DE4216769A1

DE4216769A1 - Verfahren zur Anwendung von Eisenchelatoren als selektiv Wachstumssupplemente für Mikroorganismen

Info

Publication number: DE4216769A1
Application number: DE19924216769
Authority: DE
Inventors: Rolf Dr Rer Nat Reissbrodt; Wolfgang Dr Rer Nat Rabsch
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-05-21
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1993-11-25
Also published as: EP0600044A1; WO1993023527A1

Description

Das Wachstum von Mikroorganismen hängt essentiell von der Menge assimilierba ren Eisens ab. Durch Schwerlöslichkeit (z. B. in Eisenoxidhydraten) oder Bindung in organischen Naturprodukten wie Transferrin oder Lactoferrin stehen den Mikroor ganismen besonders unter aeroben Bedingungen und pH-Werten <7 die zum Wachstum und zur Ausprägung der Stoffwechselleistungen nötigen Mengen lösli chen Eisens nicht zur Verfügung. Zur Überwindung dieses Eisenmangels haben Mikroorganismen verschiedene Strategien entwickelt, von denen bei Bakterien und Pilzen die wichtigste die Bildung und Ausschleusung von Eisenchelatoren ist. Sol che Eisenchelatoren, auch Siderophore genannt, komplexieren das Eisen von den schwerlöslichen Verbindungen in der Umgebung der Mikroorganismen und trans portieren es durch spezifische Transportsysteme in die Zelle. Dabei können Mikro organismen aber nicht nur ihre eigenen Chelatoren zur Eisenversorgung nutzen, auch von anderen Mikroorganismen produzierte oder synthetische Eisenchelatoren können durch mehr oder weniger spezifische Transportsysteme Eisen in die Mikro organismenzelle transportieren und so zur Eisenversorgung genutzt werden (z. B. Rabsch und Reissbrodt, 1992).

Bei gramnegativen Bakterien können z. B. Salmonella- und E. coli-Stämme von dem Pilzsiderophor Ferrichrom mit Eisen versorgt werden. Pseudomonas aeruginosa- Stämme können durch 3,4-Dihydroxybenzoesäure mit Eisen versorgt werden, wäh rend das Wachstum von Salmonellen und E. coli damit nicht stimuliert werden kann. Ferrioxamin G ist das Hauptsiderophor von Hafnia alvei (Reissbrodt et al., 1990), es stellt ein ausgezeichnetes Wachstumssupplement für Salmonellen dar, nicht aber für beispielsweise E. coli.

Die Schwierigkeiten bei der Anzüchtung von Mikroorganismen beruhen im wesentli chen auf der Notwendigkeit der Ausbildung geeigneter Eisenversorgungsstrategien, z. B. der Produktion von Siderophoren. Werden den mit Mikroorganismen kontami nierten Materialien, z. B. Lebensmittel medizinisch-mikrobiologische Untersu chungsmaterialien, Umweltproben verwertbare Eisenchelatoren zugesetzt, so sind die Mikroorganismen in der Lage, sich schneller zu vermehren. Nach dem Wachstumsschub durch die zugefügten Eisenchelatoren können sie ihre eigenen Eisenversorgungsstrategien besser ausbilden. Gleichzeitig lassen sich Stoff wechselleistungen durch die zusätzliche Eisenversorgung besser steuern.

Salmonellen aus Lebensmitteln und anderen Untersuchungsmaterialien müssen mit einem hohen materiellen und zeitlichen Aufwand an Methoden und durch verschie dene Anreicherungs- und Selektivnährmedien angezüchtet werden (Pietzsch, 1991, § 35 LMBG, 1990). Die Anzüchtungsrate, besonders bei den in den Untersu chungsmaterialien geschädigten Salmonellen, ist gering. Der Nachweis und die sich daraus abzuleitende Bekämpfung der Salmonellosen ist deshalb ein schwieriges Problem. Insbesondere aus kontaminierten Hühnereiern, die ein Hauptreservoir speziell von S. enteritidis sind (Buchner et al. 1991, Burow 1991), ist die Anzüchtung mit den üblichen Anreicherungsmedien wie gepuffertes Peptonwasser, Cystein-Se lenit- und Rappaport-Vassiliadis-Anreicherungsmedien zeitaufwendig und wenig effektiv (Stephenson et al. 1991). Hier behindert besonders das im Hühnereiweiß vorhandene Ovotransferrin als natürliches Eisenbindeprotein die Salmonellenan züchtung.

Durch Zugabe von Eisenchelatoren, z. B. zu den Anreicherungs- oder Selek tivnährmedien oder vorher zu den kontaminierten Materialien, kann die Sensibilität der Mikroorganismenanzüchtung erhöht werden. Durch Auswahl der zuzugebenen Eisenchelatoren läßt sich die Selektivität der Anzüchtung erhöhen. Beispielsweise lassen sich Salmonellen aus Hühnereiweiß durch Zugabe von Ferrioxamin G mit hoher Effektivität und deutlich geringerem Material- und Zeitaufwand als bisher an züchten, während E. coli-Stämme durch Nichtverwertung des Ferrioxamin G hier nicht gefördert werden.

Literatur

1. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG; Untersu chung von Lebensmitteln; Nachweis von Salmonellen, Juni 1990.
2. BUCHNER, L., R. WERMTER, S. HENKEL: Zum Nachweis von Salmonellen in Hühnereiern unter Berücksichtigung eines Stichprobenplanes. Arch. Lebensmittelhyg. 42 (1991), 77-100.
3. BUROW, H.: Nachweis von Salmonella enteritidis bei gewerblich und privat erzeugten Hühnereiern. Arch. Lebensmittelhyg. 42 (1991), 25-48.
4. PIETZSCH, O., 1981: Salmonella, In: Handbuch der bakteriellen Infektionen bei Tieren. Band III. Gustav Fischer Verlag, Jena, 344-452.
5. RABSCH, W., R. REISSBRODT: Eisenversorgung von Bakterien und ihre Be deutung für den infektiösen Prozeß. Bioforum 15 (1992), 10-15.
6. REISSBRODT, R., W. RABSCH, A. CHAPEAUROUGE, G. JUNG, G. WINKELMANN: Isolation and identification of ferrioxamine G and E in Hafnia alvei. Biol. Metals 3 (1990), 54-60.
7. STEPHENSON, P., F.B. SATCHEL, G. ALLEN, W.H. ANDREWS: Recovery of Salmonella from Shell Eggs. J. Ass. Off. Anal. Chem. 74 (1991), 821-826.

Ausführungsbeispiel

10 Salmonellen-Keime verschiedener Serovare und Lysotypen werden in 5 ml nicht kontaminiertes frisch gewonnenes Hühnereiweiß eingebracht und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wird davon 1 ml (= 2 Salmonella- Keime) in 5 ml steriles phosphatgepuffertes Peptonwasser (1 % pankreat. Fleisch pepton) eingebracht, dem einmal 30 µg Ferrioxamin G und einmal kein Ferrioxamin G zugefügt waren. Bei 37°C wird geschüttelt. Nach 6 bzw. 24 Std. wird auf Galle- Chrysoidin-Glycerol-Agar ausgestrichen und nach 18 Std. Inkubation der beimpften Platten bei 37°C abgelesen. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt.

Während 14 der 18 geprüften Salmonellen schon nach 6 Stunden Schütteln mit Fer rioxamin G nachweisbar waren, konnten alle geprüften Salmonellen nach 24 Std. aus den das Wachstumssupplement Ferrioxamin G-haltigen Anreicherungsnähr medien angezüchtet werden. Ohne Ferrioxamin G gelang die Reisolierung nach 6 Stunden nur bei 4 der 18 Salmonellen, 4 der geprüften Salmonellen waren auch nach 24 Std. Schütteln nicht anzüchtbar. Eine qualitative und quantitative Steige rung der Nachweisrate konnte so bewiesen werden.

Tabelle

Reisolierung von Salmonellen verschiedener Serovare und Lysotypen aus Hühnereiweiß (künstlich kontaminiert mit 10¹ CFU/ml) mit Hilfe der Anreicherung in gepuffertem Peptonwasser mit und ohne Ferrioxamin G (5 µg/ml) nach 6 bzw. 24 Stunden. Ergebnisse nach Ausstrich einer Öse auf Galle- Chriysoidin-Glycerol-Agar

Claims

Verfahren zur Anwendung von Eisenchelatoren als selektive Wachstumssupple mente für Mikroorganismen sind dadurch gekennzeichnet, daß
1. durch Zugabe dieser Eisenchelatoren (mikrobielle Siderophore oder synthetische Eisenchelatoren) zu den Untersuchungsmaterialien oder zu Anreicherungs- oder Selektivnährmedien das Wachstum der betreffenden Mikroorganismen gefördert wird und die Sensibilität der Anzüchtung gesteigert werden kann,
2. durch Auswahl der Eisenchelatoren eine Selektivität der Anzüchtung von Mikro organismen erreicht werden kann,
3. durch Ferrioxamine, besonders Ferrioxamin G, die Anzüchtung von Salmonellen aus Untersuchungsmaterialien signifikant verbessert werden kann,
4. durch Zugabe von Eisenchelatoren zu wachsenden Mikroorganismen die Stoff wechselvorgänge der Mikroorganismen im Sinne der Produktbeeinflussung in biotechnologischen und gentechnischen Verfahren gesteuert werden können.