CN109234239A

CN109234239A - 一种鸭瘟病毒的培养方法

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Publication number: CN109234239A
Application number: CN201810768008.0A
Authority: CN
Inventors: 胡美容; 林德锐; 齐冬梅; 郑铁锁; 李嘉爱
Original assignee: GUANGDONG WINSUN BIOPHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG WINSUN BIOPHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2038-07-13
Also published as: CN109234239B

Abstract

本发明提供了一种鸭瘟病毒的培养方法，属于病毒培养技术领域。本发明以鸡胚成纤维细胞系DF‑1作为鸭瘟病毒宿主，采用逐步驯化的方式，通过超剂量接毒、细胞液中添加鸡胚尿囊液、逐代盲传的方式，使鸭瘟病毒适应DF‑1细胞系并产生细胞病变。本发明的鸭瘟病毒培养方法操作简单，DF‑1细胞系培养鸭瘟病毒生长良好，病毒含量达10^7.4~10^8.0TCID₅₀/ml，较CEF细胞培养的病毒含量提高0.25‑0.75个滴度，避免了CEF细胞培养病毒存在外源病毒污染的安全隐患，并且由于DF‑1细胞建库后，对产品生产的稳定性和持续性提供了保证，随用随取，省时省力，工艺放大更简单易行，极大地降低了鸭瘟病毒培养过程中的生产成本，能够取得提高安全性和降低成本的双赢，经济效益显著。

Description

一种鸭瘟病毒的培养方法

技术领域

本发明涉及生物制品制备技术领域，具体地涉及病毒培养技术领域，特别是涉及一种以鸡胚成纤维细胞系DF-1为宿主培养鸭瘟病毒的方法。

背景技术

鸭瘟（Duck Plague，DP），是由鸭瘟病毒（Duck Plague Virus，DPV）引起的鸭、鹅及多种雁目禽类的一种急性败血性传染病。DPV传播迅速，流行广泛，发病率和死亡率非常高，给养鸭业造成巨大的经济损失，是危害养鸭业的最为严重的传染病之一。鸭群接种鸭瘟病毒疫苗是防制鸭瘟的有效措施之一，生产鸭瘟病毒疫苗需要培养大量的鸭瘟病毒液。我国目前繁殖鸭瘟病毒所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞（CEF）。虽然国家已规定所使用的鸡胚必须来源于SPF鸡群，但是由于检测的滞后性及饲养环境的复杂性，使得生产鸭瘟用CEF细胞存在外源病毒污染的安全隐患；另外，生产时要用大量鸡胚，劳动强度大，同时也加大了CEF细胞被污染的可能性。目前已有报道表明鸡肝癌细胞系可作为鸭瘟病毒的宿主细胞，但是鸡肝癌细胞极不易培养，增加了鸭瘟病毒培养的生产成本，并且由于鸡肝癌细胞具有致癌性，不能用于活疫苗的生产。

DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，来源于ELL鸡胚胎，该细胞在形态上呈纤维状。DF-1细胞系是一种稳定的、无肿瘤基因、自发无限增殖的细胞系。目前已有研究表明传染性法氏囊病毒、鸡马立克氏病毒、新城疫病毒均能在DF-1细胞上生长良好，但常见的鸭瘟病毒株无法直接在DF-1细胞上生长并产生细胞病变，目前没有DF-1细胞系培养鸭瘟病毒方法的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种无外源病毒污染、操作简便、成本低、细胞原料易获得的鸭瘟病毒的培养方法。

本发明的另一目的在于提供DF-1细胞在生产鸭瘟病毒液中的应用。

本发明的再一个目的在于提供一种能够在DF-1细胞生长的鸭瘟病毒及其驯化方法。

本发明首先提供了一种鸭瘟病毒的培养方法，是采用鸡胚成纤维细胞系DF-1培养鸭瘟病毒。

具体地，本发明的鸭瘟病毒的培养方法包括以下步骤：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后5-10日收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；

（3）收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-10%的体积比接种于DF-1细胞，培养。

其中，步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

所述病毒液为CEF细胞培养的鸭瘟病毒液。

本发明的鸭瘟病毒的培养方法中，优选地，可设立空白对照组，处理方式为以CEF细胞液为接种源来接种DF-1细胞，若空白对照组整个培养过程均为阴性（每次盲传接种后5-10日均无CPE），则培养方法可信。

优选地，步骤（1）所述超剂量为10^6.5-10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

更优选地，步骤（1）所述超剂量为10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-8%接种量。在本发明一个较佳实施例中，采用10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的5%接种量。本领域技术人员应当理解，无论采用上述列举的任一病毒含量或体积比，只要鸭瘟病毒的接种量足够大均适用于本发明的技术方案。

进一步地，步骤（1）所述DF-1细胞液中添加9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液，以增加初始鸭瘟病毒的适应性。

优选地，步骤（1）所述DF-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。更优选地，添加体积比4%-6%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。在本发明一个较佳实施例中，添加体积比5%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

本发明鸡胚尿囊液是用9~11日龄的SPF鸡胚是现用现做的，吸取尿囊液后以常规方法离心，取上清添加至DF-1细胞液中。

本发明提供的鸭瘟病毒的培养方法中，步骤（2）中，随着盲传代次增加，细胞病变出现时间提早，病变越明显、越多。通常在盲传8-10代左右，接种后48小时出现细胞病变，72小时细胞病变达75%以上。

步骤（2）中，优选地，接毒后6-9日收获细胞液。

优选地，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；更优选地，至接种后72小时内CPE达75%以上时收获病毒液。

更进一步地，步骤（3）所述DF-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液。

优选地，步骤（3）中，收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于DF-1细胞。更优选地，收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-2%的体积比接种于DF-1细胞。

本发明一个较佳的实施例是按照与DF-1细胞液1%的体积比将步骤（2）最终收获的病毒液接种于DF-1细胞。

步骤（3）中，由于降低了病毒接种量，不再添加鸡胚尿囊液于细胞液中，通常当以1%的接毒量盲传4-6代后，接种后48小时细胞出现明显病变、72小时CPE达75%以上。

上述步骤中鸭瘟病毒接种DF-1细胞时，按照常规方法培养DF-1细胞，当细胞满单层时，弃去培养液，用灭菌的PBS清洗细胞1次，将鸭瘟病毒液按要求剂量接种到DF-1细胞表面，常规条件吸附、间隔一定时间晃动细胞瓶，吸附结束后补加维持液。

本发明实施例所用的DF-1细胞培养液含90%～92％体积百分比的DMEM/F12液、抗生素和8%～10％体积百分比的牛血清，细胞培养液的pH值为7.0～7.2。所述的抗生素为100IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素的组合。

本发明实施例所用DF-1细胞维持液含95%～98％体积百分比的DMEM/F12液、抗生素和2%～5％体积百分比的牛血清，细胞维持液的pH值为7.2～7.4。所述的抗生素为100IU/ml青霉素和100IU/ml链霉素的组合。

本发明不限于上述列举的细胞培养液和细胞维持液的配方，本领域技术人员可以采用本领域公知公用的其他能够培养DF-1的方法来培养DF-1细胞系按照本发明的培养方法，均能够实现本发明预期的技术效果。

细胞传代时经EDTA-胰酶消化传代，用细胞培养液继续培养，形成传代细胞单层。

本发明提供了鸡胚成纤维细胞系DF-1在培养鸭瘟病毒中的应用。

所述的应用具体步骤为：（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；（2）接毒后5-10日（优选6-9日）收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；（3）收获的病毒液冻融后按照与DF-1细胞液0.5%-5%的体积比接种于DF-1细胞，培养。

本发明提供了鸡胚成纤维细胞系DF-1在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

本发明还提供了一种能够在鸡胚成纤维细胞系DF-1中生长的鸭瘟病毒。

本发明的能够在鸡胚成纤维细胞系DF-1中生长的鸭瘟病毒，是通过以下方法驯化得到：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后6-9日收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后72小时内CPE达75%以上时收获病毒液，即得。

本发明实施例中采用的初始鸭瘟病毒液为CEF细胞培养得到的鸭瘟病毒液。

本发明提供的能够在鸡胚成纤维细胞系DF-1中生长的鸭瘟病毒，上述驯化方法的步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量；步骤（1）所述DF-1细胞液中添加9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。DF-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。优选地，添加体积比4%-6%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。更优选地，添加体积比5%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

进一步地，本发明提供了上述鸭瘟病毒在生产鸭瘟病毒疫苗中的应用。

本发明提供了一种驯化鸭瘟病毒的方法，驯化得到的鸭瘟病毒能够在鸡胚成纤维细胞系DF-1中生长，该方法包括以下步骤：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后5-10日收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液，即得。

步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

更优选地，步骤（1）所述超剂量为10^7.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3-8%接种量。

进一步地，步骤（1）所述DF-1细胞液中含有体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。更优选地，添加体积比4%-6%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。在本发明一个较佳实施例中，添加体积比5%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

本发明提供的驯化鸭瘟病毒的方法步骤（2）中，随着盲传代次增加，细胞病变出现时间提早，病变越明显、越多。通常在盲传8-10代左右，接种后48小时出现细胞病变，72小时细胞病变达75%以上。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明为鸭瘟病毒繁殖寻找到了一种新的宿主，用DF-1细胞培养鸭瘟病毒，避免了现有技术中采用CEF细胞培养病毒容易存在外源病毒污染的安全隐患，提高了鸭瘟疫苗的安全性。

（2）本发明提供的鸭瘟病毒培养方法，能使鸭瘟病毒在DF-1细胞系上生长良好，病毒含量达10^7.4~10^8.0TCID₅₀/ml，病毒产量高于CEF原代细胞，较CEF细胞培养的病毒含量提高0.25-0.75个滴度。

（3）由于DF-1细胞是一种可传代的鸡成纤维细胞系，具有随用随取、省时省力的特点，因此在鸭瘟病毒液生产过程中，避免了现有技术中由于需要使用CEF细胞而受到SPF鸡胚供应和孵化日龄的限制，极大地简化了生产工艺和生产成本。

（4）本发明方法操作简单、效果稳定，实现了提高安全性和降低成本的双赢，培养的鸭瘟病毒液可用于制备鸭瘟疫苗，经济效益显著。

附图说明

图1为DF-1对照细胞；图2为DPV F80以1%接毒DF-1细胞接毒后24h；图3为DPV F80以1%接毒DF-1细胞接毒后48h；图4为DPV F80以1%接毒DF-1细胞接毒后72h。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

本文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

以下实施例中，DF-1细胞购自舜冉（上海）生物科技有限公司。鸭瘟病毒为鸡胚化弱毒株AV1222株，购自中国兽医药品监察所。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1 鸭瘟病毒培养方法的建立

DF-1细胞按照常规方法培养至单层后，设立接毒组和空白对照组。接毒组是按体积比5%（即300ul）接种DPV F65代毒（CEF细胞传代致弱的鸭瘟病毒液DPV F65代毒，病毒含量为10^7.5TCID₅₀/ml），同时按细胞液体积6ml添加5%（即300ul）9~10日龄的SPF鸡胚尿囊液，置37℃、5%CO₂条件下吸附60min，期间每隔15min轻轻摇动细胞瓶，吸附结束后补加维持液，同时设立CEF细胞液接种DF-1细胞作为空白对照组，接种比例和添加尿囊液的量与鸭瘟病毒相同。

每日观察细胞病变情况，若培养7日后仍不出现细胞病变则将接毒组的细胞瓶和空白对照组的细胞瓶置-20℃条件下冻融1次后按上述方法继续接种DF-1细胞，连续盲传，每代培养7日后收获。接毒组DPV F66~F69代（即DF-1细胞培养的第1-4代）均无明显细胞病变；DPV F70代培养6日后细胞出现明显病变，即细胞变圆，有颗粒状缺失，细胞拉网。随着代次增加，病变出现时间提早，病变越明显、越多，病变细胞开始脱落。DPV F72接种后48小时出现细胞病变，72小时CPE达75%以上。空白对照组始终未出现细胞病变。

DPV F74代毒开始，接毒量调整至1%，同时不再添加9~10日龄的SPF鸡胚尿囊液。接毒后病变时间推迟，96小时出现明显病变，120小时 CPE达75%以上，随着代次增加，病变时间提早，DPV F77接种后48小时出现明显病变，72小时 CPE达75%以上。空白对照组的操作与实验组相同，不同点在于空白对照组接种的是DF-1细胞液。

DPV F80~F100按体积比1%接种后48小时左右，细胞出现圆缩，有颗粒状缺失，病变细胞开始脱落，贴壁细胞出现拉网，胞浆内出现空泡，接种后72小时CPE达75%以上，见图1~图4。

实施例2 病毒含量的测定

将实施例1中收获的DPV F80~F100不同代次病毒液用无血清M199作10倍系列稀释，取4个稀释度，分别接种已长成良好单层的 CEF细胞96孔微量细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照。置37℃、含5% CO₂培养箱中吸附1小时后，每孔补加含4%血清的M199维持液0.1ml，观察120～144小时，记录细胞病变（CPE）孔数。按Reed-Muench法计算TCID₅₀,结果表明DPV F80~F100代病毒含量稳定，病毒含量达10^7.4~10^8.0TCID₅₀/ mL。

表1 病毒含量检测结果

实施例3 DF-1细胞生产的DPV F80、F86、F95代毒特异性鉴定

将实施例1中收获的F80、F86、F95代病毒液用无血清M199稀释至含100TCID₅₀/ 0.1ml，与等量抗鸭瘟病毒特异性血清混合后，37℃中和1小时，接种6个已长成CEF单层的细胞孔（48孔细胞板），每孔0.2ml，同时设病毒对照和正常细胞对照各6孔。置37℃、含5% CO₂培养箱培养并观察120-144小时，结果中和组和正常细胞对照组均无细胞病变，病毒对照组细胞均出现细胞病变。

本实施例中所用的抗鸭瘟病毒特异性血清的制备方法为：

（1）抗鸭瘟病毒特异性血清的制备方法

取9周龄SPF鸡40只，每只肌肉注射实施例1收获的鸭瘟病毒F80代病毒液0.5ml（病毒含量为10^7.6TCID₅₀/ml）；14天后每只肌肉注射鸭瘟病毒F80代病毒液0.2ml和鸭瘟病毒F80代毒株的灭活疫苗1.0ml（灭活前病毒含量为10^7.6TCID₅₀/ml）；然后再用鸭瘟病毒F80代毒株灭活疫苗加强免疫2次，每只1.0ml。4次免疫后28天采集血清，检测中和抗体效价。当抗体水平达到峰值时大量采血，分离血清。

（2）抗鸭瘟病毒特异性血清标准

【性状】淡黄色澄清液体。

【无菌检验】按现行《中国兽药典》附录3306进行检验，应无菌生长。

【支原体检验】按现行《中国兽药典》附录3308进行检验，应无支原体污染。

【特异性鉴定】鸡新城疫、禽流感、禽腺病毒（有血凝性）均为HI抗体阴性；鸡传染性支气管炎病毒、禽网状内皮组织增生症病毒、禽白血病病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒均为ELISA抗体阴性；鸡痘病毒、鸡马立克氏病病毒、禽腺病毒（Ⅰ群）；鸭肝炎、鸭坦布苏病毒病中和抗体阴性。

【中和效价测定】与鸭瘟病毒的中和抗体效价应不低于1:64。

【贮藏与有效期】-70℃以下保存，保存期暂定为24个月。

实施例4 DPV F80、F86、F95代毒外源病毒检测

（1）PCR方法检测鸭坦布苏病毒DTMUV、鸭肝炎Ⅰ型病毒DHV-1和鸭肝炎Ⅲ型病毒DHV-3

取DPV F80、F86、F95不同代次病毒液用试剂盒提取RNA，用反转录试剂盒反转录成cDNA后进行PCR检测。引物序列见表2。

表2

PCR反应体系：DNA模板10 µL，10×PCR buffer 5 µL，2.5mmol/L dNTP 2 µL，上游引物 1 µL，下游引物1 µL，Ex Taq酶1 µL，ddH₂O 30µL。

PCR反应程序：

（a）鸭坦布苏病毒（DTMUV）

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性40秒，56℃退火40秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟。

（b）鸭肝炎Ⅰ型病毒（DHV-1型）

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。

（c）鸭肝炎Ⅲ型病毒（DHV-3型）

PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火30 秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃延伸5分钟。

PCR检测结果：实施例1制得的 F80、F86、F95代毒（也即DF-1细胞上传代的第15、21、30代毒）三个代次的病毒液经PCR检测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎Ⅰ型病毒和鸭肝炎Ⅲ型病毒抗原均为阴性，未扩增到表2中的三条目的条带，说明实施例1方法制得的鸭瘟病毒液未受到常见3种鸭外源病毒的污染。

（2）鸡检查法

取DPV F80、F86、F95不同代次病毒液用灭菌生理盐水稀释至每毫升含10^3.5TCID₅₀，每个代次病毒液肌肉注射10周龄SPF鸡20只，1ml/只。14日后，每只点眼、滴鼻接种 0.1ml（含10^4.5TCID₅₀）、肌肉注射1ml（含10^5.5TCID₅₀）。观察21日后，按上述方法和剂量重复接种1次。第2次接种后21日采血，分离血清。在56日内，不应有疫苗引起的局部或全身症状或呼吸道症状或死亡。如果有死鸡，应进行病理学检查，以证明是否由鸭瘟病毒所致。

对分离的血清用HI检验方法测定鸡新城疫病毒、腺病毒（有血凝性）、H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒抗体；用ELISA方法测定鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽白血病病毒、禽网状内皮增生症病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性贫血病毒、禽呼肠孤病毒和禽脑脊髓炎病毒的抗体；用AGP方法进行鸡马立克氏病病毒的抗体检测；用中和试验测鸭坦布苏病毒、鸭肝炎病毒抗体。

结果：3个代次的病毒液分别两次接种雏鸡后，56日采血，进行血清抗体检测，抗体检测均为阴性。在56日内，均未引起局部或全身症状或呼吸道症状或死亡，详见表3。

表3 外源病毒检测方法与结果

注：“—”表示阴性。

实施例5 DPV F80、F86、F95代毒在CEF细胞和DF-1细胞上增殖的病毒含量的比较

将实施例1中在DF-1细胞上驯化的DPV F80、F86、F95代毒和不经DF-1细胞驯化的DPVF65代毒（即实施例1的初始接毒毒种）分别按体积比1%接种已长成良好单层的DF-1细胞和CEF细胞，37℃吸附60分钟后加入细胞维持液继续置37℃、5%CO₂培养，每日观察细胞病变，当细胞病变达75%左右时收获病毒液（CPE达75%为终判标准），收获的病毒液置-20℃冻融1次后取样用CEF细胞进行病毒含量的测定，按上述方法将DPV F80、F86、F95代毒及DPV F65代毒分别在CEF细胞和DF-1细胞上连续繁殖3代（每代做5个重复试验，取其平均数，见表4），每代取样用CEF细胞进行病毒含量的测定。

表4 不同代次毒分别的CEF细胞和DF-1细胞上TCID₅₀测定结果

表4表明在DF-1细胞上驯化的DPV F80、F86、F95代毒在CEF细胞和DF-1细胞均增殖良好，在DF-1细胞上增殖的病毒含量略高于CEF细胞，约0.25~0.75个滴度；在DF-1细胞上驯化的DPV F80、F86、F95代毒与不经DF-1细胞驯化的DPV F65代毒在CEF细胞上的增殖的病毒含量与收获时间无明显差异；不经本发明提供的DF-1细胞驯化方法的DPV F65代毒能在CEF细胞增殖，但是不能在DF-1细胞增殖。

实施例6 对比试验

1、关于接毒量

1.1 参照实施例1的方法，设置多个接毒量对比组，其他步骤和参数均同实施例1，仅每次盲传的接毒量按照下面不同组的设置进行，连续盲传，记录开始出现CPE的盲传代，结果见表5。

表5 不同接毒量组经多次盲传后细胞病变情况

表5结果表明，当种毒病毒含量不低于10^6.5TCID₅₀/ml，接种量体积比在3%~12%范围内，连续盲传5~10代后，均能在DF-1细胞上产生CPE；若种毒病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml，接毒比例为0.5%时，则盲传15代后，仍不出现CPE；若种毒病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml，接毒比例为10%时，盲传15代后也不出现CPE。

1.2 取已长成良好单层的DF-1细胞，将实施例1中在DF-1细胞上驯化的DPV F80分别按体积比0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、5%、10%共7个不同的接毒量，接种DF-1细胞，37℃吸附1小时，加维持液后置37℃继续培养，接毒后每日观察，当CPE达到75%以上时收获病毒液，收获的毒液置-20℃以下保存，将收获的细胞毒液，冻融1次后测定病毒含量。结果见表6。

表6 不同接毒量收获毒液的病毒含量测定（TCID₅₀/ml）

组别	收毒时间	病毒含量（TCID<sub>50</sub>/ml）
			0.1%	150h	10<sup>6.15</sup>
0.3%	124h	10<sup>6.75</sup>
			0.5%	92h	10<sup>7.5</sup>
1%	70h	10<sup>7.6</sup>
			2%	65h	10<sup>7.36</sup>
5%	50h	10<sup>7.0</sup>
			10%	36h	10<sup>6.5</sup>

表6结果表明， 0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、5%、10%不同的接毒量所收获的鸭瘟病毒液病毒含量不同，分别为10^6.15、10^6.75、10^7.5、10^7.6、10^7.36、10^7.0、10^6.5TCID50/ml，收获时间也不一样，分别为150、124、92、70、65、50、36小时；根据实际生产情况、降低料耗和生产成本方面考虑，将鸭瘟病毒液生产时的病毒接种量与DF-1细胞液的体积比确定为0.5%~2%。

2、关于添加鸡胚尿囊液

2.1 将实施例1中在DF-1细胞上驯化的DPV F71代毒按体积比5%接种DF-1细胞，同时按体积比设（1）-（8）分别为：无添加组、添加1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%比例的鸡胚尿囊液的对比试验，细胞病毒达75%以上时收获病毒液。其他步骤和参数均与实施例1相同，不同点在于是否添加鸡胚尿囊液和添加的比例。结果见表7。

表7 添加不同比例鸡胚尿囊液对收毒时间的影响

组别	收毒时间	病毒含量（TCID<sub>50</sub>/ml）
			0%	10d	10<sup>5.5</sup>
1%	9d	10<sup>5.75</sup>
			2%	8d	10<sup>6.0</sup>
3%	7d	10<sup>6.5</sup>
			4%	150h	10<sup>6.75</sup>
5%	140h	10<sup>7.25</sup>
			6%	120h	10<sup>7.0</sup>
8%	72h	10<sup>7.0</sup>
			10%	72h	10<sup>7.0</sup>

表7结果表明DPV F71代毒按体积比5%接种DF-1细胞，按体积比分别添加3%~8%鸡胚尿囊液，收毒时间在72h~7d，病毒含量在10^6.5~7.25 TCID50/ml。尿囊液的添加量低于3%，收毒时间更长，且病毒含量比较低，尿囊液的添加量高于10%，收毒时间与病毒含量则无明显改进。

2.2 将实施例1中在DF-1细胞上驯化的DPV F74代毒按体积比1%接种DF-1细胞，同时设（1）-（8）组，分别为无添加组、添加1%、2%、3%、5%、6%、8%、10%比例的鸡胚尿囊液的对比试验，细胞病毒达75%以上时收获病毒液。其他步骤和参数均与实施例1相同，不同点在于是否添加鸡胚尿囊液和添加的比例。结果见表8。

表8 添加不同比例鸡胚尿囊液对收毒时间的影响

组别	收毒时间	病毒含量（TCID<sub>50</sub>/ml）
			0%	120h	10<sup>7.36</sup>
1%	108h	10<sup>7.4</sup>
			2%	100h	10<sup>7.4</sup>
3%	96h	10<sup>7.5</sup>
			4%	90h	10<sup>7.4</sup>
5%	80h	10<sup>7.25</sup>
			6%	72h	10<sup>7.4</sup>
8%	72h	10<sup>7.25</sup>
			10%	72h	10<sup>7.4</sup>

表8结果表明，DPV F74代毒按体积比1%接种DF-1细胞，按体积比以不同量添加鸡胚尿囊液，随着添加比例的增加，收获时间在72h~120h之间，均在可接受范围，且病毒含量无明显变化，为了尽可能降低外源病毒污染的可能，此时可考虑不再添加鸡胚尿囊液。

3、关于收毒时间

参照实施例1的方法，DPV F65代毒（即实施例1的初始接毒毒种）接毒后分不同时间收毒，其他步骤和参数均同实施例1，仅每次盲传的收毒时间按照下面不同组的设置进行，连续盲传，记录开始出现CPE的盲传代次、不同收获时间的接毒组和正常细胞对照组细胞病变情况，结果见表9。

表9 盲传时不同收毒时间对病毒驯化的影响

组别	收毒时间	开始出现CPE的盲传代次	接毒组CPE情况	正常细胞组情况
					1	接毒后2天	15代	无CPE	细胞正常
2	接毒后3天	15代	无CPE	细胞正常
					3	接毒后4天	15代	无CPE	细胞正常
4	接毒后5天	10代	有CPE	细胞正常
					5	接毒后6天	8代	有CPE	细胞正常
6	接毒后7天	6代	有CPE	细胞正常
					7	接毒后8天	5代	有CPE	细胞正常
8	接毒后9天	5代	有CPE	细胞正常
					9	接毒后10天	5代	有CPE	细胞正常
10	接毒后11天	1代	/	细胞出现异常

表9结果表明DPV F65代毒接种DF-1细胞培养5~10天后收获，连续盲传，盲传5~10代后接毒组细胞开始出现CPE；接毒后2~4天收获连续盲传15代接毒组仍无CPE出现，接毒后11天收获不合适，此时正常细胞已不能维持正常状态。因此，选择在DPV F65代毒接种DF-1细胞培养6-9天后收获病毒液，再连续盲传。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广东永顺生物制药股份有限公司

<120> 一种鸭瘟病毒的培养方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatgcgtcg tacgtgct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtcgttccc agattcca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggggagacca aacgacaa 18

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacccatcac cattctataa gc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaatacaa ggggagtcgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaaatgggc gatggttgcg 20

序列表

<110> 广东永顺生物制药股份有限公司

<120> 一种鸭瘟病毒的培养方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatgcgtcg tacgtgct 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtcgttccc agattcca 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacccatcac cattctataa gc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaatacaa ggggagtcgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgaaatgggc gatggttgcg 20

Claims

1.一种鸭瘟病毒的培养方法，其特征在于，采用鸡胚成纤维细胞系DF-1培养鸭瘟病毒。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；

（2）接毒后5-10日收获含病毒的细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种鸭瘟病毒后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液；

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述超剂量为不低于10^6.5TCID₅₀/ml的病毒液按照与DF-1细胞液体积比的3%-12%接种量。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述DF-1细胞液中添加9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述DF-1细胞液中添加体积比3%-8%的9-11日龄的SPF鸡胚尿囊液。

6.根据权利要求2-5任一所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）所述DF-1细胞液中不添加鸡胚尿囊液。

7.鸡胚成纤维细胞系DF-1在培养鸭瘟病毒中的应用。

8.鸡胚成纤维细胞系DF-1在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。

9.一种能够在鸡胚成纤维细胞系DF-1中生长的鸭瘟病毒，其特征在于，通过以下方法驯化得到：（1）超剂量鸭瘟病毒液接种DF-1细胞；所述鸭瘟病毒液为CEF细胞培养得到的鸭瘟病毒液；（2）接毒后5-10日收获细胞液，反复冻融后按照步骤（1）再次接种DF-1细胞，如此盲传多代，至接种后120小时内CPE达75%以上时收获病毒液。

10.权利要求9所述的鸭瘟病毒在制备鸭瘟病毒疫苗中的应用。