RU2692604C1 - Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных - Google Patents
Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных Download PDFInfo
- Publication number
- RU2692604C1 RU2692604C1 RU2018129817A RU2018129817A RU2692604C1 RU 2692604 C1 RU2692604 C1 RU 2692604C1 RU 2018129817 A RU2018129817 A RU 2018129817A RU 2018129817 A RU2018129817 A RU 2018129817A RU 2692604 C1 RU2692604 C1 RU 2692604C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- rotavirus
- medium
- culture
- cell
- ratio
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000617996 Human rotavirus Species 0.000 title claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 title claims description 4
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims abstract description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 abstract 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 abstract 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 abstract 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002953 anti-rotaviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940043274 prophylactic drug Drugs 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ адаптации ротавируса человека группы А к росту на перевиваемых культурах клеток животных, заключающийся в том, что адаптацию и последующее культивирование ротавируса человека группы А проводят путем последовательных пассажей на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток в соотношении 1:1; в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК), выращенные раздельно на среде 199; полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1, разводят средой 199 в 4 раза, смешивают при соотношении культур клеток 1:1, добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток; отмывают 3-кратно монослой смеси клеток от ростовой среды раствором Хенкса, добавляют 0,5 мл обработанной раствором трипсина (20 мкг/мл) 10% фекальной суспензии, содержащей ротавирус человека, и контактируют в течение 10 мин; добавляют поддерживающую среду 199 без сыворотки до первоначального объема и выдерживают в термостате при +37°С в течение 10 суток; замораживают при -18-20°С в течение 5 ч с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды; последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа. Изобретение позволяет получить стабильно растущие на перевиваемых культурах клеток штаммы ротавируса человека группы А с концентрацией вирусных частиц не менее чем 1⋅10в 1 мл. культуральной жидкости, имеющие типичную морфологию ротавирусных частиц и двунитевую сегментированную РНК. 1 табл., 3 ил.
Description
Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии и касается способа адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных для использования при получении диагностических и вакцинных препаратов.
Острые кишечные инфекции, вызываемые ротавирусами (РВИ), несмотря на значительные успехи вирусологии, продолжают оставаться чрезвычайно актуальными, особенно у детей до 2-х лет жизни. Важным условием борьбы с ротавирусной инфекцией является разработка методов и средств специфической диагностики, лечения и профилактики. При этом, если при получении диагностических средств возможно использование штаммов ротавируса животного происхождения, то для профилактических препаратов необходимо применение штаммов ротавируса, выделенных от человека, так как только они будут стимулировать выработку антител к поверхностным антигенам ротавируса человека, отвечающим за вируснейтрализующую активность. К тому же, учитывая периодическую смену доминирующих серотипов и генетических вариантов ротавируса, необходим постоянный мониторинг за циркулирующими штаммами с целью отбора серотипов ротавируса, обладающих высокой степенью гомологии с эпидемическими штаммами человека, для введения их в состав вакцины.
Штаммы ротавирусов человека относятся к труднокультивируемым, поэтому необходима адаптация штамма ротавируса человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных. Стандартных способов адаптации, дающих возможность культивировать ротавирусы человека в высоких титрах, до сих пор не существует.
Существует способ адаптации штаммов ротавируса группы А человека, предполагающий адаптацию штаммов ротавирусов на культуре клеток МА 104 (RU 2026345, SU 1687613 А1). Однако при использовании данного способа титр ротавируса достигает всего 5,5 lg ТЦД50/мл, что вообще не позволяет создавать инактивированные вакцины. Живые вакцины с такой концентрацией вирионов неспособны вызвать напряженный иммунитет в детском организме.
Целью изобретения явилась разработка способа адаптации, позволяющего в кратчайшие сроки получать стабильно растущие на перевиваемых культурах клеток штаммы ротавируса человека группы А с концентрацией вирусных частиц не менее, чем 1⋅109 в 1 мл. культуральной жидкости.
Цель достигается тем, что в предлагаемом способе адаптацию и культивирование ротавируса человека группы А проводят на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток (СПЭВ и ФК) в соотношении 1:1. При этом в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), а в качестве клеток фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК).
Способ осуществляют поэтапно.
Этап 1. Подготовка культур клеток
Культуры клеток ведут отдельно, выращивают во флаконах емкостью 250 мл на среде 199 и пересевают 1 раз в неделю с кратностью пересева 1:4-1:6. Полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1. Полученные суспензии клеток разводят средой 199 в 4 раза и смешивают в одном флаконе емкостью 250 мл при соотношении культур клеток 1:1. Во флаконы добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, разливают по флаконам и выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток. После образования на стекле видимого плотного монослоя клетки готовы к заражению.
Этап 2. Подготовка 10% фекальных суспензий от больных детей
К 1 г фекалий от больных детей, в которых методом электронной микроскопии (ЭМ) обнаружен ротавирус, добавляют 9 мл раствора Хенкса, гомогенизируют стеклянной палочкой в центрифужной пробирке и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант - 10% фекальную суспензию - используют для заражения.
Этап 3. Заражение смешанной культуры клеток ротавирусом человека
Проводят 3-х кратную отмывку монослоя клеток от ростовой среды раствором Хенкса. Из флаконов с выращенным монослоем смешанных клеток выливают ростовую среду, вносят такой же объем раствора Хенкса. Путем легкого покачивания флакона промывают монослой и выливают раствор Хенкса. Операцию повторяют трижды. Полученную 10% суспензию фекалий с ротавирусом человека обрабатывают раствором трипсина (20 мкг/мл).
Во флакон с монослоем клеток добавляют 0,5 мл обработанной трипсином суспензии и контактируют в течение 10 мин. с клеточным монослоем, добавляют среду 199 без сыворотки до первоначального объема. Флаконы оставляют в термостате при +37°С в течение 10 суток. Через 3-5 дней наблюдают первые признаки нарушения целостности монослоя в виде неспецифической деградации клеток. Через 10 суток все флаконы вне зависимости от наличия или отсутствия цитопатогенного действия вирусной этиологии подвергают замораживанию при -18-20°С в течение 5 час. с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды.
Последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа.
К 4-5 пассажу во флаконах обнаруживают ротавирус с типичными морфологическими признаками, присущими всем ротавирусам.
Сравнительные результаты выращивания ротавируса человека на смешанной клеточной культуре и клеточных культурах, использованных в смеси, представлены в таблице 1.
Контроль адаптированных ротавирусов
Контроль выросших ротавирусов осуществляли методами электронной и иммуноэлектронной микроскопии и электрофорезом геномной РНК.
Электронная микроскопия. «Окрашивание» сеток с образцами проводят методом негативного контрастирования с помощью 0,5% уранилацетата. Просматривают под электронным микроскопом при инструментальном увеличении 85000 раз. Концентрация вирионов в поддерживающей среде составила 109-1010 в мл (Рисунок 1).
Иммуноэлектронная микроскопия. Иммуноэлектронную микроскопию проводят с антиротавирусной сывороткой белых крыс, иммунизированных ротавирусом обезьян SA-11. Сыворотку разводят в 2000 раз и соединяют с культуральным неразведенным ротавирусом на 20 мин., после чего приготавливают препараты на электронномикроскопических сетках. Иммунные комплексы под микроскопом имеют характерный вид «декорированных» частиц (Рисунок 2).
Электрофорез геномной РНК. РНК адаптированных штаммов изучали электрофорезом в 8% полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в системе Лемли в течение 10 час с последующим окрашиванием 0.2% раствором азотнокислого серебра. Гены имели фрагментированное строение с распределением сегментов, характерным для ротавирусов группы А: 4-2-3-2 (11 генов), со штаммовой вариабельностью, не выходящей за пределы каждого сегмента (рис. 3)
Краткое описание рисунков
Рисунок 1. Представлена электронно-микроскопическая фотография ротавируса человека группы А. Подтверждает принадлежность данного вируса к семейству Reoviridae, роду Rotavirus. Негативное контрастирование, увеличение 430000 раз.
Рисунок 2. Показано скопление агрегированных антиротавирусной сывороткой культуральных ротавирусов человека при негативном контрастировании и увеличении в 190000 раз.
Рисунок 3. Представлены результаты электрофореза в 8% полиакриламидном геле РНК ротавирусов человека группы А и штамма ротавируса обезьян SA-11, относящегося к группе А. Показано, что распределение сегментов генома ротавируса человека (11 пар), характерно для ротавирусов группы А (4-2-3-2), что подтверждает их принадлежность к ротавирусам группы А.
Предлагаемым способом к росту на культуре клеток адаптированы 6 штаммов ротавируса человека, три из которых депонированы в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, номера депонентов ГКВ №№2727, 2728, 2729. Количество вирионов в поддерживающей среде до лиофилизации, по данным электронной микроскопии, составило не менее 1⋅109 в 1 мл.
Геном всех адаптированных штаммов ротавируса человека содержит 11 сегментов РНК, состоящих из 4 групп: 1 группа - 4 сегмента, 2 группа- 2 сегмента, 3 группа - 2 сегмента 4 группа - 2 сегмента. По распределению сегментов РНК после электрофореза все эти штаммы можно однозначно отнести к группе А ротавируса человека.
Claims (1)
- Способ адаптации ротавируса человека группы А к росту на перевиваемых культурах клеток животных, заключающийся в том, что адаптацию и последующее культивирование ротавируса человека группы А проводят путем последовательных пассажей на смешанной культуре, состоящей из эпителиоидного и фибробластного типов клеток в соотношении 1:1; в качестве клеток эпителиоидного ряда используют перевиваемую культуру клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), фибробластного типа - перевиваемую культуру фибробластов крысы (ФК), выращенные раздельно на среде 199; полученный монослой клеток обоих типов снимают со стекла смесью раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 5:1, разводят средой 199 в 4 раза, смешивают при соотношении культур клеток 1:1, добавляют 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота, выдерживают в термостате при +37°С в течение 2 суток; отмывают 3-кратно монослой смеси клеток от ростовой среды раствором Хенкса, добавляют 0,5 мл обработанной раствором трипсина (20 мкг/мл) 10% фекальной суспензии, содержащей ротавирус человека, и контактируют в течение 10 мин; добавляют поддерживающую среду 199 без сыворотки до первоначального объема и выдерживают в термостате при +37°С в течение 10 суток; замораживают при -18-20°С в течение 5 ч с последующим оттаиванием при 37°С, повторяя процедуру трижды; последующие пассажи проводят по той же схеме, используя инокулят предыдущего пассажа.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129817A RU2692604C1 (ru) | 2018-08-15 | 2018-08-15 | Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018129817A RU2692604C1 (ru) | 2018-08-15 | 2018-08-15 | Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2692604C1 true RU2692604C1 (ru) | 2019-06-25 |
Family
ID=67038111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018129817A RU2692604C1 (ru) | 2018-08-15 | 2018-08-15 | Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2692604C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1687613A1 (ru) * | 1989-12-19 | 1991-10-30 | Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии | Штамм ротавируса человека дл получени иммунобиологических препаратов |
| RU2026345C1 (ru) * | 1991-11-26 | 1995-01-09 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера | Штамм ротавируса человека для получения диагностических и профилактических сывороток |
-
2018
- 2018-08-15 RU RU2018129817A patent/RU2692604C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1687613A1 (ru) * | 1989-12-19 | 1991-10-30 | Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии | Штамм ротавируса человека дл получени иммунобиологических препаратов |
| RU2026345C1 (ru) * | 1991-11-26 | 1995-01-09 | Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера | Штамм ротавируса человека для получения диагностических и профилактических сывороток |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104099301B (zh) | 柯萨奇病毒a16型病毒株、用途、疫苗及其制备方法 | |
| PT1427817E (pt) | Multiplicação de vírus numa cultura celular | |
| Philipson et al. | Recovery of a cytopathogenic agent from patients with non-diphtheritic croup and from day-nursery children. I. Properties of the agent | |
| CN110343671A (zh) | 一种表达vp2基因的重组ⅰ型马立克氏病病毒疫苗毒株 | |
| CN111500542B (zh) | 一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的应用 | |
| CN103382460B (zh) | 一株马立克氏病病毒疫苗株及其分离鉴定和应用 | |
| RU2692604C1 (ru) | Способ адаптации ротавируса группы А человека к росту на перевиваемых культурах клеток животных | |
| CN111778217B (zh) | Ⅰ群4型禽腺病毒sd-f株、灭活疫苗及制备方法 | |
| CN110846284B (zh) | 一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用 | |
| CN110859956B (zh) | 一种犬细小病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
| Ashraf et al. | Interference between mild and pathogenic strains of infectious bursal disease virus in chickens | |
| CN102805862B (zh) | 一种vero细胞培养新布尼亚病毒纯化灭活疫苗的制备方法 | |
| CN103923885A (zh) | 鸡传染性法氏囊病毒Vero细胞适应株及其应用 | |
| CN110551694B (zh) | 塞尼卡谷病毒svv/ch/zz/2016 | |
| CN112961837B (zh) | 一种新城疫vii型弱毒株无血清全悬浮细胞培养的方法 | |
| CN112143714B (zh) | 利用低免鸡胚生产h7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法 | |
| CN102380093B (zh) | 一种利用传代成纤维细胞生产鸡新城疫活疫苗的方法 | |
| JPH0998778A (ja) | マレク病ワクチン | |
| US3098011A (en) | Process of producing a vaccine against distemper | |
| CN102978167A (zh) | 用细胞系生产鸡嗜肾型传染性支气管炎病毒与活疫苗 | |
| CN103160475A (zh) | 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法 | |
| CN1202378A (zh) | 使用细胞系来制备传染性囊病病毒及禽呼肠病毒的方法 | |
| Bernkopf et al. | Characteristics of a fixed rabies virus cultivated on developing chick embryos | |
| CN109234239A (zh) | 一种鸭瘟病毒的培养方法 | |
| CN110862972B (zh) | 一种犬腺病毒ⅰ型无血清培养方法 |