z buněk, u nichž by mohlo docházet k expresi takového receptoru by mohly být získány buňky po transfekci, u nichž by k expresi takového receptoru skutečně docházelo a které by tedy reagovaly na přítomnost uvedeného faktoru. Pak by bylo možno využít účinné mechanismy pro selekci, například schopnosti vytvářet kolonie na definovaných živných prostředích v přítomnosti uvedeného faktoru, čímž by bylo možno identifikovat buňky, u nichž po transfekci dochází k expresi hledaného receptoru. Pak by bylo možno obvyklým způsobem izolovat také gen, který je kódovým řetězcem pro tento receptor.
Příklady-provedení vynálezu
S. PříklaGen pro trkB je kódem pro funkční receptor pro BDNF a NT-3, avšak nikoliv pro NGF
5.1. Materiály a metody
6.1.1. Buněčná kultury, neurotrofiny a značení neurotrofinů radioaktivním jodem
Buňky COS-M5 byly pěstovány v Eaglově živném prostředí DMEM v Dulbeocově modifikaci, obsahujícím 10 % fatálního séra skotu FBS, 1 % penicilinu i strepromycinu P/S a 2 mil glutaminu v atmosféře s obsahem 5 S oxidu uhličitého. Buňky PC12 byly pěstovány na prostředí DMEM, obsahujícím 6 % FBS, % koňského séra, P/S a 2 mil glutaminu na plotnách Costar pro tkáňové kultury v atmosféře s obsahem 7,5 % oxidu uhličitého. Buňky PC12 (Dr.L. .¾. Greene's Laboratory) byly použity v pokusech, znázorněných na obr. 2, buňky PC12 (Dr.
Ε. M. Shooter*s laboratory) byly použity v pokusech, znázorněných na obr. 5. Buněčná linie lidského neuroblastomu SH-ΞΥ5Υ (Juna Biedler, Sloan-Kettering) byly pěstovány na Eaglově minimálním základním prostředí ΕΙΊΕΜ s 10' % FBS, (P/S) a 2 mM glutaminu.
2,5S myší NGF· byl získán od Bioproducts for Science (Indianapolis, IN). Lidský BDNF a NT-3 byly produkovány buňkami CHO a čištěny ze živného prostředí, v němž byly tyto buňky pěstovány až do homogenity a pak byly tyto látky stanoveny na polyakrylamidovém gelu při barvení stříbrem a byly analyzovány řetězce aminokyselin. Pak byly čištěné neurotrofiny NGF, BDNF a NT-3 značeny radioaktivním jodem při použití laktoperoxidázy podle publikace Hempstead a další, 1939, Science, 243, 373 - 375. Jodované neurotrofiny byly odděleny
od nezabudovaného radioaktivního jodu při použití filtrů Centriflo CF50A (Amicon, Beverly, MA). Shluky byly odstraněny filtrací na gelu S200.
6.1.2. Klonování trkB krysy, exprese u savců, konstrukce a přechodná transfekce
Klon cDNA pro trkB krysy s plnou délkou byl získán analýzou banky cDNA krysího mozku ve vektoru lambda ZAP2 (Stratagene) při použití specifických oligonukleotidů pro trkB krysy, odpovídajících většině 5'- a 3'-kódových oblastí trkB. Jak lidský LNGFR pode Johnson a další, 1386,
Cell 47, 545 - 554, tak cDNA pro trkB krysy byly subklonovány v savčím vektoru pro expresi, pCMX za vzniku pCMX-LNGFR nebo pCNX-trkB. Plasmid pCMX-trkB(del) byl vytvořen rozštěpe ním plasmidu pCMX-trkB enzymem Apal, který štěpí těsně za transmembránovcu oblastí trkB a enzymem Notl, který štěpí těsně za kódovou oblastí pro trkB v řetězci vektoru, obě zakončení byla vyplněna a plasmid t>yl znovu navázán, takto vzniklá kódová oblast trkB obsahuje extracelulární i transmembránovou oblast trkB, avšak neobsahuje 320 C-terminálních aminokyselin.
,
Buňky COS-M5 byly podrobeny přechodné transfekci plasmidem pCMX-LNGFR, pCMX-trkB nebo kontrolním vektorem pCMX transfekci při použití DEAE-dextranu. Postup byl prováděn tak, že buňky COS-M5 byly naočkovány v množství 1,5 x 10^ buněk na plotny s průměrem 100 mm 24 hodin před transfekci. Pro provedení transfekce byly buňky pěstovány v prostředí DMEM, prostém séra a obsahující 400/Ug/ml DEAE-dextranu,
1/UM chlorochinu, 2 mM glutaminu, 20/Ug/ml insulinu, 5/Ug/ml transferinu, 33 nM selenitu sodného a 5/Ug příslušné DNA, v tomto prostředí se směs inkubuje 3 hodiny a 15 minut při teplota 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého. Pak se prostředí, použité pro transfekci odsaje a nahradí chloridem sodným s fosfátovým pufrem a s 10 % DMSO na 2 minuty. Po tomto DMSO šoku se buňky COS-M5 uloží do prostředí DMEM s 10 % F3S a s 1 % penicilinu i strepromycinu a s glutaminem v konečné koncentraci 2mM na 43 hodin.
Buňky PC12 byly podrobeny přechodná transfekci otevřením pórů působením elektrického proudu. Před transfekci byly buňxy propláchnuty ledově chladným roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem, prostým vápníku a hořčíku a obsahujícím 2 mg/ /ml glukosy (Dulbecco), pak se buňky znovu uvedou do suspenze v tomtéž pufru při hustotě buněk 1,5 x 10 buněk na ml v přítomnosti 40 mikrogramů příslušné DNA. Buňky PC12 byly podrobeny transfekci působením plasmidů pCMX, pCMX-trkB nebo pT24-rs popsaných v publikaci Yancopculos a další 1985 Proč. Nati. Acad Sci., USA 82:5455-5459. Buněčná směs se inkubuje 10 minut v ledu a pak se nechá rychle zteplat na teplotu místnosti a póry se otevřou působením elektrického proudu v celkovém objemu 1 ml při působení 1150 V/cm a 500 ^uF. Pak se buňky inkubují v ledu ještě 30 minut . načež se nanesou na plotny s prostředím DMEM se 6 % FBS, 6 % koňského séra, 1 % penicilinu i streptomycinu a 2mM glutaminu. Užijí se plotny Costar z plastické hmoty bez jakéhokoliv předběžného povlaku. 48 hodin po transfekci se na buňky působí 10 ng/ml neurotrofinu nebo BSA, tak jak je uvedeno v popisu k obr. 5 a po dalších 43 hodinách se vyhodnotí růst nervových vláken.
6.1.3 Chemické zesítění
Buňky se odeberou do roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem, který dále obsahuje 1 mM EDTA, 1 mg/ml glukosy a 25 mM HEPES (PBS-versene) a pak se buňky znovu uvedou do 6 suspenze při vhodné hustotě, obvykle 1 x 10° buněk/ml v ledově chladném vazném pufru A, jde o PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a glukosy. Plasmidy pCMX-trkB nebo pCMX, uzite k transfexci 5 „ . .
buněk C0S-M5 v množství 4 x 10 buněk byly s buňkami ínxuoovány v ledu v přítomnosti I-značených neurotrofinu, které byly užity v konečné koncentraci v rozmezí 0,1 až 0,25 ní-I, inkubace byla prováděna 90 minut v nepřítomnosti nebo v přítomnosti neznačeného NGF, BDNF nebo NT-3, jak je znázorněno na obr. 1 a 3. Chemická látka pro zesítění DSS (Pierce, Rockford, IL) byla použita za podmínek, popsaných v publikaci Meakin a Shooter, 1991, Nuron 6, 153 - 163. Reakce pro zesítě ní byla ukončena po 90 minutách a zastavena přidáním 12 ml 50 mM tris-pufru s obsahem 160 mI4 chloridu sodného. Buňky byly odstředěny 5 minut při 300 g a pak 2x promyty vždy 12 ml pufru A. Usazenina buněk pak byla rozpuštěna v SDS s obsahem 2 % 2-merkaptoethanolu, směs byla 5 minut povařena a radioaktivně značené zesítěné bílkoviny pak byly děleny na 7% polyakrylamidovém gelu a jejich množství bylo odečítáno pomocí autoradiografie po exposici suchého gelu při použití filmu Kodak X-Omat při teplotě -70 °C.
125
6.1.4 I-NT-3 kompeticní vazné zkoušky
125
Vazba I-NT-3 na buňky COS-M5 po transfekci plasmidam pCMX-LNGFR, p-CMX-trkB nebo kontrolním vektorem pCMX byla stanovena na buňkách v suspenzi. Buňky pak byly odebrány do PBS-versene a pak znovu uvedeny do suspenze ve vazném pufru A tak, jak bylo popsáno svrchu pro chemické zesítění.
„ 125
Buňky byly inkubovány se I-NT-3 v koncentraci 0,1 az 0,25 nM v nepřítomnosti nebo v přítomnosti zvyšujících se koncentrací neznačeného NT-3, BDNF nebo NGF v koncentraci 0,3 až 30 nM v případě NGF a 1 až 100 nM v případě BDNF a NT-3, jak je uvedeno v popisech k obr. 4C a 4D. Vazné reakce byly provaděny 90 minut v ledové lázni. Volný I byl oddělen od vázané látky rychlým odstředěním po dobu 30 sekund při použití sacharosového gradientu, vytvořeného ve zkumavce pro mikro <
odstředivku v její prodloužené spodní části. Zkumavky byly okamžité zmrazený ve směsi suchého ledu a ethanolu. Spodní část zkumavky byla odříznuta a výsledek byl odečten na počítači gamma-záření.
6.1.5 Izolace RNA a analýza northern blot
Celková buněčná RNA, izolovaná z buněk SH-3Y5Y a ze zpra covaných nebo nezpracovaných buněk PC12 byla frakcionována na agarcsovém gelu s 1 % formaldehydu, pak byl materiál přenesen na nylonové membrány a hybridisován při použití sondy v-fos, značené p nebo sondy c-jun, značené stejným způsobem, jak bylo popsáno v publikaci Squinto a další, 1990, Neuron 5,
757 - 766. Exprese trkB byla sledována při použití sondy kry> * x 32 * * siho trk3, značeného p z oblasti, která je kódovou oblastí pro intracytoplasraatickou tyrosinkinázu.
6.2. Výsledky
6.2.1 Vazba všech tří neurotrofinů na LNGFR, BDNF a
NT-3 nepůsobí přes HNGFR » ,
Aby bylo možno stanovit, zda NT-3 se stejně jako NGF a BDNF může vázat na LNGFR, jak bylo popsáno v publikaci Rodriquez-Tebar, 1990, Neuron, 4, 487 - 492, byly všechny tři neurotrofiny zkoumány na svou schopnost chemického zesítění s bílkovinou LNGFR po její přechodné expresi v buňkách COS. Každý ze tří radioaktivně značených neurotrofinů může být specificky zasítěn s bílkovinou s molekulovou hmotností, jaká je očskávána pro LNGFR, uvádí se, že zesítěný komplex, znázorněný na obr. 1B má velikost přibližně 100 kb podle publikace Hosang a Shooter, J. Biol. Chem., 260, 655 - 662. Zesítěný produkt nebylo možno prokázat v buňkách COS, u nichž i
nedocházelo k expresi bílkoviny LNGFR, jak je zřejmé z obr.
1A. Mimoto, jak bylo možno očekávat v případě specifické vazby, bylo možno vzniku zesítěnýcn produktů účinné zabránit kompeticí s přebytkem odpovídajícího neznačeného naurotrofinu, jak je zřejmé z obr. 1B. Kompetitivní zesítění s polypeptidam odpovídajícího rozměru bylo možno pozorovat také v buněčné linii melanomu A875, o níž je známo, že u ní dochází ke stálé expresi velkých množství LNGFR, jak je zřejmé z obr. 1C.
Jakmile bylo prokázáno, že se všechny tři neurotrofiny mohou vázat na bílkovinu LNGFR, byla zkoumána schopnost BDNF a NT-3 působit přes receptory NGF s nízkou nebo vysokou afinitou. Buňky PC12. u nichž dochází k expresi obou skupin recaptorů NGF poskytují význačnou odpověd pokud jde o růst nerovových látek i pokud jda o indukci skupiny tak zvaných časných genů po transkripci jako odpovědi na NGF, jak bylo popsáno v publikacích Graena a Tischler, 1976, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 73, 2424 - 2428 a Greenberg a další, 1935,
J. Biol. Chem. 260, 14101 - 14110 a jak je také zřejmé z obr. 2A, a 2B. Avšak v případě, že se buňky PC12 inkubují v přítomnosti BDNF nebo NT-3 v koncentraci, která je příliš nízká nebo v koncentraci, která je vyšší než koncentrace nasycení pro odpověd na NGF, nedochází k morfologickým změnám ani za podmínek, které jsou optimální pro růst nerovových látek a nedochází také k indukci exprese časných genů podle obr. 2A a 2B. Z těchto výsledků je možno usuzovat, že receptory s nízkou nebo vysokou afinitou pro NGF nestačí pro funkční odpověd na BDNF a NT-3, pro tuto odpověd je patrně nezbytná alespoň jedna složka receptoru, který se u buněk PC12 obvykle nevyskytuje.
<
6.2.2 BDNF a NT-3, avšak nikoliv NGF jsou schopné vazby na trk-B s plnou délkou nebo ve zkrácené formě
X expresi trk-B v buňkách PC12 nedochází, jak bylo popsáno v Kaplan a další, 1991, Nátuře 350, 153 - 160. Buněčné linie, u nichž by docházelo k expresi trk-B ještě habyly popsány. Byla izolována cDIIA pro trk3 s plnou délkou a bylo dosaženo její přechodné exprese v buňkách COS a pak byly prováděny pokusy se zesítěním při použití neurotrofinů, značených radioaktivním jodem. Jak je zřejmé z obr. 3A, mohou být BDI4F a NT-3, avšak nikoliv NGF zesítšny s polypeptidem s přibližnou velikostí pro produkt genu trkB. Bylo možno pozorovat určitou heterogenitu zesítšného materiálu, jak bylo již dříve popsáno pro HNGFR, zesítěný s NGF v publikaci Meakin a Shootar, 1991, Neuron 6, 153 - 163. Zesítění značeného BDNF nebo NT-3 s předpokládaným produktem genu trkB nebylo možno pozorovat v přítomnosti přebytku neznačené homologní vazné látky, jak je zřejmé na obr. 3Ά v drahách, označených Aby bylo možno ověřit, že bílkovina, zesítěná BDNF nebo NT-3 skutečně odpovídá produktu genu trkB a aby bylo možno stanovit, zda určité zkrácené formy této bílkoviny jsou rovněž schopné se vázat na váznou látku, byla zkonstruována mutanta trkB, v níž chybí .intracytoplasmatická oblast pro tyrosinkinázu a bylo dosaženo exprese této mutanty v buňkách COS. Jak je znázorněno na obr. 3B, byla radioaktivně značena vazná látka, v tomto případě NT-3 účinně zesítěná s povrchovou složkou buněk, u nichž docházelo k expresi produktu trkB se zkráceným řetězcem. Mimoto výrazný posun v pohyblivosti, který je pozorován mezi zesítěným materiálem s plnou délkou nebo se zkráceným řetězcem a který odpovídá molekulové hmotnosti přibližně 35 000 je v souladu se známým rozsahem vypuštěné části.
<
6.2.3 BDNF a NT-3, avšak nikoliv NGF mohou být v kompetici na vazbu trkB a mají vyšší afinitu vazby k trkB než k LNGFR
Specifičnost a raaltivní afinita vazby neurotrofinů na LNGFR a trkB byla srovnávána v kompetičních zkouškách. Každý ze tří naznačených neutrotrofinů byl účinně schopen specificky blokovat zesítění radioaktivně značeného NT-3 na LNGFR po jeho expresi v buňkách COS v koncentraci 500 nlí avšak nikoliv v koncentraci 1 až 5 nM, jak je zřejmé z obr. 4A. V souladu s těmito výsledky byla vazba radioaktivně značeného NT-3 na LNGFR po jeho expresi v buňkách COS dovršena obdobným způsobem v případě všech tří neznačených neurotrofinů, jak je zřejmé z obr. 4C. Kompetiční křivky ukazují, že disociační konstanty by pro všechny tři neurotrofiny měly ležet v oblasti nanomolů, což znamená, že před chozí pozorování platí taká pro NGF a BDNF podle publikace Rodriguez-Tabar a další, 1990, Neuron, 4, 487 - 492.
Na rozdíl od poměrně vysokého množství neznačených vazných látek, jehož je zapotřebí pro specifickou inhibici vazby na LNGFR stačí daleko nižší množství neznačeného BDNF a NT-3 k účinné inhibici vazby radioaktivně značěného NT-3 na trkB, jak je možno prokázat bud pomocí zesítění podle obr. 43 nebo přímou analýzou vazby podle obr. 4D. NGF není ani v molárním přebytku 500 až 1000 v kompetici na vazbu ra dioaktivně značeného NT-3 na trkB při žádné z uvedených zkoušek, jak ja zřejmé z obr. 43 a 4D. Vzhledem k množství neznačeného BDNF a NT-3, jehož je zapotřebí k úplné inhibici vazby radioaktivně značeného NT-3 na trkB, které je 10 až lOOx nižší než množství, jehož je zapotřebí k blokování vazby NT-3 na LNGFR je možno se domnívat, že trkB má podstatně vyšší aktivitu pro BDNF a NT-3, než je afinita LNGFR pro tyto látky.
6.2.4 trkB může zprostředkovat růst nervových látek u buněk PC12 po působení BDNF a NT-3
Buňky PC12 vyvinou charakteristickou morfologickou od povaěd po vystavení působení NGF, tato odpovad spočívá v prodloužení nervových látek a je průkazem diferenciace na zralejší fenotyp. Jak již bylo svrchu prokázáno, uvedené buňky nereagují na působení BDNF nebo NT-3. Aby bylo možno prokázat, zda trkE může zprostředkovat biologicky relevantní odpcvěá na BDNF nebo KT-3, byly buňky PCI 2 pcdro.’;t?ny pře chodné transfekci vektorem pro expresi trkB, pCMX-trkB, a pak byly inkubovány s jednotlivými neurotrofiny. Aby bylo možno snížit na co nejmenší míru vliv pozadí, byly buňky po transfekci pěstovány na standardních plotnách pro pěstování tkáňových kultur z plastické hmoty a nikoliv na plotnách, opatřených povlakem kolagenu nebo povlakem Primaria. Za těchto podmínek, které jsou suboptimální pro prodloužení nervových vláken podle publikací Greene a další, 1987, Meth Enzymol., 147, 207 - 216, Vhem a další, 1990, Cell Grovth, 1, 79 - 85, vyvolá NGF růst krátkých neuronů u kontrolních buněk PC12 i u buněk po transfekci trkB, jak je zřejmé z obr. 5B. V případe, že se nepřidá žádný neurotrofní faktor, nedojde v'kulturách po transfekci trkB k růstu nervových vláken, jak je zřejmé z obr. 5C. Avšak celá řada buněk v kulturách buněk PC12 po transfekci trkB vyvine robustní nervová vlákna v přítomnosti NT-3 nebo BDNF, jak je zřejmé z obr. 5D a 5E. Žádné buňky s neurity nebí možno pozorovat v případě buněk PC12 po přechodné transfekci kontrolními vektory a po působení BDNF nebo NT-3. Aby bylo možno získat pozitivní kontrolu pro odhad účinnosti transfekce, byly buňky PC12 podrobeny transfekci aktivovaným genem H-ras, přičemž se ukázalo, že v přítomnosti tohoto genu dochází k diferenciaci buněk PC12, která je nezávislá na přítomnosti vazných látek. Počet diferencovaných buněk, který je možno diferencovat v kulturách po transfekci genem H-ras je ukazatelem počtu buněk PC12, u nichž skutečně došlo k přechodně transfekci. Vzhledem k tomu, že počet diferencovaných buněk, které jsou pozorovány po působení BDNF na buňky PC12 po transfekci pCI-IX-trkE je srovnatelný s počtem diferencovaných buněk, které lze prokázat v buněčné populaci po transfekci genem H-ras, jak je zřejmě z obr. 5A a 5E, je možno se domnívat, že každá buňka PC12, u níž dochází k expresi trkB může reagovat na BDNF avšak menší část těchto buněk může odpovídat také na NT-3, jak je zřejmé z růstu neuritů na obr. 5D. Je zřejmé, že bude zapotřebí pečlivějšího výzkumu závislosti odpovědi na dávce, aby bylo mošno vyhodnotit zřejmý rozdíl mezi působením DBNF a NT-3 při těchto pokusech. Jak je znázorněno na obr. 5, je velmi překvapující, že extensivní růst neuritů u buněk PC12 po transfekci H-ras nebo u buněk PC12 po transfekci pCMX-trkB a po působení BDNF nebo NT-3 byl kvalitativně odlišný od růstu neuritů, který je za obvyklých podmínek možno v těchto kulturách pozorovat po působení NGF.
S.2.5 Buňky SH-SH5Y lidského neuroblastomu reagují , na BDNF, avšak nikoliv na NT-3 a nedochází u nich k expresi trkB, průkaz dalšího receptorů pro neurotrofin
Indukce exprese časného genu byla použita jako zkouška k vyhledání buněčných linií nádorových buněk nervové tkáně, které by byly schopny reagovat na BDNF, NT-3 a NGF podle Squinto a další, 1990, Neuron, 5, 757 - 766. Bylo prokázáno, že například buněčná linie SH-SY5Y reaguje expresí mRNA c-fos na působení NGF, jak již bylo dříve popsáno, a také na působení BDNF, avšak nikoliv na působení NT-3, jak je zřejmé z obr. 6A. Dalšími pokusy bylo ověřeno, že BDNF, avšak nikoliv NT-3 má na buňky SH-HY5Y ještě další funkční účinky. BDNF na<
příklad chrání tyto buňky před oxidativním poškozením. Přestože bylo prokázáno, že u uvedených buněk dochází k expresi malých množství receotorů NGF s nízkou i vysokou afinitou podle Chem a další, 1990, Cell Growth Diff., 1, 79 - 85 a k expresi zjistitelných množství mRNA trkA, nedochází k expresi zjistitelných množství mRNA pro trkB, jak je zřejmé z obr. 6B. Zřejmý nedostatek exprese trkB u buněčné linie, reagující na BDNF a neschopnost této buněčné linie reagovat na NT-3 vede k předpokladu, že existují další modulátory LNGFR nebo trkA, která umožní reakci na BDNF nebo že existuje ještě další funkční receptcr pro neurotrofin, který je specifický pro BDNF.
6.3. Diskuse
Je možno uzavřít, že trkB je kódem pro podstatnou složku funkčního raceptoru pro BDNF a NT-3, avšak nikoliv pro třetí látku za skupiny neurotrofinů, NGF. V současných publikacích se uvádí, že protoonkogen trkA, který je nejpříbuznější trkB, je podobně kódem pro podstatnou složku receptoru s vysokou afinitou pro NGF, například podle publikací Kaplan a další, 1991, Nátuře, 350, 158 - 160, Klein a další, 1991, EMBO J., 3, 3701 - 3709. Současná pozorování, že buňky PC12 za normálních podmínek nereagují na- BDNF nebo NT-3, ukazují na to, že trkA, k jehož expresi v buňkách PC12 dochází, je aktivován pouze jedinou známou látkou ze skupiny neurotrofinů, a to NGF.
Je možno prokázat, že BDNF a NT-3 jsou schopné se vázat na trkB v nepřítomnosti LNGFR a to s vyšší aktivitou než na LNGFR. Podobně v publikaci Klein a další, 1991, Cell, 65, 189 - 197 se popisuje, že NGF se může vázat s vysokou afinitou na trkA v buňkách, u nichž nedochází k expresi LNGFR. Funkce LNGFR zůstává nejasná. Dřívější pozorování, shrnutá v <
publikaci Rodriguez-Tebar a další, 1990, Neuron 4, 4ó7 492 je možno rozšířit o důkaz, že všechny tři naurotrofiny jsou schopné se vázat na LNGFR s přibližně stejnou, i když poměrně nízkou afinitou. Zachování táto vlastbosti je patrně způsobeno důležitou biologickou úlohou. Je možné, že LNGFR mění vazbu každého z neurotrofinů na jeho příslušný receptor typu trk. Je rovněž možné, že LNGFR mění převod signálu přes nezávislý způsob převodu nebo se může přímo účastnit počátku tohoto převodu. Mohl by například lokalizovat, koncentrovat a zachytit neurotrofin na povrchu buněk, u nichž k expresi LNGFR dochází. Z tohoto hlediska by mohlo být zajímavé, že podpůrné nervové buňky, například Schwannovy buňky, které neodpovídají na NGF vykazují expresi LNGFR a mění ji v případě poškození, jak bylo popsáno v publikaci Johnson a další, 1933, TIN3 11,
299 - 304, takže je možno, že tyto buňky představují pevnou matrici nebo cestu pro koncentrování a přívod neurotrofinů k regenerujícím nervovým buňkám. Je také možné, že LNGFR působí jako receptor, který snižuje hladinu neurotrofinů, volných nebo obíhajících. Vyskytuje se totiž jak v centrálním nervovém systému, tak na periferii, jak bylo popsáno v Mainsonpierre a další, 1990, Neuron 5, 501 - 509. Vylučované formy LNGFR, popsané v DiStefano a,Johnson, 1938, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 85, 270 - 274 mohou napomáhat tomuto mechanismu. Pokud jde o některé pravděpodobné úlohy LNGFR, může jít o podobné mechanismy, které jsou specifické pro BDNF a NT-3 tak, jak je možno je prokázat při použití zkrácených forem trkB. Společná lokalizace BDNF a transkriptů zkrácených forem trkB mimo nervový systém, převážně v plicích a v kosterním svalu vyvolává otázky, týkající se úlohy BDNF, trkB a dalších potenciálních receptorů BDNF v jiných než nervových tkáních.
Skutečnost, že BDNF a NT-3 mají společný funkční receptor trkB, je v souladu s dřívějším předpokladem, že
distribuce a překrývající se specifičnost účinnosti BDNF a NT-3 pro neurony spojuje úlohu těchto dvou neurotrofinů alespoň v centrálním nervovém systému. V průběhu zrání různých oblastí mozku dochází ke snižování koncentrace NT-3 a postupnému zvyšování koncentrace BDNF, avšak exprese trkB zůstává poměrně stálá. Avšak identifikace buněčné linie, která reaguje na BDNF, avšak nikoliv na NT-3 a u níz nedochází k prokazatelné expresi trkB napovídá, že tyto dva neurotrofiny není možno úplně zaměnit a že mohou existovat další receptory nebo modulační složky, které dovolují odlišit odpověd na BDNF nebo NT-3. Taková modulace by například mohla vysvětlit odlišné účinky NT-3 a BDNF na buňky PC12 po transfekcí trkB, tak jak byly svrchu uvedeny nebo na neurony sympatiku, jak bylo popsáno v publikaci Maisonpiěrre a další, 1990, Science, 247, 1446 - 1451. Je známo, že u neuronů sympatiku dochází k expresi trkB, přestože údaje, které jsou k dispozici na základě hybridizace in šitu neodlišují přítomnost funkčních a nefunkčních transkriptů trkB v těchto neuronech, jak bylo popsáno v Klein a další, 1989, EHBO, 8, 3701 - 3709. Vývojové srovnání BDNF a NT-3 vede k předpovědi, že tyto dva neurotrofiny byly pevně konzervovány tak, aby si uchovaly své specifické interakce s větším počtem receptorů. Přestože NGF je dobře vývojově konzervován ve srovnání s většinou vylučovaných faktorů, jeho konzervace není tak velká jako konzervace BDNF a NT-3, což pravděpodobně naznačuje, že tato látka není v interakci s takovým množstvím receptorů jako ostatní dva neuro trofiny. Uvedené výsledky zařazují neurotrofiny do zvětšující se skupiny systémů receptorů a vazných látek, v nichž se mnohočetné receptory jsou schopné vázat na několik různých příbuzných vazných látek, údaje jsou shrnuty v publikaci Cross a Dexter, 1991, Cell, 64, 271 - 280.
Vazba a aktivace receptorů pro tyrosinkinázu působením neurotrofinů prokazuje, že tyto faktory využívají
signální dráhy, které jsou velmi podobné drahám, aktivovaným mitogenními růstovými faktory. Tento poznatek je v souladu s výsledky posledních výzkumů, které uvádějí, že neurotrofní faktory mohou v určitých souvislostech působit jako mitogeny, jak bylo popsáno v publikaci Cattaneo a McXay, 1990, Nátuře, 347, 762 - 755. Mimoto pak bylo také prokázáno, že signály, které zahajují aktivaci receptoru tyrosinkinázy, jsou za běžných podmínek integrovány do nemitogenních cest pro převod v nervových buňkách. Přes rozdíly v cílovém jevu, kterým je mitogenesa, přežívání nebo diferenciace, jsou alespoň některé z časných meziproduktů v signalizační kaskádě tyrosinkinázy, jako skupina ERX bílkovinných kináz podobným způsobem aktivovány v nervových i jiných buňkách. Dalším příkladem toho, že aktivace tyrosinkinázy v nervových buňkách může vést k nemitogenním důsledkům může být bílkovina z Frosophila sevenless, jejíž aktivace je nutná pro diferenciaci buněk fotoreceptorů podle publikace Basler a další,
1991, Cell, 64, 1069 - 1081.
7. Příklad: trk může zprostředkovat přežívání v závislosti na BDNF/NT-3 a proliferaci u fibroblastů, jimž chybí receptor NGF s nízkou afinitou
7.1. Materiály a metody
7.1.1 Buňky, buněčné kultury a transfekce DNA
Buňky NIH3T3 byly pěstovány v Eaglově prostředí DMEM v Dulbeccově modifikaci, obsahujícím 10 % telecího séra, % peniclinu i streptomycinu (P/S) a 2 mM glutaminu v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého. Pro zkoušky na definovaných prostředích byla tato prostředí připravena podle publikace Zhan a další, 1987, Oncogene, 1, 369 - 376.
I když bylo prokázáno, že buňky NIH3T3 ztrácejí svou životnost v prostředích v nepřítomnosti růstového faktoru, jak bylo popsáno v Zhan a další, Oncogen, 1, 369 - 376, Zhan a Goldfarb, 1986, Mol, Cell, Biol., 6, 3541 - 3544, je nutno se zmínit o tom, že některé jiné varianty buněk NIH3T3 životnost neztrácejí, avšak ve stejných prostředích zachovávají klidový stav. Transfekce DNA v těchto buňkách při použití konstrukcí pLTR-trkB a pLTR-hyg, popsaných ve Squinto a další, 1991, Cell, 65, 1 - 20, byla uskutečněna podle publikace Wigler a další, 1979, Cell 16, 777 - 785. Buněčné kultury buněk COS a transfekce pomocí pCMX-LNGFR byly prováděny podle Squinto a další, 1991, Cell 65, 1 - 20. Zkoušky na přežívání neuronů při použití neuronů ganglií dorsálních kořenů kuřete byly prováděny podle publikace Rodriguez-Tebar a Barde, 1988, The Journal of Neuroscience 8, 3337-3342.
7.1.2 Faktory
Příprava, čištění a radioaktivní značení rekombinantního lidského BDNF a NT-3, produkovaného v buňkách CHO byly popsány v publikaci Squinto a další, 1991, Cell 6.5, 1-20. NGF myši byl získán od Bioproducts, Indianapolis, IN. Faktor bFGF byl získán od R a D Systems, lne., Minneapolis, MN.
.;. 7.1.3 Zkoušky na přežíváni, proliferaci a příjem thymidinu
Zkoušky na přežívání a proliferaci byly prováděny v podstatě způsobem podle publikací Zhan a další, 1937, Oncogene 1, 369 - 376, Zhan a Goldfarb, 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 3541 - 3544. Zkoušky na přežívání byly prováděny tak, že buňky byly naneseny na plotny, opatřené povlakem poly-D-lysinu/fibronectinu, pěstovány až do získání 20% souvislé vrstvy a pak pěstovány 5 dnů v definovaném prostředí v přítomnosti nebo nepřítomnosti faktoru. Stupeň přežívání byl hodnocen mikroskopicky stupnicí v případě, že žádné buňky nepřežily až do +++ v případě souvislé vrstvy přežívajících buněk. Při zkouš.tách na proliferaci byly buňky naneseny na plotny do přibližně 0,5% souvislé vrstvy, byly užity plotny, opatřené povlakem poly-D-lysinu/fibrolactinu a buňky bňlň pěstovány 8 dnů bez přidání faktoru nebo v přítomnosti faktoru a pak byly buňky počítány po rozrušení vrstvy trypsinem na počítacím zařízení Coulter counter. Při zkouškách syntézy DNA byly buňky naneseny na plotny v prostředí s obsahem 3 % telecího séra a po dosažení rovnovážného stavu byly na 14 dnů přidány různé faktory. Pak bylo prostředí doplněno ^H-thymidinem v množství 1 mikroCurie na 1 ml na dobu 2 hodiny. Pak bylo stanoveno zařazení radioaktivně značeného materiálu do materiálu, nerozpustného v TCA podle publikace Cavalieri a Goldfarb 1987, Mol. Cell. Biol., 7, 3544 - 3560.
7.1.4 Izolace RNA a analýza northerm blot t t
Uvedené zkoušky byly prováděny způsobem, popsaným v publikaci Maisonpierre a další, 1990, Neuron, 5, '501 - 509.
7.1.5 Izolace bílkoviny a analýza western blot
Za účelem detekce změn fosforylace tyrosinu v závislosti na přidávání jednotlivých faktorů byly buňky uloženy na 1 hodinu do definovaného prostředí, prostého séra, pak byly na 5 minut přidány označené faktory. Pak byly buňky promyty roztokem chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS) s 1 mM orthovanadičnanem a rozrušeny v pufru RIPA (PBS s obsahem 1 % NP40, 0,1 % SDS, 0,5 % deoxycholátu, 1 mM PMSF,
mM orthovanadičnanu a 0,14 jednotky/ml aprotininu) . Při provádění pokusů z obr. 11A byl materiál z rozrušených buněk vysrážen pomocí monoklonální protilátky proti fosfotyrosinu, konjugované s agarosou a označené 4G10 (FOXNY Sp2-derivát myelomu x slezinné buňky BALB/c), materiál byl získán od Uostate Biotechnologies, lne. Imunologicky vysrážený materiál byl promyt pufrem, v němž byly buňky rozrušeny, pak byl za varu uveden do suspenze v pufru, obsahujícím SDS a v tomto pufru byl nanesen na 6% SDS-akrylamidový gel a podroben imunoblotové analýza při použití protilátky proti fosfotyrosinu 4G10. V případě pokusů podle obr. 11B byl rozrušený buněčný materiál přímo podroben alektroforéze na 8% SDS-akrylamidovém gelu a pak byla prováděna imunoblotová zkouška při použití protilátky 4G10. Zkoušky byly provedeny při použití membrán Immobilon-P. Po aplikaci primární antifosfotyrosinové protilátky 4G10 byla k detekci použita kozí polyklonální protilátka proti myším tkáním, značená I.
7.2. Výsledky
7.2.1 BDNF a NT-3 jako faktory, nutné pro přežívání buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB, » .
v nepřítomnosti LNGFR
Aby bylo možno prozkoumat funkční schopnosti receptoru trk při jeho expresi v buňkách, odlišných cd nervových buněk, byla provedena současná transfekce svrchu uvedené varianty buněk NIH3T3 při použití konstrukce trkB pro expresi, pLTR-trkB podle publikace Squinto a další, 1991, Cell, 65, 1-20 a značícího genu pro hygromycin k usnadnění selekce, pLTR-hyg podle Murphy a Efstratiadis, 1987, Proč. Natl.Acad.Sci., USA, 34, 8277 - 8281. U uvedené varianty buněk NIH3T3 nedochází k expresi zjistitelného množství LNGFR, jak je možno prokázat přímým zesítěním s radioaktivně značeným faktorem NT-3, jak í
získat buňky, která vytvářejí rostoucí kolonie působením BDNF nebo NT-3.
Aby bylo možno stanovit, zda většina buněk po transfekci trkB může odpovídat na BDNF nebo na NT-3 nebo zda svrchu uvedené kolonie jsou tvořeny vzácnými klony buněčné populace po transfekci, byly buňky po transfekci trk3 nejprve podrobeny selekci na prostředí, obsahujícím 10 % telecího séra a hygromycin. U těchto buněk dochází k expresi většího množství transkriptů trkB, jak je zřejmé ze spodní části obr. 9B a k expresi prokazatelného množství bílkoviny trkB, jak je možno prokázat chemickým zesítěním s radioaktivně značeným NT-3 a jak je zřejmé z obr. 7A, dráhy 5 a 6. Počet receptorů trkB v těchto buňkách je nízký ve srovnání s počtem molekul LNGFR, k jejichž expresi dochází v buňkách COS po přechodné transfekci konstrukcí pro expresi LNGFR, jak je zřejmé z obr. 7A při srovnání drah 1, 2 a 5, 6. Buňky, u nichž dochází k expresi trkB pak byly zkoumány na přežívání při pokusech, při nichž byly buňky nanášeny na plotny živného prosťředí s poměrně vysokou hustotou, do 20% souvislé vrstvy, a to na definovaném prostředí nebo na definovaném prostředí, doplněném 5 nll bFGF nebo jednotlivých neurotrofinů. V průběhu několika dnů bylo možno pozorovat ňa definovaném nedoplněném prostředí nebo na prostředí, doplněném pouze NGF téměř úplné uhynutí buněk, jak je znázorněno na obr. 9A. Je překvapující, že v případě kultur buněk, u nichž dochází k expresi trkB je možno pozorovat souvislé vrstvy buněk v případě přidání bFGF, BDNF nebo NT-3, což je průkazem poměrně rovnoměrného přežívání buněk, jak je také zřejmé ze spodní části obr. 9A. Přežívání buněk bylo podporováno bFGF, avšak nikoliv ostatními neurotrofiny v kulturách původních buněk NIH3T3, jak je zřejmé z horní části obr. 9A, v kulturách buněk, u nichž byla provedena transfekce pouze s použitím samotného pLTR-hyg a v kulturách buněk, obsahujících vektor pro expresi LNGFR.
je zřejmé z obr. 7A, v němž jsou buňky, u nichž dochází k expresi LNGFR v drahách 1 a 2 srovnány s buňkami NIH3T3 v drahách 3 a 4. Je také možno provést vazbu I NGF na neporušených buňkách. Při analýze northern blot rovněž nebylo možno prokázat mRNA pro LNGFR v buňkách NIH3T3, přesto že tuto mRNA bylo možno snadnoprokázat v buňkách PC12, kde bylo patrně přítomno 100 000 molekul LNGFR v jedné buňce nebo v buňkách SH-SY5Y, u nichž dochází k expresi sotva prokazatelných množství LNGFR podle publikací Chao a další,1986, Science 232, 513 - 521, Sonnenfeld a Ishii, 1982, J. Neurosci Res., 8, 375 - 391, a jak je znázorněno také v horní části na obr. 7B. Po současné transfekci pomocí pLTR-trkB a pLTR-hyg byly buňky NIH3T3 znovu naneseny na plotny do 20% souvislé vrstvy a pak bu3 podrobeny selekci na definovaném prostředí, nebo bylo toto prostředí ještě doplněno 5 nM některého z faktorů bFGF, NGF, BDNF nebo NT-3, nebo byly buňky pěstovány v úplném prostředí, obsahujícím hygromycin a telecí sérum, jak je znázorněno na obr. 8. Přímá selekce na definovaném prostře dí prokázala, že všechny pěstované buňky přežily v případě, že prostředí bylo doplněno faktorem bFGF, jak bylo očekáváno. Mimoto nebylo možno prokázat tvorbu žádných kolonií v případě, že definované prostředí nebylo nikým doplněno nebo bylo doplněno pouze NGF, což ukazuje na to, že přidáním trkB není možno zajistit růstový signál bez jeho stimulace .vaznými látkami. Na rozdíl od tohoto pozorování bylo možno prokázat několik kolonií v případě, že buňky po transfekci pLTR-trkB byly pěstovány na definovaném prostředí, doplněném BDNF nebo NT-3. Poněkud větší množství kolonií bylo možno prokázat po přidání BDNF ve srovnání s přidáním NT-3, jak je zřejmé z levé strany obr. 8. Žádné kolonie nebylo možno pozorovat v případě buněk NIH3T3 bez transfekce, u buněk po transfekci pouze s použitím pLTR-hyg nebo u buněk, obsahujících konstrukci pro expresi LNGFR. To znamená, že v případě transfekce buněk NIH3T3 pomocí konstrukce pLTR-trkB bylo možno
Zkoušky na závislost účinku na dávce při přežívání buněk ukázaly, že koncentraci bFGF, BDNF a NT-3 řádu pikomolů byly účinné, přičemž účinnost bFGF a BDNF byla zřejmá v rozmezí 0,5 až 5 pM a účinnost NT-3 byla rozeznatelná při 50 pM, jak je zřejmé z obr. 9B. Avšak NGF nebyl účinný ani při 100 až lOOOkrát vyšší koncentraci, jak je zřejmé z obr. 9A. To znamená, že BDNF byl téměř stejně účinný jako bFGF při podpoře přežívání buněk NIH3T3 po transfekci trkB, kdežto NT-3 byl při této zkoušce alespoň lOx méně účinný než BDNF.
7.2.2 BDNF a NT-3 jako proliferativní faktory pro buňky NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB
Aby bylo možno stanovit, zda aktivace trkB působením BDNF a/nebo NT-3 má mitogenní účinky nebo zda má nějaký vliv na přežívání buněk NIH3T3, byly obě uvedené látky zkoušeny na svou schopnost vyvolat syntézu DNA u buněk, u nichž dochází k expresi trkB, při zkouškách na příjem thymidinu.
Buňky byly pěstovány až do vzniku souvislé vrstvy ve 3% séru, po dosažení souvislé vrstvy již nebylo možno pozorovat mitotické buňky. Za těchto podmínek také nedocházelo k úhyI .
nu buněk. Pak byly přímo do prostředí přidávány různé faktory a 12 hodin po jejich přidání byl sledován příjem thymidinu, značeného H. Jak je zřejmé z obr. 10A, pouze faktor bFGF byl schopen vyvolat syntézu DNA u původních buněk NIH3T3, účinná syntéza DNA byla vyvolána také působením pikomolárních koncentrací BDNF a NT-3 ubuněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB, jak je zřejmé z obr. 10B. Závislost dávky na účinku pro BDNF a NT-3 při těchto zkouškách zhruba odpovídá závislosti, pozorované u těchto látek při zkouškách na přežívání, jak je zřejmé ze srovnání obr. 9B a 10B. NGF nevyvolá syntézu DNA ani v původních buňkách ani v buňkách, u nichž dochází k expresi trkB, jak je zřejmé z obr. 10A a 10B.
BDN? a NT-3 byly také zkoušeny na svou schopnost vyvolat dlouhodobou proliferaci buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB. Při těchto zkouškách byly jednotlivé faktory zkoumány na svou schopnost zvýšit rychlost růstu u buněk, u nichž dochází k expresi trkB a které byly velmi řídce naneseny na plotny s živným prostředím. Na rozdíl od uhynutí buněk, které je možno pozorovat při nanášení těchto buněk s velkou hustotou na definované živné prostředí bez mitogenů je na tomto prostředí při řídce nanesených buňkách možno pozorovat kontinuální proliferaci bez pozorovatelného uhynutí buněk, například při 0,5% vytvoření souvislé vrstvy. Kromě očekávané odpovědi na bFGF je možno u buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB možno pozorovat urychlení růstu v závislosti na působení BDNF a NT-3, jak je zřejmé z obr. 10C. Původní buňky NIH3T3 reagují pouze na přítomnost bFGF. Také v tomto případě je závislost účinku na dávce pro BDNF a NT-3 v případě proliferace obdobná jako závislost, která byla pozorována při zkouškách na přežívání a na příjem thymidinu, jak je zřejmé ze srovnání obr. 9B, 10B a 10C.
7.2.3 U fibroblastů, u nichž dochází k expresi trkB a u primárních neuronů, závislých na BDNF je možno pozorovat pro BDNF obdobné křivky závislosti účinku na dávce
Aby bylo možno stanovit, zda k účinkům BDNF na přežívání a na růst buněk u fibroblastů s expresí trkB dochází v oblasti fyziologicky přijatelných koncentrací neurotrofinu, byla sledována koncentrace BDNF, nutná k dosažení těch to účinků s koncentrací, jíž je zapotřebí při klasické zkouš ce na přežívání nervových buněk při použití neuronů, závislých na BDNF, izolovaných z ganglií dorsálních kořenů DRG. Při použití rekombinantního lidského BDNF byla získána téměř nerozeznatelná křivka závislosti účinku na dávce pro přeží4 vání .neuronů (obr. 10B), stejně jako to bylo popsáno pro BDNF, čistění z mozku vepře podle publikace Rodriguez-Tebar a Barde, 1988, The Journal of Neuroscience 8, 3337 - 3342. Tato křivka závislosti odpovědi na dávce je u primárních neuronů velmi podobná svrchu popsané křivce pro přežívání a proliferaci u fibroblastů, jak je zřejmé ze srovnání obr. 10D s obr. 9B, 10B a 10C. To znamená, že u fibroblastů, u nichž dochází k expresi trkB v nepřítomnosti LNGFR je možno předpokládat citlivost k BDNF, která je podobná citlivosti primárních nervových buněk, závislých na BDNF.
7.2.4 BDNF a NT-3 aktivují fosforylaci tyrosinu u buněk ΝΙΗ3Τ3» u nichž dochází k expresi trk3
Aby bylo možno sledovat signální dráhy, k jejichž spuštění dojde vazbou neurotrofinů na trkB, byla sledována fosforylace tyrosinu u buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB, po působení bFGF nebo neurotrofinů. Na původní buňky NIH3T3 nebo na buňky, u nichž dochází k expresi trkB se při této zkoušce působí 5 minut určitým faktorem, pak se buňky rozruší a provádí se imunoprecipitace při použití protilátky proti fosfotyrosinu. Vysrážené bílkoviny se oddělí elektrofořežou na gelu a prokazují imunoblotovou zkouškou při použití protilátek proti fosfotyrosinu. U buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB je po působení BDNF nebo NT-3 možno prokázat hlavní produkt fosforylace tyrosinu s molekulovou hmotností přibližně 145 000, což odpovídá známé velikosti trkB, jak je zřejmé z obr. 11B. Tento produkt není mož no pozorovat u původních buněk po působení kteréhokoliv z uvedených faktorů ani u buněk, u nichž docházík expresi trkB a které byly vystaveny působení bFGF nebo NGF, jak je zřejmé z obr. 11A. Tyto údaje ukazují, že hlavnímf.produktem fosforylace s molekulovou hmotností 145 000, který je možno získat působením BDNF a NT-3, je trkB.
Působením BDÍJF a NT-3 na buňky NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB, dochází také k fosforylaci tyrosinu za vzniku bílkoviny s molekulovou hmotností 41 000, jak je zřejmé z obr. 11B. Působením bFGF dochází také k fosforylaci bílkoviny o molekulová hmotnosti 41 000 jak u původních buněk NIH3T3, tak u buněk s expresí trkB, jak je rovněž zřejmé z obr. 113. Podle výsledků, popsaných v publikaci Boulton a další, 1991, Cell 65, 663 - 677, může tento fosfoprotein odpovídat ERK2, jde o serin/threonin kinázu, která je aktivována, k fosforylaci tyrosinu u buněk PC12 dochází působením NGF.Tyto údaje jsou v souladu s pozorováním, že neurotrofin a receptory růstového faktoru fosforylují některé stejné cílové látky v nervových buňkách i v buňkách odlišného původu.
7.3. Diskuse
Bylo prokázáno, že trkB po expresi v buňkách PC12, positivních na LNGFR může zprostředkovat růst nervových Vláken jako odpověč na působení BDNF a NT-3 podle publikace Squinto a další, 1991, Cell 65, 1 - 20. Jak bylo svrchu uvedeno, je nyní možno prokázat, že látka ze skupiny trk může zprostředkovat biologickou odpověS na neurotrofiny bez současného působení LNGFR. BDNF a NT-3 mohou působit na přežívání a růst buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB, avšak nikoliv k prokazatelné produkci LNGFR. Tyto vlivy na přežívání a růst buněk je možno pozorovat se závislostí účinku na dávce, která je velmi podobná závislostem, pozorovaným při přežívání primárních neuronů v kultuře. Mimoto je také působení BDNF a NT-3 na fibroblasty, u nichž dochází k expresi trkB biologicky i biochemicky analogické působení známého růstového faktoru, bFGF.
Uvedené poznatky potvrzují, že receptory pro neurotrofiny nejsou neobvyklým jevem mezi receptory pro tyrosinkiná<
zu, a to jak pokud jde o jejich požadavky na interakce s ostatními složkami receotorů, tak pokud jde o typy signálů, které jsou schopné převádět. To znamená, že zjevně jedinečné působení neurotrofinů, kterým je podpora přežívání nervových buněk a jejich diferenciace je pravděpodobně možno připsat poměrně omezené distribuci receptorů trk u nervových buněk po mitose, spíše než výjimečným vlastnostem receptorového systému. Na druhé straně je možno ze získaných informací usoudit, že zjevné neurotrofní účinky tradičních růstových faktorů včetně látek ze skupiny FGF jsou zprostředkovány převodem signálu, který se překrývá s převodem, využívaným v případě neurotrofinů.
Identifikace receptorů, využívaných neurotrofinů a vytvoření neneuronových buněčných linií, rovněž reagujících pře žíváním;?.a růstem na tyto faktory by mělo zlepšit porozumění situaci, při níž tytéž signály mohou být nakonec v neuronech a neneuronových buňkách interpretovány odlišným způsobem. Je nutno uvést, že buňky NIH3T3, u nichž dochází k expresi trkB jsou prvním příkladem immortalizóvané buněčné linie, která je schopna reagovat na neurotrofiny v koncentraci, podobné fyziologickým koncentracím. U buněk PC12 je k odpovědi zapotřebí přibližně stonásobného, množství NGF, než jakého je zapotřebí k vyvolání odpovědi u primárních neuronů. Tyto studie ukazují, že zkoušky na proliferaci a přežívání buněk NIH3T3, u nichž dochází k expresi nového receptoru tyrosinkinázy je možno využít jako velmi vhodného systému pro molekulární klonování vazných látek pro tyto receptory. Mimoto může systém s použitím těchto buněk také podat informaci o tom, jak mohou neurotrofní faktory zabránit uhynutí nervových buněk. Nyní je tedy možno prokázat, zda jsou v případě neurotrofinů využívány tytéž nebo odlišné cesty k zábraně uhynutí nervových buněk a buněk odlišného původu.
Důležitá informace, která vyplývá ze získaných údajů se týká úlohy LNGFR s vazným místem s nízkou afinitou pro všechny známé neurotrofiny. Řada studií ukazuje, že při zavedení LNGFR do buněk, odlišných od nervových buněk nedochází k reakci na neurotrofiny u těchto buněk, jak bylo popsáno v publikacích Hempstead a další, 1982, Science, 243, 373 375, Sehgal a další, 1938, Mol. Cell. Biol., 8, 2242 - 2246. Najpřímější důkaz, týkající se funkční úlohy LMGFR při zprostředkování převodu signálu byl získán v pokusu, v němž byl LNGFR znovu zaváděn do mutanty buněk PC12, která zjevně ztratila veškerou schopnost vázat NGF a odpovědět na přítomnost tohoto faktoru, jak bylo popsáno v Hempstead a další, 1939, Science 243, 373 - 375, Sehgal a další, 188, Mol. Cell. Biol., 8, 2242 - 2246. Výsledné buňky po transfekci obsahovaly vazná místa s vysokou i nízkou afinitou pro NGF a byly také poněkud schopné reagovat na přítomnost NGF. Bylo předpokládáno, že tento pokus prokazuje, že LNGFR je jedinou vaznou molekulou pro NGF, k jejíž expresi dochází v buňkách PC12 a že tato molekula spolupracuje s další částí bez vazné schopnosti pro NGF ale se schopností převádět LNGFR na receptor s vysokou afinitou, schopný převádět signál. Pozorování, že bílkoviny trk jsou schopné vázat neurotrofiny a že u buněk PC12 za běžných podmínek dochází k expresi trkA tedy vyžaduje .reinterpretaci uvedeného pokusu. Publikace, vydávané v současné době se neshodují v názoru, zda trkA vyžaduje LNGFR pro vznik vazných míst pro NGF s vysokou afinitou. Je nutno zdůraznit, že pouze jedinou bílkovinu, o níž je nyní známo, že odpovídá trkA je možno zesítit s NGF za vysoce afinitních podmínek vazby, jak bylo popsáno v Hosang a Shooter, 1985, J. Biol, Chem.,
260, 655 - 662. Mimoto protilátka, která účinně brání vazbě NGF na LNGFR blokuje veškerou nízkoafinitní vazbu, avšak nikoliv veškerou vysoce afinitní vazbu NGF a nebrání odpovědi buněk PC12, vyvolané NGF, jak bylo popsáno v Weskamp a c Reichardt, 1991, Neuron, 6, 649 - 663. Svrchu uvedené funkční <
8. Příklad: Klonování molekul receptoru pro tyrosinkinázu
8.1. Materiály a metody
Na obr. 12Ξ označují římská číslice oblasti homologie tyrosinkinázy, tak jak byly popsány v publikaci Hanks a další, 1988, Science, 241, 42 - 52. Prokázané oblasti homologie řetězce na obr. 12E, které jsou podtrženy a které jsou uloženy v katalytické oblasti těchto bílkovin byly užity při konstrukci degenerovaných oligonukleotidových primerů které pak byly užity při PCR-reakci při použití cDNA z mozku krysy, a to buč dospělé krysy nebo v embryonálním stadiu E13 Výsledné amplifikované fragmenty DNA byly klonovány po ulože ní do plasmidů, byl analyzován jejich řetězec a takto získané řetězce DNA pak byly srovnávány s řetězci všech dosud zná mých tyrosinkináz.
Matrice cDNA byly připraveny reversní transkripcí RNA z mozku krysy, a to dospělé krysy i krysy ve stádiu E13 při použití oligo-d(T)rprimerů. Kombinační PCR-reakce s oběma skupinami cDNA byly prováděny při použití šesti kombinací primerů po směru řetězce i v opačném směru, jak je uvedeno v následující tabulce I a na obr. 12A, primery byly navazovány při teplotě 40 a 45 °C. Podíly materiálu z PCR-reakcí byly podrobeny elektroforéze na agarasovém gelu, pak byly naneseny na nylonovou membránu a jako sondy byly užity vnitřní radioaktivně značené degenerované oligonukleotidy, homologní k oblasti VII homologie. V závislosti na relativní intensitě získaných hybridizačních signálů bylo pro další analýzu vybráno pět PCR-reakcí, které se vyznačovaly uvedenými vlastnostmi.
údaje tedy přesvědčivě prokazují, že LNGFR zřejmě není nezbytný pro odpověa na fyziologické dávky BDNF a NT-3, zprostředkovanou trkB. Je vsak možno, že LNGFR poněkud mění odpovědi, zprostředkované trkA nebo trkB. LNGFR by také mohl hrát signální úlohu při přenosu, v němž nejsou zahrnuty faktory typu trk, přestože zjevné neschopnost BDNF nebo NT-3 vyvolat odpověa u buněk PC12 činí tuto možnost méně pravděpodobnou, jak bylo popsáno v Squinto a další, 1991, Cell S5, 1 - 20. Zjištění, že LNGFR má širší distribuci než faktory trk podle Bothwell, 1991, Curr. Top. Microbiol. Imraunol., 165, 63 - 70, zvláště v případě cílových tkání pro inervaci, které produkují neurotrofiny, avšak o nichž není známo, že by na ně reagovaly, patrně podporuje spise imunomobilisační nebo podobnou úlohu než signální úlohu LNGFR.
Svrchu uvedené výsledky přiřazují neurotrofiny a bílkoviny ze skupiny trk ke zvětšující se skupině systémů faktoru a receptorů, v nichž na tentýž receptor může působit celá skupina příbuzných vazných látek, jak bylo popsáno v Cross a Dexter, 1991, Cell, 64, 271 - 281. K expresi NT-3 a BDNF dochází v průběhu vývoje dramaticky recipročním způsobem, jak bylo popsáno v Maisonpierre a další, 1990a, Neuron, 5,
501 - 509j K expresi genu pro NT-3 dochází v č.asném vývoji na daleko vyšší úrovni než k expresi genu pro BDNF a pak se tato exprese snižuje, kdežto exprese genu pro BDNF se zvyšuje. Tento reciproční vztah mezi expresí NT-3 a BDNF je zvláště zajímavý v případě, že se bere v úvahu zjištění, že trkB může působit jako receptor BDNF a v menší míře také jako receptor NT-3. Vyšší množství NT-3 v časném vývoji může umožnit jeho obecnější působení na receptor trkB a po poklesu exprese pak patrně pouze na neidentifikované receptory, specifické pro NT-3.
Tabulka I
PCR č. teplota °C zdroj cDNA primery
1 40 . E13 DLATEN-DVWSLG
2 40 dospělá DLATRN-DVWSYG
3 40 E13 DLATRN-DVWSYG
4 40 dospělá DLAARN-DVW5LG
5 40 E13 DLAARN-DVWSLG
Amplifikované fragmenty DMA z těchto PCR-reakcí, rozdělené podle velikosti byly klonovány v plasmidech následujícím způsobem: každý z pěti spojených vzorků PCR byl rozštěpen pomocí enzymů Xhol a Sstl k rozštěpení míst na zakončení primerů, tak jak bude dála uvedeno a pak byla provedena elektroforéza na 6% polyakrylamidovém gelu. DNA o 225 bp + 25 bp po štěpení Xhol/Sstl a po barvení ethidium bromidem byla čištěna elucí z příslušných vyříznutých fragmentů polyakrylamidového gelu. DNA po eluci byla klonována
I v kompatibilním miste působení enzymů Xhol/Sstl v plasmidu Bluescript II XS(-), uloženéovdo DH5alfa E. coli pomocí otevření pórů působením elektrického proudu, pak byl mikroorganismus nanesen na plotny agaru pro selekci. Přibližně 200 bakteriálních kolonií, odolných proti ampicilinu bylo z každé transformace PCR naočkováno na mikrotitrační plotny, obsahující 96 vyhloubení a byly skladovány v glycerolu při teplotě -80 °C. Jednotlivé kolonie ze svrchu uvedených pěti vzorků PCR klonů byly analyzovány analýzou řetězce DNA plasmidu po čištění běžnými postupy.
8.2. Výsledky a diskuse
Oligonukleotidové primery, odpovídající konzervovaným oblastem známých molekul tyrosinkinázy byly užity k amolifikaci a klonování kódových řetězců DNA pro nové molekuly receptorů tyrosinkinázy. Řetězce aminokyselin, vybrané ze skupiny tyrosinkináz a popsané v publikaci Hanks a další, 1983, Science, 241, 42 - 52, byly srovnány, jak je zřejmé z obr. 12E a byly identifikovány oblasti homolcgie v katalytické oblasti těchto bílkovin a použity ke konstrukci degenerovaných oligonukleotidových primerů, tak jak bylo svrchu uvedeno v tabulce I a na obr. 12A. Pak byly primery použity k uskutečnění PCR-reakce, jako matrice byla užita cDNA z mozku dospělých krys nebo z mozku krys v embryonálním stadiu E13. Výsledné amplifikované fragmenty DNA pak byly klonovány v plasmidu Bluescript II XS(-), byl analyzován jejich řetězec a řetězce DNA byly srovnávány s řetězci známých tyrosinkináz.
Na obr. 12B je znázorněn řetězec aminokyselin, pro něž jsou kódem uvedené klony, řetězce jsou homologní řadě řetězců známých tyrosinkináz. Pět klonovaných molekul z obr. 12B má homologii s trk, sestavou CSFlR/PDGFT, ret, eck(alfa), a eck(beta), tyto řetězce byly označeny Rtk-1, Rtk-6, Rtk-7, Rtk-8 a Rtk-9. Na obr. 12G jsou uvedeny řetězce DNA pro každý z těchto pěti klonů tyrosinkinázy a jsou uvedeny také informace o zdroji cDNA a primery, užité k amolifikaci každého klonu. Uvedeno je také srovnání těchto řetězců DNA a jejich aminokyselinových řetězců, zřejmá je příbuznost různých řetězců tyrosinkináz.
Na obr. 12B jsou uvedeny řetězce aminokyselin, získané při použití cDNA krysího mozku po jejím získání při použití sondy cDNA Rtk-1, tak jak je znozorněno na obr. 12C.
Klon cDNA obsahuje řetězce, totožné s Rtk-1 a další segment genu pro řetězec 1440 aminokyselin, který je založen na srovnání trkA a trkB, tento řetězec může odpovídat karboxyterminálnímu zakončení produktu genu Rtk-1.
9. Příklad: Klonování molekuly receptorů, podobné trk
9.1. Materiály a metody
Klonování pomocí PCR bylo provedeno v podstatě stejně jako svrchu, avšak byla užita cDNA z buněčné linie lidského neuroblastomu SY5Y jako matrice a dále byly užity oligonukleo tidové primery z tabulky II.
9.2. Výsledky a diskuse
Cílem této práce byla identifikace řetězců DMA, blízce příbuzných genům trk a trkB pomocí PCR. Z tohoto důvodu byly zkonstruovány oligodeoxynukleotidové primery, odpovídající bílkovinným oblastem, silně konzervovaným u všech proteinkináz, avšak tak, aby současně došlo k amplifikační reakci ve smyslu řetězců, podobných trk. Například primer trk-lOr ná obr. 13A odpovídá řetězci -PIRWMPPE-, který je totožný pro trk a trkB, avšak i nejblíže příbuzné, látky, to znamená insulin a insulinu podobné receptory růstových faktorů již v tomto místě obsahují dvě substituce aminokyselin. Na obr. 13A je znázorněno srovnání oblastí tyrosinkinázy u členů skupiny insulinových receptorů, u nichž již byly identifikovány konzervované oblasti řetězce a je uvedeno uložení všech primerů, které byly užity.
Při použití cDNA z buněčné linie lidského neuroblastonu SY5Y jako matrice byla provedena PCR-reakce s různými kombinacemi primerů. Produkty DNA pak byly rozštěpeny res4 trikčními enzymy, schopnými štěpit řetězce trk a trkB a odolný materiál/byl znovu amplifikován a klonován. Řetězce jednotlivých klonů pak byly analyzovány. Řetězce aminokyselin, odvozené od těchto řetězců DNA prokázaly přítomnost fragmentů čtyř nových potenciálních receptorů. Tyto fragmenty, které byly označeny Rtk-2, Rtk-3, Rtk-4 a Rtk-5 byly znázorněny na obr. 13B (Rtk-4 a Rtk-5), na obr. 14 (Rtk-2) a na obr. 15 (Rtk-3) a byly srovnány s odpovídajícími oblastmi lidského trk na obr. 13C. R*k-2 je znázorněn pro srovnání spolu s lidským trk, trkB krysy, receptorem pro růstový faktor insulinového typu a insulinovým receptorem na obr. 13D.
Oligodeoxynukleotidové primery, uvedené v následující tabulce II byly užity při přípravě PCR-fragmentů (zakončení místa restrikčního působení, které bylo užito pro klonování je znázorněno velkými písmeny a degenerace v určité poloze je znázorněna tak, že příslušná písmena jsou uvedena v závorce) :
T a buu 1 k a II
Rtk-2 and Rtk-3
TRK-9 ACGTCTCGAG-GC(TCAG) -GG(TCAG) -ATG-GT (TCAG) TA(TC) - (TC)T ‘
TRK-lOr CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG) -C(GT) (AGT) AT (TCAG) - GG
Rtk-4
TRK-5 ACGTCTCGAG-AA(AG) -AT (TCA) -GG (TCAG) TT(TC) -GG
TRK-lOr CATGTCTAGA-GGC-ATC-CA(TCAG) -C(GT) (TCAG) - GG
-GA(TC) (AGT) - AT
Rtk-5
TRK-9 ACGTCTCGAG-GC(TCAG) -GG(TCAG) -ATG-GT(TCAG) TA(TC) - (TC) T
TRX-6r CATGTCTAGA-CC- (GA)AA- (GA)TC- (CTGA)CC(TGA)AT- (CT)TT .
Zvláště zajímavé jsou Rtk-2 a Rtx-3. V případě, že odvozené řetězce aminokyselin byly použity při analýze genové knihovny, byly získány hodnoty 67,0 (03/91) a modifikovaná hodnota EMBL 26,0 (02/91) při použití TFASTA, nejvyšší hodnoty pro homologii byly získány pro trkB a pro ostatní řetězce typu trk. Rtk-2 a Rtk-3 obsahují řetězec YxxDYY, který je charakteristický pro podskupinu trk/insulin-R. Oba řetězce mají substituci L místo F ve skupině DFG, která je velmi silně konzervovaná u všech kináz.
V případě, že byly sondy Rtk-2 a Rtk-3 hybridizovány metodou northern blot, nebyl získán při použití RNA SY5Y žádný signál. Řetězec Rtk-2 hybridisoval s pásem o 6 až 7 kb z RNA z jiných linií/ zejména z buněk CHP100, SXES a LAN5. Řetězec Rtk-3 hybridisoval s pásem o 5 kb z RNA z buněk SKN-SH a LAN5. Při vyšetření 1,5 x 10^ klonů z baňky cDNA SY5Y v lambda ZPA II při použití sondy Rtk-2 bylo získáno pět positivních klonů s uloženými řetězci v rozmezí 1,4 až 3 kb.
Údaje o řetězci Rtk-2, tak jak jsou znázorněny na obr. 14 ukazují, že nukleotidy 801 až 875 jsou zřejmě kódovými řetězci pro transmembránovou oblast, nukleotidy 1002 až 1850 obsahují oblast pro tyrosinkinázu a nukleotidy 1 až 800 jsou kódovým řetězcem pro kontinuální otevření čtecí rámec, zahrnující oblast pro vazbu vazných látek. Za oblastí pro tyrosinkinázu následuje prodloužení, obsahují<
cí 130 aminokyselin na rozdíl od látek typu trk, které konci krátce za oblastí pro tyrosinkinázu.
Částečný řetězec aminokyselin pro Rtk-3 je znázorněn na obr. 15, kde je také znázorněna přítomnost uvedeného podlouzení za oblastí pro tyrosinkinázu, zjevná je silná nomologie s Rtk-2.
Srovnání řetězce Rtk-3 s řetězci pro Rtk-2, sloučeniny ze skupiny trk, IGFR a receptor insulinu, tak jak je uvedeno na obr. 15 ukazuje, že řetězce Rtk-2 a Rtk-3 vykazují nejvyšší homologii a jde tedy patrně o novou podskupinu receptorů tyrosinkinázy.
10. Funkční spojení trk s neurotrofiny v gangliích dorsálních kořenů u krysího embrya
10.1. Materiály a metody
Ganglia dorsálních kořenů DRG krysího embrya E14 byla vyňata a uložena do prostředí F14, doplněného 5 % koňského séra podle publikace Linsay a další, 1985, Dev. Biol., 112, 319. Pro žkoušky na explantátech byla ganglia 'uložena na misky s průměrem 35 mm, předem opatřené povlakem -polyornithinu 1 mg/ml a laminiau 50 mikrogramů/ml. Ganglia byla pěstována v přítomnosti nebo v nepřítomnosti neurotrofinu při teplotě 37 °C při vysoké vlhkosti v atmosféře s obsahem 3 % oxidu uhličitého. Růst nervových vláken byl hodnocen stupnicí 0 až 5. Na konci pěstování byla ganglia opláchnuta PBS a pak byla připravena RNA při použití guanidiniumthiokyanátu podle publikace Chomczynski a Šaceni 1987, Analytical Biochem 162, 156. Při zkouškách na disociovaných buňkách byla ganglia inkubována 30 minut s 0,1% trypsinem při teplotě 37 °c, pak byla ganglia rozetřena a znovu nanesena na 2,5 hodin na živné <
prostředí. Pak byly nervové buňky odděleny a rozděleny do vyhloubení s průměrem 16 mm, předem opatřených povlakem 100 mikrogramů/ml polyornithinu a 50 mikrogramů/ml lamininu. Nervové buňky bňlň pěstovány 24 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti neurotrofinů a byl zaznamenán počet buněk. RNA z tkání byla připravena při použití běžných postupů.
10.2. Výsledky
Při inkubaci DRG s NGF v různých koncentracích došlo k masivnímu růstu nervových vláken z explantátů, účinek byl závislý na dávce , jak je zřejmé z obr. 17. Podobná výsledky byly získány při použití NT-3. K nasycení koncentrace pro tuto odpověď dochází přibližně při 5 ng/ml pro NGF nebo NT-3. Na druhé straně BDNF vyvolává slabší, avšak homogennější odpověď u explantátů DRG, jak je zřejmé z obr. 17.
U ganglií, pěstovaných v přítomnosti nebo v nepřítomnosti různých neurotrofinů byla také sledována úroveň mRNA pro trkA, B a C. U kontrolních DRG, odebraných z krysích embryí E14 je možno prokázat mRNA pro trkA, B a C, jak je zřejmé z obr. 13ra 19. Jak je znázorněno na obr. 18A, bylo u ganglií, inkdbovaných v přítomnosti 50 ng/ml NGF možno prokázat značnou úroveň mRNA pro trkA, avšak nebylo možno prokázat mRNA pro trkB, jak je zřejmé z obr. 13B. Na druhé straně u ganglií, inkubovaných v přítomnosti 50 ng/ml BDNF bylo možno prokázat značné množství mRNA pro trk^ jak je zřejmé z obr. 19B, avšak velmi malé množství tohoto materiálu pro trkA, jak je zřejmé z obr. 19A a žádný materiál pro trkC, jak je zřejmé z obr. 19C. Konečně po působení 50 ng/ml NT-3 bylo možno v gangliích prokázat značné množství mRNA pro trkC a trkA, avšak velmi nízké množství tohoto materiálu pro trkB. Tyto výsledky prokazují, že populace nervových buněk, která v přítomnosti těchto neurotrofinů přežívá obsahuje specific<
ké raceptory pro každý z uvedených neurotrofinů. Znamená to, že po inkubaci s BDNF přežívají pouze neurony, obsahující trkB , kdežto po působení NG7 přežívají pouze neurony, obsahující trkA. Po působení NT-3 patrně přežívají jak neurony, obsahující trkC, tak ty, které obsahují trkA. Skutečnost, že v určitých buněčných typech se nacházejí specifické raceptory pro určité neurotrofiny ukazuje na to, že tyto neurotrofiny je možno užít k podpoře přežití určitých skupin buněk v periferním nervovém systému.
11. Uložení mikroorganismů
Ve veřejné sbírce kultur American Type Culture Collection, ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 2O352..byly uloženy následující mikroorganismy:
číslo pBluescript SK, obsahující Rtk-2 75052 pBluescript SK, obsahující Rtk-3 75053
Vynález nemá být omezen na popsaná specifická provedení. Je zřejmé, že by bylo možno uskutečnit ještě řadu modifikací rovněž spadajících do rozsahu vynálezu. '

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY v y
    i) ii)
    1. Způsob detekce a měření účinnosti neurotrofinu, značující se t í m , že se buňka, u níž dochází k expresi trkB vystaví působení zkoumaně látky, načež se prokáže nebo měří specifická vazba zkoumané látky na trkB, která je v positivní korelaci s účinností neurotrofinu.
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že buňka obsahuje rekombinantní gen s kódovým řetězcem pro trkB.
  3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že buňka dále obsahuje referenční gen pod řízením časného promotoru genu.
  4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že buňka jako časný promotor obsahuje promotor fos.
    ) ·
  5. 5. Způsob podle nároku 3,vyznačující se t í m , že buňkajako časný promotor obsahuje promotor jun.
  6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se specifická vazba zkoumané látky na trkB prokazuje nebo měří průkazem nebo měřením vazby zkoumané látky na povrch buňky.
  7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se specifická vazba zkoumané látky na trkB prokazuje nebo měří průkazem nebo měřením schopnosti této látky zesítit trkB ve formě bílkoviny.
  8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se specifická vazba zkoumané látky na trkB prokazuje nebo měří průkazem nebo měřením schopnosti kompetice se značeným neurotrofinem o vazbu na trkB.
  9. 9. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se specifická vazba zkoumané látky na trkB proka zuje nebo měří průkazem nebo měřením sekundárních biologických účinků vazby neurotrofinu na trkB.
  10. 10. Způsob podle nároku 9,vyznačující se tím, že sekundárním biologickým účinkem je růst nervových vláken.
  11. 11.
    tím, že ho genu.
    Způsob podle nároku 9, vyznačujíc sekundárním biologickým účinkem je indukce í se časné12. Způsob identifikace látky s účinkem neurotrofinu, vyznačující se tím, že se
    i) buňka, u níž dochází k expresi trkB vystaví působení zkoumané látky a t » ii) prokazuje se specifická vazba zkoumané látky na trkB, která je v positivní korelaci s účinkem typu neurotrofinu.
    13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m , že buňka obsahuje rekombinantní gen s kódovým řetězcem pro trkB.
    14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se t í m , že buňka dále obsahuje referenční gen pod řízením časného promotoru genu.
    15. Způsob podle nároku 14,vyznačující se t í m , že buňka jako časný promotor obsahuje promotor fos.
    15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že buňka jako časný promotor obsahuje promotor jun.
    17. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m , že se specifická vazba zkoumané látky na trkB prokazuje nebe měří průkazem nebo měřením vazby zkoumané látky na buněčný povrch.
    18. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m, že se specifická vazba zkoumané látky na trkB prokazuje nebo měří průkazem nebo měřením schopnosti této látky zesítit bílkovinu trkB.
    19. Způsob podle nároku 12, vyznačující se t í m , že specifická vazba zkoumaná látky na trkB se prokazuje nebo měří průkazem nebo měřením schopnosti kompetioe této látky se značeným neurotrofinem o vazbu na trkB.
    20. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím , že se specifická vazba zkoum&né látky na trkB prokazuje nebe měří průkazem nebo měřením sekundárního biologického účinku vazby neurotrofinů na trkB.
    21. Způsob podle nároku 20,vyznačující se tím, že sekundárním biologickým účinkem je tvorba nervových vláken.
    22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že sekundárním biologickým účinkem je indukce časného genu.
    s e ván
    23. Způsob podle nároku 20, vyznačující tím, že sekundárním biologickým účinkem je přežíbuněk.
    24. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t í m , že sekundárním biologickým účinkem je proliferace buněk.
    25. Způsob podle nároku 20, vyznačuj ící se t i m , že sekundárním biologickým účinkem je transformace buněk.
    26. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že sekundárním biologickým účinkem je fosforylace trkB.
    27. Způsob detekce nebo měření účinnosti neurotrofinu vyznačující se tím, že se
    i) zkoumaná látka uvede in vitro dojštyku s bílkovinou trkB za podmínek, při nichž může dojít k vazbě a ii) prokáže se vazba zkoumané látky na bílkovinu trkB, která je v positivní korelaci s neurotrofinovým ne» . · bo podobným účinkem.
    28. Způsob podle nároku 27, vyznačuj íc 1 se t i m , že se zkoumaná látka uvede do styku s bílkovinou trkB, vázanou na pevný nosič.
    29. Způsob identifikace látky s neurotrofinovým účinkem, vyznačující se tím, že se
    i) zkoumaná látka uvede in vitro do styku s bílkovinou trkB za podmínek, při nichž může dojít k vazbě a ii) prokáže se vazba zkoumané látky na bílkovinu trkB,
    která je v positivní korelaci s neurotrofinovým nebo podobným účinkem.
    30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se t í m , že se zkoumaná látka uvádí do styku s bílkovinou trkB, vázanou na pevný nosič.
    31. Buňka, která
    i) ja schopna exprese rekombinantní bílkoviny trkB a ii) obsahuje rekombinantní nukleovou kyselinu s obsahem časného promotoru genu.
    32. Buňka podle nároku 31, v níž promotorem časného genu je promotor fos.
    33. Buňka podle nároku 31, v níž promotorem časného genu je promotor jun.
    34. Buňka podle nároků 31, 32 nebo 33, odvozená od buněčné linie FC12.
    35. Buňka podle nároků 31, 32 nebo 33, odvození! od » ' buněčné linie NIH3T3.
    36. Buněčná linie podle nároku 27, dále obsahující kódový gen pro rozlišitelné označení, schopný exprese pod řízením časného promotoru genu.
    37. Buněčná linie fibroblastů, závislá v prostředí, prostém séra na přítomnosti růstového faktoru a obsahující kódovou rekombinantní nukleovou kyselinu pro trkB.
    38. TrkB deficientní buňka, získaná inaktivací endogenního genu pro trkB homologní rekombinací.
    89 až90
    39. Účinná látka, tvořená v podstatě čistou giplekulou. i čištěnou způsobem podle nároku 12.
    40. Způsob klonování alespoň části genu pro receptor tyrosinkinázy, vyznačující se tím, že se
    i) amplifikuje kódový řetězec nukleové kyseliny pro tyrosinkinázu pomocí PCR-reakce při použití směsi cDNA molekul jako matrice a při použití oligonukleotidových primerů, odpovídajících oblastem ve známé molekule tyrosinkinázy, přičemž tyto oblasti jsou spojeny s účinností tyrosinkinázy, načež se ii) amplifikovaná nukleová kyselina klonuje při použití příslušného vektoru.
    41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se t í m , že jeden z oligonukleotidových primerů obsahuje po směru exprese genu přiměř s řetězcem, uvedeným pro přiměř 1 na obr. 12A.
    42. Způsob podle nároku 40, vyznačující se. t í m , že jeden z oligonukleotidových primerů obsahuje po směru exprese genu přiměř s řetězcem, uvedeným pro přiměř 2 na obr. 12A.
    43. Žpůsob podle nároku 40, vyznačující se t í m , že jeden z oligonukleotidových primerů obsahuje proti směru exprese genu přiměř s řetězcem, uvedeným pro přiměř 3 na obr. 12A.
    44. Způsob podle nároku 40, vyznačující se t í m , že jeden z oligonukleotidových primerů obsahuje proti směru exprese genu přiměř s řetězcem, uvedeným pro primer 4 na obr. 12A.
    45. Způsob podle nároku 40, vyznačující se t í m , že jeden z olidonukleotidových primerů obsahuje proti směru exprese genu primer s řetězcem, uvedeným pro primer 5 na obr. 12A.
    SI
    46. Způsob podle nároku 40,vyznačující se t í m , že oligonuklaotidové primary jsou tvořeny párem primářů trk-9 a trk-lOr z tabulky II.
    47. Způsob podle nároku 40,vyznačující se t í m , že oligonukleotidová primery jsou tvořany párám primerů trk-5 a trk-lOr z tabulky II.
    48 . Způsob podle nároku 40, vyznačující se t í m , že oligonuklaotidové primery jsou tvořeny párem primerů trk-9 a trk-6r z tabulky II.
    49 . V podstata čištěná nuklaová kyselina, klonovaná způsobem podle nároku 40, 41, 42, 43, 44, .45, 46, 47 nebo
    48.
    50. V podstatě čištěná rekombinantní molekula nukleové kyseliny, tvořená řetězcem nukleové kyseliny, klonovaným způsobem podle nároku 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48
    51. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr. 12C uveden pro Rtk-1 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleových kyselin.
    52. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr.
  12. 12C uveden pro Rtk-6 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleových kyselin.
    53 . V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr.
    12C uveden pro Rtk-7 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleových kyselin.
    54. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr. 12C uveden pro Rtk-3 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleových kyselin.
    55. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr. 12C uveden pro Rtk-9 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleových kyselin.
    56. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr.
  13. 14 uveden pro Rtk-2 nebo jeho část, obsahující alespoiě deset zbytků nukleových kyselin.
    57.V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr.
  14. 15 uveden pro Rtk-3 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleové kyseliny.
    58. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr. 13B uveden pro Rtk-4 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleové kyseliny.
    59. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, obsahující řetězec nukleové kyseliny, tak jak je na obr. 13B uveden pro Rtk-5 nebo jeho část, obsahující alespoň deset zbytků nukleové kyseliny.
    60. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 12C pro Rtk-1 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    61.V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 12C pro Rtk-5 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    62. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 12C pro Rtk-7 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    63. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 12C pro Rtk-3 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkč ní ekvivalent.
    64. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 12C pro Rtk-9 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    65. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 14 pro Rtk-2 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    66.. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 15 pro Rtk-3 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    67. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 13B pro Rtk-4 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    63. V podstatě čištěná bílkovina, obsahující řetězec aminokyselin, tak jak je uveden na obr. 138 pro Rtk-5 nebo fragment s obsahem alespoň šesti aminokyselin nebo jeho funkční ekvivalent.
    69. Buňka, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle některého z nároku 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 nebo 59.
    70. Mikroorganismus, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle některého z nároků 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 nebo 59,
    71. V podstatě čištěná molekula nukleové kyseliny, tvořená kódovým řetězcem pro bílkovinu podle některého z nároků 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67 nebo 68.
CS932237A 1991-04-23 1992-04-23 Method of detecting and measuring activity of neurotrophins, method of cloning a gene for tyrosinkinase and a recombinant molecule of nucleic acid, cell, micro-organisms and protein thereof CZ223793A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69019991A 1991-04-23 1991-04-23
US73655991A 1991-07-26 1991-07-26
PCT/US1992/003376 WO1992018149A1 (en) 1991-04-23 1992-04-23 Assay systems for neurotrophin activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ223793A3 true CZ223793A3 (en) 1994-08-17

Family

ID=27104557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS932237A CZ223793A3 (en) 1991-04-23 1992-04-23 Method of detecting and measuring activity of neurotrophins, method of cloning a gene for tyrosinkinase and a recombinant molecule of nucleic acid, cell, micro-organisms and protein thereof

Country Status (19)

Country Link
EP (2) EP1001024B1 (cs)
JP (1) JPH06509413A (cs)
AT (2) ATE336576T1 (cs)
AU (1) AU676664B2 (cs)
CA (1) CA2109100A1 (cs)
CZ (1) CZ223793A3 (cs)
DE (2) DE69232496T2 (cs)
DK (1) DK0589961T3 (cs)
ES (1) ES2170056T3 (cs)
FI (1) FI934701A (cs)
HK (1) HK1024935A1 (cs)
HU (1) HUT66051A (cs)
IE (1) IE921316A1 (cs)
IL (1) IL101661A (cs)
NO (1) NO933819L (cs)
NZ (1) NZ242468A (cs)
PT (1) PT100423A (cs)
SK (1) SK116593A3 (cs)
WO (1) WO1992018149A1 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ242813A (en) * 1991-05-21 1996-09-25 Regeneron Pharma Neurotrophin -4 (nt-4), its use as a pharmaceutical, diagnostic kits, chimeric preproproteins, vectors, recombinant nt-4
JPH07509600A (ja) * 1992-06-12 1995-10-26 リジェネロン　ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ニューロトロフィン−４発現に基づく治療および診断法
JPH07246040A (ja) * 1993-07-06 1995-09-26 Takeda Chem Ind Ltd ニューロトロフィン−３遺伝子が不活性化された胚幹細胞および該遺伝子発現不全動物
US5625121A (en) * 1993-09-02 1997-04-29 Bristol-Myers Squibb Company Mice deficient in nerve growth factor receptors encoded by trkB
US5753225A (en) 1993-12-03 1998-05-19 The Regents Of The University Of California Antibodies that mimic actions of neurotrophins
US7196055B2 (en) 1994-08-31 2007-03-27 Trustees Of Boston University Inhibition of apoptosis in keratinocytes by a ligand of p75 nerve growth factor receptor
US6867179B1 (en) 1994-08-31 2005-03-15 Trustees Of Boston University Methods of inducing hair growth and coloration
US6103689A (en) * 1994-08-31 2000-08-15 Trustees Of Boston University Methods of inducing hair growth and coloration
CZ310798A3 (cs) * 1996-03-28 1999-02-17 Trustees Of Boston University Způsob tlumení aktivace tyrosinasy, upravování pigmentace a identifikace látky, látka zesilující fosforylaci tyrosinasy, látka tlumící fosforylaci tyrosinasy, použití činidla tlumícího fosforylaci tyrosinasy, použití peptidu a použití DNA
AU719038B2 (en) 1996-03-29 2000-05-04 Trustees Of Boston University Methods for diagnosing and treating Alzheimer's disease
GB9807781D0 (en) * 1998-04-09 1998-06-10 Univ Bristol Therapeutic agent
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
EP3204415B1 (en) 2014-10-09 2020-06-17 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4963481A (en) * 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US5231001A (en) * 1991-03-14 1993-07-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Trk tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor
CA2062377A1 (en) * 1991-03-21 1992-09-22 Mariano Barbacid Method for detection of neuroactive substances
US5843749A (en) * 1991-07-26 1998-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ehk and Ror tyrosine kinases

Also Published As

Publication number Publication date
NO933819L (no) 1993-12-20
HU9303012D0 (en) 1994-03-28
CA2109100A1 (en) 1992-10-29
EP1001024A3 (en) 2004-02-18
AU676664B2 (en) 1997-03-20
PT100423A (pt) 1993-08-31
IL101661A (en) 1998-02-08
HK1024935A1 (en) 2000-10-27
JPH06509413A (ja) 1994-10-20
DE69233649D1 (de) 2006-09-28
ATE214733T1 (de) 2002-04-15
DE69232496D1 (de) 2002-04-25
EP0589961A4 (en) 1994-11-02
DK0589961T3 (da) 2002-05-27
ATE336576T1 (de) 2006-09-15
IL101661A0 (en) 1992-12-30
FI934701A (fi) 1993-12-22
FI934701A0 (fi) 1993-10-25
EP0589961B1 (en) 2002-03-20
IE921316A1 (en) 1992-11-04
WO1992018149A1 (en) 1992-10-29
AU2014992A (en) 1992-11-17
SK116593A3 (en) 1994-11-09
NO933819D0 (no) 1993-10-22
NZ242468A (en) 1994-12-22
EP1001024A2 (en) 2000-05-17
EP0589961A1 (en) 1994-04-06
EP1001024B1 (en) 2006-08-16
ES2170056T3 (es) 2002-08-01
HUT66051A (en) 1994-09-28
DE69232496T2 (de) 2002-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5843749A (en) Ehk and Ror tyrosine kinases
FI120313B (fi) TIE-2-ligandit, niiden valmistusmenetelmät ja käytöt
Betsholtz Biology of platelet‐derived growth factors in development
US5814478A (en) Tyrosine kinase receptors and ligands
CZ223793A3 (en) Method of detecting and measuring activity of neurotrophins, method of cloning a gene for tyrosinkinase and a recombinant molecule of nucleic acid, cell, micro-organisms and protein thereof
JPH08502168A (ja) ニューロン細胞においてイオンチャンネル誘導活性をもつ栄養因子
Escandon et al. Characterization of neurotrophin receptors by affinity crosslinking
JP3686084B2 (ja) 生物学上活性なｅｐｈ族リガンド
US6413740B1 (en) Tyrosine kinase receptors and ligands
KR100227240B1 (ko) 섬모형 신경성인자 수용체
US5622862A (en) Assay systems for trkB neurotrophin activity
US5426177A (en) Ciliary neurotrophic factor receptor
EP0533846B1 (en) The ciliary neurotrophic factor receptor
US6316206B1 (en) Method for screening comprising cells expressing the CNTF receptor
EP0767835B1 (en) Denervated muscle kinase (dmk), a receptor of the tyrosine kinase super family
WO1996004389A1 (en) Rtk/cytokine receptor chimeras
DE69632064T2 (de) Neue tyrosinkinase-rezeptoren und liganden
JP2004201693A (ja) 除神経筋キナーゼ（ｄｍｋ）、チロシンキナーゼスーパーファミリーのレセプター
CZ15293A3 (en) Chimeric neurotrophilic factors