RU2816514C1 - Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования - Google Patents
Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816514C1 RU2816514C1 RU2023127127A RU2023127127A RU2816514C1 RU 2816514 C1 RU2816514 C1 RU 2816514C1 RU 2023127127 A RU2023127127 A RU 2023127127A RU 2023127127 A RU2023127127 A RU 2023127127A RU 2816514 C1 RU2816514 C1 RU 2816514C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- risk
- psca
- selp
- gastric
- developing
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 21
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 title abstract description 12
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 title abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 33
- 208000011906 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 30
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 10
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 7
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 4
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 3
- 101150082969 SELP gene Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 2
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011328 necessary treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000019315 Nicotinic acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108050006807 Nicotinic acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710120463 Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000873420 Simian virus 40 SV40 early leader protein Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000003403 autonomic nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002297 emergency surgery Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 210000004269 weibel-palade body Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования. Способ включает выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs6136 SELP. Высокий риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки прогнозирует выявление комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA у неродственных пациентов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ и проживающих в Белгородской области. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA. 2 ил.
Description
Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования.
Язвенная болезнь (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки - хроническое рецидивирующее заболевание, характерным признаком которого в период обострения является образование язв слизистой оболочки желудка и/или двенадцатиперстной кишки (Моисеев В.С. и др., 2018). За рубежом ЯБ встречается у 5-10% взрослого населения, и каждый год регистрируется около 500000 новых случаев заболеваемости ЯБ (Chan F.K.L. et al., 2015; Lanas A. et al., 2017; McQuaid K.R., 2020; Joo M.K. et al., 2020). В России, по данным Федеральной службы государственной статистики (Здравоохранение в России, 2019 г.), количество зарегистрированных случаев ЯБ в 2018 году составляет 850,1 на 100000 человек, в том числе впервые выявленных - 71,9, среди которых около 60% пациентов - лица трудоспособного возраста (Колотилова М.Л. и др., 2014). Мужчины страдают ЯБ в 2-7 раз чаще, чем женщины, и на каждый случай язвенной болезни желудка (ЯБЖ) приходится 4 случая язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (ЯБ ДПК) (Ивашкин В.Т. и др., 2016, 2020). Поражение ДПК чаще встречается у лиц в возрасте от 30 до 55 лет, а локализация патологического процесса в желудке характерна для возрастной группы 55-70 лет (McQuaid K. R., 2020).
Осложнения встречаются у 10-20% больных ЯБ (Tarasconi A. et al., 2020). В связи с тяжестью клинической картины и высокой частотой наибольшую опасность представляют перфорации и кровотечения. Хотя кровотечения встречаются в 6 раз чаще, чем перфорации, именно последние являются наиболее частыми показаниями к экстренному оперативному вмешательству и примерно в 40% случаев они становятся причиной летальности при ЯБ (Tarasconi A. et al., 2020; Joo M.K. et al., 2020). В России число больных с перфорацией желудка и ДПК составляет 19,1 тысяч человек в год, а связанное с ней количество поздних госпитализаций достигает 23,4% (Клинические рекомендации. Язвенная болезнь, 2019).
Полиморфный вариант rs2294008 PSCA, по результатам полногеномного исследования, выполненного в японской популяции, играет роль в развитии ЯБ ДПК (аллель С, OR=1,84, p=3,92×10-33) (Tanikawa C. et al., 2012). Эти данные подтверждают репликативные исследования, проведенными по этому локусу среди населения Японии для ЯБЖ (аллель С, OR=1,13, p=5,85×10-7) (Tanikawa C. et al., 2013) и ЯБ ДПК (аллель С, OR=1,34; p=2,28×10-6) (Usui Y. et al., 2019), а также среди жителей Испании для ЯБ ДПК (аллель Т, OR=0,52, p=0,005) (García-González M.A. et al., 2015).
Ген PSCA (антиген стволовых клеток простаты) экспрессируется в предстательной железе, мочевом пузыре, в некоторых других органах, а также в дифференцирующихся эпителиальных клетках желудка, кодирует гликозилфосфатидилинозитол - мембранный гликопротеин, играющий роль в пролиферации и обновлении клеток (https://www.omim.org, https://www.genecards.org, Tanikawa C. et al., 2012, 2013). За счет этого, в зависимости от уровня экспрессии, ген PSCA может участвовать в разнонаправленных процессах, происходящих в слизистой оболочке желудка и ДПК: язвообразовании и малигнизации (Lu Y. et al., 2010; Zeng Z. et al., 2011; Tanikawa C. et al., 2012, 2013; Shi D. et al., 2012; Zhang Q.H. et al., 2012; Zhang T. et al., 2012; Matsuda K. et al., 2013; Saeki N. et al., 2013; Gao J. et al., 2015; Garcia-Gonzalez M.A. et al., 2015; Geng P. et al., 2015; Gu Y. et al., 2015; Mocellin S. et al., 2015; Wang M. et al., 2015; Chandra V. et al., 2016; Qiu L.-X. et al., 2016; Qin Z. et al., 2017; Usui Y. et al., 2019; Yan K. et al., 2019). Необходимо также отметить, что ген PSCA может выступать в качестве модулятора никотиновых ацетилхолиновых рецепторов и, следовательно, данный ген может влиять на вегетативную нервную систему и за счет этого также участвовать в развитии ЯБ (https://www.genecards.org).
По данным полногеномных исследований, полиморфизм rs6136 гена SELP ассоциирован с уровнем Р-селектина (Barbalic M. et al., 2010; Suhre K. et al., 2017; Sun B.B. et al., 2018), который участвует в развитии воспалительного процесса. Белковый продукт гена SELP (Р-селектин) относится к молекулам клеточной адгезии, находится в альфа-гранулах тромбоцитов и тельцах Вейбеля-Паладе эндотелиальных клеток, является кальций-зависимым рецептором миелоидных клеток, опосредует взаимодействие активированных эндотелиальных клеток или тромбоцитов с лейкоцитами, участвует в развитии воспаления (https://www.genecards.org, https://www.omim.org).
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности, на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA.
Известен патенту RU №2 231 794 (опубл. 27.06.2004) Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни, включающий исследования желудочных проб, основанный на измерении скорости диффузии ионов водорода через слой слизи, покрывающей слизистой оболочки желудка, путем введения в желудок тестового 0,1 H раствора соляной кислоты и исследования динамики проникновения ионов водорода в слизистой оболочки путем эвакуации содержимого желудка, тем самым определяют риск развития язвенной болезни. Недостатком этого способа является трудоемкость выполнения, которая заключается в многократной эвакуации содержимого желудка и введении в желудок большого количества соляной кислоты, сложность подсчетов, и кроме того не учитывается роль генетических полиморфизмов.
Известен патенту RU №2 318 217 (опубл. 27.02.2008) Способ и устройство для прогнозирования риска развития язвенной болезни, в котором описан способ и устройство для прогнозирования риска развития язвенной болезни. Сущность способа заключается в том, что электрохимическим методом измеряют диффузионный (жидкостной) или мембранный потенциал между желудочным соком и тестовой жидкостью, и при величине потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, прогнозируют риск развития язвенной болезни. в качестве тестовой жидкости можно использовать воду. В этом случае пороговый уровень составляет 10 мв. одновременно с измерением диффузионного или мембранного потенциала может быть измерен рн желудочного сока, при этом риск развития язвенной болезни прогнозируют при величине диффузионного или мембранного потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, и рн менее 1,5. Устройство для осуществления способа при исследовании желудочного сока in vitro состоит из двух емкостей, разделенных диафрагмой: с желудочным соком и с тестовой жидкостью. В них опущены электроды сравнения, напряжение между которыми равно диффузионному потенциалу. устройство для исследования желудочного сока in vivo содержит камеру с тестовой жидкостью, через диафрагму, контактирующую с желудочным соком, и два электрода сравнения, один из которых контактирует с желудочным соком, а другой - с тестовой жидкостью. Напряжение между электродами равно диффузионному потенциалу. Использование способа позволяет своевременно начать профилактическое лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является его трудоемкость, он не учитывает роль генетических полиморфизмов.
Известен патенту RU №2 281 037 (опубл.10.08.2006) Способ прогнозирования развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, в котором описан способ прогнозирования развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Сущность способа заключается в том, что осуществляют определение календарного возраста пациента, биологического возраста, соотношение биологического и календарного возрастов, рост, массу тела, показатели качества жизни. Затем рассчитывают вероятность развития язвенной болезни по формуле:
где е - экспонента, число оснований натурального логарифма, равное - 2,71, D1 - сумма показателей, умноженных на коэффициент В дискриминантных функций для больных, D2 - сумма показателей, умноженных на коэффициент А дискриминантных функций для здоровых, при этом значения коэффициентов А и В выбирают из таблицы «Коэффициенты дискриминантных функций» и при P1>Р2 прогнозируют риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является то, что он не учитывает роль генетических полиморфизмов.
За прототип выбран патент RU № 2 563 828 (опубл. 20.09.2015) «Способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов на основе генетического анализа». Патент характеризуется тем, что устанавливают факторы риска - определяют полиморфизм интерлейкина IL-8 методом рестрикционного анализа при выделении ДНК из лимфоцитов венозной крови, а также определяют генотип Helicobacter pylori методом ПЦР при выделении ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка у пациентов, относящихся к коренным жителям Республики Хакасия. Факторам риска присваивают числовые значения и затем определяют прогностические коэффициенты P1, Р2. При Р1>Р2 прогнозируют низкий риск, а при Р1<Р2 прогнозируют высокий риск развития язвенной болезни. Недостатком данного метод является трудоемкость подсчета и применим только для коренных жителей Республики Хакасия.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития язвенной болезни на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA СС × rs6136 SELP AA.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности, на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA, включающий:
- выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови;
- анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs6136 SELP;
- прогнозирование высокого риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки с учетом молекулярно-генетического тестирования у индивидуумов русской национальности на основе данных о комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при температуре -20˚С. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs6136 SELP осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System («Bio-Rad», США) c использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (синтезированы в ООО «Тест - Ген» (Ульяновск). Амплификация геномной ДНК производилась в реакционной смеси, суммарным объемом 10 мкл, включающей смесь для ПЦР - 4 мкл, Taq-полимеразу - 2 мкл, исследуемый образец (~30 нг ДНК/мкл) - 1 мкл, деионизированная вода - 3мкл. Генотипирование исследуемых образцов осуществлялось с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ). Для полиморфизма rs2294008 гена PSCA зонд с флуоресцентным красителем VIC соответствует аллелю C, зонд с красителем FAM - аллелю T (фиг. 1), для rs6136 гена SELP зонд с флуоресцентным красителем VIC соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM - аллелю A (фиг. 2).
Изобретение характеризуется фигурами.
Фиг. 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма PSCA (rs2294008): -СС, -TT, -CT, ♦-отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма SELP (rs6136): -CC, -AA, -AC, ♦-отрицательный контроль.
Изучение SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с развитием язвенной болезни было проведено с помощью модификации метода снижения размерности MDR (Multifactor Dimensionality Reduction) - Model-Based-MDR (MB-MDR).
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития язвенной болезни у индивидуумов подтверждает анализ результатов наблюдений 746 пациентов (399 - больные ЯБ, 347 - группа контроля). Среди больных средний возраст: 48,86±13,13, в контрольной группе: 48,47±13,69 лет. В выборки для исследования включались индивидуумы русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и проживающие в Белгородской области (Чурносов М.И., Сорокина И.Н., Балановская Е.В. Генофонд населения Белгородской области. Динамика индекса эндогамии в районных популяциях // Генетика. 2008. Т. 44. № 8. С. 1117-1125), не имеющие родства между собой, подписавшие информированное согласие на включение их в исследование. В группу больных включались пациенты с установленным диагнозом «язвенная болезнь», который устанавливался на основании анамнестических данных (характерные жалобы, анамнез заболевания), физикального обследования (обнаружение болезненности и резистентности мыщц брюшной стенки при пальпации), инструментального обследования (обнаружение язвенного дефекта при эндоскопическом исследовании желудка и двенадцатиперстной кишки). (Клинические рекомендации, 2019). Обследование больных ЯБ проводилось на базе гастроэнтерологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
В контрольную группу формировалась при профилактических осмотрах (обследовании) населения, и в нее входили пациенты, не имеющие клинических и эндоскопических признаков язвенной болезни.
Все исследования проводились под контролем этического комитета ОГБУЗ БОКБ Святителя Иоасафа (протокол № 15 от 21.12.2016) с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, связанных с заболеванием, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского института НИУ «БелГУ».
Установлена связь комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA с повышенным риском развития язвенной болезни (beta=0,43, p=0,017).
Применение данного способа позволит прогнозировать риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности, при выявлении комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA формировать группы риска по развитию язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки и реализовывать в данных группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия.
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациентов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs2294008 PSCA и rs6136 SELP.
У пациента А. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены генотипы СС rs2294008 PSCA и AA rs6136 SELP, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз язвенной болезни у пациента.
У пациента М. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены генотипы ТТ rs2294008 PSCA и СС rs6136 SELP, что позволило отнести пациента в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни у пациента М.
У пациентки Н. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены генотипы ТТ rs2294008 PSCA и АС rs6136 SELP, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни у пациентки.
У пациентки И. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров были выявлены генотипы СТ rs2294008 PSCA и АС rs6136 SELP, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития язвенной болезни. При дальнейшем наблюдение диагноз язвенной болезни у пациентки И. не подтвердился.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациентов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития язвенной болезни.
Claims (1)
- Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования, включающий выделение ДНК из лейкоцитов периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs2294008 PSCA и rs6136 SELP, высокий риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки прогнозирует выявление комбинации генотипов rs2294008 PSCA CC × rs6136 SELP AA.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2816514C1 true RU2816514C1 (ru) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2563828C1 (ru) * | 2014-10-01 | 2015-09-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова" (ФГБОУ ВПО ХГУ им. Н.Ф. Катанова) | Способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов на основе генетического анализа |
RU2780505C1 (ru) * | 2022-02-04 | 2022-09-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка на основе генетического анализа |
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2563828C1 (ru) * | 2014-10-01 | 2015-09-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова" (ФГБОУ ВПО ХГУ им. Н.Ф. Катанова) | Способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов на основе генетического анализа |
RU2780505C1 (ru) * | 2022-02-04 | 2022-09-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (НИУ "БелГУ") | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка на основе генетического анализа |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
РАШИНА О. В., ЧУРНОСОВ М. И. Вклад межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов-кандидатов в развитие язвенной болезни желудка, Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2022, номер 11 (207), с.102-109. TANIKAWA C. et al., Impact of PSCA Variation on Gastric Ulcer Susceptibility. PLoS ONE, 2013, VOL.8 (5): e63698. * |
РАШИНА О.В. Анализ функциональной роли полиморфного варианта rs2294008, ассоциированного с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки / О.В. Рашина // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье: XXIII Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей, посвященная 25-летию медицинского факультета СПбГУ. Материалы научной конференции, Санкт-Петербург, 26 сентября 2020 года. Том XXIII. - Санкт-Петербург: Общество с ограниченной ответственностью Издательский дом "Сциентиа", 2020. - С. 42-43. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20190111967A (ko) | 외상성 뇌 손상의 바이오마커 | |
CN107254531B (zh) | 早发性结直肠癌辅助诊断的遗传生物标志物及其应用 | |
RU2816514C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2816519C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2821471C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития Н. pylori-негативной язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки | |
RU2558854C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития эндометриоза | |
RU2811577C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2819282C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у мужчин на основе молекулярно-генетического тестирования | |
WO2006117945A1 (en) | Method for detecting lipid metabolism disorder, and diagnostic agent for use therein | |
RU2642939C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития преэклампсии | |
RU2819776C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития Н. pylori-позитивной язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2557944C1 (ru) | Способ прогнозирования уровня артериального давления у женщин в конце беременности | |
RU2550933C1 (ru) | Способ прогнозирования риска формирования миомы матки | |
RU2780505C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка на основе генетического анализа | |
RU2786314C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни у женщин по генетическим данным | |
RU2782304C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2809912C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин по результатам генетического тестирования | |
JP5643933B2 (ja) | Znf512b遺伝子の一塩基多型に基づく筋萎縮性側索硬化症の検査方法 | |
RU2782496C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки с использованием данных о полиморфизме гена ММР-9 | |
RU2809911C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни на основе данных о межгенных взаимодействиях | |
RU2473912C1 (ru) | Способ прогнозирования уровня артериального давления у беременных в зависимости от генетического полиморфизма эндотелина 1 | |
RU2780525C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка | |
RU2809798C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин с использованием молекулярно-генетических данных | |
US8445208B2 (en) | Multivariate analysis involving genetic polymorphisms related to mediators of inflammatory response for prediction of outcome of critcally ill patients | |
RU2650994C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития генитального эндометриоза |