SI7510908A8 - Postopek za pripravo klavulanske kisline - Google Patents

Description

Oblast tehnike

Pronalazak se odnosi na postupak za ^bivanje kiseline, novog antibakterijskog aktivnog sredstva izolovanog iz Streptomyces clavuligerus. Ovo novo jedinjenje koje smo označili kao kla-

Pored toga što je antibiotik širokog npextra a srednje jačine, klavulanska kiselina i njene soli imaju spsob nost da pojačaju efikasnost beta-laktamskih antibiotika protiv mnogih bakterija koje proizvode beta-laktamaze.

Tehnički problem

Pronalaskom se rešava problem dobivanja novog antibakterijskog sredstva, klavulanske kiseline, polazeci od streptomyces clavuligerus, i radeči u neutralnim uslovima.

Stanje tehnike

a. Streptomyces clavuligerus je detaljno opisano Higgens et al, Int.

J.Systematic Bacteriology 21 326 (1971). Ova streptomiceta bila je interesantna jer proizvodi izvesne beta-laktamske antibiotike kao što je penicilin N, 7-(5-amino-karboksivaleramido)-3-karbamoiloksimetil-3-cefem-4 -karboksilna kiselina i 7-l5-amino-5-karboksivaletamido)-3-karbamoil-oksimetil-7-iuetoksi-?-cefem-4 -karboksilna kiselina. Streptomiceta je deponovana u Agricultural Research Service Collection kao NRRL 3585 i u American Type Culture Collection kao ATCC 27064. Streptomyces clavuligerus je takodje pomenuta u Patentu Sjedinjenih Država No. 3770590 a takodje i u radovima Hagarajan et al, J.Amer. Chem. Soc., 93 2308 (1971), Brannon et al. Antimicrob. Agents Chomother 1, 237 (1972) i Antimicrob. Agents Chemother.

1, 24ⁿ (1972) i Higens et al, J. Antibiotics, 27, 298 (1974).

b. Beta-laktamaze su onzimi koji otvaraju beta-laktamski prsten penivilina i cefalosporina tako da daju proizvode koji nemaju antibakterijsku aktivnost. Ove enzime proizvode mnoge bakterije, naročito vrste sojeva Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter i Staphylococcus i to je u mnogim slučajevima objašnjenje za otpornost izvesnih sojeva takvih organizama prema penicilinima i cefalosporinima. Važnost proizvodnje beta-laktamaze može se uočiti kada se shvati da veliki broj klinički izolovanih organizama proizvodi beta-laktamaze (vidi, na primer, M.Wilson i I.A. Freeman, Bacteriological Proceedings, 80 (1969) gde su u raau pod naslovom Penicilin Inactivation by Gram-Negative Bacilli pokazali da 84% gramr.egativnih organizama izolovanih u američkim bolnicama proizvodi beta-laktamaze). U mnogim slučajevima, neki penicilini iii cefalosporini neefikasni su za tretiranje bolesti pripisanih organizmima koji ne proizvode beta-laktamaze zbog uobičajene pojave ko-infekcije sa producentom beta-laktamaze /vidi, na primer, R.May et al,- Brit. J.Dis.Chest. 66, 185 (1975)/- Kombinovanjem supstance koja inhibira beta-laktamazu sa penicilinom iii cefalosporinom može se očekivati da se poslednji zaštiti od degradacije bakterijskom beta-laktamazom pa se tako pojačava njihova antibakterijska aktivnost protiv mnogih infektivnih organizama. Ovaj postupak pojačavanja antibakterijske aktivnosti naziva se sinergizmom kada je antibakterijska aktivnost kombinacije znatno iznad prostog zbira aktivnosti dve posebne supstance. Komponenta koja inhibira beta-laktamazu iz smeše zove se sinergist i takve supstance su korisne za povečanje antibakterijske aktivnosti penicilina i cefalosporina protiv rezistentnih organizama. Jedan od ciljeva ovog pronalaska jeste da obezbedi takve sinergiste.

c. Primeri koriščenja izvesnih beta-latkamazno rezistentnih polu-sintetskih penicilina i cefalosporina kao inhibitora beta-laktamaze i sinergista za penicilne i cefalcsporine več su

2.

opisani u literaturi, vidi na primer, Sutherland et al., Nature, 201 868 (1964); Sabth et al., Nature, 204, 1066 (1964); 0'Gallaghan et al., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 1968, 67 (1969). Medjutim, nijedno od ovih poznatih sredstava nema dramatičan efekat na spektar drugog antibiotika prisut.nog u smeši.

d. Opisano je da izvesne kulture aktinomiceta proizvode supstance koje inhibiraju beta-laktamazu, koje dejstvuju sinergetski sa penicilinima iii cefalosporinima, na primer one kulture koje su opisane u Britanskom Patentu No. 1,363.075 i one koje su opisali Hata et al., J.Antibiotics, 25,473 (1972) i Umozava et al., J.Antibiotics, 26 51 (1973) . Nijedan od ovih beta-laktamaznih inhibitora aktinomicetnog porekla dosada nije našao upotrebu na klinici. Naročito vredne karakteristike koje ističu klavulansku kiselinu od drugih beta-laktamaznih inhibitora aktinomicetnog porekla jesu sposobnost nijednog ekstrahovanja u organske rastvarače iz filtrata kulture na pH , njena visoka stabilnost u ljudskoj Tcrvi i široki spektar antibakterijske i beta-laktamazne inhibira j uče aktivnosti, mala molekulska težina i njene visoke R^ vrednosti na papirnoj hromatografiji koriščenjem različitih rastvaračkih sistema.

Opis rešenja tehničkog problema sa primerima izvodjenja

Sada je utvrdjeno da aerobno kultivisanje Strept.omyces clavuligerusu konvencionalnim hranljivim podlogama na oko 25-30 C pod grubo neutralnim uslovima proizvodi supstancu koja inhibira beta-laktamazu koja takodje poseduje antibakterijsku aktivnost. Ovaj novi materijal označili smo sa klavulanska kiselina.

Klavulanska kiselina ima sledeče osobine:

(a) To je karboksilna kiselina.

(b) Obrazuje natrijumovu so koja ima karakterističan infracrveni spektar praktično kao što je prikazan na Sl.

1.

(c) Sposobna je da inhibira rast sojeva

Staphylococcus aureus.

(d) Sposobna je da sinergizuje antibakterijski efekat ampicilina protiv sojeva koji proizvode beta-laktamazu Escherichia coli, Klebsiella aerogenes i Staphylococcus aureus.

(e) Sposobna je da sinergizuje antibakterijski efekat cefaloridina protiv sojeva koji proizvode -laktamazu Proteus mirabilis i Staphylococcus aureus.

(f) Obrazuje metilestra koji ima molekulsku težinu (pomoču masene spektroskopije) 213.0635 što odgovara formuli ^C9^HU^NO5'

Tako se klavulanska kiselina može smatrati monobaznom karboksilnom kiselinom formule ΟθΗ^ΝΟ^ koja u obliku svoje natrijumove soli ima karakterističan infracrveni apsorbcioni spektar praktično kao što je prikazan na Sl. 1. Jedinjenje proizvedeno pomoču Streptomyces clavuligerus koje ima gornje osobine ima formulu (II):

Tako klavulanska kiselina može dobiti ime 3-(beta-hidroksietiliden)-7-okso-4-oksa-l-azabiciklo/?, 2, 0/heptan-2-karboksilna kiselina.

Stereohemija 'na i C kalvulanske kiseline je ista kao kod prirodnih penicilina i cefalosporina tako da se klavulanska kiselina može predstaviti strukturnom formulom (I) :

Tako je potpuniji hemijski naziv klavulanske kiseline Z-(2R,5R)-3-(beta-hidroksiletiliden)-7-okso-4-oksa-l-azabiciklo/3,2,0/heptan-2-karboksilna kis’hna.

Velika korisnost klavulanske kiseline može se lako shvatiti kada se zna da j-k- vsni sojevi Klebsiella aerogenes

A, čiji se rast ne inhibira prisustvom 125 .ug/ml amplicilna, amoksicilina, karbdnicilina iii benzilpenicilina iii prisustvom 10 ug/ml klavulanske kiseline, inhibiraju prisustvom manje od 125 ug/ml prethodno spomenutih penicilina kada je takodje prisutno i 5 ug/ml klavulanske kiseline. Slični rezultati zapazeni su za kombinacije koje sadrže različite estre klavulanske kiseline. Na primer, sojevi Klebsiella aerogenes A, čiji se rast ne inhibira sa 125 ug/ml apmicilina iii sa 10 ug/ml metil estra klavulanske kis· .-line, inhibiraju se sa man je od

12.5 ug/ml amplicilina u prisustvu 5 _/ug/ml metilestra klavulanske kiselihe. Takodje je nadjeno da se sojevi Staphylococcus aureus Rzssel, čiji se rast ne inhibira prisustvom 100 .ug/ml ampicilina iii sa 5 ug/ml klavulanske kiseline, inhibiraju prisustvom man je od 10 ug/ml ampicilina u prisustvu 1 ug/ml klavulanske kiseline. U testovima na ženkama miševa nadjeno je da se nivoi klavulanske kiseline u krvi i tkivu od znatno iznad 5/Ug/ml mogu lako postiči potkožnim davanjem 100 mg/kg natrijumove soli klavulanske kiseline, kao i da se korisni nivoi klavulanske kiseline mogu dobiti posle oralnog davanja 100 mg/kg natrijumove soli klavulanske kiseline.

Prema torne, pronalazak obezbedjuje dobivanje klavulanske kiseline, kao što je ovde rani je opisano, i njenih soli.

Najpodesnije soli klavulanske kiseline su farmaceutski prihvatljive soli kao što su natrijumove, kalijumove, kalcijumove, magnezijumove, aluminijumove, amonijumove i supstituisano amonijum soli kao što se trimetilamonijumska, benzatiinska, prokainska, i slične soli koje se konvencionalno obrazuju sa penicilinima iii cefalosporinima. Farmaceutsko neprihvatljive soli klavulanske kiseline su takodje uključene u obim ovog prcnalaska pošto su korisni intermedijeri za dobivanje estara klavulanske kiseline, i tu spadaju litijumove i soli srebra klavulanske kiseline koje mogu reagovati sa benzilbeomidom tako da obrazuju koristan benzil estar klavulanske kiseline.

Soli klavulanske kiseline su stabilnije od same osnovne kiseline pa tako čine povoljan aspekt ovog pronalaska. Naročito podesne soli klavulanske kiseline uključuju natrijumove i kalijumove soli koje imaju formulu (III), odnosno (IV):

Največim delom priroda bilo kojeg supstituenta u estarskoj vrsti nije važna sve dotle dok ne ometa reakciju hidrigenolize.

Pošto su klavulanska kiselina i njene soli korisni intermedijeri za pravljene poželjnih antibakterijski aktivnih estara prema pronalasku, pronalazak takodje obezbedjuje klavulansku kiselinu i njene soli, kada se oni koriste kao intermedijeri.

Kao što je ranije rečeno, klavulanska kiselina i njene soli imaju vredne terapeutske osobine. Prema torne, mogu se koristiti za farmaceutski preparat koji obuhvata klavulansku kiselinu iii njenu so iii estar zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Preparati uključuju oblike oralnog površinskog iii parenteralnog koriščenja i mogu se primeniti za tretiranje infekcija kod sisara uključujuči ljude.

Podesni oblici preparata uključuju tablete, kapsule, kremove, sirupe, suspenzije, rastvore, prahove koji se mogu rekonstruisati i sterilne oblike za injekcije iii infuzije. Takvi preparati mogu sadržati konvencionalne farmaceutski prihvatljive materijale kao što su razblaživači, vezivna sredstva, sredstva za bojenje, mirisna sredstva, prezervanse, sredstva za dezintegrisanje i slično, sve u saglasnosti sa konvencionalnom farmaceutsk4 om praksom i na način koji je dobro poznat stručnjacima za formulaciju antibiotika.

Preparati klavulanske kiseline iii njenih soli za injekcije iii infuzije su naročito podesni, pošto se mogu postici visoki nivoi u tkivu klavulanske kiseline posle davanja injekcijom iii infuzijom.

Preparati sa jediničnom dozom koji sadrže klavulansku kiselinu iii njenu so, podešeni za oralno davanje, su od posebnog značaja.

Pod odredjenim uslovima, efikasnost oralnih preparata klavulanske kiseline iii njenih soli može se poboljšati ako takvi preparati sadrže sredstvo za puferovanje iii sredstvo za unutrašnje prevlačenje, tako da jedinjenja dobivena prema pronalasku nemaju produženi kontakt sa vrlo kiselim stomačnim sokom. Takvi puferovani iii unutrašnje prevučeni preparati mogu se napraviti u saglasnosti sa konvencionalnom farmaceutskom praksom.

Klavulanska kiselina iii njena so mogu biti prisutni u preparatu kao jedino terapeutsko sredstvo iii zajedno sa drugim terapeutskim sredstvima kao što je beta-laktamski antibiotik. Podesni beta-laktamski antibiotici za takve sinergetske preparate uključuju ne samo one za koje je poznato da su vrlo osetljivi prema beta-laktamazama, več takodje i one koji imaju dobar stepen unutrašnje otpornosti prema -laktamazama. Tako, podesni beta-laktamski antibiotici za preparate ovog tipa obuhvataju benzilpenicilin, fenoksimetilpenicilin, karbonicilin, meticilin, propicilin, ampicilin, amoksicilin, epicilin, tikarcilin, ciklacilin, 6-aminopenicilansku kiselinu, 7-aminocefalosporansku kiselinu, ?-aminodezacetoksicefalosporansku kiselinu, cefaloridin, cefalotin, cefalozolin, cefaleksin, cefoksitin, cefacetri, cefamandol, cefapirin, cefradin, cefaloglicini druge poznate penicilne i cefalosporine iii pro-lekove kao što su hetacilin, metampicilin, acetoksimetil, pivaloiloksimetil iii ftalidil estri benzilpenicilina, amplicilina, amoksicilina iii cefaloglicina iii fenil, tolil iii indanil alfa-estri karabenicilina iii tikarcilina iii slični.

Prirodno, ako penicilin iii cefalosporin koji je prisutan u preparatu nije podestan za oralno davanje, tada če preparat biti podešen za parenteralno davanje.

Kada je prisutna u farmaceutskom preparatu zajedno sa beta-laktamskim antibiotikom, odnos klavulanske kiseline iii njene soli prema prisutnom beta-laktamskom antibiotiku može biti od, na primer, 20:1 do 1:12, češce 10:1, a podesno može biti od 3:1 do 1:3.

Ukupna količina prisutnih antibakterijskih sredstava u bilo kojem jediničnom doznom obliku biče normalno izmedju 50 i 1500 mg, a obično če biti izmedju 100 i 1000 mg.

Preparati se mogu koristiti za tretiranje infekcija, izmedju r .a log, respiratornog trakta, urinarnog trakta i mekih tkiva kod ljudi. Preparati se mogu takodje koristiti za tretiranje infekcija kod domačih životinja kao što je matitis kod stoke. Normalno če se svakog dana tretiranja davati izmedju 50 i 6000 mg preparata iz pronalaska, ali je običnije da se na dan daje izmedju 500 i 3000 mg preparata iz pronalaska. Medjut.im, za tretiranje jakih sistemskih infekcija iii infekcija sa naročito nepomirljivim organizmima, mogu se koristiti više doze u saglasnosti sa kli ničkom praksom.

Tačni oblik preparata zavisiče u izvesnoj meri od mikroorganizma koji se tretira. Za tretiranje kod večine infekcija preparati se normalno podešavaju tako da proizvode maksimalni nivo u krvi od najmanje 0.1 ug/ml, još podesnije od najmanje 0.25 ug/ml, a najbolje od najmanje 1 ug/ml' sinergetika, na primer 2,5-5 ug/ml. sinergetika. '

Penicicilin iii cefalosporin u sinergetskim preparatima če normalno biti prisutan do približno one količine koja se konvencionalno koristi kada je penicilin iii cefalosporin jedino terapeutsko sredstvo koje se koristi za tretiranje infekcije.

Naročito povoljni preparati sadržače od 150 - 1000 mg amoksicilina, ampliclina iii pro-leka i od 50 - 500 mg klavulanske kiseline. iii soli iii njenog estra, koji se hidrolizuje in vi5 vo. a podesnije od 200 - 500 mg amokaicilina, ampicilina iii pro-leka i od 50 - 2 50 mg klavulanske kiseline iii odij. xli njenog estra, koji se hidrolizuje. in vivo.

Materijali prisutni u t.akvim preparatima mogu biti hidratisani, ako je to potrebno. Težine antibiotika u takvim preparatima izražavaju se po osnovi teorijski pristupačnog antibiotika iz preparata, a ne po osnovi težine pro-ieka.

Pronalazak obezbedjuje, kako je več pomenuto, postupak za dobivanje klavulanske kiseline i njenih soli koji obuhvata kultivisanje soja Strepto; y<.es clavuligerus i izolovanje klavuianske kiseline i njenih soli iz podloge kulture i posle toga, ako se želi, obrazovanje slobodne kiseline iii njene soli iii estra.

Najbolje se u postupku prema pronalasku koristi Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 iii njegov visokoprinosni mutant.

Kako se ovde koristi, termin kultivisanje znači slobodni aerobni rast organizma koji proizvodi klavulansku kiselinu u prisustvu izvora ugljenika, azota i mineralnih soli koji se mogu asimilirati. Takav aerobni rast može se vršiti u čvrstom iii polučvrstom hranljivom medijumu iii u tečnoj podloži u kojoj su rastvoreni iii suspendovani hranljivi sastojci. Kultivisanje se može vršiti na aerobnoj površini iii pomoču uronjene kulture. Hranljiva podloga može biti sastavljena od kompleksnih hranljivih sastojaka iii može biti hemijski definisana. Mi smo našli da su naročito podesne podloge koje sadrže kompleksne hranljive sastojke kao što su ekstrakt kvasca, sojino brašno i slično.

Hranljive podloge koje se koriste za kultivisanje Streptomyces clavuligerus sadrže, u intervalu od 0.1 do 10%, kompleksni izvor organskog azota kao što je ekstrakt kvasca, kukuruzna tečnost, vočni protein, protein iz semena, hidrolizati takvih proteina, hidrolizati proteina iz mleka, eksrakti ribe i mesa, i takvi hidrolizati kao što su peptoni. Alternativno, mogu se koristiti hemijski definisani izvori azota kao što su karbimid, amidi, jedna iii smeša uobičajenih aminokiselina kao što su valin, asparagin, glutaminska kiselina, prolin i fenilalanin. Ugljeni hidrat (0.1 - 5%) može se uključiti u hranljive podloge ali je glukoza u izvesnim podlogama nepoželjna pošto ima depresivni efekat na prinos željene klavulanske kiseline. Mogu se koristiti škrob iii škrobni hidrolizati kao što je dekstrin, saharoza, laktoza iii drugi šečeri iii glicerin iii glicerinski estri. Izvor ugljenika meze takodje poticati od vočnih ulja iii životinjskih masti. Karboksilne kiseline i njihove soli mogu se uključiti kao izvor ugljenika za rast i proizvodnju -laktamaznih inhibitora. Naročito podesna jeftina podloga je ona koja sadrži sojino brašno (Arkasoy) plus sušene rastvorne sastojke malta iz destilerije (Scotasol) plus dekstrin.

Dodavanje sredstava protiv penušanja kao što je Pluronic L81 može se pokazati potrebnim za kontrolisanje penušanja izvesnih podloga u fermentima. Mineralne soli kao što su NaCl, M^Cl , ZnCl₂, FeCl^, Na₂SC>₄, MgSC>₄ i Na* iii K soli fosiorne kiseline mogu se dodavati u gore opisane podloge»naročito ako su hemijski definisane^ CaCO^ se može dodati kao izvor Ca jona iii zbog svog puferujučeg dejstva. Takodje se mogu uključiti soli takvih elemenata kao što su nikl, kobalt iii mangan u tragovima. Ako je potrebno mogu se dodati vitamini.

Kako se ovde koristi termin mutant uključuje bilo koji mutantni soj koji nastaje spontano iii dejstvom nekog spoljašnjeg sredstva, bilo da se ono primenjuje slobodno iii na drugi način. Podesni postupci za proizvodnju mutantnih sojeva uključuju metode koje je opisao H.I. Adler u Techniques for the Development of Mico-Crganisms u Radiation and Radioisotopes for Industrial Micro-Organisms, Proceedings of Symposium, Vienna, 19T3, strana 241, International Atomic Energy Authority i ovi uključuju:

i. Jonizujuču radijaciju (kao što su X- i Υ-zrači) , uv svetlosti, uv svetlost plus fotoosetljivo sredstvo (kao što je 8- metoksipsoralen), azotastu kiselinu, hidrcksilamin, analoge piri6 midinskih baza (kao što je 5-bromouracil), akridine, sredstva za alkilovanje (kao što je skačični gas, etil-metansulfonat), vodonikperoksid, fenole, formaldehid, zagrevanje, i ii. Genetske tehnike kao što je rekombinacija, transformacija, lizogenizacija, lizogena konverzija i selektivne tehnike za spontane mutante.

Kultivisanje Streptomyces clavuligerus se normalno vrši u temperaturnom intervalu 15-40°C, obično 20-35°C i najbolje, 25-30°C i na pH izmedju 5 i 8.5, najbolje izmedju 6 i 7.5.

Streptomyces clavuligerus može se kultivisati u gornjim podlogama u staklenim konusnim balonima u kojima se vrši aeracija mučkanjem na rotacionoj mučkalici iii u fermentorima od nerdjajučeg Čelika sa pregradama koji se mešaju sa disk propelerima sa veslima a aeracija se vrši sa prskalicom. Fermentacija se može vršiti na kontinualan način.

Polazni pH fermentacije je obično 7.0 a maksimalan prinos klavulanske kiseline dobiva se u intervalu od 2-10 dana na 20-35 C. U mešanom fermentoru od nerdjajučeg Čelika koriščenjem Arkasoy /Scotasol/ Dext.rin podloge opisane gore, poželjna temperatura je 26 C a vrhunski prinosi klavulanske kiseline dobivaju se unutar 5 dana. Klavulanska kiselina se može ekstrahovati iz filtrata kulture pomoču različitih postupaka. Nadjeno je da su naročito korisni ekstrakcija rastvaračem iz hladnog filtrata kulture podešenog na kisele pH vrednosti i postupci koji su bazirani na anjonskoj prirodi metabolita, kao što je koriščenje anjonskih izmenjivačkih smola. Čelije Streptomyces clavuligerus se obično najpre oavoje iz fermentacije filtracijom iii centrifugiranjem, pre nego što se otpočnu takvi postupci ekstrakcije.

postupku ekstrakcije rastvaračem, filtrat kulture se jako ohladi i pH se snizi na region od pH 2-3 dodavanjem kiseline uz potpuno mešanje sa organskim rastvaračem koji se ne meša sa vodom kao što je n-butilacetat, metilizobutilketon, n-butanol iii etilacetat. Kiselina koja se koristi za snižavanje pH podloge je obično mineralna kiselina kao što je hlorovodonična kiselina, sumporna, azotna, fosforna iii slične kiseline. n-Butanol je naročito podestan rastvarač za koriščenje u ekstrakciji zakišeljenog filtrata kulture. Posle odvajanja faza centrifugiranjem, metabolit koji inhibira beta-laktamazu ekstrahuje se nazad iz faze rastvarača u vodeni natrijumkarbonat iii kalijumbifosfatni pufer, CaCO^ suspenziju iii vodu, uz održavanje pH na približnoj neutralnosti, na primer, na pH 7.0. Ovaj vodeni ekstrakt posle odvajanja faza može se koncentrovati pod smanjenim pritiskom tako da se dobiva sirovi preparat soli klavulanske kiseline. Ovaj preparat je stabilan kada se stokira kao supstanca na -20°C.

U postupku sa anjonsko izmenjivačkom smolom, izbistreni filtrat kulture na približno neutralnom iii neznatno kiselom pK, na primer, pH 6-7, prekolira se niz kolonu od slabe iii jako bazne anjonsko izmenjivačke smole, kao što je Amberlite IR4B iii Zerolit FFIF, sve dok se smola ne zasiti i materijal koji inhibira beta-laktamazu ne izidje sa dna. Kolona se zatim ispere sa vodom i eluira sa vodenim natrijumhloridom. Frakcije koje inhibiraju beta-laktamazu se sakupe, spoje se, oslobode se soli i zamrznu do suva tako da daju sirovu čvrstu so klavulanske kiseline. Amberlite IR 4B je primer slabo bazne anjono-izmenjivačke smole sa poliaminskim aktivnim grupama i unakrst vezanim polistirol-divinil-benzol matricama. Zerolite FFIP je jako bazna anjono-izmenjivačka smola sa kvaternernim amonijum aktivnim grupama i unakrst vezanim polivinil-divinil-benzol matricama. Smole slične Zerolit-u FFIP su Isoper FFIP i DeAcidite FFIP SRA.64. Ove smole su nabavljene od Strane BDH Chemicals Ltd., Poole, Derset, U.K. Jedan alternativni oblik postupka ekstrakcije jeste da se dovede u kontakt filtrat kulture (obično na približno neutralnom pH) koji sadrži so klavulanske kiseline, sa organskom fazom u kojoj je rastvoren amin koji se ne meša sa vodom. Podesni organski rastvarači uključuju takve konvencionalne polarne rastvarače, koji se ne mešaju sa vodom, kao što su metilzobutilketon, trihloroetilen i slični. Podesni amini uključuju sekundarne iii terci.... amine u kojima je jedna od supstituentnih grupa alifatična grupa drugog niza, na primer, sa 12-16 ugljenikovih atoma, a druga je tercijarna alkil grupa, tako da je molekul lipofilan. U našim rukama pokazalo se je da je Amberlite LA2 zadovoljavajuči ami n.

Posle postupka ekstrakcije klavulanska kiselina je prisutna u organskoj fazi kao aminska so. Organska faza se zatim odvoji od filtrata kulture. Klavulanska kiselina se može zatim ekstrahovat.i zad u vodenu fazu povratnom ekstrakijom sa rastvorom soli, najbolje sa koscentrovanim rastvorom natrijumhlorida, natrijumnitrata iii sličnih.

Sirova so klavulanske kiseline može se zatim dobiti suvim zamrzavanjem iii slično.

Drugi primarni postupci za izolovanje ko ji se mogu koristiti uključuju konvencionalne postupke kao što su adsoprcija na ugljeniku, taloženje, ispoljavanje i molekulska filtracija ali ovi postupci obično nisu tako zadovoljavajuči kao gore opisani postupci koji su najpoželjniji.

Dalje prečiščevanje sirovih supstanci dobivenih po postupcima opisanim gore može se postiči pomoču različitih postupaka, ali je hromatografija na koloni sa jonoizmenjivačkom smolom naročito podesna, specijalno kada se koriste Isopor, De-Acidite FFIP SRA64 iii DEAE celuloza. DeAcidite kolona može se postepeno eluirati sa vodenim rastvorom soli kao što je natrijumhlorid (0-0.5M). Kolona sa DEAE celulozom u 0.01M fosfatnom puferu na pH 7 može eluirati sa rastvorom soli, normalno NaCl rastvorom (0-0.2M) NaCl u 0.01M fosfatnom puferu pH?). Aktivne frakcije mogu se detektovati po njihovoj inhibirajučoj beta-laktamaznoj aktivnosti i po njihovoj antibakterijskoj aktivnosti protiv Klebsiella aerogenes u probi difuzije na agaru. Frakcije koje sadrže največi deo ove aktivnosti se zatim spoje i koncentruju na malu zapreminu u vakuumu. Ovaj sirovi preparat soli klavulanske kiseline i soli se prekoliranjem niz kolonu Bio Gel P2. Bio Gel P2 je primer visoko lipofilne smole na kojoj se mogu adsorbovati organski materijali ali koje ne zadržavaju neorganske soli. Bio Gel P2 je poliakrilamid gel primenjen od Strane Bio Rad, 32 and Griffen Avenue, Richmond, Ca 94804, Ih S.A.

Aktivni isoljeni materijal se zatim koncentruje, meša se sa etanolom i dalje hromatografiše na celuloznoj koloni koriščenjem gornje faze sistemima butanol/etanol/voda 4/1/5 v/v, kao rastvarača.

Frakcije koje sadrže materijal koji inhibira beta-laktamazu Escherichia coli se sakupe, upare se do suva u vakuumu, ponovo se rastvore u vodi i zamrznu do suva tako da se dobiva so klavulanske kiseline kao bela supstanca.

Postupci za koje je utvrdjeno da su najkorisniji za detektovanje klavulanske kiseline u filtratima kulture su papirna hromatografija i sistem bioautografskog detektovanja. Klavulanska kiselina se može testirati pomoču njene aktivnosti za inhibiranje beta-laktamaze. Tankoslojna hromatografija može se koristiti za detektovanje klavulanske kiseline u čvrstim preparatima. Ovo detektovanje i postupci testiranja opisani su ovde kasnije.

Opis 1

Podesna proba za detektovanje klavulanske kiseline Princip probe

Rastvori koji sadrže klavulansku kiselinu (filtrat kulture, uzorci iz postupka izolovanja i slično) inkubiraju se 15 minuta sa laktamaznim preparatom u 0.05M fosfatnom puferu na pH 7 i 37 C. U toku ovog vremena, nastaje inhibiranje enzima iii inaktivacija. Tada se doda supstrat (benzilpenicilin) i inkubiranje se produži 30 minuta na 37 C. Količina enzimske degradacije supstrata u penicilinsku kiselinu odredjuje se hidroksilaminskom probom na penicilin. Količina koriščene -laktamaze je takva da daje 75% hidrolizu benzilpenicilina u toku 30 minuta na 37°C.

Obim hidrolize je odraz količine enzima koji je ostao neinhibiran. Rezultati se izražavaju kao procenat inhibiranja enzimske aktivnosti datim raz8 blaženjem rastvora koji sadrži klavulansku kiselinu (npr. filtrat kulture) iii koncentracijom klavulanske kiseline (ug/ml) koja daje 50% inhibiranje enzima pod gore navedenim ušlovima ^(I50>·

Beta-laktamazni enzim

Kao enzim se koristi beta-laktamaza ko ju proizvodi Escgericia coli JT4. Ova kultura je soj rezistentan na ampicilin i svoju otpornost duguje proizvodnji R-faktora kontrolisanog beta-laktamazom.

Kultura koja se održava na hranljivim probama kosog agara inokulira se u

400 ml sterilne Tryptone-ske podloge koja se nalazi u konusnom balonu od litra. Ova podloga ima sledeči sastavs Tryptone (Oxid) 32 g/1, ekstrakt kvasca (Oxid) 20 g/1, NaCI 5 g/1 i

CaCl₂.6H O 2.2 g/1. Konačni pH se podesi na ,.4 sa razblaženim NaOH. Balon o se mucka na 25 C 20 časova na rotacionoj mučkalici pri 240 r.p.m. (obrtaju minutu).

Bakterijske čelije se sakupe centrifugiranjem, isperu se sa 0.05M fosfatnim puferom pH 7 (koji je resuspendovan i centrifugiranj i resuspenduju se u vodi tako da se dobiva čelijska koncentracija 25 puta veča od one u kultivisanoj podloži. Ova čelijska suspenzija se zatim poremeti u MSE ultrasoničnom dezintegratoru na 4 C. Otpaci čelije se uklone centrifugiranjem i alikvoti presičene tečnosti stokiraju se dubokim zamrzavanjem. Za koriščenje u probnom postupku, presičena tečnost se razblaži u 0.05M fosfatnom puferu dok ne daje oko 75% hidrolizu 1 mg/ml rastvora benzilpenicilina u toku 30 minuta na 37 C.

Probni postupak

Podesna razblaženja preparata inhibitora i beta-laktamaznog rastvora mešaju se i inkubiraju na 37 C u toku 15 minuta (Test). Kontrola sa puferom umesto preparata inhibitora takodje se inkubira. Rastvor benzilpenicilina (supstrat) se zatim doda u testiranu i kontrolnu smešu i inkubiranpe se produži dalj ih 30 minuta na 37 C. Zaostali benzilpenicilin u svakoj smeši se zatim proceni koriščenjem hidroksilaminske probe kao sto su opisali Batchelor et al. , Proč. Roy. Soc., B. 154, 498 (1961). 6 ml hidroksilaminskog reagensa doda se u sve testove, kontrole i slepe probe i puste se da reaguju 10 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja 2 ml feriamonijumsulfatnog reagensa. Apsorpcija finalnih rastvora meri se u E.E.L. Colorimeter-u iii Spectrophotometer-u na 490 nm naspram slepe probe reagensa. Sastav reakcije, testova i slepih proba pre hidroksilaminske probe bio je sledeči;

Komponente (sve raatvorene u iii razblažene sa 0.005U pH Ί fosfatnim puferom)	Test	Benzilpenicilin, Slepa proba, ml.	Kontrola	Beagens Slepa proba ml.
Escherioia coli
-laktamazni rastvor	1.9	0.0	1-9	1.9
Raetvor lniibitora	0.1	0.0	0.0	0.0
Benzilpenicilin
5 mS ml.	0.5	0.5	0.5	0.0
0.005— 7·’· 7 fos-
fatni pufer	0.0	2.0	0.1	0.6

Izračunavanje rezultata čunava se na sledeči način;

Procentno inhibiranje -laktamaze obra- Apsorpcija benzilpenicilinske slepe

9.

rcoe minus apsorpcija (neinhibirana reakcija) = x

-ija testa (inhibirana reakcija) minus apsorpcija kontrole (neinhibirana reakcija) = y y

% inhibiranja = - x 100 x

Da se dobije I vrednost, preparat inhibitora se razblažuje dok se u gornjem postupku ne dobije 50% inhibiranje -Taktamazne inaktivacije benzilpenicirina.

vpis 2

Detektovanje klavulanske kiseline hromatografijom na papiru Filtrat kulture i referentni rastvor klavulanske kiseline (250 ug/ml delimično pročiščenog preparata), nanesu se, (20 .ul/ na početku) na Whatman No. 1 paparne trake široke 1 cm. Hromatogrami se realizuju silaznom hromatografijom u toku 16 časova na 5 C koriščenjem sistema n-butanol/izopropanol/voda 7/7^6 kao rastvarača. Trake se suše na 40 C i polože se na agarne ploče koje sadrže 6 ug/ml benzilpenicilina pa se pelcuju sa sojem koji proizvodi beta-laktamazu Klebsiella aerogenes (sinergetski sistem). Ploče se inkubiraju preko noči na .30 C i klavulanska kiselina se pokazuje kao zona inhibiranog rasta. R^ vrednost zone bila je 0.46. Samo 6 .ug/ml benzilpenicilina potrebno je' da ubije Klebsiella aerogenes ali u prisustvu inhibitora beta-laktamaze, ova koncentracija postaje toksična, to jest , javlja se sinergizam.

Koriščenje gornjeg sinergetskog sistema omogučuje da se klavulanska kiselina otkrije pri koncentracijama koje su niže od onih u kojima pokazuje antibakterijsku aktivnost.

Opis 3

Detektovanje natrijumove soli klavulanske kiseline tankoslojnom kromatografij om

Rastvori preparata natrijumove soli klavulanske kiseline nanesu se (5 .ul lmg/ml) na staklene ploče presvucene sa slojem od 0.25 mm silika-gela (F25e’ koji isporučuje E.Merck. Darmstadt, Germany. Hromatogrami se razvijaju na 22 C koriščenjem gornje faze sistema n-butanol/etanol/voda 4/1/5 v/v. Hromatogramske ploče se suše na 40 C i natrijumova so klavulanske kiseline locira se bioautografijom na agarnim pločama koje sadrže 6 ug/ml benzilpenicilina i koje su pelcovane sa Klebsiella aerogenes (sinergetski sistem - vidi gornji odeljak o kromatografiji na papiru). Agarna površina se pokrije sa finom filtar tkaninom pre stavljanja TIC ploče na nju. Pošto se dopusti 15-30 minuta za kvašenje i difuziju, TIC ploča se podigne pomoču filtar tkanine a agarna jploča se inkubira preko noči na 30 C tako da se otkriju zone inhibiranog rasta. R^ vrednost natrijumove soli klavulanske kiseline u gornjem rastvaraču je približno 0.37. Reagensi za prskanje, Ehrlich-ov i trifeniltetrazolijumhlorid, takodje se koriste za otkrivanje zone natrijumove soli klavulanske kiseline. Prvi reagens se sastoji od 300 mg p-dimetilaminobenzaldehida rastvorenog u 9 ml etilalkohola, 54 ml n-butanola i 9 ml koncentrovane HCI. Zagrevanjem prstena TIC ploče na 120 C u toku 1-2 minuta, natrijumova so klavulanske kiseline javlja se kao pink mrlja. Trifeniltetrazolijumhloridni reagens sastoji se od smeše 1 zapremine 4% rastvora ovog jedinjenja u metanolu sa 1 zapreminom metanolnog natrijumhidroksida. Posle j>rskanja, TIC ploče se zagrevaju na 80 C. Natrijumova so klavulanske kiseline javlja se kao crvena mrlja na beloj pozadini.

Primer 1

Kultivisanje streptomyces ciavuligerus Streptomyces ciavuligerus se kultiviše na 26 C na agarnim kosim probama koje sadrže 1% Yeatex (ekstrakt kvasca), 1% glukozu i 2% Oxid agara No. 3, pH 6.8. Sterilna petlja koristi se za transfer miceliuma i spora iz probe u 100 ml tečne podloge u Ehrlenmeyer-ovom balonu od 500 ml. Tečna podloga ima sledeči sastav;

Oxid ekstrakt malta	10	g/i
Oxid bakteriološki pepton	10	9/1
Glicerin	20	9/1
Česmenska voda	1	litar

10.

Podloga se podesi na pH 7.0 s .natrijumhidroksidnim rastvorom i zapremine od 100 ml. prenesu se u balone koji su zatvoreni sa penastim zapušačima pre nego sto ^e autoklaviraju · pri

6,8 kg/2,5 cm u toku 20 minuta. Inokulirani pelcovani balon mucka se 3 dana na 26 C na rotacionoj muckalici sa odbacivanjem od 2 inča i brzinom od 240 o.p.m. Baloni za proizvodnu fazu koji sadrže tečnu podlogu opisanu gore inokuliraju se sa 5% vegetativnog inokulata i kultivišu se pod istim uslovima kao balon za pelcovanje. Uzorci filtrata kulture se testiraju na inhibirajuče dejstvo protiv beta-laktamaze Escherichia coli JT4. Optimalna aktivnost dobiva se posle 3 dana. Rezultati su prikazani u Tablici 1. Zona klavulanske kiseline na R^ 0.46 vidi se kada se filtrat kulture ispita postupkom pomocu hromotografige na papiru, kogi je ranije opisan. Povečanje veličine zone paralelno ge sa povečanjem u probi na inhibiciju beta-laktamaze. Streptomyces clavuligerus se takodje kultiviše u mučkanim balonima od 2 litra koji sadrže 400 ml podloge (proizvodna faza), pri čemu se koriste ista podloga i uslovi za kulturu, kao što je opisano u ovom Primeru. U ovim večim sudovima, rast organizma je bio sporiji pa se optimalna beta-laktamazna inhibirajuča aktivnost postiže 7-9 dana posle inokuliranja sa vegetativnim pelcerom. Rezultati su takodje prikazani u Tablici 1.

T£3LICA 1

-Laktaciacna inhibirajuda aktivnost Streptofnyc83 clavuligerus kultiDisano;? u 500 al. j u balonina od 2000 al.

Ferraentaciono	% Inhibiranja 'i -laktaraaze se Escherichia
vreze		coli pri	finalnora razblaženju od 1/2500
(dani)			filtrata kulture
		iiuckan balon	od. 500 al· iiičkan balon od 2000
	1	15
	2	30	-
	3	55	-
	4	50	10
	5	5!	21
	6	57	36
	7	-	51
	8	-	53
	9	-	50

Primer 2

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Balon za pelcovanje napravljen kao u Primeru 1 koristi se za inokuliranje konusnih balona od 500 ml koji sadrže 100 ml alikvota sledeče podloge u dejonizovanoj vodi:

Rastvoreni škrob 2% w/v

Glicerin 0,3% w/v

Scotasol 0,1% w/v

Arkasoy 1% w/v

FeSO .7HJ 0,01% w/v

L·

Podloga se sterilizuje autoklaviranjem na 15 p.s.i. u toku 20 minuta i inokulira se dodavanjem 5% faze vegetativnog pelcera. Baloni se muckaju na 26 C na rotacionoj muckalici kao u Primeru 1. Optimalan titar klavulanske kiseline postize se unutar 3-5 dana. Razblaženje od 1/2500 filtrata kulture dalo je 60% inhibiranje u probi inhibiranja beta-laktamaze. Zona klavulanske kiseline vidi se na R 0.46 koriščenjem postupka hromatografije na papiru (bili oa ltografije), ko ji je ranije opisan. ?va zona se povečava po veličini zajedno sa povečanjem aktivnosti u probi .1 .ije beta-laktamaze.

/Rastvorni škrob isporučila je British Drug Houses Ltd., Poole, U.K.j Scotasol su sušeni rastvoreni sastojci iz destilerija koje isporučuje Thomas Borthwich Ltd., 60 Viellington Street, Glasgow, UK;

Arkasoy je sojino brašno koje isporučuje British Arkady Co, Old Trafford, Manchester, UK/.

Primer 3

Kultivisanje streptomyces Glavuligerus

Balon za pelcovanje kako je proizveden u Primeru 1 koristi se za inokuliranje konusnih balona od 500 ml koji sadrze alikvote od 100 ml sledeče podloge, ko j a je napravljena u dejonizovanoj vodi i sterilisana kao sto je opisano ranije. Nivo inokulata je bio 5%.

Dekstrin 2% w/v

Arkasoy 1% w/v

Scotasol 0.1% w/v

FeSO.7HO) 0.01% w/v

2 O

Inokulirani baloni se muckaju na 26 C. Optimalna beta-laktamazna inhibirajuča aktivnost postiže se izmedju 3-5 dana. Aktivnost je bila slična sa onom postignutom u Primeru 2.

/Dekstrin isporučuje C P C (UK) Ltd. , Trafford Park, Manchester, UK/

Primer 4

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Faza pelcovanja kao što je opisana u Primeru 1 koristi se inokuliranje konusnih balona od 500 ml ko ji sadrže sledeču podlogu napravljenu u dejonizovanoj vodi.

Dekstroza 1% w/v

Obrok od scjinog brašna 1% w/v

Scotasol 0.05% w/v

CaCO 1% w/v

Ovi Daloni se tretiraju tačno kao u prethodnim Primerima i kultivišu se pod identičnim uslovima. Beta-laktamazna inhibirajuča aktivnost proizvodi se u intervalu od 3-5 dana. Filtrat kulture pri finalnom razblaženju od 1/2500 dao je 35-45% inhibiranje u probi na inhibiciju beta-laktamaze.

Primer 5

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Aktivnost inhibiranja beta-laktamaze koja se može pripisati klavulanskoj kiselini proizvodi se koriščenjem sledeče podloge sa identičnom fazom pelcovanja i uslovima kultivisanja kao u Primeru 1.

Glicerin 2% w/v Obrok od sojinog brašna 1,5% w/v MgSO₄ 0.1% w/v k₂hpo₄ 0.1% w/v Podloga se pravi u dejonizovanoj vodi. Aktivnost inhibiranja beta-laktamaze dostiže maksimalni nivo izmedju 3-5 dana, i bila je sličnog reda sa onom proizvedenom u Primeru 4.

Primer 6

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Sledeča podloga proizvodi klavulansku kiselinu kada se koriste uslovi i inokulat za vegetativno pelcovanje kao što je opisano u Primeru 1.

Glukoza 2%

Lab Lemco (Oxid) 1%

Oxid ekstrakt kvasca 0.3%

CaCO 0.3%

Podloga se pravi u dejonizovanoj vodi. Optimalni titri postižu se za 3-5 dana a 1/2500 razblaženje filtrata kulture dalo je 35-45% inhibiranje u probi za inhibiranje enzima beta-laktamaze.

Primer 7

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Kao u Primerima 4, 5 i 6 sledeča podloga proizvela je 35-45% inhibiranje (1/2500 razblaženje) u beta-laktamaznoj probi pri optimalnom titru koji se dostiže 3-5 dana posle inokuliranja. Svi uslovi bili su kao što je definisano prethodno.

Glukoza 2% w/v

Arkasoy 1% w/v

CaCO^ 0.02% w/v

CoCl₂.6H₂0 0.0001% w/v

Podloga je napravljena u dejonizovanoj vodi.

Primer 8

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Sledeča podloga proizvodne faze kada se koristi pod standardnim uslovima kultivisanja, kao što je opisano u prethodnim Primerima proizvela je 2012.

-30% inhbiranje pri 3/2500 razblaženju beta-laktamaznoj probi u intervalu izmedju 3-5 dana posle inokuliranja. Koriščenjem ranije opisanog postupka za hromatografiju na papiru vide se zona na R^ 0.46, kada se ispituje filtrat kulture.

Scotasol 2% Oxid ekstrakt kvasca 1% Podloga je napravljena u česmenskoj vodi

Finalni pH je 7.0.

Primer 9

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Pod standardnim uslovima kult.ivisania, sledeča podloga proizvela je klavulansku kiselinu 3-5 dana posle inokuliranja sa vegetativnim pelcerom. Razblaženje od 1/2500 kulture dalo je 20-30% inhibiranje u probi na inhibiranje beta-laktamaze.

Glicerin

Saharoza

Prolin

9/1

2.5

Mononatrijum glutamat NaCl K„NPO

1.5

5.0

2.0

0.4

0.1

0.1

0.05

1.0 '2‘ 4 CaCl

MnCl^H 0 FeCK.6H?D ZnCl.

MgSO^.7H₂O Podloga se pravi u dejonizovanoj vodi Finalni pH 7.1.

Primer 10

Kultivisanje streptomyces glavulicjerus Stok Yeatex /glukoza agarna kosa proba koristi se za inokuliranje Yeatex/glukoza agarne kose probe u Roux-ovoj boči pravljenjem suspenzije micelijum/spora u sterilnoj vodi. Kosa proba u Rouxovoj boči unkubira se na 26 C u toku 10 dana. Ovoj kosoj probi doda se 100 ml sterilne vode i napravi se suspenzija micela. Ova se koristi za inokuliranje 50 litara parom sterilisane podloge za pelcovanje sledečeg sastava u česmenskoj vodi.

Oksid ekstrakt malta 1% w/v

Oksid bakteriološki pepton 3% w/v

Glicerin 1% w/v

10% Pluronic L81 antipenušavca u sojinom ulju 0.05% w/v /Pluronic isporučuje Jacobs and Van den Borg UK Ltd., 231 The Vale, London, W3 i sadrži polupropilen-polietilenski blok polimer, a sojino ulje isporučuje British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, U.K./. Podloga se nalazi u fermentoru od nerdjajučeg Čelika sa pregradama od 90 litara, i meša se sa disk propelerima sa veslima od 5 pri 240 r.p.m. Sterilni vazduh se uvodi pri 50 1/min i tank se inkubira na 26°C.

Posle 72 časa, pelcovani fermentor koristi se za inokuliranje 150 litara iste podloge koriščenjem 5% v/v dodavanja pomoču sterilnog transfera. Ova podloga za proizvodnu fazu nalazi se u potpuno pregradjenom fermentoru od nerdjajučeg Čelika od 300 1, koji se meša sa disk propelerom sa veslima od 8 1/2. Sterilni vazduh šaržira se pri 150 1/min. Fermentacija se održava na 26 C. Doda se antipenušavac kada je potrebno u šaržama od 10 ml (10% Pluronic L81 u sojinom ulju). Uzori se odvoje za probu inhibiranja beta-laktamaze, što se čini u pravilnim intervalima. Fermentor se obere izmedju 4-5 dana pri optimalnem nivou aktivnosti inhibiranja beta-laktamaze (Tablica 2) .

TABLICA 2

Aktivnost inhibiranja -laktanaze uzoraka filtrata kulture uzetih iz 300 Litara fermentacije Strontoniyces clavuli^arus

Fermentacija vre-.e (aani) /j Inhibiranja u probi na inhibiranje -laktamaze pri finalnom razblaženju od 1/2500

13.

2.0

2.5 3.0

3.5 4.0

4.5 5.0

56

Priner 11

Kultivisanje streptomyces clavuligerus Fermentor za pelcovanje upravlja se tačno kao što je opisano u Primeru 10 koriščenjem iste podloge.

Posie 72 časa, fermentor za pelcovanje koristi se da obezbedi 5% v/v vegetativnog inokulata za potpuno pregradjeni fermentor od nerdjajučeg Čelika od 300 litara koji sadrži 150 litara parom sterilisane podloge koja se meša sa disk propelerom sa veslima od 21.25 cm pri 210 o.p.m. Fermentacija se održava na 26°C, uz šaržiranje vazduha pri 150 1/min. Antipenušavac se dodaje kada je potrebno u partijama od 10 ml (10% Pluronic L81 u sojinom ulju).

Podloga koja se koristi u proizvodnoj fazi bila je kao sto je opisano u Primeru 3 sa dodatkom 0.05% v/v 10% Pluronic L81/ sojinog ulja kao penušavca pre sterilisanja.

Aktivnost inhibiranja beta-laktamaze fermentacionih uzoraka bila je slična aktivnostima iz Primera 10 (vidi Tablicu 2) . Ispitivanje hromatografijom na papiru otkrilo je zonu klavulanske kiseline na R^ 0.46 koriščenjem biobioautografskog postupka(sinergizam) koji je opisan ranije. Veličina zone klavulanske kiseline povečala se paralelno sa povečanjem u probi za inhibiranje beta-laktamaze.

Primer 12

Kultivisanje streptomyces clavuligerus 100 ml sterilne vode dodaje se u kulturu sa sporama koja je kultivisana na Benett-ovom agaru u Roux-ovoj boči u toku 10 dana na 26 C. Proizvedena je suspenzija micelium/spore i koristi se za inokuliranje 75 litara parom sterilisane podloge sledečeg sastava u česmenskoj vodi.

Dekstrin 2% w/v

Arkasoy 50 1% w/v

10% Pluronic L81 0.03% w/v u sojinom ulju pH sredine podesi se na 7.0.

Podloga se nalazi u fermentoru sa pregradama od nerdjajučeg Čelika od 100 litara, koji se meša sa disk propelerom sa veslima od 18,75 cm, pri 140 o.p.m. Sterilni vazduh uvodi se pri 75 1/minut i tank se inkubira 72 časa na 26°C.

Sadrzaj fermentora za pelcovanje koristi se za inokuliranje 1500 litara parom sterilisane podloge sledečeg sastava u česmenskoj vodi.

Arkasoy 1.5% w/v Glicerin 1.0% w/v KH PO 0.1% w/v 10% Pluronic L81 u 0.2% w/v sojinom ulju pH podloge podesi se na 7.0.

Podloga se nalazi u potpuno pregradjenom fermentoru od nerdjajučeg Čelika od 2000 litara mešanom sa dva disk propelera sa veslima od 47,5 cm pri 106 o.p.m.

Sterilni vazduh šaržira se pri 1200 litara u minutu. Doda se antipenušavac u količinama od 25 ml, kada je to potrebno. Fermentacija se kontroliše na 26 C dok se ne dobije maksimalan prinos klavulanske kiseline i on se dobiva unutar perioda od 3-5 dana, kada se proizvodi 200-300 .ug/ml klavulanske kiseline.

Primer 13

Kultivisanje Strept.omyces clavuligerus Inokulat se proizvodi u balonu za pelcovanje kao što je prethodno opisano, ali koriščenjem podloge opisane u Primeru 3 (sa pH podloge podešene na 7.0). Ovaj se koristi za inokuliranje 500 ml-skih konusnih balona koji sadrže alikvote od 100 ml sledeče podloge napravljene u dejonizovarioj vodi i sterilisane. Nivo inokulata bio je 5%.

Prichem P224 1% w/v

Arkasoy 50 1,5% w/v ^KH2^P°4 0.1% w/v pH podloge podesi se na 7.0. Inokulirani baloni mučkaju se na '26°C i optimalna aktivnost inhibiranja beta-laktamaze postiže se izmedju 3-5 dana. Postižu se nivoi od 300-500 .ug/ml klavulanske kiseline.

Prichem P224 je triglicerid koji isporučuje Prices Limited, Bromborough, Bebington, Wirral, Chesire, U.K. Prichem P224 se bazira na oleinskoj kis. /65%/, palmatinskoj kiselini /11%/ i drugim sličnim kiselinama.

Primer 14

Izolovanje sirove natrijumove soli klavulanske kiseline Obrana tečnost kulture proizvedena kao Sto je opisano u Primeru 10 izbistri se kontinualnim protočnim centrifugiranjem i micelium se odbaci. Od 150 litara fermentacione tečnosti dobiva se 320 litara izbistrenog fluida kulture. Ovaj filtrat dao je .58% inhibiranje u probi inhibiranja beta-laktamaze pri 1/2500. Filtrat se prehladi na 5°C i doda se 40 litara n-butanola. Smeha se meša i dodaje se 25% H^SO^ sve do pH 2.0. Zakišeljena smeš a se meša daljih 10 minuta pre odvajanja faza centrifugiranjem. Vodena faza se odbaci. Doda se n-butanolni ekstrakt 0.5% Norit GSX ugljenika i smeša se meša 15 minuta. Ugljenik se odbaci posle odvajanja filtracijom koriščenjem diatomejske zemlje kao pomagala filtracije. n-But.anolu se doda 3/4 zapremine dejonizovane vode i smeša se meša uz dodavanje 20% NaOH rastvora, sve dok se pH ne ustali na 7.0. Faze se odvoje centrifugiranjem i n-butanolna faza se odbaci. Vodena faza se koncentruje pod smanjenim pritiskom na 800 ml i zatim se zamrzne do suva. Ovako se dobiva 35 g sirovog čvrstog preparata klavulanske kiseline sa i

1.3 .ug/ml u probi na inhibiranje beta- laktamaze. Ovaj čvrst preparat stokira se suv na -20 c dok se očekuje dalje prečiščavanje.

Primer 15

Izolovanje sirove natrijumove soli klavulanske kiseline

Jedan litar filtrata kulture koji daje 53% inhibiranje pri 3/2500 u probi na inhibiranje beta-laktamaze, i koji se dobiva kao što je opisano u Primeru 12 perkolira se niz kolonu od 1 inča prečnika x 6 inča od Permutit Isopere smole FF 1P (SRA 62) u Cl obliku (isporučuje Permutit Co., Ltd., 632-652 London Road, Isle worth, Middlesex, U.K./. Filtrat kulture pračen je sa 300 ml destilisane vode da se kolona ispere. Eluiranje aktivnog inhibitora beta-laktamaze postiže se sa 0.2M NaCI rastvorom. Sakupe se frakcije (20 ml) i isprobaju se pri 1/2500 razblaženju u probi na inhibiranje beta-laktamaze. Aktivne frakcije se spoje i koncentruju se u vakuumu na 20 ml. Ovaj rastvor se oslobodi soli pomoču gel hromatografije na Biorad Biogel P2 koloni prečnika 3,75 cm, sa ležištem gela od 16 inča i eluira se sa 1% n-butanolom u vodi. /Biogel P2 isporučuje Bio Rad Laboratories, 32 nd and Griffin Ave., Richmond, California, U.S.A./ Aktivne, frakcije, a to se pokazuje u probi na inhibiranje beta-laktamaze, se spoje. Natrijumhlorid eluira se posle klavulanske kiseline i odredjuje se koriščenjem rastvora natrijumhlorida. Spojene aktivne frakcije se koncentruju i zamrznu do suva.

Jedan litar filtrata kulture posle gornjeg tretiranja daje 0.45 g sirovog čvrstog preparata klavulanske kiseline koja ima Ι^θ 0.92 .ug/ml. θ

Ova supstanca stokira se na -20 C dok se očekuje dalje prečiščavanje.

Primer 16

Izolovanje sirove natrijumove soli klavulanske kiseline Filtrat kulture koji sadrži 300 ug/ml klavulanske kiseline zakiseli še koriščenjem linijskog sistema za mešanje, ekstrahuje se sa n-butanolom i klavulanska kiselina se ekstrahuje opet sa vodom na neutralnom pH. Prehladjeni filtrat kulture (5-3.O°C) pumpa se ka linijskom mikseru na čijem se ulazu dodaje dovoljno 6% (v/v) azotne kiselipe da se na izlazu održava pH na 2.0 - 0.1. Zakišeljeni filtrat se propušta pri 4.1/min kroz toplotni izmenjivač sa glikolom hladjenom pločom (A.P.V. Ltd.) da se temperatura

15.

ο održava izmed ju 2 - 5 C. pH se regis^: ruje u protočnoj čeliji pre propuštaitja u trofazni separator suprotnog . ..ja (VJestfalia Separator Ltd., Model EG 1006).

Prehladjena smeša n-butanola zasičenog vodom (na oko 5 C) pumpa se pri 1/min u separator suprotnog strujanja.

Iz laz vode iz separatora suprotnog strujanja vodi se na otpad. Uklopljena voda uklanja se iz isteka butanola iz separatora suprotnog strujanja koriščenjem tečnost/tečnost centrifugalnog separatora. (Alfa Laval Ltd. Model 3024Χ - G) . Butanol se sakupi u sudu od nerdjajučeg Čelika koji je snabdevi?n sa plaštom za hladjenje koji se čuva na oko 5 C.

Iz suda se odvoje alikvoti od 40 1 i potpunc se izmešaju sa 2 1 prehladjene vode (5 C), zasičeno sa n-butanolom. pH ove smeše podesi se na pH 6.8 - 0.1 koriščenje 20% rastvora natrijumhidroksida.

Ova smeša vodeni ekstrakt /butanol šaržira se tečnost/ tečnost centrifugalni separator (Scharples Centrifuge. Ltd., Model Μ35ΡΥ - 5 PH) pri brzini pumpanja od 2 1/min.

Iz 1800 1 filtrata kulture, izoluje se 90 1 vodene faze koja sadrži 39% klavulanske kiseline prisutne u filtratu kulture.

1 vodenog ekstrakta podesi se na od 2% do 8% ukupnih supstanci dodavanjem 60 g natrijumhlorida po litru, i suši se prskanjem (Anhydro, Copenhagen, Type Lab S 1). Uslovi su bili: Brzina šaržiranja 2 1/čas; Voltaža atomizera 170 v; Položaj grejača 6-7^ ulazna temp. 150 C; Izlazna temp. 80 C.

Sušeni proizvod, ukupna težina 1 kg, sadržao je 62% klavulanske kiseline prisutne u stoku za šaržiranje. Zaostalih 75 1 vodenog ekstrakta koncentruje se ultracentrifugiranjem (De Danske Sukkerfabrikker, Laboratory Module, Membrane Type 900). Operativni postupak je bio da se recirkuliše retenat iz tanka od nerdjajučeg Čelika, koji je opremljen sa sistemom za hladjenje, pri čemu je izlazni ventil tako postavljen da se dobije diferencijalni pritisak duž 40 membrana od 25 atmosfera. Temperatura se održava na 2 - 5 C apH na 6.8 -0.1 dodavanjem 2H hlorovodonične kiseline, kada je potrebno. Zapremina se smanji na 34 1 koji sadrže 72% klavulanske kiseline prisutne u stoku za šaržiranje.

Vodeni koncentrat stokira se na oko o

C, podesi se na 8% čvrstih supstanci, i suši se prskanjem kao gore. Sušeni materijal sadrži 75% klavulanske kiseline prisutne u stoku za šaržiranje sušača.

Ukupni prskanjem sušen proizvod iz 90 1 vodenog ekstrakta sadržao je

69.4 g klavulanske kiseline, a to je 72% od klavulanske kiseline u stoku za šaržiranje sušača i 21% od klavulanske kiseline prisutne u 1800 1 filtrata kulture.

Primer 17

Delimično prečiščavanje sirove klavulanske kiseline

Sirovi preparati klavulanske kiseline dobiveni kao što je opisano u Primeru

5 prečiščavaju se jonoizmenjivačkom hromatografijom. Gsamnaest. grama materijala napravljenog kao što je opisano u Primeru 15 koji ima I vrednost 5 V

1.3 ug/ml (finalna koncentracija) rastvori se u 25 ml destilisane vode i aplicira se na 3,75 x 40 cm ležište Permutit FF 1P (SRA 62) smole u hloridnom obliku. Kolona se eluira postepeno sa natrijumhloridom, tako što se šaržira 0.5M natrijumhlorid u mešoviti rezervoar koji sadrži 1 litar destilisane vode, pa se odatle vrši šaržiranje kolone. Sakupijaju se probe od 10 ml i aktivnost inhibiranja beta-laktamaze testira se koriščenjem 1/2500 razblaženja frakcija. Aktivnost se eluira posle glavne bojene trake izmedju frakcija 24 i 30. Aktivne frakcije se spoje i koncentruju na 30 ml.

Ovaj rastvor se oslobodi soli koriščenjem 2 x 18 sloja Biorad Biogel P2 i eluiranjem sa 1% n-butanolom u vodi. Frakcije od 20 ml se testiraju na klavulansku kiselinu koriščenjem probe na inhibiranje beta-laktamaze. Frakcije se takodje nanesu na papirne trake i prskaju se bilo sa Ehrlich-ovim bilo sa trifeniltetrazolijum reagensima za prskanje kao što je opisano u Opisu 3. Aktivnost inhibiranja beta-laktamazekoreliše se sa pink iii crvenim mrljama koje proizvode ovi reagensi. Aktiv16.

ne probe se spoje, isključe se one koje sadrže natrijumhlorid, i koncentruju se u vakumu do suva. Tako se dobiva 520 mg delimično prečiščene natrijumove soli klavulanske kiseline sa I 0.2 ug/ml u standardno j probi na inhibiranje beta-laktamaze. Tarkoslojna hromatografija (silika-gel) ovog preparata klavulanske kiseline dala je sledeče R_f vrednosti: n-butanol/etanol/voda 4:1:5 v/v gornja faza 0.37; n-butanol/sirčetna kiselina/voda 12:3:5 v/v R^ 0.44; izopropanol/voda 7:3 v/v R^ 0.^8. Zone se detektuju prskanjem sa Ehrlich-ovim reagensom. 6-Aminopenicilanska kiselina hromatografisana je kao marker i detektovana je sa istim reagensom pa je imala R^ vrednosti 0.38; 0.39, odnosno 0.77.

Primer 18

Delimično prečiščevanje natrijumove soli klavulanske kiseline Filtrat kulture proizvedene kao što je opisano u Primeru 12 ekstrahuje se rastvaračem kao u Primeru 14 tako da se dobiva čvrst preparat koji se dalje prečiščava jonoizmenjivačkom hromatografijom koriščenjem Whatman diethylaminoethyl cellulose DE 52. Ova supstanca (10 g) se rastvori u 20 ml destilisane vode i nanese se na 3,75 x 40 cm kolonu DE 52 celuloze, ko ja je. prethodno ekvilibrisana sa 0.01 M natrijumfosfatnim pufercm pH 7.5. Kolona se eluira sa NaCl gradientom. 0.1M NaCl u 0.01M natrijumfosfatnom puferu 7.5 saržira se u komoru za mešanje koja sadrži 1 litar 0.01M fosfatnog pufera, koja se tada poveže sa kolonom. Sakupe se frakcije (10 ml) testiraju se na aktivnost inhibiranja -laktamaze pri razblaženju od 1/2500. Frakcije se takodje ispitaju na antibakterijsku aktivnost koriščenjem metoda sa rupicom u ploči i koriščenjem ploča sa hranljivim agarom pelcovar.ih sa Klebsiella aerogenes. Frakcije koje imaju najvišu aktivnost inhibiranja beta-laktamaze i koje daju zone inhibiranja u testu sa pločom sa rupicom se spoje, koncentruju se i zatim se oslobode soli na Eicrad Biogel P2 koloni. Pokazano je de ove frakcije sadrže klavulansku kiselinu papirnom i tankcslojnom hromatografijom.

Primer 19

Izolovanje čvrste natrijumove soli klavulanske kiseline

Delimično prečiščen čvrst preparat klavulanske kiseline (500 mg) napravljen kao u Primeru 17 saržira se na Whatman mikrokristalnu CC 31 ceiuloznu kolonu sa 2,5 x 40 cm veličinom ležišta. Hromatografski zatvarač bio je n-butanol/etanol/voda 4:1:5 v/v, gornja faza. Kolona se hromatografiše na 4 C i sakupijaju se frakcije od 4 ml. Frakcije se testiraju na prisustvo klavulanske kiseline nanošenjem na filter papir i prskanjem sa Ehrlich-ovim (pink mrlja) iii trifeniltetrazolijum (crvena mrlja) reagensima za prskanje. Ovi testovi sa mrljama potvrdjeni su probama na inhibiranje beta-laktamaze pri 1/2500 razblaženju. Aktivne frakcije se spoje i suše se u vakuumu na rotacionom isparivaču. Supstanca se rastvori u maloj zapremini vode (destilisana) i zamrzne se do suva. Dobiva se beli čvrst preparat natrijumove soli klavulanske kiseline (40 mg) koji ima I 0.08 /Ug/ml u probi na inhibiranje beta-laktamaze.

Primer 20

Izolovanje čvrste natrijumove soli klavulanske kiseline

Koncentrovani povratni ekstrakt (6 1) (iz ultrafiltracije u Primeru 16) sadrži 10 g klavulanske kiseline kao što je odredjeno · probom na inhibiranje beta-laktamaze kao u Opisu 1. Ovaj se prekolira pri 1 1/čas na 5 x 60 cm koloni od Permutita Zerolit FF 1 P SRA 62 anjonske izmenjivacke smole u hloridnom obliku. Kolona se zatim ispere sa 2 1 dejonizovane vode pre eluiranja sa natrijumhloridnim gradientom. Gradient se pravi pomocu rezervoara koji sadrži 4 1 1.4 m NaCI punjenjem mešanog rezervoara koji sadrži 4 1 0.7 NaCl koji je pomešan sa mešanim rezervoarom koji sadrži 4 1 dejonizovane vode koji je preko pumpe spojen za kolonu. Kolona se eluira pri 2.5 ml/min i sakupe se frakcije od 25 ml. Frakcije se testiraju pomocu probe na inhibiranje beta-laktamaze.

17.

Aktivne frakcije (No. 140-230) se spoje i upare se u vakumu skoro do suva. Zatim se doda etanol (500 ml) i supsLaiica se profiltruje posle snažnog muckanja. Etanolni ekstrakt se zatim upari u vakuumu do suva na rotacionom uparivaču i ponovo se rastvori u dejonizovanoj vodi (40 ml) . Ovaj rastvor se šaržira na 10 x 60 cm kolonu od Biorad Biogel P^ i eluira se sa 1% n-brtanolnim rastvorom. Frakcije se sakupe (25 ml) i testiraju na aktivnost inhibiranja beta-laktamaze pri 1/2500 finalnom razblaženju. Koriščeni su testovi na sadrzaj natrijumhlorida pri 1/25 razblaženjima frakcija, upoi „eboni srebronitratnog rastvora. One frakcije koje sadrze klavulansku kiselinu bez natrijum hlorida se spoje, koncentruju se uparavanjem rastvarača pod smanjenim pritiskom na 20 ml i zatim se zamrznu do suva. Ovako se dobiva 4.8 g natrijumove soli klavulanske kiseline. (I oko 0.06 .ug/ml).

/

Primer 21

Antibakterijski spektar klavulanske kiseline

Antibakterijska aktivnost natrijumove soli klavulanske kiseline naspram širokog intervala bakterija odredjena je koriščenjem mikrotitarskog postupka. Serijska razblaženja natrijumove soli klavulanske kiseline u Oxoid čorbi za_ testiranje osetljivosti, koja se nalazi u mikrotitarskom plastičnem sudu, inokulirana su sa prekonočnom čorbom kulture svakog organizma tako da je finaln^) razblaženje inokulata 0.5 x x 10 . Kulture se inkubiraju preko noči i tačke bakterijskog rasta registruju se sledečeg jutra zapažanjem mutnila kulture. Rezultati, izraženi kao približno NIC vrednosti (minimalna inhibirajuča koncentracija ug/ml) dati su u Tablici 3 koja pokazuje da jedinjenje ima široki spektar antibakterijske aktivnosti.

soli klavulanske kiseline

Bakterijski soj Minimalna inhibirajuča koncentracija ug/ml

Staphylococcus aureus
(Oxford H) Staphylococcus aureus	7.5
(Russel)	7.5
Bacillus suptilis	62
Streptococcus faecalis	500
Streptococcus pyogenes CN 10	125
Escherichia coli NCTC 10418	31
Klebsielia aerogenes	31-62
Klebsielia oxytocum	62
Enterobacter aerogenes T 624	31
Enterobacter cloacae	62
Acinetobacter anitratus	125
Providentia stuartii	125
Serratia marcescens	125
Proteus mirabilis C977	62
Prote us vulgaris W090	31
Salmonella typhimurium	31
Shigella sonnei	62
Pseudomonas aeroginosa A	500

Primer 22

Primeri inhibiranja beta-laktamaze pomoču natrijumove soli klavulanske kiseline

Klavulanska kiselina progresivno i ireversno inhibira beta-laktamazu Escherichia coli. Postupak iz Opisa 1 pokazuje dasui druge beta-laktamaze prikazane u Tablici 4 takodje inhibirane sa klavulanskom kiselinom.

Tablica 4

Inhibiranje beta-laktamaza klavulanskom kiselinom

Izvor beta-laktamaze Približno I vrednost u odnosu na Escherichia coli JT 4 = 1

Tablica 3

Antibakterijski spektar natrijumove

Staphylococcus aureus (Russel) 1.0 Escherichia coli JT 4 1.0 Escherichia coli Bil 2.0 Klebsielia aerogenes A 0.6

18.

Pseudomonas aerogunosa 1822 (R faktor) 5.0

Pseudomonas dalgieish 0.1

Sa penicilinom G kao supstratom natrijumove soli klavulanske kiseline protiv beta-laktamaze Staph. auereus (Russell) je približno 0.06 ^ug/ml. Primer 23

Antibakterijski sinergizam izmedju ampicilina i natrijumove soli klavulanske kiseline

Minimalna inhibirajuča koncentracija (M.I.C. vrednosti) ampicilina, natrijumove soli klavulanske kiseline i ampicilina u prisustvu 1 ug/ml natrijumove soli klavulanske kiseline odredjene su za različite bakterije koje proizvode beta-laktamazu. Organizmi su inokulirani u Oxoid čorbi za testiranje osetljivosti koja se nalazi u malim otvorima u plast.ičnom sudu i koja sadrže posebne gradiente koncentracije ampicilina, natrijumove soli klavulanske kiseline iii ampicilina plus 1 ug/ml natrijumove soli klavulanske kiseline (mikrotitaski postupak). Preko noči dobiveno finalno r^blaženje inokulata bilo je 0.5 x 10 . Sud se inkubira na 37 C preko noči i sledečeg jutra beleže se krajnje tačke bakterijskog rasta. M.I.C. vrednosti u ,ug/ml date su u Tablici 5 koja otkriva da sinergist. pri niskoj koncentraciji od 1 ug/ml značajno pojačava antibakterijsku aktivnost ampicilina protiv izvesnih gram + ve i gram + ve bakterija. Mehanizam ovog sinergizma verovatno uključuje inhibiranje beta-laktamaznih enzima koji uništavaju ampicilin, ali se poštojanje drugih mehanizama ne može isključiti.

Slični rezultati sa onima prikazanim u Tablici 5 dobiveni su kada je ampicilin zamenjen sa amoksicilinom iii sa ftalidil estrom ampicilina.

TA3LICA 5

ANTIBAKTERIJSKI SIN3SCIZAH IZMEDJU 7J.IPICILINA I NATRIJUMOVE

SOLI KLAVULANSKE KISELINE

Bakterijski soj	Minimalne inhibira.iuče koncentracije /ur/ml.
Natrijumova klavulanske seline	so ki-	Ampicilin	Ampicilih u.prisustvu 1 /ug/ml natrijumbve soli klavulanske kiseline
Escherichia coli
NCTC 10481	31		1.8	< 0.4
Zsckerccbin coli
3 11	62		/500	125
Klebsieiln re7c.~cr.e3 Λ	31		125	< 0,4
Klebaiella on 62	31		125	< 0.4
Σ n ΐ e 7 e r e t e r c 1 o c. c r e	62		250	62
Se77 ··) ”7*c e sc e r.3	125		500	62
StanhvSecoccus aureus
(Russell)	15		/500	< 0.4
methicillin 7ezictanten	soj
S t anhva oc oc cu s au reu s	62		250	7-5
rcethicillin rezictantan	soj

Primer 24

Antibakterijski sinergizam izmedju cefaloridina i natrijumove klavulanske kisenne

Minimalne inhibirajuče koncentracije cefaloridina, natrijumove soli klavulanske kiseline i cefaloridina u prisustvu 5 /Ug/ml natrijumove soli klavulanske kiseline odredjene su postupkom opisanim u Primeru 23. Rezultati u Tablici 6 pokazuju da se može postiči sinergizam izmedju natrijumove soli klavulanske kiseline i cefaloridina, naročito na soj Staphylococcus aureus (Russell) koji proizvodi beta-laktamazu.

TABLICA 8

ANTIBAKTERIJSKI SINERGIZAM IZMEDJU CEFALORIDINA I NATRIJUMOVE

Rektsrijski soj

Minimalne inhibirajuče koncentracija /ug/ml.

/

Natrijumova so Cefaloridih u klavulanske ki- Cefaloridin prisustvu 5 ηζ/ιΛ .·.

aeline natrijumove to klavulanske kiseline

Proteus

mirabilis 889 \ 500	62	7.5
Stcnhvlccoccus aurois 15	3.1	<0.03 +
(Russell, methicillin rezistantan soj Stznhvlccoccus aureus 62	15	3.7
methicillin rezistantar« soj

Tačka vučenja kada je sir.ergist dodan pri

Ista vrednost dobivena je 1 /ug/ml umesto 5 /ug/ml.

Primer 25 Antibakterijski natrijumove soli sinergizam klavulanske izmedju kiseline

Rezultati predstavljeni u Tablici 7 dobivaju se po postupku opisanem u Primeru 23.

i različitih penicilina

TABLICA 7

ANTIBAKTERIJSKI SINERGIZAM IZMEDJU NATRIJUMOVE SOLI KLAVULANSKE ------- * - - - .......

KISELINE I RAZLIČITIH PENICILINA PROTIV SOJEVA KLEBSIELLA /U^HOGSNES

Amoksiciln Karbenicilin Benzilpenicilin

Soj	sam	+5 /ug/ml sir.ergista	som	+5 /ug/ml sinergista	sam	+5 /ug/ml sinergista
A	500	0.97	500	7.8	250	7-8
E 70	500	3.9	500	'15	500	15.6
62	250	15.6	125	7.8 '	250	15.6

20.

Primer 26

Ekstrakcija klavulanske kiseline koriščenjem tečne jonoizmenjivačke smole

Filtrat kulture (200 ml, dobiven na sličan način kao u Primeru 3 ali koriščenjem podloge ko ja sadrži 0.1% v/v

ΚΗ,,ΡΟ ume s to 0.03% Fe SO ^7 H 0)_ ekstranuje se sa Amberlite LA2 (Cl oblik k 15% v/v u metilizobutilketonu, 66 ml) u toku 30 minuta na 5 C.

Faze se odvoje centrifugiranjem (1660 g 20 minuta) Faza rastvarača (60 ml) izoluje se pipetom i podeli se u četiri jednaka dela. Svaki deo se ekstrahuje mešanjem na 5 C u toku 20 minuta sa 1/4 zapremine (3.75 ml) vodenog ekstraktanta kao što je naznačeno u donjoj Tablici. Dobivena smeša se centrifugira (1660 g, 15 minuta). 3.6 ml vodene faze izoluje se iz svake ekstrakcije .

Uzorak	Zapreraina (ml)	Koncentracija kla.vulanske kiseline (/ug/ml-1)	Klavulanska kiselina (og)
izbistreni var	200	128	25.4
ekstrahovani var	200	15	3.0
11 HaCl ekstrakt	3.6	305	1.1
2U NaCl ekstrakt'	3.6	598	2.5
il KaKDj ekstrakt	3.6	638	2.3
211 ekstrakt	3.6	758	2.73

Rezultat dobiven sa 211 NbNOj predstavlja izolovanje od 41½ od izbistrenog vara.

'Amberlita LA2 nože se dobiti od Rohm and Hass (UK) Ltd.,

Croydon.

Primer 27

Ekstrakcija klavulanske kiseline koriščenjem tečne jonoizmenjivačke smole Izbistreni var (47 litara, dobiven kao u Primeru 12) ekstrahuje se sa Amberlite LA2 (acetatni oblik, 15% v/v metilizobutilketonu, 12.5 litara) mešanjem u toku 1 časa na 17 C. Posle dodavanja oktan-l-ola (500 ml) faze se odvoje u centrifugi sa kontinualnim protokom tako da se dobiva 9.2 litara faze rastvarača, koja se zatim meša na 5 C u toku 1 1/2 časa molarnim natrijumnitratom (2.3, litra). Smeša se odvoji kontinualnim protočnim centrifugiranjem tako da se dobiva 2.4 litra vodene faze (uključujuči vodu koja se koristi za svrhe zamene) pH vodene faze (početno 8.0) podesi se na 7.0 sa koncentrovanom hlorovodičnom kiselinom.

Uzorak	Zaprenina	Koncentracija klavulanske kiseline (/ug/ral-1)	Klavulanska kiselina (mg)
isbistreni var	47	146	6862
ekstrahovani var	47	19	893
U SaSOj	2.4	1638	3931

Zfikasnost ekstrakcije iz izbistrenog vara u natrijuranitratnon ekstraktu je 57%.

21.

Dolivanje natrijum klavulinata enzil klavulinat (840 mg) u etanolu '^qC ml) i vodi (5 ml) hrdrogenizovan ρχ.^κο 10% Pd/C (267 mg) i natrijum bikarbonata (244 mg) tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku. Katalizator je procedjen, ispran sa vodom i etanolom i kombinovani filtrati su upareni na vakuumu. Proizvod kristališe iz smeše voda-acetor u obliku mikro-iglica (565 mg) . aekristalizacija iz voda-acetona je dala iglice koje, posle sušenja preko ^P2°5 ^{na va}^^{uuciu to}k°^m 24 h daju sledeču analizu:

C 4J.01, 40.86; H 3.77, 3.64; N 5.68, • 53; i.r. (KBr disk) 1785, 1700, 1620 cm ; Nmr (DO) 3.06 (d,l,J=18.5Hz) ,

3.57 (dd,l,J =18.5 Hz, J =2.5Hz), 4,15 (d,2,J=8Hz) , 5.3 (HOD), 4.9 (m), 5.71 (d,l,J=2.5Hz).

Claims (4)

1. PATENTNI ZAHTEVI

   1. Postupak za dobivanje klavulanske kiseline formule (I) i njenih farmaceutski prihvatljivih soli, naznačen time, što se soj streptomyces clavulagerus ATCC 27064 (DSM-738) kultiviše na temperaturi u opsegu od 15-40 C, poželjno na 26 C, i pri po lažno j pH vrednosti od 5-8,5, poželjno 7.0, u aerobnim uslovima i hranljivoj podloži koja se sastoji od 0.1-10% mas/zapr. izvora azota, kao štc je ekstrat slada, peptoni iii prolin, od 0.1-5% izvora ugljenika kao štc je škrob, glicerol, dekstrin, sojino brašno, suvi slad, rastvorni destilati, dekstroza, mlevena soja, ekstrakt kvasca, glukoza iii surkoza, i do oko 1% mineralnih soli kao što su CaCO^, MgSO , K HPO , CoCl . NaCl, CaCl_, MnCl₂, FeCl₃, ZnCl₂7 MgS0₄, KH₂PO₄, i kultura filtrira, pri čemu se koncentrat klavulanske kiseline nalazi u filtratu kulture, sto se potom ovaj koncentrat klavulanske kiseline ekstrahuje iz filtrata kulture ekstrakcijom rastvaračem koji se ne meša sa vodom, kao što je n-butanol, pri pH oko 2, i posle razdvajanja faza ponovo ekstrahuje vodenim rastvorom, kao što je razblaženi vodeni rastvor natrijum hidroksida, iii voda, pri neutralnom pH, iii se ekstrahuje pomocu bazne jono-izmenjivačke smole pri približno neutralnom pH, i clavulanska kiselina eluira sa rastvorom neorganske soli kao što je rastvor natrijum hlorida, iii se ekstrahuje pri približno neutralnom pH sa polarnim organskim rastvaračem koji se ne meša sa vodom, kao što je metilizobutilketon i koji sadrži jono-izmenjivačku smolu u tečnom obliku, i posle razdvajanja faza clavulanska kiselina ponovo ekstrahuje sa vodenim rastvorom soli kao što je rastvor natrijum hlorida iii rastvor natrijum nitrata, i što se potom, po· potrebi, vrši prečiščavanje klavulanske kiseline nanošenjem na anjono-izmenjivačku smolu.
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, n a značen time, što je bazna jono-izmenjivačka smola u obliku umreženih polistirol-divinilbenzol matrica u hloridnom obliku.
3. 3. Postupak prema zahtevu 1, n a značen time, što je jono-izmenjivačka smola u tečnom obliku slabo-bazna smola velike molekulske težine sekundarnog amina u slobodnom baznom obliku.
4. 4. Postupak prema zahtevu 1, n a značen time, što je upotrebljena anjono-izmenjivačka smola u stupnju prečiščavanja, anjono-izmenjivačka celuloza kao što je dietilaminoetil celulola i što se eluiranje izvodi sa rastvorom soli kao što je rastvor natrijum hlorida.