JPS62242854A - 血液の血小板凝集阻止方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 イ、産業上の利用分野 この発明は血液を採取した試料を用いて血液中の血小板
の数を測定するに際し血小板の凝集を防止して正確な血
小板の数の測定値を得るための方法、即ち血液中の血小
板の凝集を駆出する方法に関するものである。

口、従来技術 血液中の血球、血小板の数を測定するには、直接に計算
盤で肉眼により計数算定する方法（几ｅｅｓｂｅｃｋｅ
ｒ法、　Ｂｒｅｃｈｅｒ−Ｏｒｏｋｉｔｅ法。

Ｐｉｅｔｔｅ−Ｐｉｅｔｔｅ法〕があり、間接的に、は
Ｉｉ’ｏｎｉ。

法（抗凝固静脈塗抹法）があるが、最近は自動血球計数
器による方法が許及してきている。

一般に血液の各種の特性を測定するには、通常採血した
血液を、（ａ）添加剤を加えず血球等を沈降させて血清
中の成分を測定する、（ト））弗化物等を添加し血球等
の活性による糖分の分解専を阻止しておいて血清中の糖
分、乳酸等を測定する、（ｃ）抗凝固剤（凝固阻止剤）
を添加して血球等の凝固を阻止しておいて血球や血小板
の数を測定する、の３種類に採血試料を分割しく場合に
よりもっと多くに分割することもある）でそれぞれの特
性を測定する。この内（Ｃ）の場合抗凝固剤としては、
ｆｆＤＴＡ（エチレンジアミンテトラアセチックアシド
）基塩（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　２　Ｋ　ｔ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　
Ａ　　２　Ｎａ等）が血球に対する影響が少なく優れた
抗凝固剤として多く用いられている。その池にもクエン
酸ナトリウム（例えばクエン酸ナトリウムを主成分とす
る米国薬局店によるＡＯＤ−Ａ液がある）、シュウ酸ナ
トリウム、シュウ酸アンモニウム、硫酸マグネシウム等
のアルカリ塩が抗凝固剤として検討されている。

自動血球計数器による血小板数の測定は、前記（Ｃ）の
抗凝固剤を添加した全血を希釈して細管を通過させ容積
の相違により白血球、赤血球、血小板を分別して計数す
る方法も開発されているが、現在は前記（Ｃ）の全血を
遠心分離して赤血球と白血球を除いた多血小板血漿（以
下ＰＲＰという）を造り、これを希釈して自動血球計数
器にかけ、血小板が自動血球計数器の検出孔（細孔）を
通過する際に生ずる電気抵抗の変化、または静電容量の
変化を電気的パルスに変換して計数するのが管通である
。

八　発明が解決しようとする問題点 血小板は速やかに凝集したり容器の壁面に粘着し且つ容
易に破壊されるので採血後直ちにこれを防止する抗凝固
剤と混合し、手早く操作する必要がある。即ち血小板は
非常に活性で且つ血液の凝固に関係がある細胞である。

ところが前記従来の抗凝固剤では血液の凝固は阻止され
るか血小板同志の凝集（凝塊となること）は阻止されな
い。

この血小板凝集が起こるとＰ几Ｐを自動血球計数器にか
けた時、血小板の凝塊を一個と計数するし、また全血の
場合には凝塊は容積が大であるので他の血球（赤血球、
白血球）と誤って計数してしまい、結局いずれの測定に
おいても実際の血小板数より低い値しか得られない。即
ち全血で血球数を測定する場合は血小板数の値が減少す
ると同時に血球数の値が大に測定される。いずれの場合
にもこれらは大きな欠点となる。また目視測定の場合に
も測定を誤る危険がある。

抗凝固剤として通常多用されるＥＤ　’Ｉ’Ａ塩系の抗
凝固剤では或種の被検患者でＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ塩のために
特異的な血小板凝集が起こり、見掛は上異常な血小板減
少を来たすことが知られ問題となっている。Ｇｏｗｌａ
ｎｄや５ｒｅｉｎｅｒがこれをＥＤ’ｌｌ’Ａ依存性偽
性血依存性生性血小板減少症て以来、我が国でも多くの
症例が報告されており、この点からもＥＤＴＡ塩系の抗
凝固剤は再検討を要する実状である。

二１問題点を解決するための手段 本発明者等は従来の血液検査における抗凝固剤の前記欠
点を克服すべく鋭意研究を行った。その結果、血小板は
その活性により解糖作用を行っているが、血小板の糖、
エネルギー代謝の解糖径路の酵素群中のホスホフルクト
キナーゼの作用が血液のｐＨを低下（酸性化）すると速
効的に阻止されて解糖作用が阻止されると共に血小板の
凝集能も強力に抑制され、検査過程での血小板凝集を完
全に阻止できること、またｆｆＤＴＡ偽性血小仮性血小
板減少症の場合にも同様に血小板凝集を阻止できて正し
い値を測定できることを見い出し本発明をなしたもので
ある。

すなわち本発明は血液検査実施に際して、採取した血液
試料に各種の酸を用いて血液と混合した時、血液のｐＩ
■が６．５以下に調整されるようにした抗凝固剤を使用
することによって血小板の凝集を速効的に阻止すること
を特徴とする血小板の凝集阻止方法である。

例えば蔵本厚氏の「血小板の糖、エネルギー代謝と機能
」（血液と脈管、第１６巻、３４３〜３５４頁、１９８
５）には、血小板機能に直接関与するエネルギーは嫌気
的解糖系と酸化的リン酸化反応で形成され供給される。

この両代謝系の各々の阻害剤を使用してＡＴＰ合成の抑
制の度合と各種血小板機能への影響は、まずアラトキシ
ン酸遊離が抑制され、次いでＡｃｌｄｈｙｄｒｏｌａｓ
ｅ分泌の抑制、α顆粒放出、濃染顆粒放出、そして凝集
、形態変化の抑制が見られる。また血小板は形態保持の
ために、刺激されてない状態でも主として嫌気性解糖径
路と’ｒＯＡ回路からＡ’ｌ’Ｐを補給している。非刺
激状態での解糖系調節酵素はホスホフルクトキナーゼと
ピルビン酸キナーゼが律速酵素と考えられている」こと
が示されており、この現象は公知になっている。しかし
この論文には血液を酸性にする抗凝固剤を混合して血液
を酸性にすることにより嫌気性解糖系を速効的に阻止し
且つ血小板の凝集を同じように速効的に抑制することに
ついてはなんの示唆もなく、且つこの効果を血液検査に
利用することも示唆されていない。

また本発明者等は血液の糖分測定のために血液を酸性と
して血液中の解糖を阻止する方法を見い出して「血液中
の解糖阻止方法」（特願昭６Ｏ−１００１６１）を出願
した。この出願は血液中の糖分を測定するための方法で
あり、抗凝固剤を用いるものでなく、本発明とは目的、
構成、効果を異にするものである。

通常血液のｐｌ（は７．３〜７．４であるが本発明にお
いては酸を加えて血液がｐＩ−Ｉ６．５以下になるよう
に調整した抗凝固剤を使用する。酸としては有機酸、無
機酸のいずれでもよい。多くの酸は抗凝固性を有しない
ので通常の抗凝固剤と混合し、血液と溶解混合した時に
ｐＨが６．５以下になるように調整する。併用する抗凝
固剤としては従来用いられる抗凝固剤ならいずれでも良
いが一般にＥＤＴＡ塩を使用するのが好ましい。

特にクエン酸はそれ自体で抗凝固作用を有するので単体
で本発明方法の抗凝固剤として使用できる。

さらに血液を酸性にすると血小板は膨化する傾向がある
が、本発明の抗凝固剤に食塩を加えておくと、食塩は細
胞内の水分を細胞外に引き出し細胞容積を正常に戻す効
果があるので併用するとよい。クエン酸と食塩は生体に
無害であるので、クエン酸を酸性の抗凝固剤として用い
食塩を加えて水溶液として調整し、予め採血時に注射器
に適量吸入しておき、その注射器を用いて直接採血して
血小板凝集抑制を最も効果的にした血液採取をすること
ができる。

本発明を実施するには、容量１．５〜２．　Ｏｐａｌの
採取管のなかに前記のように調整した抗凝固剤を顆粒状
、粉末状、或いは液状で血液と混和した時血液が前記の
ｐＨになる量だけ予め入れておき、採血した血液を直ち
にこの採取管の中に１．５〜２．０ｔｘｌを入れて混合
する。そうすると血液は凝固を阻止され且つ容易に適当
なｐＨとなり血小板の凝集が阻止されるので、その試料
を従来と同じ方法（全血或いはＰＩＬＰを調整して）で
自動血球計数器によって血小板数を測定すれば良い。

ホ、実施例 実施例１ 同一の健常体から採取した検体（血液）に従来の各種の
抗凝固剤及びクエン酸単体の抗凝固剤を添加してｐＨを
測定し、これをＰＲＰとした後自動血球計数器（東亜医
用電子は、製Ｅ−４０００型）により血小板の数を測定
した。結果は第１表の通りであった。

第１表 この血液の目視法による測定値は３６．４Ｘ１０’／−
であった。

以上の結果から各種の抗凝固剤中でＥＤＴＡ−２Ｋ（Ｅ
ｉ）ＴＡ塩）が最高の１直を示しているが、それでも本
発明品に比し約５ｘｔＯ／＋ｍ少なく、また本発明品を
用いると現在段も確実とされている目視法による測定値
と一致していることが分かる。

実施例２ 多数の被検者（１０名）から血液を採取し、Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａ　−２Ｋを抗凝固剤とし用いた場合とＥ　Ｄ　Ｔ　
Ａ　−２Ｋに酢酸を加えて血液と混合した時ｐＩ−Ｉ５
．８となるように調整した抗凝固剤を用いた場合の血液
をＰＲＰ法で自動血球計数器（実施例１と同じ）により
測定した。結果は第２表の通りであった。

以下余白 、表−２− 第２表　血小板数　１０／− 以上の結果から、全ての被検者の血液で本発明の抗凝固
剤を使用した値の方が高い値を示し、血小板の凝集が防
止されていることが分かる。

実施例３ 通常の健常者の血液を採取して、クエン酸ナトリウムを
抗凝固剤としたものと実施例２に用いた抗凝固剤を用い
たものを試料とし、ＰＲＰを造った。このＰＲＰに血小
板の凝集促進剤としてＡＤＰ（アデノシン２リン酸）を
ｌ　ＯｌｚＭｏｌを加えて血小板の凝集を濁度により観
察した。結果は＠１図の通りであった。

即ちクエン酸ナトリウムを用いた場合はＡＤＰの添加直
後から血小板の凝集が起こり濁度が変化するが、本発明
品を用いると殆ど変化がなく凝集作用が認められず、即
ち血小板の凝集能が抑制されていることが分かる。

実施例４ 実施例２で用いた本発明の抗凝固剤を３〜１０＃ｌ！７
／ｌｘｔ及びＥＤＴＡ−２Ｋｓｐｇｙ／肩ｔを実施例３
の血液に混合してＰＲＰを造り、そのｐＩｌ、血小板数
を測定した。同時に解糖が阻止されている程度を測定し
た。結果は第３表の通りであった。

第３表　（血小板数　ＸＩＯ／ｄ） 以上の結果から、本発明の抗凝固剤を使用してｐＨ６，
５以下になるようすると血小板の凝集が阻止されている
ことが分かる。同時に解糖作用も不十分であっても阻止
されている。

実施例５ あらかじめクエン酸４１９　／ｌｌ　（血液当たり）を
入れた試料採取管に血液を入れて十分混和した。

血液のｐＨは７．３であり添加後はｐＨ５，７となった
。この試料を８００Ｇ、１０分間遠心してＰＩ’ＬＰ（
多血小板血漿）を得、自動血球計数器で血小板を測定し
たところ、血小板数はＥＤＴＡ−２Ｋを使用した場合に
比し、平均４００００ケ／−高い１直を得た。このＰ　
Ｉ′ＬＩ）を２４時間常温で保存して測定したがｆＬｌ
ｌＪ定値の低下は認められなかった。

実施例６ あらかじめクエン酸２．５　ｍｙ　／１ｔｔｔ　、クエ
ン酸ナトリウム１．０　Ｍ９／ａｔ、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
−２Ｎａ塩３．５Ｑ／ｙｔｔｔ（それぞれ血液当たり）
を顆粒状として入れた試料採取管に血液を入れてよく混
和した。血液のｐＨは採取時に７．３であり、混和後は
ｐＨ６．０となった。この試料を８００Ｇ、１０分間遠
心してＰＲＩ’　（多血小板血漿）を得て、自動血球計
数器で血小板数を測定した。一方Ｅ　Ｄ　’ｆ’　Ａ　
−２Ｋ塩単独使用の試料による測定結果と比較したとこ
ろ約４００００ケ／−高い測定値を得た。また本発明品
を使用して得た値は目視法による値とほぼ一致していた
。

実施例７ あらかじめクエン酸４ダ／肩ｔと食塩（ＮａＣ１）（そ
れぞれ血液当たり）を入れた試料採取管に血液を入れて
よく混和した。血液のｐＨは７．３であり、混和後はｐ
Ｈ５．４となった。この試料を８００Ｇ、１０分間遠心
してＰＲＰ（多血小板血漿）を得、自動血球計数器にか
け血小板数を測定したところ、血小板数は目視法の値と
良く一致し、且つ測定が容易であった。

実施例８ 健康人のＥＤＴＡ塩採血から造ったＰＩｔＰ（多血小板
血漿）にＥＤＴＡ依存性依存性手性血小板減少症例血清
を添加すると血小板が凝集することが知られている。

健康人からＥＤＴＡ塩を抗凝固剤として用いて採血しＰ
ｎＰを造った。このＰ几Ｐ１容にＥＤＴＡ依存性依存性
手性血小板減少症例血清を１容を混和して自動血球計数
器で血小板数を測定したところ、元のＰＲＰに換算して
血小板数が半減している値を得た。またこの混和物で造
った塗抹標本を観察したところ明らかな血小板の凝集塊
があることが確認できた。

一方向じ健康人からクエン酸を用いた本発明品を抗凝固
剤として採血して造ったＰＲＰにｌ：１の割合でＥＤＴ
Ａ依存性依存性手性血小板減少症例血清を混和して血小
板数を測定したところ、血小板の減少は認められなかっ
た。またこの混和物の塗抹標本を観察したが、血小板の
凝集塊が存在しないことが確認できた。

へ　発明の効果 以上に詳しく説明したように、本発明は血液の血小板数
を測定する際、予め血液と混和した時ｐＨ６，５以下と
なるように調整した抗凝固剤を採取した血液に混合して
試料血液のｐ　Ｉ−Ｉを６．５以下に酸性化することに
よって血小板の凝集を阻止して血小板数を測定するよう
にしたもので、従来の抗凝固剤では不正確であった測定
を正確且つ精密に測定できるようにした有効なものであ
る。この方法によれば特に自動血球計数器を用いる場合
、全血で血球数測定する時は血小板、赤血球、白血球の
各数値を正確に測定でき、またＰＲＰを用いる時も正確
な血小板の値を得ることができる。目視による測定の場
合にも測定が容易になる効果を有する。

また本発明の方法によればＥＤＴＡ依存性依存性手性血
小板減少症者の場合にＥＤＴＡ塩系抗凝固剤を用いても
血小板の減少が生ぜず正しい血小板数の値が得られる効
果を有するものである。

さらに従来血液測定には糖分測定用と血球数測定用に血
液を分割していたが、これを−個の試料で兼用すること
ができる可能性を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗凝固剤を添加した血液のＰＲＰ　（多血小板
血漿）中の血小板の凝集能を測定した結果を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血液中の血小板数を測定する検査において、血液に
   混合した時血液のｐＨが６．５以下になるように調整し
   た抗凝固剤を採取した血液に混合して血液を酸性化する
   ことを特徴とする血液の血小板凝集阻止方法 ２、各種酸の一種或いは数種を通常の抗凝固剤に配合し
   た抗凝固剤を用いることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項記載の血液の血小板凝集阻止方法 ３、ＥＤＴＡ塩に各種酸の一種又は数種を配合した抗凝
   固剤を用いることを特徴とする特許請求の範囲第１項若
   しくは第２項記載の血液の血小板凝集阻止方法 ４、クエン酸単体を酸性の抗凝固剤として用いることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の血液の血小板凝
   集阻止方法 ５、血液の採取管に予め血液に混合した時血液のｐＨが
   ６．５以下になるように調整した抗凝固剤を顆粒、粉末
   或いは液状で入れておき、該採取管に血液を注入して試
   料とすることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第
   ４項いずれかに記載の血液の血小板凝集阻止方法 ６、クエン酸と食塩の混合水溶液を予め注射器に適量吸
   入し、該注射器に採血することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第４項いずれかに記載の血液の血小板凝
   集阻止方法