SE502820C2 - Filtrering - Google Patents

Description

20 25 30 35 502 820 2 Beskrivning av uppfinningen En avsikt med föreliggande uppfinning, är att kraftigt reducera uppehållstiden vid filtrering av lösningar innehållande makromole- kyler.

En annan avsikt med föreliggande uppfinning, är att kraftigt reducera vätskemängderna vid filtrering av lösningar innehållande mala-omolekyler., En annan avsikt med föreliggande uppfinning, är att reducera behovet av filteryta vid effektiv filtrering av lösningar innehållande makromolekyler.

En ytterligare avsikt med föreliggande uppfinning, är att utbytet av mal En ytterligare avsikt med föreliggande uppfinning, är att reduce- ra polymeriseringen över filterytan varigenom flödet kan ökas och processtiden minskas.

Dessa och andra avsikter uppfylls av föreliggande uppfinning, vilken avser ett sätt att virusfiltrera en lösning innehållande minst en makromolekyl genom att den totala salthalten i lösningen ligger inom intervallet från ca 0,2 M upp till mättnad för saltet ifråga.

Uppfinnaren av föreliggande uppfinning har sålunda funnit att virusfiltrering kan genomföras betydligt effektivare än vad som förut varit känt, genom att höja salthalten i lösningen. Detta är överraskan- de eftersom det vid virusfiltrering av proteiner, hittills endast varit känt att proteinkoncentrationen, flödet och pH påverkat processen.

Orsaken till den förhöjda filtreringseffektiviteten vid högre salt- halt, kan tänkas vara att proteinet dras ihop och därmed lättare passe- rar genom porerna i filtret. Vidare är det troligt att proteiner med många hydrofoba grupper påverkas i större utsträckning av en för- höjd salthalt.

Vid genomförande av föreliggande uppfinning ligger den totala salthalten i lösningen lämpligen inom intervallet från 0,4 upp till 2,5 M, företrädesvis inom intervallet från 0,6 upp till 2,0 M. Det är spe- ciellt föredraget att den totala salthalten i lösningen lämpligen inom intervallet från 0,8 upp till 1,5 M.

Den totala salthalten kan vid behov justeras genom tillsats av vilket som helst accepterbart salt. Det är således möjligt att använda lösliga oorganiska salter, lösliga organiska salter eller kombinationer 10 20 25 30 35 502 820 3 därav. Det kan antas att större processmässiga fördelar erhålls med salter som uppvisar hög utsaltningseffekt enligt den s.k. Hofmeister- serien. Här till S. Glasstone, Textbook of Physical Chemistry, van Nostrand Co., Toronto, 2:a uppl., april 1946, sid. 1254-1259. De viktigaste exemplen på anjoner med hög sådan utsaltningseffekt är citrat, tartrat, sulfat, acetat och fosfat. Katjoner som med fördel kan användas i föreliggande uppfinning är monovalenta katjoner, såsom natrium, kalium och ammonium. Med hänsyn till fördelen med farma- ceutiskt accepterbara tillsatser, utgör natriumklorid, kaliumklorid, nat- riumacetat och natriumcitrat eller kombinationer därav, speciellt före- dragna salter i föreliggande uppfinning. Det är även möjligt att till- sätta ett eller flera salter i sekvens, då filtreringen genomförs i två eller flera steg.

Vid virusfiltrering rekommenderas ofta en proteinkoncentration inom intervallet från ca 5 upp till ca 10 mg/ ml lösning. Vid tillämp- ning av föreliggande uppfinning, har det överraskande visat sig att lösningar med en högre proteinkoncentration, ca 10 upp till ca 20 mg/ ml, med fördel kan processas över virusfiltret.

Temperaturen i lösningen bör ligga inom intervallet från 0°C upp till temperaturen där proteinet ifråga denatureras. Lämpligen ligger temperaturen inom intervallet från 10 upp till 50°C , företrädes- vis från 20 upp till 35°C .

Vid genomförande av uppfinningen bör pH i lösningen ligga inom intervallet från ca 3 upp till ca 9, lämpligen från 4 upp till 8.

Vidare bör pH i proteinlösningen inte ligga för nära isoelektriska pun- kten för proteinet i fråga. För t. ex. gammaglobulin uppnås således bätttre resultat vid ett pH av 5,5 än vid ett pH av 6,8.

Med lösning avses i föreliggande uppfinning en lösning inne- hållande minst 50 vikt-% vatten, eventuellt innehållande ett eller flera lösningsmedel, såsom metanol, etanol, aceton eller acetonitril.

Föreliggande uppfinning är användbar för processoptimering vid virusfiltrering av lösningar innehållande ett stort antal olika typer av makromolekyler. Exempel på sådana är proteiner, polysackarider och polypeptider eller kombinationer därav. Mal ursprung har ingen betydelse för användningen av föreliggande upp- finning. Makromolekylema kan således komma från växt- eller djur- riket eller framställas industriellt från början. Mal 10 15 20 25 30 35 502 820 4 dock lämpligen av humant eller arlimalt ursprung eller framställda med genteknik (rekombinanta).

Speciellt lämpliga proteiner i föreliggande uppfinning är faktor VIII, faktor IX, antitrombin IH, gammaglobulin, albumin, streptoki- nase och apolipoproteiner.

En speciellt föredragen faktor IX-produkt är Nanotiv®, som levereras av Pharmacia AB, i Stockholm, Sverige. Fördelen med denna produkt är att den före filtreringen uppvisar så hög spedfik aktivitet, att filter med mycket fin struktur kan väljas. Härigenom kan víruskon- centrationen sänkas till en mycket låg nivå, samtidigt som själva filtre- ringssteget blir mycket snabbt och utbytet högt.

Föredragna typer av faktor VHI utgörs av deleteringsderivat av rekombinant framställda faktor VIII-produkter. En speciellt föredra- gen faktor VIII-produkt är r-VIII SQ®, som levereras av Pharmacia AB, i Stockholm, Sverige. En fördel med denna produkt är att den rekombinant framställda molekylen saknar den inaktiva mellandelen av den naturliga faktor VIH-molekylen. Detta ger molekylen en medelmolekylstorlek av ca 170000. Denna molekylstorlek är synner- ligen lämplig för filtrering med sådana filter som möjliggör avsevärd virusreduktion.

Speciellt lämpliga polysackarider i föreliggande uppfinning är glykosaminoglykaner och bakteriepolysackarider. Exempel på glykos- arninoglykaner är hepariner, heparinfrag-rnent, heparinderivat, hepa- ransulfat och hyaluronsyra. En speciellt föredragen grupp av glykos- aminoglykaner utgörs av lågmolekylära hepariner med en medel- molekylstorlek upp till ca 10000, företrädesvis från 2000 upp till 8000.

Speciellt lämpliga polypeptider i föreliggande uppfinning är bio- aktiva polypeptider såsom humana tillväxthormoner. En speciellt föredragen sådan produkt är Genotropin®, som levereras av Pharmacia AB, i Stockholm, Sverige.

Föreliggande uppfinning är således användbar för processopti- mering vid virusfiltrering av lösningar innehållande t.ex. proteiner, polysackarider och polypeptider. I det följande kommer dock uppfin- ningen att beskrivas med hänvisning till lösningar innehållande pro- teiner, närmare bestämt proteiner som naturligt förekommer i den mänskliga organismen.

Virus som kan förekomma i proteinlösningar är normalt avsevärt större än proteinema själva. Separering med avseende på 10 15 20 25 30 35 502 820 5 storlek, t.e.x genom filtrering, har således förutsättningar att avlägsna virus från proteiner.

Virusfiltrering är en omvänd process jämfört med ultrafiltrering (UF). Sålunda pumpas proteinlösningen runt med ett konstant flöde på retentatsidan, medan en annan pump suger proteinlösningen igenom filtret. Då en viss bestämd volym erhållits på retentatsidan, tillsätts buffert på retentatsidan. Detta upprepas erforderligt antal gånger, varvid större delen av återstående protein passerar filtret, medan virus blir kvar på retentatsidan. En sådan process kallas för diafiltrering. Filtret kastas normalt efter en körning, för att undvika överföring av virus.

Virusfilter är kända och levereras av bl.a. Millipore från Massa- chusetts, USA och Asahi Chemical Industry Co., Ltd. från Japan. Milli- pore levererar filter med två olika membrantyper beroende på protei- nets storlek. Sålunda levererar Millipore bl.a. Virosolvem / 70 för proteiner med en molekylstorlek på upp till ca 70000, medan Virosolvem / 180 är avsedd för proteiner med en molekylstorlek på upp till ca 180000. Exempel på användning av det senare filtret är för monoklonala antikroppar. Asahi Chemical Industry levererar bl.a.

Planovam 35- och Planovam 15-filter, där det senare filtret används för mindre virus såsom polio.

Valet av filter är som ovan sagts bl.a. en funktion av storleken hos proteinet. Faktor D(, antitrombin III och human serum albumin (HSA) har samtliga en molekylstorlek av ungefär 60000-70000, varvid t.ex. Virosolvem / 70 utgör ett lämpligt alternativ. Gammaglobulin har en molekylsmrlek av ungefär lsoooo, varvid t.ex. virosalvef" /1so utgör ett lämpligt alternativ. Det senare filtret är även lämpligt för den rekombinant framställda faktor VIH-produkten, r-VIII SQ®, vilken som ovan sagts har en medelmolekylstorlek av ca 170000.

Möjligheten att välja filter med fin struktur förutsätter vidare att proteinlösningen har en hög renhet före filtrering. Användning av filter med en fin struktur utgör i sin tur en förutsättning för att kunna producera proteinlösningar med en mycket låg halt av virus i slutpro- dukten. För att kunna reducera koncentrationen av virus till en mycket låg nivå, krävs sålunda filter med en mycket fin struktur, t.ex.

Virosolvem / 70. Vid användning av Virosolvem /180 kan inte kon- centrationen sänkas lika lågt. 10 20 25 30 35 6 Effektiviteten över filtreringssteget påverkas av renheten hos proteinlösningen som tillförs filtret. Härvid ger en hög specifik aktivi- tet före filtrering ett högre utbyte över filtreringssteget. Vid föredragna utföringsformer med filtrering av lösningar innehållande faktor IX, har det sålunda visat sig att utbytet av protein över filtreringssteget kan höjas från ca 70 % till över 95 %. Föreliggande uppfinning möjlig- gör dock framställning av protein med ett utbyte av över 90 %, även vid användning av lösningar med låg specifik aktivitet.

Virusfiltrering enligt föreliggande uppfinning genomförs lämp- ligen i slutet av en sekvens för framställning av protein, eftersom en hög specifik aktivitet före filtrering ger ett högre utbyte över filtre- ringssteget. Företrädesvis används föreliggande uppfinning som sista reningssteg, eventuellt följt av ett steg för justering av t.ex. proteinkon- centration, salthalten eller pH hos slutprodukten. Ett efterföljande steg med diafiltrering med ett UF-membran kan också användas för att avlägsna salter som kan vara processmässigt eller ekonomiskt fördel- aktiga, men som inte bör ingå i slutprodukten. Proteinlösningar fär- diga för administrering innehåller en fysiologisk lösning, t.ex. 0,15 M natriurnklorid vid ett pH av 7. Virusfiltrering kan även genomföras i två eller flera steg, med eller utan andra mellanliggande processteg.

Föreliggande uppfinning reducerar effektivt innehållet av virus med lipidhöljen såväl som virus utan lipidhöljen. Exempel på virus utan lipidhölje är hepatit A och polio, vilka är relativt små virus.

Exempel på virus med lipidhölje är hepatit B, hepatit C och Human Immunodeficiency Virus (HIV).

Exemplen avser att illustrera uppfinningen, utan att begränsa densamma.

EXPERIMENTELLT Vid försöken bestämdes först proteingenomsläpplígheten (eng. siev- ing coefficient) vid olika filtratflöden. Proteingenornsläppligheten är angiven som P/ R, där P är proteinkoncentrationen på permeatsidan (filtratsidan) uppmätt genom absorption vid 280 nm (A230) och R är proteinkoncentrationen uppmätt på retentatsidan (R) uppmätt genom absorption vid 280 nm (A230). Därefter valdes det filtratflöde som gav högst proteingenomsläpplighet utan att polymerisering erhölls över filtret. Med några makromolekyler gjordes även en utbytesoptimering. 20 25 30 502 820 Eztemneü Försök utfördes med faktor D( som makromolekyl, för att visa inver- kan av två salthalter på proteingenomsläppligheten, díafiltrefings- mängden och utbytet. En kommersiell lösning med faktor IX, Nanotiv® , levererades av Pharmacia AB i Stockholm, Sverige.

Lösningen med faktor IX erhållen från humant blodplasma hade före filtreringen behandlats i en sekvens med anjonbytare, kemisk virus- inaktivering, affinitetslcromatografi och katjonbytare. Lösningen ultra- filtrerades mellan varje steg förutom mellan den kemiska virusinaktí- veringen och afñnitetslaomatografin.

Försöksbetingelser: ingående renhet på proteinlösriingen: hög. buffert: 0,144 M NaCl+0,0055 M natriumcitrat. Total salthalt: ca 0,15 M proteinkoncentration: O,5-1,0 A230-enheter proteinlösriingens pH: 7 försökstemperatur: rumstemperatur (ca 2.3 grader). virusavskiljande filter: Virosolvem / 70 filteryfa: 1 /3 ft2 retentatflöde: 41 l /h pump: Watson-Marlow 504 TABELL 1 Bestämning av proteingenorrisläppligheten Försök Fillratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 35,0 2 6,9 39,6 3 10,7 45,8 4 14,1 56,2 5 17,6 55,6 6 20,8 58,3 7 24,3 61,7 Bestämning av proteingenomsläppligheten gav ett optimalt filtrat- flöde av 20,8 m1/ min. - 502 820 20 30 8 TABELL 2 Utbytesoptimering. Filtratflöde: 20,8 m1/ min. Ingående renhet på proteinlösningen: hög. Buffert: 0,144 M NaCl + 0,0055 M natriumcilrrat.

Total salthalt: ca 0,15 M . ” Försök Filtreringstid P/ R, % 1 _ 3 min 10 s 55,1 2 6 min 25 s 52,1 3 10 min 40 s 44,5 4 13 min 20 s 34,0 Diafiltlering med utspädning av ca 1 volymsenhet per volymsenhet ingående proteinlösning (1 + 1) gav ett utbyte av ca 90 %. x m I Samma betingelser som i Exempel 1, bortsett från att bufferten i detta fall utgjordes av 1,0 M NaCl + 0,01 M natriumcitrat, vilket gav en total salthalt av ca 1,0 M.

TABELL 3 Bestämning av proteingenomsläppligheten Försök Filtratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 55,2 2 6,9 g 55,7 3 10,7. 61,4 4 14,1 68,4 5 17,6 74,2 6 20,8 77,0 7 24,3 80,5 Bestämning av proteingenomsläppligheten gav ett optimalt ñltrat- flöde av 24,3 m1/ min. 20 30 502. 820 9 TABELL 4 Utbytesoptimering. Filtratflöde: 24,3 ml/min.

Försök Frltreñngstid P/ R, % 1 2 min 30 s 72 2 -- 68 3 7 min 14 s 65 4 9 min 38 s' 55 Diafiltrering med utspädning av ca 0,3 volymsenheter per volymsenhet ingående lösning (1 + 0,3) ger ett utbyte av > 95%. xml Samma betingelser som i Exempel 1, bortsett från att renheten på ingående proteinlösning var lägre. ~ Diafiltrering med utspädning av ca 3 volymsenheter per volymsenhet ingående proteinlösning (1 + 3) gav ett utbyte av ca 65%.

Ezemneli Samma betingelser som i Exempel 2, bortsett från att renheten på ingå- ende proteinlösning var Diafiltrering med utspädning av ca 3 volymsenheter per volymsenhet ingående proteinlösning (1 + 3) gav ett utbyte av 89 %. Utbytet av faktor D(:C var samtidigt 87%. xml Försök utfördes med faktor D( som makromolekyl, för att visa inver- kan av fyra salthalter på proteingenomsläppligheten, diafiltrerings- mängden och utbytet vid i övrigt konstanta försöksbetingelser. Den använda Nanotiv®-lösningen, levererad av Pharmacia AB i Stock- holm, Sverige, var en annan än i exempel 1-4. Försöksbetingelsema var de samma som i exempel 1, bortsett från att det virusavsldljande filtret, Virosolvef" / 70, var något använt. 25 30 502 820 10 TABELL 5 Bestämning av proteingenornsläppligheten. Bufferten utgjordes av 0,144 M NaCI + 0,0055 M natriumcitrat. Total salthalt: ca 0,15 M.

Försök Filtratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 25 2 6,9 28 3 14,1 43 4 20,8 49 5 24,3 50 TABELL 6 Bestämning av prcteíngenonxsläppligheten. Bufferten utgjordes av 0,5 M NaCI + 0,01 M natriumcitrat. Total salthalt: ca 0,5 M.

Försök Fuuamöae, ml/mm P/R, % 1 3,5 se 2 6,9 44 a 14,1 61 4 20,8 67 s 24,3 s 69 TABELL 7 Bestämning av proteingenomsläppligheten. Bufferten utgjordes av 1,0 M NaCI + 0,01 M natriumciuat. Total salthalt: ca 1,0 M.

Försök Filtratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 49 2 6,9 60 3 14,1 72 4 20,8 74 5 24,3 76 20 502 820 ll TABELL 8 Bestämning av proteingenoinsläppligheten. Bufferten utgjordes av 1,5 M NaCl + 0,01 M natriumcitrat. Total salthalt: ca 1,5 M.

Försök Filtratflöde, m1/ min P / R, % 1 3,5 48 2 6,9 56 3 14,1 73 4 20,8 76 5 24,3 74 Det framgår av tabell 5 till 8 att användning av föreliggande uppfin- ning innebär en märkbar förbättring av process betingelserna vid virusfiltrering av faktor D(-lösningar, jämfört med tidigare känd teknik där låg salthalt använts. hrmnelj Försök utfördes med faktor D( som makromolekyl, för att visa inver- kan av tre olika salter på proteingenonxsläppligheten, diafiltrerings- mängden och utbytet vid i övrigt konstanta försöksbetingelser. Den använda N anotiv®-lösningen, levererad av Phannacia AB i Stock- holm, Sverige, var densamma som i exempel 5. Försöksbetingelsema var de samma somi exempel 1, bortsett från att det virusavskiljande filtret, Virosolvem / 70, var något använt.

TABELL 9 g Bestämning av proteingenornsläppligheten. Bufferten utgjordes av 0,5 M kaliumdivätefosfat. Total salthalt: 0,5 M.

Försök Filtratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 34 2 6,9 48 3 14,1 57 4 20,8 55 20 30 502 820 12 TABELL 10 Bestämning av proteingenontsläppligheten. Bufferten utgjordes av 0,5 M NaC1. Total salthalt: 0,5 M.

Försök Filtratflöde, m1/ min P/ R, % 1 3,5 27 2 6,9 43 3 14,1 50 4 20,8 46 TABELL 11 Bestämning av proteingenornsläppligheten. Bufferten utgjordes av 0,5 M bariumldorid. Total salthalt: 0,5 M.

Försök Filtratflöde, ml /min P/ R, % 1 3,5 24 2 6,9 36 3 14,1 34 4 20,8 - Det framgår av tabell 9 till ll att ett flertal olika salter med fördel kan användas vid genomförandet av föreliggande uppfinning. Det fram- går vidare att proteingenomsläppligheten ökar vid användning av salt med hög utsaltningseffekt enligt Hofmeister-serien (kaliumdiväte- fosfat) jämfört med ett salt med låg utsaltningseffekt (bariumklorid). fixempeLZ Försök utfördes med gammaglobulin som ntalcomolekyl, för att visa inverkan av salthalten på proteingenomsläppligheten, diafiltrerings- mängden och utbytet. Lösningen med gammaglobulin var en kom- mersiell produkt erhållen från blodplasma, Gammonativ®, levererad av Pharmacia AB i Stockholm, Sverige. Lösningen med gammaglo- bulin hade före filtreringen renats genom en inledande Cohn-fraktio- nering med efterföljande krornatografisteg.

Försöksbetingelser i enlighet med exempel 1-, bortsett från att det virusavskiljande filtret var ett Viroso1veT"/180-fi1ter, lösningens pH 20 30 13 5021820 var 6,8 och proteinkoncentrationen var 0,Z5-0,5 Azßo-enheter. Buffer- ten utgjordes av 2,2% albumin + 0,15 M N aC1 + 0,02 M NaAc + 0,075 M glycin. Total salthalt: 0,17 M.

TABELL 12 Bestämning av proteingenomsläppligheten Försök Filtratflöde, m1/ min 1 3,5 2 6,9 3 10,7 4 14,1 5 17,6 6 20,8 7 24,3 P/ R, % 32 35 41 51 59 63 69 Bestämning av proteingenomsläppligheten gav ett optimalt filtrat- flöde av 20,8 ml/min. xml Samma betingelser som i Exempel 7, bortsett från att bufferten i detta fall utgjordes av 2,2% albumin + 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc + 0,075 M ' glycin. Total salthalt: ca 1,0 M.

TABELL 13 Bestämning av proteingenoinsläppligheten Försök Filtratflöde, ml/ min 1 3,5 2 6,9 3 10,7 4 14,1 5 17,6 6 20,8 7 24,3 P/R, % 38 ääâïï 80 20 30 502 820 14 _ Bestämning av proteingenomsläppligheten gav ett optimalt filtrat- flöde av 20,8 m1/ min.

Utbytesoptimering vid ett fillratflöde av 20,8 m1/ min och en uppe- hållstid av upp till 10 min, gav en P/ R-kvot av mellan 60 och 68%.

Diafiltrering med utspädning av ca 1 volymsenhet per volymsenhet ingående proteinlösning (1 + 1) gav ett utbyte av 90%. kempslfl Samma betingelser som i Exempel 7, bortsett från pH i detta fall var 5,5. i TABELL 14 Bestämning av proteingenomsläppligheten Försök Filtratflöde, m1 /min P/ R, % 1 3,5 41 2 6,9 47 3 14,1 t 62 4 20,8 72 5 24,3 74 Samma betingelser som i Exempel 9, bortsett från att bufferten i detta fall utgjordes av 2,2% albumin + 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc + 0,075 M glycin. Total salthalt: ca 1,0 M.

TABELL 15 Bestämning av proteingenornsläppligheten Försök Fnn-afflöde, :fu/mm P/R, % 1 3,5 57 2 6,9 67 3 14,1 78 4 20,8 88 5 28,1 90 20 30 502 820 xm 1 Försök utfördes med albumin som makromolekyl, för att visa inver- kan av salthalten på proteingenomsläppligheten, diafiltreringsmäng- den och utbytet. Den 4%-iga lösningen med Human Serum Albumin (HSA) erhállen från blodplasma, levererades av Pharmacia AB i Stock- holm, Sverige. Lösningen med albumin hade före filtreringen renats genom en kombinerad Cohn-fraktioneríng och lcomatografisteg.

Försöksbetingelser i enlighet med exempel 1, bortsett från att protein- koncentrationen var 1-2 A230-enheter. Bufferten utgjordes av 0,15 M NaCl + 0,02 M NaAc, vilket gav en total salthalt av 0,17 M.

TABELL 16 Bestämning av proteingenomsläppligheten Försök Filtratflöde, m1 /min P / R, % 1 3,5 34 2 6,9 39 3 14,1 50 4 20,8 51 5 24,3 50 Bestämning av proteingenomsläppligheten gav ett optimalt filtrat- flöde av 20,8 m1/ min.

Samma betingelser som i Exempel 11, bortsett från att bufferten i detta fall utgjordes av 1,0 M NaCl + 0,02 M NaAc, vilket gav en total salt- halt av ca 1,0 M. 10 502 820 16 TABELL 17 Bestämning av proteingenomsläppligheten Försök Filtratflöde, m1 /min P / R, % 1 3,5 39 2 6,9 57 3 14,1" 62 4 20,8 64 5 24,3 60 Diafiltrering med utspädning av ca 1 volymsenhet per volymsenhet ingående proteinlösning (1 + 1) gav ett utbyte av 85%.

Claims (10)

10 15 20 30 35 502' 820 17 PATENTKRAV

1. Sätt att virusfiltrera en lösning innehållande minst en makromole- kyl, k ä n n e t e c k n at av att den totala salthalten i lösningen ligger inom intervallet från ca 0,2 M upp till mättnad för saltet ifråga.

2. Sättenligtkrav 1, kännetecknat avattden totalasalthalteni lösningen ligger inom intervallet från 0,4 upp till 2,5 M.

3. Sättenligtkrav2, kännetecknat av attden totalasalthalteni lösningen ligger inom intervallet från 0,6 upp till 2,0 M.

4. Sätt enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t av att saltet väljs bland natriumklorid, kaliumklorid, natriumacetat och natriumcitrat eller kombinationer därav.

5. Sätt enligt något av föregående krav, k ä n n e t e c k n a t av att makromolekylen väljs bland proteiner, polysackarider och polypep- tider eller kombinationer därav.

6. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n at av att makromolekylen utgörs av minst ett protein valt bland faktor VIH, faktor IX, antitrom- bin IH, gammaglobulin, albumin, streptoldnase och apolipoproteiner.

7. Sätt enligtkrav 6, kännetecknat av attmakromolekylen utgörs av faktor D(.

8. Sätt enligt krav 6, k ä n n e t e c k n at av att makromolekylen utgörs av gammaglobulin. '

9. Sätt enligt krav 6,_ k ä n n e t e c k n a t av att makromolekylen utgörs av ett deleteringsderivat av rekombinant faktor VIH.

10. Sätt enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t av att makromolekylen utgörs av en polysackarid vald bland hepariner, heparinfragment, heparinderivat, heparansulfat och hyaluronsyra.