SE460669B - Foerfarande foer extrahering av jaenrbindande mjoelkproteiner - Google Patents

Description

460 669 _, 10 15 20 25 30 35 2 av dessa proteiner från mjölkprodukter och framför allt vassla, som innehåller dem i löst tillstånd och som i allmänhet utgör en restprodukt i mejerierna.

Flertalet av de använda förfarandena är baserade pà användning av jonbytare eller kromatografi på "Sephadex", vid pH-värden som ej överstiger 7 och för det mesta är lägre än 6,3. Så är t ex fallet med den metod som förordas i US patentskrifterna 3 234 199 eller 3 969 337.

Man tillgriper även elektrofores eller fällning medelst salter och centrifugering, vilken sistnämnda metod beskrivits av Montreuil och Mullet, C.R. 250, 1736-7 (1960). Helt nyligen har arbeten pá separeringen av mjölkproteiner beskrivits i de franska patentskrifterna 2 390 906 och 2 399 214, där proteinerna, andra än kaseinet, extraheras först med ett anjonbytande harts och därpå med kiseljord, eller omvänt; extraktionen sker här vid ett pH mellan 4 och 7,5.

Om de olika förfarandena enligt den kända tekniken lämpar sig väl till avskiljande av sådana proteiner som laktalbuminerna och serum-albuminet, möjliggör dock inget av dem effektiv och praktisk utvinning av de järnbindande proteinerna, dvs transferrinerna och laktoferrinerna. Även om mjölkserumet är ett billigt ämne, innehåller det dock endast ca 6,5 g protein per liter, varav blott en liten del utgöres av lakto- ferrinerna. Man är alltså tvungen att behandla tämli- gen stora volymer av detta utgångsämne för att extrahera en ringa mängd av proteiner av intresse. Därför är det betydelsefullt att förfoga över ett förfaringssätt som möjliggör att genomföra denna extraktion med så rikligt utbyte som möjligt. Denna målsättning uppnås nu med sättet enligt föreliggande uppfinning. Det nya förfaringssättet enligt uppfinningen möjliggör nämligen speciellt utvinningen av järnkelatiserande proteiner, i synnerhet laktoferrin och transferrin, och därtill immunglobuliner, från det mjölkserum, som blivit kvar efter avskiljandet av kaseinerna. 10 15 20 25 30 35 460 669 3 I den efterföljande beskrivningen skall för enkel- hetens skull endast talas om laktoferrinet, men det underförstàs att detta uttryck inbegriper också trans- ferrinet och eventuellt andra järnkelatiserande protei- ner av samm typ, vilka kan förekomma i mjölken från ' olika däggdjur.

Sättet enligt föreliggande uppfinning är baserat på den överraskande upptäckten att - tvärs emot den tidigare tekniken - avskiljningen av de ovan angivna proteinerna medelst adsorption sker bäst i lätt basisk miljö.

Sättet enligt uppfinningen består i att bringa det laktoferrininnehàllande mediet till fastsättning på en lämplig adsorberande substans i ett svagt basiskt medium, dvs i en vätska med ett pH-värde av 7,7-8,8 och ännu hellre mellan 7,9 och 8,5.

Det medium som skall behandlas enligt uppfinningen kan utgöras av varje vattenhaltig vätska som innehåller mjölkens olika proteiner, men är befriad från åtminstone merparten av kaseinerna; den mest praktiska källan är då vasslan, som eventuellt kan vara koncentrerad eller redan behandlad för extraktion av andra protei- ner än laktoferrinet.

Efter adsorption i det svagt basiska mediet och avlägsnande.av den ovanpå flytande vätskan elueras de på'adsorbatorn fästa proteinerna fràn denna genom sänkning av pH-värdet under 7 och företrädesvis under ca 4; härvid består en föredragen utföringsform i att begagna ett surt elueringsmedel, vars jonstyrka ökats genom tillsats av ett lösligt salt.

Såsom adsorberande substans kan man med fördel använda kiseljord med en specifik yta av ca 5-150 m2/g med en pordiameter av 25-250 um (250-2500 Å). Kisel- jorden kan användas i pulverform med tillräcklig storlek på kornen, t ex 5 um - 5 mm. För användning i en kolonn är att föredra att använda sfäriska kulor med en diameter av storleksordningen mellan 10 och 500 um. 460 " va» ef. ~» 10 15 20 25 30 35 66\9 4 « ° .Ehuru kiseljord utgör en utmärkt bärare för fixe- rande av företrädesvis laktoferrinet, kan även andra bärare begagnas, i synnerhet olika naturliga eller artificiella silikater, såsom pimpsten, kiselgur, bentonit osv, ävensom aktiverad alunjord.

Fästandet på bäraren i ett svagt basiskt medium medför fördelen av stor selektivitet gentemot lakto- ferrinet, som endast átföljes av en del immunglobuliner.

De övriga proteinerna, i synnerhet laktoalbtninerna, laktoglobulinerna, albuminserumet och resten av lakto- globulinerna förblir lösta i den ovanpå flytande vätskan.

Efter tillvaratagandet av laktoferrinet och immun-- globulinerna bringas bäraren - i synnerhet kiseljorden - åter i kontakt med en lätt basisk lösning, t ex med ett pH mellan 8 och 9, som gör den lämplig att tjäna till en ny extraktion från en mjölkprodukt. Det inses att förfarandet enligt uppfinningen är avsevärt mycket enklare än metoderna enligt den tidigare tekniken; således är det, i motsats till de ovan åberopade franska patentskrifterna, tillräckligt med en enda mineralisk bärare i stället för två bärare, av vilka en är jon- bytare. Dessutom sker fastsättandet pá den adsorbe- rande substansen i ett basiskt medium i stället för att utföras vid pH-värden under 7,5 och framför allt under 7, såsom är fallet i hela den tidigare kända tekniken.

Enligt en variant av uppfinningen tvättas bäraren, efter eluering medelst en sur lösning, med en basisk lösning, vilket gör det möjligt att extrahera den I fraktion av immunglobulinerna, som icke eluerats i sur miljö. I detta fall kan den basiska lösningen g även möjliggöra utvinningen av en laktoferrinrest. ¿ Tvättningen enligt denna variant kan genomföras med ' ett pH av t ex 8-10. Emellertid påverkas en kisel- jordbärares extraktionsförmága gentemot laktoferrinet ej av en dylik tvättning; denna kan därför utelämnas, då man blott söker extrahera laktoferrinet. 10 15 20 25 30 35 460 669 _ 5 Sättet enligt uppfinningen lämpar sig för mjölk- serum oberoende av hur den metod varit, med vilken kaseinet avlägsnats och vilken resulterar i just detta mjölkserum; med andra ord, huruvida kaseinet utfällts genom surgöring av råmjölken eller inverkan av ett ensym. Sättet lämpar sig för vassla som sådan, ävensom för vätskor som erhållits genom att åter bringa mjölk- serumets fasta beståndsdelar, vilka erhållits genom varje känt medel såsom t ex ultrafiltreringen eller torkning, i lösning.

Uppfinningen kan utnyttjas för extraktion av laktoferrinet ur olika sorters mjölk, i synnerhet sådana från får och nöt, ävensom från människor. Enär de förstnämnda mjölksorterna innehåller mycket mindre laktoferrin än den sistnämnda, är deras behandling mindre effektiv genom den kända tekniken, och därför gör sig uppfinningens nytta där synnerligen märkbar.

Uppfinningen kan genomföras under de betingelser, som angivits av Gordon, Ziegler och Basch i Biochim.

Biophys. Acta 60, 410-411 (1962): i denna variant gäller fixeringen på en adsorberande bärare i svagt basiskt medium en laktoferrininnehållande vätska, till vilken på förhand tillsatts en järnförening så att hela det förefintliga laktoferrinet mättas med järn.

Graden av laktoferrinets extraktion genom sättet enligt uppfinningen är hög. Angående sammansättningen av de genom detta förfarande erhållna proteinerna efter eluering från den adsorberande bäraren medelst sur lösning, så består den till mer än 50% av lakto- ferrin, under det att resten i huvudsak utgöres av immunglobuliner. Renheten av laktoferrinet, som väsent- ligen användes som bakteriostatiskt, dvs bakteriehäm- mande medel, är helt tillräcklig, och det är ej nödvän- digt att avskilja det från immunglobulinerna; i själva verket har det klart bevisats att förmågan att förhindra tillväxt av patogena bakterier genom laktoferrin för- 460 669 6 stärktes genom närvaron av immunglobuliner.

I det fall, som är mycket fördelaktigt frán indust- riell synvinkel, där bäraren utgöres av kiseljord, finner man hos denna en kapacitet av mera än 20 mg 5 laktoferrin per gram kiseljord, vilket fullt rätt- färdigar industrimässig användning av sättet enligt uppfinningen.

Under uppfinningens driftsbetingelser undergâr de med laktoferrinet medföljande immunglqbulinerna 10 ingen nedbrytning och kan följaktligen med fördel användas i livsmedels-, läkemedels- och djurläkemedels- industrierna, emedan de har alla sina egenskaper kvar.

De olika proteinerna, vilka kan separeras genom förfaringssättet enligt uppfinningen, kan identifieras 15 med hjälp av de klassiska metoderna och i synnerhet med dem, som har beskrivits av J Garnier i Ann. Biol. anim. Biochq Biophys., 1964, 4 (2), 163-187. De följande exemplen skall förklara den föreliggande uppfinningen, men ej begränsa den i något avseende. 20 EXEMPEL 1 I en kolonn med en innerdiameter av 1 cm har placerats 5'g kiseljordkorn med en granulometri av 100-200 um, varvid denna kiseljord uppvisar en specifik yta av 20 m2/g och en pordiameter av 80 um. 25 Kiseljorden tvättas med en lösning av dinatrium- fosfat Na HPO 2 4 I l liter av samma fosfatlösning löses 10 g av ett i en koncentration av 0,005_M. pulver, som erhållits genom torkning av den fasta återstoden från ultrafiltrering ax ett mjölkserum. 30 Detta pulver innehåller 6,5 g proteiner. Den erhållna lösningens pH inställes till 8,2. ~ Därefter bringar man lösningen att passera genom kisel- jordinnehàllet i den ovan angivna,kolonnen med en inmatningshastighet av 60 ml/hk varpå detta innehåll 35 tvättas med en lösning av dinatriumfosfat i en koncent- ration av 0,005 M och med ett pH av 8,2 för att driva bort alla proteiner, som ej fastnat på kiseljorden. 10 15 20 25 30 . 460 669 7 Det fastsittande laktoferrinet elueras sedan medelst en 0,1 N lösning av ättiksyra, som försatts med NaCl till en_koncentration av 0,5 M. Man erhåller pà detta sätt en fraktion av 25 ml av en skär vätska, som inne- håller 40 mg proteiner, av vilka 66% utgöres av lakto- ferrin och resten av immunglobuliner. Efter tvättning av kiseljordsinnehállet genom passage av en lösning av.dinatriumfosfat med en koncentration av 0,005 M, är kolonnen på nytt iordningställd för användning.

EXEMPEL 2 _ , Vid ett experiment av liknande slag som enligt exemplet l spolas kolonnens innehåll med en tris-HCl- -buffert med pH 9, till vilken tillsatts NaCl i en 1 koncentration av 0,5 M, efter eluering medelst ättik- syran och tillvaratagandet av laktoferrinfraktionen.

Detta behandlingssteg levererar en ny fraktion av 20 ml, som innehåller 30 mg proteiner, som väsentligen utgöres av immunglobuliner, laktoperoxidas och en mycket liten mängd laktoferrin.

Efter tvättning av kiseljorden i kolonnen med en lösning av dinatriumfosfat i en koncentration av 0,005 M är kolonnen ånyo i skick för användning.

EXEMPEL 3 Tillverkningssättet enligt exemplet 1 upprepas, men källan för laktoferrinet utgöres av 1 liter vassla, som direkt härrör från ostframställning, utan koncent- rering, varvid till vätskan tillsatts dinatriumfosfat i en koncentration av 0,005 M per liter.

Resultaten är desamma som i exemplet l.

EXEMP/EL 4 _ Den alkaliska tvättningen enligt exemplet 2 till- lämpas på ett behandlingssätt som använder vassla, enligt exempel 3. Detta ger resultat som är identiska_ med dem enligt exempel 2.

Claims (7)

460 669 10 15 20 25 30 8 PÅTENTKRAV

1. l. Förfarande för extrahering av järnbindande mjölk- proteiner från ett vattenhaltigt medium, som är väsent- ligen fritt från kaseiner, genom adsorption på en fast bärare och efterföljande eluering av de adsorberade pro- teinerna medelst en sur lösning, k ä n n e t e c k n a t därav, att adsorptionen genomföres i ett svagt basiskt medium vid ett pH-värde av 7,7 - 8,8 på pulverformig kisel- - dioxid med en partikelstorlek frán 5'pm till 5 mm, en specifik yta av omkring 5 till 150 m2/g och en pordiameter av från 25 till 250 nm. - '

2. Förfarande enligt kravet l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att elueringen genomföres vid ett pH-värde under omkring 4 och att elueringsmedlet innehåller ett lösligt salt, som ökar dess jonstyrka. _

3. Förfarande enligt kravet 1, k ä n n,e t e c k - n a t därav, att elueringen efterföljes av en behandling med en basisk lösning och utvinning av de härvid frigjorda immunglobulinerna och laktoferrinet.

4. Förfarande enligt kravet l, n a t därav, att de järnbindande proteinerna innefattar laktoferrin i en vätska, som härrör från mjölk.

5. Förfarande enligt kravet 4, k ä n n e t e c k - n a t därav, att immunglobuliner och/eller andra proteiner utvinnes från den vätska, som kvarblir efter adsorption k ä n n e t e c k - av laktoferrin.

6. Förfarande enligt kravet l, n a t därav, att pH-värdet hos det medium, som utsättes k ä n n e t e c k - för adsorption, ligger mellan 7,9 till 8,5.

7. Förfarande enligt kravet 6, k ä n n e t e c k - n a t därav, att kiseldioxidpartiklarnas storlek ligger mellan l0 till 500 um.