RU2687373C2 - Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium - Google Patents
Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium Download PDFInfo
- Publication number
- RU2687373C2 RU2687373C2 RU2016152370A RU2016152370A RU2687373C2 RU 2687373 C2 RU2687373 C2 RU 2687373C2 RU 2016152370 A RU2016152370 A RU 2016152370A RU 2016152370 A RU2016152370 A RU 2016152370A RU 2687373 C2 RU2687373 C2 RU 2687373C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- growth
- nutrient medium
- biomass
- medium
- brucella
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 title claims abstract description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 241000589562 Brucella Species 0.000 claims abstract description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 10
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 4
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 2
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 2
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 2
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M thiamine(1+) chloride Chemical compound [Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N MYVIATVLJGTBFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 229960005203 brucella antigen Drugs 0.000 description 6
- 241001148106 Brucella melitensis Species 0.000 description 5
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 5
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000006180 nutrition needs Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930187593 rose bengal Natural products 0.000 description 1
- AZJPTIGZZTZIDR-UHFFFAOYSA-L rose bengal Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C1=C(Cl)C(Cl)=C(Cl)C(Cl)=C1C1=C2C=C(I)C(=O)C(I)=C2OC2=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 AZJPTIGZZTZIDR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940081623 rose bengal Drugs 0.000 description 1
- STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N rose bengal A Natural products O1C(=O)C(C(=CC=C2Cl)Cl)=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 STRXNPAVPKGJQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/40—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum bacterial
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИTECHNICAL FIELD
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения биомассы бруцелл в технологии приготовления биопрепаратов на их основе.The invention relates to the field of biotechnology and can be used to obtain Brucella biomass in the technology of preparation of biological products based on them.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИPRIOR ART
В качестве основы для приготовления различных препаратов для диагностики бруцеллеза в настоящее время широко используется вакцинный штамм 19ВА Brucella abortus [RU 2163141 C1, 20.02.2001]. Кроме того, для специфической профилактики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных применяются живые вакцины из штаммов 19 В. abortus и Rev-1 B. melitensis [Наставление по применению вакцины живой сухой против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма бруцелла абортус 19 (1996), Наставление по применению вакцины живой нативной из штамма Rev-1 бруцелла мелитензис для иммунизации баранов против инфекционного эпидидимита (1995)]. Основным этапом технологии изготовления указанных препаратов является процесс получения микробной биомассы возбудителя бруцеллеза с необходимой концентрацией и в достаточном объеме. В биотехнологии для получения стандартизованных культур микробов достаточно глубоко разработан и нашел широкое практическое применение способ периодического глубинного культивирования.As the basis for the preparation of various drugs for the diagnosis of brucellosis, the vaccine strain 19BA Brucella abortus is now widely used [RU 2163141 C1, 20.02.2001]. In addition, live vaccines from strains 19 B. abortus and Rev-1 B. melitensis are used for the specific prevention of brucellosis in farm animals [Manual on the use of vaccines live dry against brucellosis on farm animals from Brucella abortus 19 (1996), Manual on the use of vaccines live native strain Rev-1 brucella melitenzis for immunizing rams against infectious epididymitis (1995)]. The main stage of the manufacturing technology of these drugs is the process of obtaining microbial biomass of the causative agent of brucellosis with the required concentration and in sufficient volume. In biotechnology, to obtain standardized cultures of microbes, it has been developed quite deeply and has found wide practical application of the method of periodic deep-seated cultivation.
Для глубинного выращивания бруцелл в технологии приготовления биопрепаратов чаще всего используют жидкие питательные среды на основе перевара Хоттингера с высоким содержанием белкового компонента с добавлением глицерина, глюкозы и дрожжевого экстракта [Девришов Д.А., Кузнецов С.М., Шведов Д.В. и др. Сравнительная оценка ростовых свойств питательной среды для приготовления живой бруцеллезной вакцины из штамма Rev-1 // Ветеринарная медицина.- 2007. - №1. - С. 6-7, Лузан Н.С. Усовершенствование промышленных технологий производства бруцеллезной вакцины и диагностикумов из штамма Brucella abortus 19. - Дисс… канд. биол. наук. - Щелково, 2001. - 124 с.]. Однако необходимо отметить, что высокое содержание гидролизата ценного пищевого продукта в составе среды существенно удорожает ее стоимость и определяет наличие большого количества балластных примесей в получаемых культурах.For deep cultivation of brucella in the technology of preparation of biological products most often use liquid nutrient media based on Hottinger's parvar with a high content of the protein component with the addition of glycerin, glucose and yeast extract [D. Devrishov, Kuznetsov S.M. et al. Comparative assessment of the growth properties of the nutrient medium for the preparation of live Brucella vaccine from the Rev-1 strain // Veterinary Medicine. - 2007. - №1. - p. 6-7, Luzan N.S. Improvement of industrial technologies for the production of Brucella vaccine and diagnostics from Brucella abortus 19 strain. - Diss ... Cand. biol. sciences. - Shchelkovo, 2001. - 124 p.]. However, it should be noted that the high content of the hydrolyzate of a valuable food product in the composition of the medium significantly increases the cost of its cost and determines the presence of a large amount of ballast impurities in the resulting cultures.
Имеющиеся экспериментальные данные по динамике утилизации свободных аминокислот в процессе выращивания бруцелл позволяют сделать вывод о том, что большинство питательных сред, используемых при получении биопрепаратов, содержат в своем составе белковые гидролизаты в концентрации, значительно превышающей питательные потребности данного микроорганизма [Юдин Ю.И., Жаворонкова Л.В., Шабалин Б.А. и др. Оценка возможности использования «минимизированных» питательных сред на основе различных гидролизатов для глубинного выращивания бруцелл // Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 60-летию филиала ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России - ЦВТП БЗ» «Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология», 16 июля 2009 г., Екатеринбург. - Екатеринбург, 2009. - С. 111-113]. Данное обстоятельство указывает на принципиальную возможность снижения количества белкового компонента в используемой питательной среде.The available experimental data on the dynamics of utilization of free amino acids in the process of growing brucella suggests that most nutrient media used in obtaining biologics contain protein hydrolysates in concentrations that significantly exceed the nutritional needs of this microorganism [Yudin YI, Zhavoronkova L.V., Shabalin B.A. et al. Assessing the possibility of using “minimized” nutrient media based on various hydrolyzates for deep-growing brucella // Materials of the All-Russian Scientific and Practical Conference dedicated to the 60th anniversary of the branch of FGU “48 Central Research Institute of the Ministry of Defense of Russia - TsVTP BZ” population. Diagnosis, treatment and prevention of dangerous infectious diseases. Epidemiology and epizootology. Microbiology. Biotechnology. Ecology ”, July 16, 2009, Ekaterinburg. - Ekaterinburg, 2009. - P. 111-113]. This circumstance indicates the fundamental possibility of reducing the amount of the protein component in the nutrient medium used.
Известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК), составной частью которого является получение микробной культуры методом глубинного выращивания в биореакторе [RU 2085212 С1, 15.08.1996]. Способ требует использования дорогостоящей питательной среды, при этом уровень накопления микробных клеток в глубинной культуре (около 30 млрд микробов/мл - величина определена при анализе технологической цепочки изготовления препарата) является средним и может быть повышен.A method of obtaining Brucella antigen from the strain Brucella abortus 19 for the manufacture of a single Brucella antigen for the agglutination reaction (RA), the complement fixation reaction (RAC) and the reaction of the long complement fixation (RDSK), a part of which is to obtain microbial culture by deep growing in a bioreactor [ RU 2085212 C1, 08.15.1996]. The method requires the use of expensive nutrient medium, while the level of accumulation of microbial cells in deep culture (about 30 billion microbes / ml - the value is determined in the analysis of the technological chain of the preparation of the drug) is average and can be increased.
Известен способ получения бруцеллезного антигена штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для Роз-бенгал пробы (РБП) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки и диагностические наборы [RU 2361610 С1, 20.03.2008]. В приведенной группе изобретений описан наиболее близкий к заявляемому существующий глубинный способ получения микробной культуры штамма В. abortus 19, который имеет ряд недостатков: сравнительно высокий расход белкового гидролизата (перевара Хоттингера) на основе дорогостоящего пищевого сырья для приготовления среды, содержание которого составляет 25% по объему; повышенное содержание балластных примесей в связи с высокой концентрацией белкового компонента в используемой питательной среде (содержание аминного азота от 1,40 до 1,60 г/л); использование высоких концентраций посевного материала (от 3,5 до 5,0 млрд микробов/мл) на стадии производственного глубинного культивирования. Кроме того, в указанном способе не реализован достаточно известный метод подпитки микробной культуры субстратом в процессе глубинного выращивания, обеспечивающий стабильное повышение концентрации клеток в получаемой культуре.A method of obtaining a Brucella antigen strain Brucella abortus 19 for the manufacture of a single Brucella antigen for RA, RSK and RDSK, Brucella antigen for Rose-Bengal serum test (RBP) and Brucella antigen for ring reaction (CR) with milk, a method of manufacturing a brucellosis diagnostic serum sets [RU 2361610 C1, 03.20.2008]. In the above group of inventions described is the closest to the claimed existing deep method of obtaining microbial culture of strain B. abortus 19, which has several disadvantages: the relatively high consumption of protein hydrolyzate (Hottinger digest) based on expensive food raw material for the preparation of the medium, the content of which is 25% volume; high content of ballast impurities due to the high concentration of the protein component in the nutrient medium used (the content of amino nitrogen is from 1.40 to 1.60 g / l); the use of high concentrations of inoculum (from 3.5 to 5.0 billion microbes / ml) at the stage of industrial cultivation. In addition, in this method, the well-known method of feeding the microbial culture with the substrate during the deep growing process, which ensures a stable increase in the cell concentration in the resulting culture, is not implemented.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF INVENTION
Задачей предлагаемого способа является повышение выхода микробных клеток в глубинной культуре, снижение себестоимости используемой питательной среды, уменьшение содержания балластных примесей в получаемых препаратах.The objective of the proposed method is to increase the yield of microbial cells in deep culture, reducing the cost of the nutrient medium used, reducing the content of ballast impurities in the resulting preparations.
Технический результат заключается в обеспечении достаточного накопления биомассы бруцелл вакцинных штаммов в глубинной культуре, снижении себестоимости используемой питательной среды и уменьшении содержания балластных примесей.The technical result is to ensure sufficient accumulation of biomass of Brucella vaccine strains in deep culture, reducing the cost of the nutrient medium used and reducing the content of ballast impurities.
Для выполнения заявленного технического результата предлагается:To perform the stated technical result is proposed:
использование минимизированной по содержанию белкового компонента жидкой питательной среды;the use of minimized content of the protein component of the liquid nutrient medium;
культивирование бруцелл вакцинных штаммов в биореакторе в условиях дозирования глюкозы по заданной схеме, поддержания величины рН среды на определенном уровне путем автоматического дозированного введения раствора аммиака и регуляции парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования.cultivating brucella vaccine strains in a bioreactor under dosing conditions of glucose according to a given pattern; maintaining the pH of the medium at a certain level by automatically administering a dosed solution of ammonia and regulating the partial pressure of oxygen dissolved in the culture fluid throughout the cultivation process.
Минимизированная жидкая питательная среда имеет следующий состав: ферментативный гидролизат мяса до содержания аминного азота в среде - от 0,45 до 0,55 г/л; дрожжевой экстракт сухой - 2,50 г/л; Fe2(SO4)3⋅3H2O - 7,00 мг/л; MnSO4⋅5H2O - 2,00 мг/л; KH2PO4 - 1,13 г/л; MgSO4⋅7H2O - 0,23 г/л; никотиновая кислота - 2,00 мг/л; тиамина хлорид - 0,20 мг/л; кальция пантотенат - 1,00 мг/л; глюкоза (суммарное количество за цикл выращивания) - 26,00 г/л, вода дистиллированная - до расчетного объема; рН среды - от 6,8 до 7,2 ед. рН.The minimized liquid nutrient medium has the following composition: enzymatic hydrolyzate of meat until the content of amino nitrogen in the medium is from 0.45 to 0.55 g / l; dry yeast extract - 2.50 g / l; Fe 2 (SO 4 ) 3 · 3H 2 O - 7.00 mg / l; MnSO 4 · 5H 2 O - 2.00 mg / l; KH 2 PO 4 - 1.13 g / l; MgSO 4 · 7H 2 O - 0.23 g / l; nicotinic acid - 2.00 mg / l; thiamine chloride - 0.20 mg / l; calcium pantothenate - 1.00 mg / l; glucose (total amount per growing cycle) - 26.00 g / l, distilled water - to the calculated volume; pH of the medium is from 6.8 to 7.2 units. pH
Схема дозированного введения глюкозы предусматривает одномоментное введение ее в питательную среду перед засевом в концентрации 10,0 г/л, с 16 по 19 ч роста - непрерывное введение по 1,5 г/л в ч, с 20 по 24 ч роста - непрерывное введение по 2,0 г/л в час. Оптимальную величину показателя рН культуральной жидкости в диапазоне от 6,8 до 7,2 ед. рН поддерживают автоматическим дозированным введением 12,5% водного раствора аммиака.The scheme of the metered introduction of glucose provides for the simultaneous introduction of it into the nutrient medium before seeding at a concentration of 10.0 g / l, from 16 to 19 h of growth - continuous introduction at 1.5 g / l per hour, from 20 to 24 h of growth - continuous introduction at 2.0 g / l per hour. The optimum pH of the culture fluid in the range from 6.8 to 7.2 units. The pH is maintained by automatic dosed administration of 12.5% aqueous ammonia.
По отношению к существующему способу предлагаемый способ имеет ряд отличий (таблица 1).In relation to the existing method, the proposed method has a number of differences (table 1).
Применение заявляемого способа обеспечивает накопление микробных клеток в глубинной культуре в концентрации до 85-90 млрд микробов/мл, уменьшение себестоимости используемой жидкой питательной среды и снижение содержания белковых балластных примесей в микробной культуре. Продолжительность процесса глубинного культивирования составляет от 26 до 28 ч.The application of the proposed method provides for the accumulation of microbial cells in deep culture at a concentration of up to 85-90 billion microbes / ml, reducing the cost of the used liquid nutrient medium and reducing the content of protein ballast impurities in microbial culture. The duration of the submerged cultivation process is from 26 to 28 hours.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯIMPLEMENTATION OF THE INVENTION
Заявляемое изобретение подтверждается следующими примерами практического применения.The claimed invention is confirmed by the following examples of practical application.
Пример 1.Example 1
В варочный котел через капроновое сито наливают ферментативный гидролизат мяса и дистиллированную воду из расчета конечной концентрации аминного азота в среде от 0,45 до 0,55 г/л. Смесь тщательно перемешивают, кипятят в течение 5 мин, подщелачивают 20% раствором NaOH до величины рН от 6,8 до 7,2 ед. рН, добавляют навески солей, кипятят в течение 20-25 мин, после чего среду фильтруют через осветляющие пластины и разливают в бутыли вместимостью 20 л. Жидкую питательную среду переносят в биореактор и стерилизуют при температуре от 121 до 125°С в течение 45 мин, после чего охлаждают до температуры от 36 до 38°С. Раствор глюкозы с добавлением витаминов и раствор дрожжевого экстракта готовят отдельно, стерилизуют при температуре от 108 до 112°С в течение 20 мин и вводят в стерильную среду непосредственно перед ее засевом. Расчетная концентрация глюкозы в питательной среде перед засевом составляет 10,0 г/л. Засев питательной среды в биореакторе осуществляют микробной культурой штамма 19ВА В. abortus, выращенной в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата мяса аналогичного состава. Посевная доза (концентрация посевного материала) составляет от 0,5 до 1,0 млрд микробов/мл по стандарту мутности оптическому для определения концентрации микробов ОСО 42-28-85-2013.Enzyme hydrolyzate of meat and distilled water are poured into the digester through a nylon sieve in the calculation of the final concentration of amine nitrogen in the medium from 0.45 to 0.55 g / l. The mixture is thoroughly mixed, boiled for 5 minutes, alkalinized with 20% NaOH solution to a pH of 6.8 to 7.2 units. pH, add weighed salt, boil for 20-25 minutes, after which the medium is filtered through brightening plates and poured into bottles with a capacity of 20 liters. The liquid nutrient medium is transferred to a bioreactor and sterilized at a temperature of from 121 to 125 ° C for 45 minutes, then cooled to a temperature of from 36 to 38 ° C. A glucose solution with the addition of vitamins and a solution of yeast extract are prepared separately, sterilized at a temperature of 108 to 112 ° C for 20 minutes and injected into a sterile environment immediately before it is sown. The estimated concentration of glucose in the nutrient medium before seeding is 10.0 g / l. The sowing of the nutrient medium in the bioreactor is carried out by microbial culture of the 19BA strain of B. abortus grown in a liquid nutrient medium based on an enzymatic meat hydrolyzate of similar composition. Sowing dose (concentration of seed) is from 0.5 to 1.0 billion microbes / ml according to the turbidity optical standard for determining the concentration of microbes CCA 42-28-85-2013.
Глубинное культивирование в биореакторе осуществляют по следующему режиму:Deep cultivation in the bioreactor is carried out according to the following mode:
температура культивирования - от 36,5 до 37,5°С;cultivation temperature - from 36.5 to 37.5 ° C;
величина показателя рН культуральной жидкости - от 6,8 до 7,2 ед. рН;the pH value of the culture fluid is from 6.8 to 7.2 units. pH;
парциальное давление растворенного кислорода (в процентах от насыщения) поддерживают по схеме: с 1 по 11 ч роста - от 20 до 25 pO2; с 12 по 23 ч роста - от 40 до 45 pO2; с 24 по 26-28 ч роста - от 30 до 35 pO2;the partial pressure of dissolved oxygen (as a percentage of saturation) is maintained according to the scheme: from 1 to 11 h of growth - from 20 to 25 pO 2 ; from 12 to 23 h of growth - from 40 to 45 pO 2 ; from 24 to 26-28 hours of growth - from 30 to 35 pO 2 ;
введение глюкозы в процессе выращивания осуществляют по схеме: с 16 по 19 ч роста - непрерывно по 1,5 г/л в час; с 20 по 24 ч роста непрерывно по 2,0 г/л в час.the introduction of glucose in the process of growing is carried out according to the scheme: from 16 to 19 h of growth - continuously at 1.5 g / l per hour; from 20 to 24 hours of growth continuously at 2.0 g / l per hour.
Технологические параметры процесса глубинного культивирования поддерживают следующими управляющими воздействиями:The technological parameters of the submerged cultivation process are supported by the following control actions:
поддержание температуры - подачей термостатированной воды в рубашку биореактора;temperature maintenance - by supplying temperature-controlled water to the bioreactor jacket;
поддержание величины показателя рН культуральной жидкости - автоматическим дозированным введением 12,5% водного раствора аммиака;maintaining the pH value of the culture fluid - automatic dosed introduction of 12.5% aqueous ammonia solution;
поддержание парциального давления растворенного кислорода - регуляцией расхода воздуха на аэрацию и изменением скорости вращения мешалки.maintaining the partial pressure of dissolved oxygen - by regulating the flow of air for aeration and by changing the speed of rotation of the mixer.
Введение 12,5% водного раствора аммиака в глубинную культуру осуществляют методом автоматического дозирования при снижении величины показателя рН культуральной жидкости менее 6,8 ед. рН. По окончании процесса культивирования при стабилизации величины показателя рН культуральной жидкости на уровне от 7,0 до 7,2 ед. рН перемешивание прекращают и проводят ее аэрацию в течение 0,5-3 ч. Критерием завершения процесса глубинного выращивания является самопроизвольное повышение рН культуральной жидкости до величины 7,4 ед. рН.The introduction of a 12.5% aqueous solution of ammonia into the submerged culture is carried out by the method of automatic dosing with a decrease in the pH value of the culture fluid of less than 6.8 units. pH At the end of the cultivation process with the stabilization of the pH value of the culture fluid at a level of from 7.0 to 7.2 units. The pH of the stirring is stopped and it is aerated for 0.5-3 hours. The criterion for the completion of the deep-growing process is a spontaneous increase in the pH of the culture fluid to a value of 7.4 units. pH
В полученной глубинной культуре штамма 19ВА В. abortus оценивают типичность морфологии микробов и наличие посторонней микрофлоры методом микроскопии мазков, окрашенных по Граму, определяют общую концентрацию микробов с использованием стандарта мутности оптического для определения концентрации микробов ОСО 42-28-85-2013 и содержание живых микробов методом высева соответствующих разведений на плотную питательную среду в чашках Петри.In the obtained depth culture of the 19BA strain of B. abortus, the typicality of microbial morphology and the presence of extraneous microflora are assessed by Gram smear microscopy, the total microbial concentration is determined using the optical turbidity standard for determining the microbial concentration of the CCA 42-28-85-2013 and the content of live microbes by sowing the appropriate dilutions on a dense nutrient medium in Petri dishes.
С использованием заявляемого способа были получены 3 серии глубинной культуры штамма 19ВА В. abortus. Продолжительность культивирования составила от 26 до 28 ч.Using the proposed method were obtained 3 series of deep culture of the strain 19VA B. abortus. The duration of cultivation ranged from 26 to 28 hours
В таблице 2 представлены результаты оценки биологических свойств, антигенных и иммуногенных характеристик серий глубинных культур штамма 19ВА В. abortus с учетом их целевого назначения для использования при приготовлении вакцинных и диагностических препаратов.Table 2 presents the results of the evaluation of the biological properties, antigenic and immunogenic characteristics of a series of deep-seated cultures of B. abortus strain 19BA, taking into account their intended purpose for use in the preparation of vaccine and diagnostic products.
При оценке иммуногенности морских свинок иммунизируют подкожно в дозе 2,0 млрд микробов по стандарту мутности оптическому для определения концентрации микробов ОСО 42-28-85-2013, через 28 сут. после иммунизации животных заражают культурой вирулентного штамма 16М В. melitensis в дозе 100 живых микробов. Иммуногенность культуры оценивают по доле незаболевших животных на основании данных бактериологического и серологического обследования через 30 сут. после заражения.When assessing the immunogenicity, guinea pigs are immunized subcutaneously at a dose of 2.0 billion microbes according to the optical turbidity standard to determine the microbial concentration of the CCA 42-28-85-2013, after 28 days. after immunization, animals are infected with a culture of a virulent strain 16M B. melitensis at a dose of 100 live microbes. The immunogenicity of the culture is assessed by the proportion of non-diseased animals on the basis of bacteriological and serological examination data after 30 days. after infection.
При оценке устойчивости к криоконсервации культуру стабилизируют защитной средой, замораживают при температуре от минус 18 до минус 22°С, хранят при указанной температуре в течение 3 сут., после чего реактивируют в течение 40 мин при температуре от 36 до 38°С и определяют выживаемость микробов.When assessing the resistance to cryopreservation, the culture is stabilized with a protective medium, frozen at a temperature of minus 18 to minus 22 ° C, stored at the specified temperature for 3 days, then reactivated for 40 minutes at a temperature of 36 to 38 ° C and the survival rate is determined microbes.
Пример 2.Example 2
Глубинное выращивание культуры бруцелл проводят аналогично примеру 1, но вместо штамма 19ВА В. abortus используют штамм Rev-1 B. melitensis.Deep cultivation of brucella culture is carried out analogously to example 1, but instead of the 19BA strain of B. abortus, the Rev-1 strain of B. melitensis is used.
В глубинной культуре штамма Rev-1 B. melitensis оценивают типичность морфологии микробов и наличие посторонней микрофлоры методом микроскопии мазков, окрашенных по Граму, также определяют общую концентрацию микробов с использованием стандарта мутности оптического для определения концентрации микробов ОСО 42-28-85-2013 и содержание живых микробов путем посева соответствующих разведений на плотную питательную среду в чашках Петри.In the deep culture of the Rev-1 strain B. melitensis, the typicality of microbial morphology and the presence of extraneous microflora are assessed by Gram smear microscopy, the total microbial concentration is also determined using the turbidity optical standard for determining the microbial concentration of the CCA 42-28-85-2013 and the content live microbes by sowing appropriate dilutions on a dense nutrient medium in Petri dishes.
С использованием заявляемого способа были получены 3 серии глубинной культуры штамма штамма Rev-1 B. melitensis. Продолжительность культивирования составила от 26 до 28 ч.Using the proposed method were obtained 3 series of deep culture of the strain of the strain Rev-1 B. melitensis. The duration of cultivation ranged from 26 to 28 hours
В таблице 3 представлены результаты оценки биологических свойств, антигенных и иммуногенных характеристик серий глубинных культур штамма Rev-1 B. melitensis с учетом их целевого назначения для использования при приготовлении вакцинных и диагностических препаратов. Оценку иммуногенности и устойчивости к криоконсервации осуществляют аналогично примеру 1.Table 3 presents the results of the evaluation of the biological properties, antigenic and immunogenic characteristics of a series of deep-seated cultures of the Rev-1 strain of B. melitensis with regard to their intended use for use in the preparation of vaccine and diagnostic preparations. Assessment of immunogenicity and resistance to cryopreservation carried out analogously to example 1.
Claims (4)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152370A RU2687373C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016152370A RU2687373C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016152370A3 RU2016152370A3 (en) | 2018-06-28 |
RU2016152370A RU2016152370A (en) | 2018-06-28 |
RU2687373C2 true RU2687373C2 (en) | 2019-05-13 |
Family
ID=62813915
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016152370A RU2687373C2 (en) | 2016-12-28 | 2016-12-28 | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2687373C2 (en) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2593712C2 (en) * | 2014-09-30 | 2016-08-10 | Федеральное Казенное Предприятие "Щелковский Биокомбинат" | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) |
-
2016
- 2016-12-28 RU RU2016152370A patent/RU2687373C2/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2593712C2 (en) * | 2014-09-30 | 2016-08-10 | Федеральное Казенное Предприятие "Щелковский Биокомбинат" | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2016152370A3 (en) | 2018-06-28 |
RU2016152370A (en) | 2018-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107287252B (en) | Omega-7 fatty acid composition, method for culturing chrysophyceae to produce composition and application | |
RU2433170C1 (en) | Nutrient liquid medium for culturing plague microbe of vaccine strain eb | |
Sizonenko et al. | The New Efficiency of the «SRMP»–Listerias Growth-Promoting Factor During Factory Cultivation | |
CN110643522A (en) | Culture medium, culture method and application of pasteurella multocida | |
RU2510825C2 (en) | Method of obtaining preparation based on vaccine strain of plague microbe | |
CN110982711B (en) | Method for open production of trichoderma solid strain | |
RU2687488C1 (en) | Poly-strain formolated vaccine against calves pneumonia streptococcal etiology | |
RU2687373C2 (en) | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium | |
RU2649754C2 (en) | Method of manufacture of formolvaccine of hydrooxyaluminum polystammal against streptococcal diseases of large cattle | |
RU2646163C1 (en) | Method of preparing the nutrient medium for growing the probiotic crops | |
RU2518282C1 (en) | Nutrient medium for submerged cultivation of tularemia microbe | |
RU2723711C1 (en) | Method for preparing vaccine with aluminium hydroxide against mastitis of cows streptococcal aetiology | |
RU2247775C1 (en) | Liquid nutrient transporting medium for collection, culturing and transportation of patient blood with suspicion for brucellosis | |
RU2757137C1 (en) | Method for producing a growth medium containing a nanofiltrate of curd whey intended for cultivation of probiotic cultures | |
RU2405567C1 (en) | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis | |
RU2722668C1 (en) | Method of producing inactivated vaccine against pulmonary diseases of young animals of productive animals | |
RU2757428C1 (en) | Liquid nutrient medium for deep cultivation of vaccine strain of plague microbe y. pestis ev | |
RU2124366C1 (en) | Method of preparing vaccine against salmonellosis in agriculture animals and poultry | |
RU2662949C1 (en) | Method for obtaining a native symbiotic preparation | |
RU2311199C1 (en) | Vaccine against pasteurellosis in animals | |
RU2764118C1 (en) | Polyvalent vaccine against salmonellosis of productive animals | |
RU2681116C2 (en) | Dense nutrient medium for storage of plague microbe | |
RU2650782C1 (en) | Lactobacterium strains enterococcus hirae - bread acid producer and component for wastes for probiotic products manufacturing | |
RU2333948C2 (en) | Nutritional medium for growing causative agent of tularemia | |
RU2758880C1 (en) | Method for producing biological preparation for correcting metabolism in pre-nursery pigs |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FZ9A | Application not withdrawn (correction of the notice of withdrawal) |
Effective date: 20190225 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191229 |