RU2782304C1 - Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования - Google Patents
Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования Download PDFInfo
- Publication number
- RU2782304C1 RU2782304C1 RU2022103520A RU2022103520A RU2782304C1 RU 2782304 C1 RU2782304 C1 RU 2782304C1 RU 2022103520 A RU2022103520 A RU 2022103520A RU 2022103520 A RU2022103520 A RU 2022103520A RU 2782304 C1 RU2782304 C1 RU 2782304C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- duodenal ulcer
- risk
- mmp
- gene
- developing
- Prior art date
Links
- 208000000718 Duodenal Ulcer Diseases 0.000 title claims abstract description 44
- 230000002068 genetic Effects 0.000 title description 9
- 102100006844 MMP9 Human genes 0.000 claims abstract description 26
- 101700067851 MMP9 Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000001198 Duodenum Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 abstract description 15
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 208000008469 Peptic Ulcer Diseases 0.000 description 16
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 9
- 210000004051 Gastric Juice Anatomy 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 7
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000004400 Mucous Membrane Anatomy 0.000 description 6
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 6
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 6
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 5
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N HCl Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108009000330 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001156 Gastric Mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002496 gastric Effects 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 201000000432 peptic ulcer disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003815 Abdominal Wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 1
- 102100001448 GAST Human genes 0.000 description 1
- 101700005903 GAST Proteins 0.000 description 1
- 206010019375 Helicobacter infection Diseases 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 229940037467 Helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 210000004698 Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 108010047320 Pepsinogen A Proteins 0.000 description 1
- 229940082622 Prostaglandin cardiac therapy preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940077717 Prostaglandin drugs for peptic ulcer and gastro-oesophageal reflux disease (GORD) Drugs 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108091006898 Zinc-dependent endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000037028 Zinc-dependent endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000008286 diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000002996 emotional Effects 0.000 description 1
- 230000004090 etiopathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesions Effects 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003771 matrix metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121386 matrix metalloproteinase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic Effects 0.000 description 1
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics Prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 1
- 230000001936 parietal Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 101710044770 sll1951 Proteins 0.000 description 1
- 230000000391 smoking Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ. Осуществляют забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9. Высокий риск развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки прогнозируют при выявлении гаплотипа GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфных локусах rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9. 3 ил., 4 пр.
Description
Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.
Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (ЯБЖ и ДПК) относится к группе многофакторных заболеваний, в формирование которого вовлечены ряд факторов риска и полигенная основа. Этиология и патогенез язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки активно изучаются как российскими, так и зарубежными исследователями (Malfertheiner, P. Helicobacter pylori Infection: New Facts in Clinical Management / P. Malfertheiner, M. Venerito, C. Schulz // Cur. Treat. Options Gastroenterol. - 2018. - Vol. 16, № 4. - P. 605-615), однако, несмотря на это, к настоящему времени, не создана единая теория патогенеза ЯБЖ и ДПК (Осипова, А. С. Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки и ее осложнения / А. С. Осипова, Ю. К. Саитова, С. Н. Стяжкина // Вопросы науки и образования. - 2017. - № 9. - С. 66-69).
ЯБЖ и ДПК служит одной из причин потери трудоспособности у пациентов гастроэнтерологического профиля (на долю ЯБЖ и ДПК приходится около 40% всех случаев потери трудоспособности у больных этой группы, что обусловливает значительные экономические потери (Язвенная болезнь: этиология, патогенез, клиника / С. Н. Стяжкина, А. С. Андреева, М. А. Воложанина, С. Р. Раимова // Modern Science. - 2020. - № 10-2. - С. 310-313).
Развитие язвенной болезни включает в себя взаимосвязь между поражением, защитой и восстановлением слизистой оболочки, поскольку она постоянно незащищена от воздействия травмирующих факторов среды (Diagnosis and Treatment of Peptic Ulcer Disease / R. T. Kavitt, A. M. Lipowska, A. Anyane-Yeboa, I. M. Gralnek // Am. J. Med. - 2019. - Vol. 132, № 4. - P. 447-456). Регулярное употребление нестероидных противовоспалительных препаратов, чрезмерное употребление алкоголя, нездоровое питание, курение и эмоциональный стресс являются важными этиологическими факторами развития ЯБЖ и ДПК (Se-Hwan Yeo et al., 2016). Согласно современным представлениям развитие язвенного поражения в слизистой оболочке желудка или 12-перстной кишки обусловлено нарушением в равновесии между факторами агрессии (высокая продукция соляной кислоты за счет повышения числа обкладочных клеток и увеличения образования гастрина, нарушенная нервная и гуморальная регуляция кислотообразования в желудке, повышенная выработка пепсина и пепсиногена, нарушенная моторика желудка и 12-перстной кишки, приводящая к поражению слизистой оболочки) и защитными факторами (уменьшение образования желудочной слизи и изменения в ее качественном составе, снижение содержания бикарбонатов в секрете желудка и поджелудочной железы, нарушение процесса регенерации и ухудшение кровоснабжения в слизистой желудка и 12-перстной кишки, снижение уровня простагландинов в слизистой оболочке гастродуоденальной зоны). Значимую роль в формировании заболевания имеют генетические факторы: наследственная отягощенность у больных ЯБЖ и ДПК выявляется у 5,5 - 50% (Колотилова, М. Л. Нейрогенно-генетические факторы этиологии и патогенеза язвенной болезни / М. Л. Колотилова, Л. Н. Иванов // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2017. - № 12. - С. 89-97).
Согласно данным литературы, важное значение в этиопатогенезе ЯБЖ и ДПК имеют матриксные металлопротеиназы (ММР). Данное семейство внеклеточных цинк - зависимых эндопептидаз играет ключевую роль в расщеплении компонентов экстрацеллюлярного матрикса, базальных мембран и ряда клеточных поверхностных белков (Expression pattern and association analysis of porcine matrix metallopeptidase 9 (MMP9) with diarrhea and performance traits in piglets / M. Kou, D. Guo, L. Liu [et al.] // Res. Vet. Sci. - 2020. - Vol. 129. - P. 53-58).
Эти медико-биологические эффекты матриксных металлопротеиназ, как свидетельствуют литературные материалы, имеют важное значение в патогенезе ЯБЖ и ДПК (Fields, G. B. The Rebirth of Matrix Metalloproteinase Inhibitors: Moving Beyond the Dogma / G. B. Fields. - DOI: 10.3390/cells8090984 // Cells. - 2019. - Vol. 8, № 9. - 984. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6769477/pdf/cells-08-00984.pdf (date of the application 02.05.2021)).
Одной из важных задач современной гастроэнторологии является изучение причин и механизмов развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, среди которых значимую роль играют генетические факторы.
В Российской Федерации исследования вовлеченности гена ММР-9 в формирование предрасположенности к язвенной болезни (ЯБ) ДПК единичны, а данные о роли генетических вариантов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 в развитии ЯБ ДПК отсутствуют.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров гена ММР-9. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ЯБ ДПК на основе данных о полиморфных локусах rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.
Известен способ прогнозирования риска развития язвенной болезни (патент RU №2231794, опубликован 27.06.2004), включающий исследования желудочных проб, основанный на измерении скорости диффузии ионов водорода через слой слизи, покрывающей слизистой оболочки желудка, путем введения в желудок тестового 0,1 H раствора соляной кислоты и исследования динамики проникновения ионов водорода в слизистой оболочки путем эвакуации содержимого желудка, тем самым определяют риск развития язвенной болезни Недостатком этого способа является трудоемкость выполнения, которая заключается в многократной эвакуации содержимого желудка и введении в желудок большого количества соляной кислоты, сложность подсчетов, и кроме того не учитывается роль генетических полиморфизмов.
Известен способ и устройство для прогнозирования риска развития язвенной болезни (патент RU №2318217, опубликован 27.02.2008). Сущность способа заключается в том, что электрохимическим методом измеряют диффузионный (жидкостной) или мембранный потенциал между желудочным соком и тестовой жидкостью, и при величине потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, прогнозируют риск развития язвенной болезни. в качестве тестовой жидкости можно использовать воду. В этом случае пороговый уровень составляет 10 мв. одновременно с измерением диффузионного или мембранного потенциала может быть измерен рн желудочного сока, при этом риск развития язвенной болезни прогнозируют при величине диффузионного или мембранного потенциала более порогового уровня, установленного для тестовой жидкости, и рн менее 1,5. Устройство для осуществления способа при исследовании желудочного сока in vitro состоит из двух емкостей, разделенных диафрагмой: с желудочным соком и с тестовой жидкостью. В них опущены электроды сравнения, напряжение между которыми равно диффузионному потенциалу. устройство для исследования желудочного сока in vivo содержит камеру с тестовой жидкостью, через диафрагму, контактирующую с желудочным соком, и два электрода сравнения, один из которых контактирует с желудочным соком, а другой - с тестовой жидкостью. Напряжение между электродами равно диффузионному потенциалу. использование способа позволяет своевременно начать профилактическое лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является его трудоемкость, он не учитывает роль генетических полиморфизмов.
Известен способ прогнозирования развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (патент RU №2281037, опубликован 10.08.2006). Сущность способа заключается в том, что осуществляют определение календарного возраста пациента, биологического возраста, соотношение биологического и календарного возрастов, рост, массу тела, показатели качества жизни. Затем рассчитывают вероятность развития язвенной болезни по формуле:
где е - экспонента, число оснований натурального логарифма, равное - 2,71, D1 - сумма показателей, умноженных на коэффициент В дискриминантных функций для больных, D2 - сумма показателей, умноженных на коэффициент А дискриминантных функций для здоровых, при этом значения коэффициентов А и В выбирают из таблицы «Коэффициенты дискриминантных функций» и при P1>Р2 прогнозируют риск развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Недостатком этого способа является то, что он не учитывает роль генетических полиморфизмов.
Известен способ оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у хакасов на основе генетического анализа (патент RU № 2563828, опубликован 20.09.2015). Патент характеризуется тем, что устанавливают факторы риска - определяют полиморфизм интерлейкина IL-8 методом рестрикционного анализа при выделении ДНК из лимфоцитов венозной крови, а также определяют генотип Helicobacter pylori методом ПЦР при выделении ДНК из биоптатов слизистой оболочки желудка у пациентов, относящихся к коренным жителям Республики Хакасия. Факторам риска присваивают числовые значения и затем определяют прогностические коэффициенты P1, Р2. При Р1>Р2 прогнозируют низкий риск , а при Р1<Р2 прогнозируют высокий риск развития язвенной болезни . Недостатком данного метод является трудоемкость подсчета и применим только для коренных жителей Республики Хакасия.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития ЯБ ДПК на основе данных о полиморфных локусах rs17576-rs3787268-rs2250889- гена ММР-9.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрально - Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфных локусах rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9, включающий:
-забор венозной крови;
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9;
- прогнозирование высокого риска развития ЯБ ДПК у индивидуумов при выявлении гаплотипа GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития ЯБ ДПК у пациентов на основе данных о гаплотипе GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.
Способ осуществляют следующим образом:
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S. A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. A. Miller, D. D. Dykes, H. F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. - 1988. - Vol. 16, № 3. - P. 1215) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.
Анализ полиморфных маркеров rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad) c использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (синтезированы в ООО «Тест - Ген» (Ульяновск)).
Амплификация геномной ДНК производилась в реакционной смеси, суммарным объемом 10 мкл, включающей смесь для ПЦР ММР-9 - 4 мкл, Taq-полимеразу - 2 мкл, исследуемый образец (~30 нг ДНК/мкл) - 1 мкл, деионизированная вода - 3мкл.
Генотипирование исследуемых образцов осуществлялось с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) (фиг. 1, фиг. 2, фиг. 3)
Изобретение характеризуется фигурами:
Фигура 1 - Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs17576 ММР-9 (- AA, - GG, - AG, ■ - отриц. контр.)
Фигура 2 - Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs3787268 ММР-9 (- AA, - GG, - GA, ■ - отриц. контр.)
Фигура 3 - Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма rs2250889 ММР-9 (- CC, - GG, -CG, ■ - отриц. контр.)
Определение частот гаплотипов и анализ ассоциаций гаплотипов с развитием ЯБ ДПК проводились с помощью логистического регрессионного анализа в программе PLINK v. 2.050 (http://zzz.bwh.harvard.edu/plink/). При необходимости в исследование включали ковариаты (возраст, пол, индекс массы тела). После проведения пермутационного теста (выполнялось 1000 пермутаций) за статистически значимый уровень принимали ррerm<0,05.
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ЯБ ДПК у индивидуумов подтверждает анализ результатов наблюдений 529 пациентов, из них 182 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и 347 индивидуумов контрольной группы. Среди больных средний возраст - 48,86±13,13, в контрольной группе средний возраст - 48,47±13,69 лет. В выборки для исследования включались (критерии включения): 1) индивидуумы русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и проживающие в Белгородской области (Чурносов М.И., Сорокина И.Н., Балановская Е.В. Генофонд населения Белгородской области. Динамика индекса эндогамии в районных популяциях // Генетика. 2008. Т. 44. № 8. С. 1117-1125), не имеющие родства между собой, добровольно согласившиеся на проведение исследования; 2) в группу больных включались пациенты с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки, после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических, клинико-инструментальных и клинико-лабораторных методов исследования. Диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки устанавливался на основании: анамнестических данных (характерные жалобы, собирался анамнез заболевания), физикального обследования (обнаружение болезненности и резистентности мыщц брюшной стенки при пальпации), инструментального обследования (обнаружение язвенного дефекта при эндоскопическом исследовании желудка и двенадцатиперстной кишки). (Клинические рекомендации, 2019).
Обследование больных ЯБ ДПК проводилось на базе гастроэнтерологического отделения Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа; 3) в контрольную группу входили пациенты, не имеющие клинических и эндоскопических признаков ЯБ ДПК. Контрольная группа формировалась при профилактических осмотрах (обследовании) населения, проводимого в Белгородской областной клинической больнице Святителя Иоасафа.
Все исследования проводились под контролем этического комитета ОГБУЗ БОКБ Святителя Иоасафа (протокол № 15 от 21.12.2016) с информированного согласия пациентов на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, связанных с заболеванием, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского института НИУ «БелГУ».
При расчете частот гаплотипов и анализе их ассоциаций у индивидуумов установлена связь с формированием ЯБ ДПК гаплотипа GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9. Гаплотип GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 является фактором риска развития ЯБ ДПК у индивидуумов (ОR=1,62, рperm=0,025).
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациентов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.
У пациента У. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития ЯБ ДПК. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у пациента.
У пациента О. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип АAC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9, что позволило отнести пациента в группу индувидуумов с низким риском развития ЯБ ДПК. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у пациента О.
У пациента К. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GAC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития ЯБ ДПК. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у пациента.
У пациентки Ж. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GGG полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9, что позволило отнести пациентку в группу индувидуумов с низким риском развития ЯБ ДПК. При дальнейшем наблюдении диагноз язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у пациентки Ж. не подтвердился.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациентов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ЯБ ДПК.
Claims (1)
- Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центрально-Черноземного региона РФ, включающий забор венозной крови, выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9 и прогнозирование высокого риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у индивидуумов при выявлении гаплотипа GGC полиморфных локусов rs17576-rs3787268-rs2250889 гена ММР-9.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2782304C1 true RU2782304C1 (ru) | 2022-10-25 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2143684C1 (ru) * | 1998-03-16 | 1999-12-27 | Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей | Способ прогнозирования вероятности возникновения язвенной болезни 12-перстной кишки |
RU2542459C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-02-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова" (ФГБОУ ВПО "ХГУ им. Н.Ф. Катанова") | Способ ранней диагностики язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов хакасии на основе молекулярно-генетического тестирования |
RU2652275C2 (ru) * | 2016-07-27 | 2018-04-25 | Ольга Анатольевна Курамшина | Способ прогнозирования раннего развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2143684C1 (ru) * | 1998-03-16 | 1999-12-27 | Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей | Способ прогнозирования вероятности возникновения язвенной болезни 12-перстной кишки |
RU2542459C1 (ru) * | 2013-09-30 | 2015-02-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова" (ФГБОУ ВПО "ХГУ им. Н.Ф. Катанова") | Способ ранней диагностики язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов хакасии на основе молекулярно-генетического тестирования |
RU2652275C2 (ru) * | 2016-07-27 | 2018-04-25 | Ольга Анатольевна Курамшина | Способ прогнозирования раннего развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
МИНЯЙЛО О.Н. Распределение аллелей и гаплоблочная структура полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ у больных Н.pylori-негативной язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Научные результаты биомедицинских исследований. 2020; 6(4): 488-502. МИНЯЙЛО О.Н. и др. Гендерные особенности ассоциаций полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ с развитием язвенной болезни у населения Центрального Черноземья России. Генетика. 2021; 57(10): 1185-1193. Принята к публикации 11.02.2021. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3283643B1 (en) | Means for diagnosing, predicting or monitoring pneumocystis pneumonia | |
US9902998B2 (en) | Non-invasive diagnostic method for diagnosing bladder cancer | |
RU2782304C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2782496C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки с использованием данных о полиморфизме гена ММР-9 | |
RU2780505C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка на основе генетического анализа | |
RU2786314C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни у женщин по генетическим данным | |
RU2780525C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития H. pylori-позитивной язвенной болезни желудка | |
RU2816514C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2816519C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2819776C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития Н. pylori-позитивной язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2819282C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у мужчин на основе молекулярно-генетического тестирования | |
EP3359682B1 (en) | Method for diagnosing hepatic fibrosis based on bacterial profile and diversity | |
RU2811577C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки у женщин на основе молекулярно-генетического тестирования | |
RU2823474C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития осложненной язвенной болезни желудка на основе определения уровня экспрессии микрорнк-146а | |
RU2688208C1 (ru) | Способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у населения башкортостана | |
US20140088203A1 (en) | Method for predicting abdominal obesity | |
RU2809912C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни у мужчин по результатам генетического тестирования | |
RU2795720C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития люминального подтипа рака молочной железы | |
RU2809911C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития гипертонической болезни на основе данных о межгенных взаимодействиях | |
RU2811257C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития тройного негативного подтипа рака молочной железы | |
RU2795726C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития рака молочной железы у женщин без ожирения | |
RU2753274C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития хронической истинной экземы у женщин с учетом генетических факторов | |
RU2743453C1 (ru) | Способ прогнозирования инфекционных осложнений критических состояний | |
RU2798666C1 (ru) | Способ прогнозирования низкого риска развития рака молочной железы у женщин с высокопенетратными мутациями в генах BRCA1 и CHEK2 | |
RU2542459C1 (ru) | Способ ранней диагностики язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у европеоидов хакасии на основе молекулярно-генетического тестирования |