SE440830B - Anvendning av produkter bildade vid sammankoppling av minst tva biologiska substanser med bensokinon for analys av antigener och antikroppar i biologiska vetskor - Google Patents

Description

\.J'l 10 15 20 25 BO 35 40 7909965-1- a å ena sidan utbytet vid reaktionen och å andra sidan aktiviteten hos de biologiska substanserna, speciellt proteiner, när dessa exempelvis är enzymer, antikroppar,etc.

Det skulle sålunda vara önskvärt att förfoga över ett kopp- lingsmedel, som samtidigt medger höga utbyten i fråga om sammankopp- ling och skyddar en väsentlig andel av den biologiska aktiviteten hos makromolekylerna.

Enligt föreliggande uppfinning åstadkommes ett nytt förfarande för sammankoppling av minst två biologiska substanser sinsemellan medelst kovalenta bindningar med hjälp av ett bryggbildande ämne, vilket bryggbildande ämne är bensokinon.

Förfarandet enligt uppfinningen kännetecknas av följande steg: (a) behandling av den första substansen med ett stort över- skott av bensokinon, vilken reaktion, som benämnes aktivering, utföres i homogent vätskeformigt medium (b) eliminering av produkterna från reaktionen i steg (a) och överskottet av bensokinon samt utvinning av den aktiverade substansen, (c)' åstadkommande av kontakt mellan den aktiverade substansen och den andra substans, som skall sammankopplas.

Ett väsentligt kännetecken för det nya förfarandet är att aktiveringsbehandlingen i steg (a) utföres i lösning. Detta är speciellt viktigt när det rör sig om sammankoppling av ett"aktiverat" protein med ett annat protein eller med en partikelformig substans, t ex röda blodkroppar.

Steg (a) av förfarandet utföres genom att den första substansen, såsom ett protein, upplöst i något lämpligt medium, bringas i kontakt med bensokinonen i lösning.

Som lösningsmedel kan man använda praktiskt taget vilket som helst lösningsmedel eller vilken som helst blandning av organiska lösningsmedel som är blandbara med vatten och i vilka bensokinonen är löslig. Man använder buffrade vattenbaserade media, i vilka den första substansen, såsom ett protein, är löslig.

Enligt uppfinningen väljer man Dessa media är välkända för fackmannen på området. sådana media, vars pH ligger mellan ca 5,5 och ca 9, varvid det optimala pH-värdet är 6 - 6,2.

Ett lämpligt lösningsmedel för bensokinonen är en lägre ali- fatisk alkohol, Generellt gäller att man enligt uppfinningen åstadkommer såsom etanol. sammankoppling av substanser, varav vissa sinsemellan uppvisar förmåga att gå i lösning i ett organiskt lösningsmedel som är blandbart med vatten, vilket gör det möjligt att utföra aktiveringen 10 15 20 25 BO 35 40 - n' ilx _3 _ p , 7909965-1 i steg (a) i lösning. I fallet proteiner}är}det sålunda fördelaktigt att behandla dessa med bensokinonen i lösning för att undvika irreversibel insolubilisering av proteinet.

Reaktionen med bensokinonen utföres vid en temperatur, som företrädesvis icke överstiger +22°C,ti1l dess att kopplingsmedlet är fixerat vid den substans som skall aktiveras, såsom proteinet, t ex under en tidsperiod från några minuter till 24 timmar, speciellt av storleksordningen en halv timme.

Under aktiveringsreaktionen med bensokinonen, är det lämpligt att använda ett stort överskott av kopplingsmedlet i förhållande till den substans som skall aktiveras, såsom proteinet. Överskottet av bensokinon räknas såsom förhållandet mellan antalet molekyler av reaktanten (bensokinon) och antalet molekyler av den substans, som skall aktiveras.

Storleken av överskottet av bensokinon är kritisk vid före- liggande uppfinning. För alltför låga värden sker det ingen eller praktiskt taget ingen aktivering. otillräcklig för att ge en sammankoppling. sålunda mycket stora överskott av bensokinon, vilket gynnar aktiverings~ Uttryckt i moler bör värdet för överskottet av benso- Aktiveringen är följaktligen Företrädesvis användes reaktionen. kinon i förhållande till den substans som skall aktiveras, t ex ett protein, vara minst lika med 200, t ex större än eller lika med 1000.

Ett lämpligt praktiskt värde är 2,5 X 105.

Elimineringen av reaktionsprodukterna och överskottet av bensokinon kan exempelvis åstadkommas medelst passage genom en kolonn för molekylfiltrering, såsom en kolonn som saluföres under varu~ beteckningen "Sephadex".

Enligt uppfinningen kan den "aktiverade" substansen efter reaktionen med bensokinonen sammankopplas med en annan biologisk substans 1 syfte att åstadkomma sammankoppling av tva substanser med hjälp av kovalenta bindningar. De betingelser som gäller för denna sammankoppling är relativt kritiska. Man arbetar vid en temperatur understigande 2200 eller ännu hellre ÄOC, varvid den tid som är tillräcklig vid 22°c är 24 timmar och vid noe M8 timmar.

Sammankopplingen utföres företrädesvis i ett medium, som samtidigt tjänstgör som lösningsmedel för substanserna. om dessa är lösliga, vilket är fallet för proteiner, i ett buffertmedium. Denna koppling kräver ett svagt alkaliskt pH-värde mellan 8 och 9, och närvaro av karbonatjoner föredras. Man arbetar i allmänhet med ett överskott av märksubstanser i förhållande till den andra substansen. möjligt att erhålla en sammankoppling med ekvimolära andelar av Det är 10 15 20 25 30 35 40 7909965-1 de substanser, som skall sammänkopplas. .-11-- Man kan emellertid, beroende på de speciella förhållandena, som skall behandlas med benso- kinonen, i förhållande till den substans, använda ett överskott av den substans, som skall sammankopplas, eller ett överskott av icke behandlad substans, som skall samman- kopplas, i förhållande till den substans som behandlas med benso- kinonen. Alltefter omständigheterna är sålunda variationerna ifråga om kvantitet av storleksordningen l:till 4 (förhållandena uttryckta som molförhållanden).

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning är speciellt lämpligt i det fall då ett av proteinerna är en antikropp och det andra proteinet är ett enzym.

Bensokinonderivaten existerar ofta i orto- och para-form, varvid man kan använda den ena eller den andra av dessa isomerer eller en blandning av de båda. med para-bensokinon.

Det har befunnits, kinon gör det möjligt att uppnå höga utbyten vad beträffar samman- koppling, vilka utbyten överstiger 30% och kan uppgå till 65% eller mera beroende på de använda proteinerna.

Man föredrar emellertid reaktion att den ursprungliga användningen av denna Såsom angivits ovan kan förfarandet enligt föreliggande upp- finning användas för sammankoppling av antikroppar med enzymer, vilken sammankoppling kan användas för detektering eller dosering av antikroppar och antigener.

Intresset för detta medel ligger i möjligheten att kontrollera dess reaktion med makromolekylerna. Vid pH 6 fixeras bensokinonen vid proteinmolekylerna under bildning av monosubstituerade derivat, och det måste föreligga ett alkaliskt pH för att den andra reaktionen skall bli möjlig, antingen med en annan molekyl av samma protein under bildning av polymerer eller med en annan molekyl av ett annat protein under bildning av konjugat. användas vid sammankopplingsreaktioner som utföres under två tids- perioder och härvid under helt och hållet kontrollerbara betingelser.

Detta gör att bensokinonen kan Förfarandet möjliggör vidare sammankoppling av makromolekyler och röda blodkroppar, eftersom användningen av bensokinon som brygg- bildare gör det möjligt'att utföra reaktioner, vars känslighet klart överstiger den som tidigare erhållits med andra sammankopplings- medel, t ex med glutaraldehyd. ^ Fackmannén på området inser givetvis att förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan användas för sammankoppling av två eller flera makromolekyler eller blandningar av makromolekyler. 10 15 20 30 35 40 7909965-1 _ 5 _ Utan att uppfinningenIänïoešvänsadftillïnågon speciell teori, antar man att de anmärkningsvärda resultat som har erhållits medelst för- farandet enligt uppfinningen beror på det faktum att bensokinonen kan reagera med andra grupper än aminogrupperna, för vilka talrika reaktanter redan har använts: glutaraldehyd, karbodiimiderna, di- isotiocyanaterna, bis-diazobensidin, etc. 'Denna kinon reagerar med osidgrupperna utan att förändra de antigenbestämmande grupperna i dessa molekyler.

Artikeln av Martin Morrison et al [Archives of Biochemistry and 154, 515-525 (i969j] med titeln "The reaction of benzo- visar att bensokinonen reagerar Biophysics quinone with amines and proteins" med aminosyrorna under mycket milda betingelser. Bensokinonen kan sålunda leda till additionsprodukter med proteinerna under bildning av kovalenta bindningar med hög energi. Författarna till denna artikel har exempelvis studerat fixering av bensokinonen c och har visat att produkterna härrörande från denna reaktion upp- visar förmåga att katalysera oxidationen av askorbater, vilket kan vara av intresse för studium av biologiska system.

Det torde i detta sammanhang noteras, att nämnda artikel inte i något fall talar om en sammankoppling av olika proteiner medelst bensokinonen. Artikeln avslöjar enbart en additionsreaktion för bensokinonen på ett protein och härvid är de reaktionsbetingelser, Morrison et al,sådana att de möjlig- (cytokrom 0); på cytokromen som beskrivs i artikeln av Martin gör en enkel addition av bensokinonen till proteinet speciellt gäller att det molära överskottet av bensokinon i förhållande till proteinet är maximalt lO:l. Det bildas sålunda, vid reaktionen, mellan bensokinonen och glycinen vid ett molförhållande glyoin/benso- kinon inom området från 1 till 10, mono- och disubstituerade glycin- kinon derivat. Dessa reaktionsbetingelser gör det icke möjligt att erhålla, efter det att proteinet och bensokinonen har bringats i kontakt med varandra, ett aktiverat protein med förmåga att i sin tur reagera med en annan biologisk substans. Speciellt gäller att artikeln av Martin Morrison icke avslöjar att ett mycket stort molärt överskott av bensokinon i förhållande till proteinet är kritiskt för att man skall erhålla ett aktiverat protein. Dessutom gäller att dessa förfat~- tare enbart arbetar vid pH 8 och icke omnämner möjligheten att kontrol- lera additionsreaktionerna.

Artikeln av Johny Brandt et al Efiiochimica et Biophysica Acta 386 (1975) 196-202] med titeln "Covalentättachment of proteins to polysaocharide carriers by means oflienzoquinone" beskriver fixering med hjälp av kovalenta bindningar av proteiner vid fasta bärare av 10 15 20 25 50 35 ÄO 7909965-1 _ .ri- __. polysackaridermedhjälp av bensokfnqnösomfkgpplíngsmedel. Författar- na använder sig av geler av agaros och av dextran, som reagerar med bensokinonen i heterogen fas, varvid gelerna föreligger i fast till- stånd i ett buffertmedium och bringas i kontakt med en lösning av bensokinon. De aktiva gelerna överföres i_suspension i ett buffert- medium för kopplingsreaktionen varigenom proteinet fixeras vid gelen medelst kovalenta bindningar. Dessutom föreslår J. Brandt et al en reaktionsmekanism för sammankopplingen.

Man kan sålunda konstatera, att artikeln av Brandt et al hän- för sig till ett förfarande, vid vilket man utnyttjar en olöslig bärare. Proteinet fixeras på gelen, t ex av dextran, varvid för- farandet speciellt utnyttjas för att insolubilisera proteinet.

I motsats härtill utföres aktiveringsreaktionerna enligt förçliååandê uppfinning i vätskefas under kontrollerade betingelser i syfte att därefter tillåta kvalitativa och/eller kvantitativa uppmätningar och doseringar i vätskefas. För exempelvis titrering av antikroppar eller antigener genom hemolys drar man fördel av den egenskapen hos röda blodkroppar att undergâ en hemolys som sker under färgning av det vätskeformiga titreringsmediet. Denna titreringsteknik blir möjlig tack vare det faktum att produkterna enligt föreliggande upp- finning uppvisar förmåga att användas i vätskefas. De fasta poly- sackaridbärarna som är bärare av proteiner, såsom de som omtalas av J. Brandt et al, lämpar sig absolut icke för en sådan titrering.

Man kan vidare konstatera, att användningen av bensokinon som kopplingsmedel möjliggör mycket mera anpassningsbara och mycket mera omfattande tillämpningar än de kända kopplingsmedlen, såsom glutar- aldehyd. Fackmannen på området vet att, när man använder glutar- aldehyd för sammankoppling av olika proteiner, det är nödvändigt att mycket noggrant kontrollera reaktionen, vilket är svårt, ja t.o.m. ibland omöjligt. Man måste speciellt välja reaktionstid, pH, kon- centration av glutaraldehyd, molförhållande glutaraldehyd/protein etc. så att aktiveringsreaktionen icke hamnar utanför vissa gränser, som gör att proteinet polymeriserar och slutligen blir olösligt. Det är sålunda nödvändigt att i varje enskilt fall anpassa reaktionsbetingelser- na efter den aktivering som skall utföras med glutaraldehyden. För varje protein gäller sålunda specifika betingelser. När man därvid använder ett nytt protein, måste man utföra otaliga försök innan man kan komma fram till tillfredsställande reaktionsbetingelser.

För övrigt är det icke möjligt att med hjälp av glutaraldehyd aktivera sådana biologiska substanser som polysackariderna och nukleinsyrorna. Dess användning är begränsad till fria aminosyror DW 10 20 25 BO 55 Ä0 7909965-1 _ 7 _ eller till substanser som är bärare av aminosyragrupper. Användningen av glutaraldehyd är följaktligen starkt begränsad. _ I motsats härtill är bensokinonen ett kopplingsmedel som verkar under kontrollerbara betingelser, vilka kan generaliseras. Exempelvis kan aktiveringen utföras en timme vid pH 6 när det rör sig om pro- glykoproteiner eller polysackarider§ utan att risk för bild- Vid behandling av exempelvis proteiner när man iakttar de speciella aktiverings- utan risk för att teiner, ning av polymerer föreligger. sker aktiveringen alltid lätt, betingelser som gäller för föreliggande uppfinning, det bildas oönskade polymerer. Dessutom är bensokinonen ett kopp- lingsmedel med generell användning.

Uppfinningen gör det möjligt att uppnå som det hit- tills icke har varit möjligt att uppnå, speciellt icke med glutar- aldehyd.

Exempelvis kan man direkt aktivera en antikropp eller ett fragment Fab av antikroppar med bensokinonen och därefter medelst resultaß sammankoppling fixera en annan substans, som fungerar som märknings- substans och titreringsreaktant. En annan originell tillämpning av uppfinningen består i att fixera antikroppar på naturliga röda blodkroppar (d.v.s. som icke är kemiskt behandlade), vilka bevarar egenskapen att vara lösta och dessutom uppvisar förmåga att detektera motsvarande antigener, som är närvarande t.ex. 1 ett prov av vätska som skall testas. Såvitt vi vet, har dessa tillämpningar aldrig förverkligats enligt den tidigare kända tekniken.

Uppfinningen är användbar för en mycket intressant, specifik tillämpning vid dosering av antikroppar mot stelkramp och antikroppar mot DNA i humanserum.

En annan tillämpning i samband med dosering genom hemaglutination eller hemolys innefattar användning av ett aggregat för dosering av antikroppar, som är närvarande i en biologisk vätska, innefattande följande kombinationfi de röda blodkropparna sensibiliserade med antigen l, aktiverad med bensokinon, bidrar till att bilda ett standardområde med standard- antigenen och att åstadkomma reaktion med antikropparna 1 närvarande i det prov som skall testas; standardantigen 1; ett lösningsmedel, såsom fysiologiskt serum, och en mikroplatta för dosering, varvid hemolystestet utföres genom att man helt enkelt till den ovan definierade kombinationen sätter en kolv innehållande komplement.

Det ovan definierade aggregatet eller preparatet ligger likaså 10 15 20 25 50 35 ÄO 7909965-1 _ -8- inom uppfinningens ram. _ 2 _ _U Följande exempel är avsedda att ytterligare illustrera upp- finningen utan att för den skull begränsa densamma.

I Sammankoppling av proteiner eller glykoproteiner till makromolekyler Exempel l.

Sammankoppling av antikroppar från får anti Ig från möss eller deras fragment Fab med enzymer, såsom peroxidas: glukosoxidas och alkaliskt fosfatas, laktoperoxidas, B-galaktosidas. 1A Aktivering av proteinet Exempel lAl 5 mg perçxidas (eller andra proteiner) löstes i 0,8 ml 0jlM fosfat- buffert med pH 8. Bensokinonen tillsattes i en mängd av 6 mg i 0,2 ml etanol. Reaktionen_utfördes vid 22°C under 20 minuter i mörker. Överskottet av kinon och reaktionsprodukterna avskildes från det aktiverade peroxidaset på en smal "Sephadex"-kolonn G 25 (0,9 X 5 cm) som hade bringats i jämvikt med O,lM natriumbikarbonat.

Exempel 1A2 _ 5 mg peroxidas eller andra proteiner löstes i 0,8 ml O,lM fosfat- buffert med pH-värde 6. i 0,2 ml etanol. Reaktionen utfördes vid 2200 under en timme i mörker.

Bensokinonen tillsattes i en mängd av 6 mg Överskottet av kinon och reaktionsprodukterna avskildes från det aktiverade peroxidaset på en smal "Sephadex"~kolonn G 25 (0,9 x 5 cm) som hade bringats till jämvikt med O,lM natriumbikarbonat. lB Sammankoppling av proteiner sinsemellan Exempel lB-l 5 mg "aktiverat" peroxidas från exempel lA2 i l ml 0,lM natriumbi- karbonat sammankopplades med 5 mg Fab (eller 20 mg antikroppar) i lösning med 5 mg/ml i O,lM natriumbikarbonat. Sammankopplingen ut- fördes under 24 timmar vid en temperatur understigande 2200 eller 48 timmar vid 4°C.

Utbytena för sammankopplingen visade att ca 50% av Fab hade kopplats samman med 50% reagera i ett molförhållande av 1 till l, men att detta utbyte ökade peroxidas, när proteinerna bringades att till 65% när en molekyl Fab bringades att reagera med 4 molekyler "aktiverat" peroxidas. Under sistnämnda betingelser sammankopplas enbart 55% Fab med peroxidas, om detta hade aktiverats med aldehyd. ' Exempel lB-2 5 mg alkaliskt fosfatas, som hade "aktiverats" glutar- enligt exempel lA2, sammankopplades med 2,5 mg Fab (eller 10 mg antikroppar) betingelser som i exempel lB-l. under samma 10 15 20 25 ÉO ÄO 7909965-1 ' f) .ï _ Exempel lB-j 5 mg glykosoxidas, som hade "aktiverats" enligt exempel lA2, samman- kopplades med 1,25 mg Fab (eller 5 mg antikroppar) under samma be- tingelser.

Man erhåller identiska resultat om man istället först utför aktiveringen av antikropparna och därefter sammankopplingen med enzymet.

Exempel_l§¿¶ 5 mg antikroppar eller l,25 mg Fab sammankopplades med antikroppar, som "aktiverades" med 5 mg enzym, vilket utgjordes av peroxidas.

Det erhållna utbytet, d.v.s. den procentuella andel aktiverat Fab som fixerades vid enzymet, var praktiskt taget 75% vid användning av den teknik som beskrivits i exempel lB-1.

Andra försök utfördes under samma betingelser med glukosoxidas och alkaliskt fosfatas, B-galaktosidas och laktoperoxidas. De er- hållna resultaten var i huvudsak desamma som de som erhölls för per- oxidas, varvid man i varje enskilt fall använde ca 4 molekyler enzym per en molekyl aktiverat Fab.

Exempel lB5 ~ 1,25 mg Fab, som "aktiverats" enligt exempel lB2 sammankopplades med 5 mg Fab-antiperoxidas. I detta fall kan Fab-antiperoxidas utnyttjas för märkning, om man bringar det i kontakt med peroxidaset efter reaktionen för sammankoppling Fab-Fab anti-PO med antigenen.

Enzymerna och antikropparna behandlade med bensokinonen bi- behöll mera än 65% av sin aktivitet.

De olika kompositioner som erhölls enligt exempel l, användes med framgång för detektering av de immunoglobuliner som avsöndras från lymfcellerna hos immunicerade djur. Den använda tekniken var följande: celler härrörande från mjälten eller ganglierna från möss, som några dagar dessförinnan hade erhållit en antigeninjektion, ut- breddes på en mikroskopplatta, fixerades och inkuberades med fragmentet Efter tvättning detekte- Den upp- Fab anti Ig från möss kopplat till~enzymet. rades enzymet genom sin specifika cytokemiska reaktion. komna färgen gjorde det möjligt att i mikroskopet lokalisera reaktions~ sättet”för Fab. Med hjälp av en metod med successiva utspädningar av Fab kopplat till enzymet kunde man jämföra aktiviteten hos de samman- kopplade substanserna med de som framställdes med hjälp av glutar~ aldehyd. Känsligheten hos två reaktanter för samma koncentration av antikroppar var identisk. Med hänsyn tagen till utbytet ifråga om erhållen sammankoppling ser man att förfarandet enligt föreliggande uppfinning är överlägset det tidigare kända förfarandet, vid vilket 10 15 20 25 §O * .al V1 HO 7909965-1 _ lO_ man använder glutaraldehyd.

II Koppling av polysackarider i homogent vätskemedium till makro- molekyler Exempel 2 och 2 Sammankoppling av polysackarid T av Salmonella typhi till enzymer.

Exempel 2 ' ' Sammankoppling med hjälp av metoden med aktivering av polysackariden. 2A Aktivering av polysackariden 1 mg polysackarid T löstes i 0,8 ml av O,lM fosfatbuffert med pH- värde 6. 'Bensokinonen tillsattes i en mängd av 6 mg i 0,2 ml etanol.

Reaktionen utfördes vid 22°C under en timme i mörker. Överskottet av kinon och reaktionsprodukterna separerades från den "aktiverade" polysackariden genom filtrering på"Sephadex" såsom i exempel IA2. 2B Koppling av polysackarid T till enzymet l mg "aktiverad" polysackarid T i 1 ml O,lM natriumbikarbonat kopplades samman med 2 mg alkaliskt fosfatas (eller något annat enzym) i 0,2 ml O,lM natriumbikarbonat. Sammankopplingen utfördes under 24 timmar vid laboratorietemperatur.

Exempel 2 Sammankoppling med hjälp av metoden med aktivering av enzymet. 3A.Aktivering av enzymet Aktiveringen utfördes på samma sätt som i exempel lA2 under användning av ett enzym valt bland peroxidas, alkaliskt fosfatas och glykosoxidas. 3B.Koppling av enzymet till polysackariden l mg enzym "aktiverat" enligt exempel 3A i 0,2 ml O,lM natriumbikarbo- nat sammankopplades med l mg polysackarid i 0,1 ml O,lM natriumbi- Sammankopplingen utfördes under 24 timmar vid laboratorie~ karbonat. temperatur.

III. Koppling av nukleinsyror till makromolekyler Exempel 4 och 5 Koppling av ADN till ett enzym.

Exempel 4 Koppling med hjälp av metoden med aktivering av ADN NA. Aktivering av ANN l mg ADN löstes i 0.7 ml av en 0.lM fosfatbuffert med pH-värde 6. tillsattes i en mängd av 6 mg 1 0,2 ml etanol. Reaktionen 2200 under en timme i mörker. Blandningen filtrerades Bensokinonen utfördes vid "Sephadex" såsom i exempel lA. ÄB. Koppling av "aktiverad" ADN till peroxidas 1 mg "aktiverad" ADN i 1 ml av en O,lM fosfatbuffert med pH-värde 8 sammankopplades med 1 mg peroxidas i 0,1 ml O,lM fosfatbuffert med hjälp av 10 15 20 25 40 7909965~1 -11 -_ med pH 8. Kopplingen utfördes under 2ü timmar vid laboratorie- temperatur.

Exempel 5 Koppling med hjälp av metoden med aktivering av enzymet 5A. Aktivering av enzymet Aktiveringen utfördes på samma sätt som i eåempel IA2 under använd- ning av ett enzym valt bland peroxidas, alkaliskt fosfatas och glykosoxidas. 5B. Koppling av enzymet till ADN l mg enzym¿ som hade "aktiverats" enligt exempel 5A, i 0,2 ml 0,lM fosfat sammankopplades med l mg ADN i lösning i en O,lM fosfatbuffert med pH-värde 8.

IV. Koppling av makromolekyler till röda blodkroppar Eëempel 6 Förfarandet enligt uppfinningen användes för koppling av proteiner, glykoproteiner och "aktiverade" polysaokarider till röda blodkroppar i syfte att utföra hemagglutinations~ eller hemolysreaktioner . 6A. Aktivering av proteiner eller polysackarid Denna aktivering liksom filtreringen med hjälp av såsom beskrivits ovan i exempel lAl. 6B. Koppling av makromolekyler till röda blodkroppar l mg proteiner eller polysackarider, som hade "aktiverats" enligt exempel 6A i l ml O,lM natriumbikarbonat tillsattes 0,25 ml av botten- Efter 2 timmars omröring vid "Sephadex" utfördes satsen av tvättade röda blodkroppar. laboratorietemperatur tvättades de röda blodkropparna 5 gånger i det medium som användes för hemagglutinations- eller hemolysreaktionen.

De olika preparaten användes för detektering av à ena sidan närvaron av antikroppar eller antigener i biologiska vätskor, å andra sidan utsöndringen av celler, med hjälp av lämpliga metoder. a) Titrering av antikroppar med hjälp av hemagglutination eller eåmâlië- Eë§meâl= Dosering av antikroppar mot stelkramp i humanserum.

Det antiserum, som skulle filtreras, utspäddes med successiva volymer (0.05 ml) i en buffert innehållande Mg+++ och Ca+++ (nödvän- diga för hemolysreaktionen). De röda blodkropparna sensibiliserade med stelkramptoxinet medelst bensokinonen tillsattes (0,0l ml av en 5%-ig lösning) och behållarna omrördes för att de röda blodkropparna efter 45 minuter vid 37°c var hem- agglutinationsreaktionen klart synlig. Om man därefter tillsatte komplement, inträffade hemolysen av de röda blodkropparna H5 till 60 skulle suspenderas ordentligt. 10 15 20 25 Lä' L-u 7909965-1 minuter senare vid 57°C. Generellt gäller att upplösningen av de röda blodkropparna inträffade åtminstone 2 utspädningar senare än agglutinationen. b) Titrering av antigen genom hemagglutination eller hemolys Dosering av IgG i serum från möss. I ~ Detta serum från möss utspäddes på samma sätt som antiserumet i exempel a). De röda blodkropparna, som var sensibiliserade med antikroppen eller fragmentet Fab från antikroppen, tillsattes såsom i exempel a). Efter 25 minuter vid'57°C var agglutinationsreaktionen synlig. Man kunde fortsätta till hemolys genom tillsats av komplement såsom i exempel a).. c) Detekterlng av utsöndring av proteiner genom cellerna medelst tekniken med lokal hemolys Exempel: Detektering av utsöndring av antikroppar genom immunocyterna.

Den lokala hemolysreaktionen utfördes enligt den kända tek- niken med hemolys antingen i gel eller i vätskefas med cellerna härrörande från mjälte eller ganglia från det immuniserade djuret samt de röda blodkropparna sensibiliserade antingen med proteiner, glykoproteiner eller polysackarider.

För bestämning av inverkan av bensokinonkoncentrationen på aktiveringsreaktionen utfördes försök där peroxidaset aktiverades med bensokinonen under betingelser som var identiska med undantag av att olika kvantiteter bensokinon användes i varje enskilt fall. önskade resultat erhölls genom att man fixerade det aktiverade per- oxidaset vid röda blodkroppar och genom att man utförde hemolys.

Hemolys är ett lämpligt sätt för bestämning av utbytet vid en reaktion. Frånvaro av hemolys visar att fixering icke har ägt rum.

Graden av hemolys medger en kvalitativ utvärdering av utbytet vid reaktionen.

Reaktionsbetingelserna var identiska med de som omtalats ovan i exempel lAl. Den mängd peroxidas som användes vid reaktionen var 5 mg. De varierande mängderna bensokinon löstes varje gång 1 0,2 ml etanol. Resultaten anges i nedanstående tabell: 10 15 20 25 }O 7909965-1 _ 1; _ Peroxidas 5 mg 5 mg I = 5 må (kvantitet) : ' Bensokinon f (kvantitet) 6 mg P 6,6 mg 0,06 mg Hemolys 100% 25% ingen hemolys Ovanstående resultat visar den markanta inverkan som benso- kinonkonoentrationen har på utbytet vid reaktionen.

Föreliggande uppfinning är icke begränsad till de ovan an- givna utföringsexemplen, som enbart ges i illustrationssyfte.

Den kan sålunda generellt tillämpas på sammankoppling av biologiska substanser med hjälp av bensokinon.

V. Märkning in situ av cellbeståndsdelar under användning av Fab förenade med bensokinon.

Principen är följande: man arbetar med Fab som tidigare kopplats till bensokinonen på en bärare innehållande antigenen under betingelser för reaktion antigen-antikropp vid pH 6,5.

Efter eliminering av överskottet av Fab höjes pH-värdet till 8, vilket gör den fria kinongruppen aktiv. Om bärarens aminogrupper är blockerade, kommer bensokinonen att reagera med grupperna på den tillsatta märkningssubstansen i alkaliskt medium.

Exempel 7 7A. Aktivering av Fab Denna aktivering liksom även filtreringen på "Sephadex" utfördes så- som beskrivits ovan i exempel lA2. 7B. Markerigg in situ De fixerade cellerna i formol inkuberas i en lösning av Fab (O,5~ 1 mg/ml i NaCl, O,15M) under en timme. Efter tvättning i O,l5M NäCl inkuberas cellerna med en lösning av peroxidas (eller någon annan märkningssubstans) i O,lM natriumbikarbonat under minst 6 timmar.

Claims (5)

7909965-1 IH P A T E N T K R A V

1. l. Användning, för analys av antikroppar och antigener i biologiska fluida, av produkter härrörande från sammankopp- ling av minst två biologiska substanser medelst kovalenta bind- ningar under användning av bensokínon som bryggbildare, varvid nämnda sammankoppling sker genom att man: a) behandlar den första substansen, upplöst i ett lösnings- medel, med minst cirka 200 gånger dess molära mängd av benso- kínon, varvid denna reaktion, som benämnes aktivering, utföres i homogent vätskemedium, och varvid den första substansen är vald bland proteiner, glykoproteiner, polysackarider, nuklcin- syror eller andra biologiska substanser med förmåga att fixeras sinsemellan genom kovalenta bindningar, b) avlägsnar produkterna från reaktionen i steg a) och över- skottet av bensokínon och utvinner den aktiverade första sub- stansen, och c) bringar den aktiverade första substansen i kontakt med den andra substans, som skall sammankopplas, varvid nämnda andra substans är vald bland proteiner, glykoproteiner, poly- sackarider, nukleinsyror eller röda blodkroppar eller andra biologiska substanser med förmåga att fixeras sinsemellan ge- nom kovalenta bindningar.

2. Användning enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att den första substansen är antikroppar och att den andra är en substans som användes som märknings- och analysreagens.

3. Användning enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att den första substansen är antikroppar och att den andra är röda blodkroppar, för detektering av motsvarande antigener.

4. Användning enligt krav 1 för analys av antikroppar mot stelkramp och antikroppar mot DNA i humanserum.

5. Användning enligt krav 1 för analys genom hemaggluti- nation eller hemolys, med hjälp av en komposition för analys av antikroppar närvarande i en biologisk vätska, vilken kom- position innefattar följande kombination: - röda blodkroppar sensibilíserade med antigen 1, akti- verad med bensokinon, som bidrar till att ge ett standard- intervall med standardantigen och att åstadkomma reaktio- nen med de antikroppar l, som är närvarande i det prov som skall testas, - standardantigen 1, - ett lösningsmedel, såsom fysíologískt serum, och 7909965-1 /5 - en míkroplatta för analys, varvid hemolystestet utföres genom att man helt enkelt till ovannämnda kombination sätter komplement.