SE446911B - Foerfarande foer beredning av en cellsuspension frforfarande for beredning av en cellsuspension franaan ett blodprov foere raekning av antalet roeda o ett blodprov fore rekning av antalet roda och vitch vita blodkroppar samt blodplaettar a blodkroppar samt blodplettar - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 446 911 2 differentiell räkning av vita blodkroppar, och i det automatise- rade förfarandet enligt US-PS 3 741 875 tillämpas cytokemiska metoder för att identifiera och märka individuella celltyper.

Strömmen av färgade och ofärgade celler strömmar genom en optisk g mätkammare, där amplituderna av det av varje cell absorberade och spridda ljuset mäts separat på fotoelektrisk väg. De elektro- niska signalerna sorteras efter amplitud och klassificeras i kategorier, som svarar mot de olika celltyperna. Data utskrives för ett prov per minut för de fem väsentligaste typerna av vita blodproppar i helblod. Det specifika kemiska identifieringsför- farandet färgar de vita blodkropparna. De spridda ljuset ger ett mått på cellernas storlek. ' Föreliggande förfarande för differentiell bestämning av vita blodkroppar kan anpassas både till manuellt och till auto- matiserat arbete. I båda fallen tillåter förfarandet effektiv diskriminering mellan de flesta vanliga klasserna av ofärgade leukocyter enbart genom ljusspridning, eftersom de vita blod- kropparnas morfologi inte har skadats. Räkningen är noggrann, eftersom cellberedning inte innehåller klumpar av vita blodkrop- par, klumpar av röda blodkroppar eller klumpar av blodplättar. i I ett allmänt använt förfarande för räkning av blod- plättar användes koncentrerad urinämneslösning för lysering av de röda blodkropparna. Detta förfarande medför även extraktion av en del material från plättarna, fragmentering av nâgra vita blodkroppar (under bildning av partiklar, som ej går att skilja från blodplättar i dessa instrument), så att räkningen av blod- plättarna blir felaktig, samt ibland bildning av mycket fina proteinfällningar (vilka ej heller kan skiljas från blodplättar i dessa instrument), vilket likaså leder till felaktig räkning av blodplättarna.

Extraktionen av material från blodplättarna med urinämne sänker blodplättarnas brytningsförmåga, vilket sänker storleken av den signal för det spridda ljuset, som alstras i dessa instru- ment. Detta leder till att de minsta signalerna från blodplättar- na försvinner i de största systembrussignalerna (framkallade av elektroniskt brus i detektorerna och förstärkarna och av den sammanfallande passagen genom ljusspridningsdetektorn av röda fantomceller, dvs. membraner av röda blodkroppar, vilkas innehåll -.-..»...._..--. 10 15 20 25 30 35 446 911 3 har avlägsnats genom lysis). Det är därför inte möjligt att nog- grant inställa en tröskel mellan brus och blodplättar med stor konfidens.

Syftet med föreliggande uppfinning är att erbjuda ett förfarande, vid vilket man lyserar de röda blodkropparna utan att extrahera material från blodplättarna, utan att fragmentera de vita blodkropparna och utan att alstra fällningar av proteiner från onormala blod. Det beskrivna förfarandet alstrar en puls- höjdsfördelning av signaler med ett stort väldefinierat minimum mellan brus och blodplättar såväl som ett annat stort väldefini- erat minimum mellan blodplättar och vita blodkroppar. Uppfinning- en syftar också till att bevara de skillnader i de vita blod- kropparnas morfologi, som möjliggör diskriminering mellan de flesta klasserna av vita blodkroppar från varandra utan färgning.

Vare sig det används för differentiell bestämning av vita blodkroppar eller för bestämning av blodplättar, inbegriper förfarandet först behandling av ett antikoagulerat blodprov med en detergent, som förkonditionerar de röda blodkropparna för efterföljande lysering.

Tillsatsen av en detergent i detta skede är en viktig aspekt av föreliggande uppfinning. Den verkar som ett förkondi- tioneringsmedel genom att den vid den använda koncentrationen varken skadar de vita blodkropparnas eller blodplättarnas morfo- logi eller upplöser de röda blodkropparna, men ändå förbereder de röda blodkropparna för följande lysering.

Detergenten är företrädesvis polyoxietylen-20-sorbitan- monolaurat, men andra detergenter, t.ex. polyoxietylen-23-mono- lauryleter och polyoxietylen-20-sorbitanmonooleat, vilka kan konditionera de röda blodkropparna utan att lysera dem, är lika användbara.

Detergenthalten i den erhållna blandningen ligger mellan 0,03 och 2,0 volym-%, företrädesvis mellan 0,4 och 0,6 volym-%.

Under förkonditioneringen låter man den erhållna bland- ningen inkubera_vid rumstemperatur eller omgivningstemperatur, t.ex. ca 25°C, i ca 1 minut. Detta ger detergenten möjlighet att tillfredsställande utföra den avsedda verkningen.

Ett fixativ sätts till den inkuberade blandningen under omröring, och blandningens pH hållas vid neutralt värde. 1O 15 20 25 30 35 4 Företrädesvis är íixativet en fosfatbuffrad formaldehydlösning,7 och pfi ligger i intervallet 6 - 82 Blandningen inkuberas därefter vid en temperatur av 55 - 6åoC i minst 2 minuter, företrädesvis i 2 minuter vid 5800.

I detta skede spädes blandningen eventuellt och mätes optiskt. För bestämning av antalet blodplättar sker spädning med f en surgjord isoton saltlösning, och den erhållna blandningen har ett pH-värde av 2 - 4. En suspension med 0,5 % ättíksyrakoksalt ger en lämplig utspädning, ett lämpligt förhållande mellan blod- plättsignalen och bruset, ren separation av blodkroppar från röda fantomceller och leukocyter, och de ursprungliga individu- ella plättvolymerna är välbevarade. Det är även möjligt och i vissa fall föredraget att partiellt späda provet genom tillsats av en isoton koksaltlösning före tillsatsen av detergenten.

För bestämning av vita blodkroppar spädes provet genom tillsats av en isoton koksaltlösning åtminstone partiellt efter 'inkubationen. Alternativt kan provet spädas åtminstone delvis före tillsatsen av detergenten. _ Den med den angivna metoden erhållna suspensionen av vita blodkroppar spådd med en isoton koksaltlösning bevarar de vita blodkropparnas morfologi, tillåter differentiering av ofär- gade vita blodkroppar genom ljusspridning med liten och stor vin- kel och tillåter differentiering mellan lymfocyter, monocyter, neutrofiler och eosinofiler utan färgning.

Förfarandet bevarar även de vita blodkropparnas peroxflhs- aktivitet och tillåter därför även differentiering mellan två eljest svårt särskiljbara grupper av leukocyter, nämligen peroxidasaktiva och -inaktiva agranulocyter.

Den framställda suspensionen kan användas för klinisk hematologisk analys genom ljusspridning och den kan lagras för användning som referens i ett sådant system.

Exempel 1 Makrometod 'Till ett antikoagulerat helblodprov (0,1 ml) sätts 0,32nfl 1-procentig lösning av polyoxietylen-20-sorbitanmonolaurat (i _ isotonisk koksaltlösning), och den erhållna blandningen inkuberas i rumstemperatur i ca 1 minut. Fosfatbuffrad formaldehydlösning (0,42 ml) innehållande 8 volymprocent formaldehyd sätts till 10 15 20 25 å. .fb CW 5 blandningen under omrörning, och den erhållna blandningen inku- beras i 5700 i 2 minuter.

A Bestämning av vita blodkroppar Till den inkuberade blandningen sätts isotonisk saltlös- ning (1,2 ml), och antalet vita blodkroppar bestäms i en differen- tiell mätning genom ljusspridning.) B Bestämning av blodplättar Till den angivna inkuberade blandningen sätts isotonisk saltlösning (1,2 ml). 0,1 ml av den erhållna blandningen sätts till 4,0 ml av en 0,5-procentig lösning av ättiksyra i isotonisk saltlösning. Blodplättsräkning och storleksmätning utföres med ljusspridning. _ gxempel 2 Mikrometod 0,01 ml antikoagulerat kapillärhelblod spädes i ett för- hållande av 1:10 med en isotonisk saltlösning, och den erhållna blandningen (0,1 ml) sätts till 0,32 ml 0,125-procentig lösning av polyoxietylen-20-sorbitanmonolaurat (i isotonisk saltlösning).

Den erhållna blandningen får inkubera vid rumstemperatur i ca 1 minut. Fosfatbuffrad formaldehydlösning (0,42 ml) innehållande 8 volymprocent formaldehyd sätts till blandningen under omröring, och den erhållna blandningen inkuberas vid 57OC i 2 minuter.

A Bestämning av vita blodkroppar Differentiell räkning av vita blodkroppar i den angivna uppslamningen mättes genom ljusspridning.

B Bestämning av blodplättar Till den angivna inkuberade blandningen sätts isotonisk saltlösning (1,2 ml). 0,1 ml av den erhållna blandningen sätts till 1,0 ml 0,5-procentig ättiksyra i isotonisk saltlösning.

Blodplättsräkning och storleksmätning genomförs med ljusspridning.

Claims (1)

1. 0 20 25 30 35 446 911 6 EÉÉENTKRAV 1. Förfarande för beredning av en cellsuspension från ett blodprov för särskiljning av vita blodkroppar och blod- plättar från andra blodpartiklar, k ä n n e t e c k n a t av att man (a) behandlar ett antikoagulerat blodprov med en dntorgent, som förkonditionerar de röda blodkropparna för påföljande lyucring utan att skada de vita blodkropparnas morfologi, (b) tillsätter ett fixativ under omblandning, sam- tidigt som man håller blandningen vid neutralt pH, och (c) inkuberar blandningen vid en temperatur av 55 - BZOC i minst 2 minuter. 2'. l'í5rJ}.u.=u1uš«.- enligt pahzlltkr-.lvut i, k ü nn c l. e c: k- n a t -av att detergenten är polyoxietylen-20-sorbitanmono- laurat,-som tillsätts i en sådan mängd att blandningen får en koncentration av 0,3 - 2,0 volymprocent. 3;" _Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n n e- t e c k n a t av att man i steg a inkuberar det med detergent behandlade blodprovet vid rumstemperatur i 1 minut. H. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 3, k ä n- n e t e c k n a t av att blandningen i steg b efter tillsat- sen av fixatív hålles vid ett pH av 6 - 8. 5. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - H, k ä n- n e t e c k n a t av att fixativet är en fosfatbuffrad formal- dehydlösning. 6. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 5, k ä n- n e'te c k n a t av att temperaturen isteg c är 58°C och in- kubationstiden 2 minuter. I 7. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 6 för bestämning av vita blodkroppar, k ä n n e t e c k n a t av att provet efter inkuberingen (c) utspäds åtminstone delvis med en isotonisk saltlösning och att den erhållna blandningen har ett pH-värde av 6 - 8,5. 8. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 6 för be- stämning av vita blodkroppar, k ä n n e t e c k n a t av att provet före behandlingen med detergenten i steg a utspäds åtminstone delvis. »H * 1, 10 446 911 7 9. _ Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 5 för räkning av blodplättar, k ä n n e t e c k n a t av att provet efter ínkuberingen c utspäds åtminstone delvis med en sur isotonisk saltlösning ochatt den erhållna blandningen har ett pH av 2 - 14. lu. . Förfarande enligt patentkravet 9, k ä n n e tre c k- n a t av att den isotoniska saltlösningen surgöres genom en tillsats av ättiksyra. ll. 'förfarande enligt patentkravet 9, k ä n n e t e c k- n a t sats av isotoníek saltlösning före behandlingen med detergent av att utspädningen av provet görs delvis genom till- i steg a.