RU2593712C2 - METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) - Google Patents
METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2593712C2 RU2593712C2 RU2014139329/10A RU2014139329A RU2593712C2 RU 2593712 C2 RU2593712 C2 RU 2593712C2 RU 2014139329/10 A RU2014139329/10 A RU 2014139329/10A RU 2014139329 A RU2014139329 A RU 2014139329A RU 2593712 C2 RU2593712 C2 RU 2593712C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- concentration
- bacterial cells
- brucellosis
- antigen
- billion
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Группа изобретений относится к областям ветеринарии и биотехнологии и может быть использована при производстве тест-систем (наборов) для диагностики бруцеллеза животных: для диагностики бруцеллеза животных в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК); для диагностики бруцеллеза животных в роз-бенгал пробе (РБП); для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком; а также способам получения компонентов тест-системы (набора).The group of inventions relates to the fields of veterinary medicine and biotechnology and can be used in the production of test systems (kits) for the diagnosis of animal brucellosis: for the diagnosis of animal brucellosis in the agglutination reaction (RA), complement fixation reaction (RSK) and long-term complement fixation reaction (RDSK) ; for the diagnosis of animal brucellosis in a rose-bengal test (RBP); for the diagnosis of animal brucellosis in a ring reaction (CR) with milk; as well as methods for producing test system components (kit).
При этом наборы для диагностики бруцеллеза животных включают следующие компоненты: соответствующий антиген, который получают из штамма B.abortus 19; сыворотку крови КРС, гипериммунизированного культурой бруцелл вида abortus (диагностическую, положительную); сыворотку крови здорового крупного рогатого скота (отрицательную), которая может быть получена с использованием различных технологий.Moreover, kits for the diagnosis of animal brucellosis include the following components: the corresponding antigen, which is obtained from strain B. abortus 19; blood serum of cattle hyperimmunized with brucella culture of the abortus species (diagnostic, positive); healthy bovine serum (negative), which can be obtained using various technologies.
В частности, из уровня техники известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК (патент на изобретение RU 2085212, МПК: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20), включающий получение посевного материала (штамма Br.abortus 19) на плотной питательной среде, его глубинное культивирование в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт и воду, концентрирование и очистку выросшей бакмассы на ультрафильтрационной установке при помощи аппаратов разделительных с использованием 0,5% фенолизированного физраствора, и инактивацию антигена в биореакторе при температуре 80°C в течение часа.In particular, a method is known from the prior art for producing a brucellosis antigen from a Brucella abortus 19 strain for the manufacture of a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK (patent for invention RU 2085212, IPC: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20 ), including obtaining seed (strain Br.abortus 19) in a dense nutrient medium, its deep cultivation in a liquid nutrient medium containing Hottinger digest, glycerin, glucose, NaCl, yeast extract and water, concentration and purification of the grown Bakmass on an ultrafiltration unit with aid ap separation agents using 0.5% phenolized saline, and antigen inactivation in the bioreactor at a temperature of 80 ° C for an hour.
Однако используемый метод концентрирования бактериальной массы на ультрафильтрационных колонках является недостаточно эффективным, энергозатратным и трудозатратным, включает операции сбора и стерилизации ультрафильтрационной установки, требует непрерывного контроля за процессом фильтрации. Кроме того, при использовании ультрафильтрационной колонки существует риск потери бакмассы и ее контаминации посторонней микрофлорой из-за разрыва волокон кассет.However, the method used to concentrate the bacterial mass on ultrafiltration columns is not efficient enough, energy-intensive, and labor-intensive, includes the collection and sterilization of the ultrafiltration unit, and requires continuous monitoring of the filtration process. In addition, when using an ultrafiltration column there is a risk of loss of back mass and its contamination by extraneous microflora due to rupture of the cassette fibers.
Известен также способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП) (патент на изобретение RU 2163141, МПК: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20). Способ включает получение посевного материала и производственное культивирование штамма Brucella abortus 19 в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой аутолизат и воду. Культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19-21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования. После внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20-25 pO2, с 6 по 16-18 ч культивирования - 40-45 pO2 и затем с 16-18 по 19-21 ч - 30-35 pO2. Выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15-50 кД. Инактивируют нагреванием. Окрашивают роз-бенгалом с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацией целевого продукта.There is also a known method of manufacturing brucellosis antigen for roses of Bengal samples (RBP) (patent for invention RU 2163141, IPC: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20). The method includes obtaining seed and industrial cultivation of strain Brucella abortus 19 in a liquid nutrient medium containing Hottinger digest, glycerin, glucose, NaCl, yeast autolysate and water. The cultivation is carried out in deep conditions for 19-21 hours with the regulation of the level of partial pressure of oxygen dissolved in the culture fluid throughout the entire cultivation process. After applying the seed from 1 to 6 hours of cultivation, the level of 20-25 pO2 is set, from 6 to 16-18 hours of cultivation - 40-45 pO2 and then from 16-18 to 19-21 hours - 30-35 pO2. The grown bacterial cells are separated and concentrated by ultrafiltration on fibers with a retention limit of 15-50 kD. Inactivate by heating. Stained with rose bengal, followed by resuspension in a buffer diluent and standardization of the target product.
Однако недостатки, перечисленные выше характерны и для данного технического решения.However, the disadvantages listed above are typical for this technical solution.
В отношении изобретения, касающегося способа изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки, из уровня техники известен способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки (см., например, Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР), по которому иммунизируют крупный рогатый скот в возрасте от 2 до 5-6 лет, при этом используют некастрированных быков-продуцентов. До начала иммунизации животных выдерживают в течение 1 месяца на карантине, после чего проводят грунд-иммунизацию путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно, и через 1 месяц приступают к иммунизации. Иммунизацию осуществляют в 2-4 цикла с интервалами 20-30 суток. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена с объемами 10, 15, 20, 30, 40 мл. По окончании цикла иммунизации на 10-ый день после последней инъекции антигена берут контрольную пробу крови для постановки реакции агглютинации. При наличии титра антител в сыворотке крови не ниже 1:3200 проводят кровопускание. Для иммунизации животного применяют антигены, инактивированные нагреванием при температуре 60°C в течение 2 часов с последующим добавлением карболовой кислоты и выдерживанием при 37°C 48 часов. Антигены представляют собой взвеси культур B.abortus 544, B.melitensis 16-М и B.suis 1330.With respect to the invention regarding a method for manufacturing brucellosis diagnostic serum, a method for producing polyvalent diagnostic brucellosis serum is known from the prior art (see, for example, Brucellosis diagnostic agglutinating serum. TU-316-82 of 06/01/1982, approved by the GU for the production of bacterial and viral drugs of the Ministry of Health of the USSR), which cattle are immunized at the age of 2 to 5-6 years, while uncastrated bulls are used. Prior to the start of immunization, the animals are kept in quarantine for 1 month, after which the immunization is carried out by single injection of 10 ml of brucellosis antigen subcutaneously, and after 1 month immunization is started. Immunization is carried out in 2-4 cycles at intervals of 20-30 days. During one cycle, 5 daily injections of antigen are carried out with volumes of 10, 15, 20, 30, 40 ml. At the end of the immunization cycle on the 10th day after the last injection of antigen, a control blood sample is taken to set the agglutination reaction. In the presence of an antibody titer in blood serum of not less than 1: 3200, bloodletting is performed. To immunize an animal, antigens are used that are inactivated by heating at a temperature of 60 ° C for 2 hours, followed by the addition of carbolic acid and incubation at 37 ° C for 48 hours. Antigens are suspensions of cultures of B. abortus 544, B. melitensis 16-M and B.suis 1330.
Недостатками способа являются длительность, трудоемкость процесса, эпидемическая опасность, связанная с использованием вирулентных культур бруцелл, и высокая себестоимость конечного продукта.The disadvantages of the method are the duration, the complexity of the process, the epidemic hazard associated with the use of virulent cultures of brucella, and the high cost of the final product.
Наиболее близкими решениями заявляемой группы изобретений являются решения, представленные в RU 2361610, МПК: A61K 39/10, A61K 39/40, A61P 31/04, а именно способы получения бруцеллезного антигена из штамма Bbrucella abortus 19 для РА, РСК И РДСК, бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, а также способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки.The closest solutions to the claimed group of inventions are the solutions presented in RU 2361610, IPC: A61K 39/10, A61K 39/40, A61P 31/04, namely, methods for producing brucellosis antigen from strain Bbrucella abortus 19 for RA, RSK AND RDSK, brucellosis antigen for rose bengal test (RBP) and brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk, as well as a method for manufacturing brucellosis diagnostic serum.
В частности, способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для РА, РСК и РДСК по патенту RU 2361610 включает получение посевного материала и культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией и их инактивирование нагреванием. При этом культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования осуществляют в следующем режиме: температура 37±0,5°C, pH 6,9-7,2, аэрация с 1 по 3 ч - 20-25 pO2, с 3 по 6 ч - 25-40 pO2, с 6 по 15 ч - 40-45 pO2 и с 15 по 16-18 ч - 30-35 pO2, а отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией осуществляют с использованием мембранных кассет. Культивирование бруцелл в глубинных условиях осуществляют в течение 16-18 ч. Концентрирование осуществляют в течение 2-2,5 ч. При концентрировании бактериальной массы используют мембранные кассеты с пределом задержания 20 КД. По окончании концентрирования полученный антиген ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до ОК 250-300 млрд м.кл./см3. Данный способ получения бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК лежит в основе получения антигена для РБП, для КР с молоком, и для положительной сыворотки диагностической.In particular, the method for producing brucellosis antigen from Brucella abortus 19 strain for RA, RSK and RDSK according to patent RU 2361610 involves obtaining seed and cultivating brucella in deep conditions on a liquid nutrient medium with regulation of the partial pressure level of oxygen dissolved in the culture fluid throughout the process cultivation, separation and concentration of the grown bacterial cells by ultrafiltration and their inactivation by heating. Moreover, the cultivation of brucella in deep conditions on a liquid nutrient medium with the regulation of the partial pressure of oxygen dissolved in the culture fluid throughout the cultivation process is carried out in the following mode: temperature 37 ± 0.5 ° C, pH 6.9-7.2, aeration from 1 to 3 hours - 20-25 pO2, from 3 to 6 hours - 25-40 pO2, from 6 to 15 hours - 40-45 pO2 and from 15 to 16-18 hours - 30-35 pO2, and separation and concentration grown bacterial cells by ultrafiltration is carried out using membrane cassettes. Cultivation of brucella in deep conditions is carried out for 16-18 hours. Concentration is carried out for 2-2.5 hours. When concentrating the bacterial mass, membrane cassettes with a retention limit of 20 KD are used. At the end of the concentration, the resulting antigen is resuspended in a sterile 1% phenolized isotonic solution to an OK of 250-300 bcm / cm 3 . This method of obtaining brucellosis antigen in RA, RSK and RDSK is the basis for obtaining antigen for BPO, for CR with milk, and for positive diagnostic serum.
Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для роз-бенгал пробы (РБП) по патенту RU 2361610 включает окрашивание концентрата антигена бенгальской розовой, при этом используют концентрат антигена, полученный по вышеописанной технологии, бенгальскую розовую перед окрашиванием титруют в водяной бане при температуре 40°C, а окрашивание антигена проводят при этой же температуре в течение часа.The method for producing brucellosis antigen from Brucella abortus 19 strain for rose bengal samples (RBP) according to patent RU 2361610 involves staining a Bengal pink antigen concentrate, using a Bengal pink antigen concentrate obtained before titration in a water bath at a temperature of 40 ° C, and staining of the antigen is carried out at the same temperature for one hour.
Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для кольцевой реакции (КР) с молоком по патенту RU 2361610 включает окрашивание ресуспендированной бактериальной массы антигена тетразолием хлористым или гематоксилином, при этом используют антиген также по описанной выше технологии.A method for producing a brucellosis antigen from Brucella abortus 19 strain for a ring reaction (CR) with milk according to RU patent 2361610 involves staining the resuspended bacterial mass of the antigen with tetrazolium chloride or hematoxylin, and the antigen is also used according to the technology described above.
Способом изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки по патенту RU 2361610 включает гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим кровопусканием, отделением сыворотки, ее консервированием и расфасовкой, проверкой на стерильность, активность и специфичность. При этом гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют антигеном, также полученным по описанному выше способу, подкожно в области средней трети шеи КРС по следующей схеме: 1-й день вводят 5 см3 антигена (75 млрд мк.кл.), 10-й день - 8 см3 (120 млрд м.кл.), 20-21-й день - 10 см3 (150 млрд мк.кл.), на 27-28-й день проводят пробное крововзятие, а на 30-31-й день осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 37-38°C в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°C на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку, полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором фенола на изотоническом растворе в соотношении 1:10 или путем добавления 4% сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 50°C в течение 40 мин при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 2-8°C на 10 суток. Сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК не ниже 1:20. После расфасовки сыворотку лиофилизируют.A method of manufacturing a brucellosis diagnostic serum according to the patent RU 2361610 involves hyperimmunization of animal producers with a brucellosis antigen, followed by bloodletting, separation of the serum, its preservation and packaging, checking for sterility, activity and specificity. In this case, hyperimmunization of animal producers is carried out by an antigen, also obtained by the method described above, subcutaneously in the middle third of the neck of cattle according to the following scheme: on the 1st day, 5 cm 3 of antigen (75 billion microliters of cells) are administered, on the 10th day 8 cm 3 (120 billion m.kl.), 20-21 th day - 10 cm 3 (150 billion mk.kl.) for 27-28 minutes krovovzyatie day trial is conducted, and on day 30-31 carry out industrial bloodletting. The blood is kept at a temperature of 37-38 ° C for 2-3 hours, and then placed in a refrigerator at 2-8 ° C for 3-5 days, after which the serum is separated, the obtained serum is preserved with a 5% phenol solution in an isotonic solution in a ratio of 1:10 or by adding 4% dry boric acid, after which they are heated in a water bath at a temperature of 50 ° C for 40 minutes with constant stirring, and then placed in a refrigerator at a temperature of 2-8 ° C for 10 days. Sterile serum has a titer in RA of not less than 1: 1000, and in CSC not less than 1:20. After packaging, the serum is lyophilized.
Однако в перечисленные способах также использован концентрат, полученный с применением мембранных кассет. Во время ультрафильтрации нередко наблюдается разрыв волокон, что приводит к потере бактериальной массы и ее контаминации посторонней микрофлорой.However, the above methods also used a concentrate obtained using membrane cassettes. During ultrafiltration, fiber breakage is often observed, which leads to a loss of bacterial mass and its contamination by extraneous microflora.
Заявляемое изобретение преодолевает перечисленные выше недостатки.The claimed invention overcomes the above disadvantages.
Задачей заявляемой группы изобретений в части способа получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, используемых в диагностических тест-системах, а также способов получения антигена и сыворотки бруцеллезной диагностической, также используемой в диагностических тест-системах, а также способов получения бруцеллезных антигенов (препаратов) - единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для РБП, бруцеллезного антигена для КР с молоком, является увеличение выхода концентрата - сырья для получения антигенов, при снижении риска заражения упрощении и удешевлении технологии получения концентрата и препаратов из них.The task of the claimed group of inventions in terms of a method of obtaining a culture concentrate of brucella cells from a strain of Brucella abortus 19 for the preparation of brucellosis antigens used in diagnostic test systems, as well as methods for producing antigen and serum of brucellosis diagnostic, also used in diagnostic test systems, as well as methods method of obtaining brucellosis antigens (drugs) - a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK, brucellosis antigen for RBP, brucellosis antigen for CR with milk, is an increase in the yield of concentrate, a feedstock for producing antigens, while reducing the risk of infection by simplifying and cheapening the technology for producing concentrate and preparations from them.
Поставленная задача в части способа получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, используемых в диагностических тест-системах решается тем, что он ключает получение посевного материала бактериальных клеток и их культивирование в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регулированием уровня концентрации растворенного в культуральной среде кислорода на протяжении всего процесса культивирования, инактивацию выросших бактериальных клеток нагреванием с последующим их концентрированием, при этом процесс культивирования бактериальных клеток осуществляют при температуре 36-38°C, в процессе культивирования на этапе накопления бактериальных клеток от концентрации 1,5-2,5 млрд м.к./см3 до концентрации 10 млрд м.к./см3 выдерживают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале 20-25 мг/л, а свыше 10 млрд м.к./см3 и до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста обеспечивают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале значений 40-45 мг/л, а концентрирование выросших бактериальных клеток осуществляют посредством осаждения флокулянтом, в качестве которого используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), который добавляют в культуральную среду в количестве 0, 1-0,15 г по сухому веществу на 1 литр культуральной среды, после чего сливают надосадок с получением концентрата инактивированных бактериальных клеток для последующего приготовления бруцеллезного антигена в РА, РСК, РДСК, антигена РБП; антигена КР с молоком.The task in terms of a method for producing a brucella cell culture concentrate from a strain of Brucella abortus 19 for the preparation of brucellosis antigens used in diagnostic test systems is solved by the fact that it involves the preparation of inoculum of bacterial cells and their cultivation in deep conditions on a liquid nutrient medium with level control the concentration of oxygen dissolved in the culture medium throughout the entire cultivation process, inactivation of the grown bacterial cells by heating, followed by their concentration, while the process of culturing bacterial cells is carried out at a temperature of 36-38 ° C, during cultivation at the stage of accumulation of bacterial cells from a concentration of 1.5-2.5 billion cubic meters / cm 3 to a concentration of 10 billion m. K. / cm 3 maintain the concentration of dissolved oxygen in the culture medium in the range of 20-25 mg / l, and more than 10 billion MK / cm 3 and until the bacterial cells reach the stationary growth phase, they provide the concentration of dissolved oxygen in the culture medium in the range of values 40-45 mg / l, and concent The growth of bacterial cells is carried out by sedimentation by a flocculant, which is used as sodium salt of carboxymethyl cellulose (CMC), which is added to the culture medium in an amount of 0.1-1.15 g on dry matter per 1 liter of culture medium, and then the supernatant is drained to obtain a concentrate of inactivated bacterial cells for subsequent preparation of brucellosis antigen in RA, RSK, RDSK, RBP antigen; KR antigen with milk.
В частных вариантах выполнения способа осаждение осуществляют в течение 24-48 часов при температуре от 8 до 12°C; культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях на жидкой питательной среде осуществляют доливным методом, включающим культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды с концентрацией посевного материала 1,5-2,5 млрд м.к./см3 до достижения концентрации бактериальных клеток в питательной среде 50-60 млрд м.к./см.3, после чего объем питательной среды увеличивают в два раза - до полного объема и продолжают культивирование до стационарной фазы роста бактериальных клеток, на которой достигается накопление бактериальных клеток 95-105 млрд м.к./см3. При этом культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды осуществляют течение 16-18 часов, и после увеличения объема питательной среды до полного - в течение 7-9 часов, общее время культивирования составляет 23-27 часов. Индикатором достижения клетками стационарной фазы роста является резкое увеличение концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости с 40-45 мг/л до 90 мг/л и выше в течение 1-5 минут при одном и том же уровне подачи воздуха.In private embodiments of the method, the deposition is carried out for 24-48 hours at a temperature of from 8 to 12 ° C; the cultivation of bacterial cells in deep conditions on a liquid nutrient medium is carried out by the replenishment method, including the cultivation of bacterial cells in half the volume of the nutrient medium with a seed concentration of 1.5-2.5 billion cubic meters / cm 3 until the concentration of bacterial cells in the nutrient medium is reached 50-60 billion cubic meters / cm. 3 , after which the volume of the nutrient medium is doubled to the full volume and cultivation is continued until the stationary phase of growth of bacterial cells, at which the accumulation of bacterial cells of 95-105 billion cubic meters / cm 3 is achieved. Moreover, the cultivation of bacterial cells in half the volume of the nutrient medium is carried out for 16-18 hours, and after increasing the volume of the nutrient medium to complete within 7-9 hours, the total cultivation time is 23-27 hours. An indicator of the achievement by the cells of the stationary growth phase is a sharp increase in the concentration of dissolved oxygen in the culture fluid from 40-45 mg / l to 90 mg / l and higher for 1-5 minutes at the same level of air supply.
В качестве питательной среды используют среду следующего состава, об. %: Перевар Хоттингера 15-18, Гидролизат казеина 1,5-2,0, Глицерин 1-1,5, Глюкоза 1-1,5, NaCl - 0,5, Дрожжевой экстракт сухой - 0,5, Вода (водопроводная) - остальное до 100, в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %. В процессе культивирования автоматически поддерживают pH в интервале значений 6,8-7,2 посредством добавления в культуральную среду 5% раствора NaOH или HCl. Уровень растворенного кислорода в обозначенных интервалах значений поддерживают подачей воздуха в культуральную среду и вращением мешалки с увеличивающейся скоростью мешалки от 100 об/мин на этапе накопления микробных клеток до 10 млрд м.к./см3, и до 300-350 оборотов в минуту - до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста. В случае образования пены в процессе перемешивания в культуральную среду добавляют пеногаситель, например, марки «Барванол» от 0,015-0,02 л на 100 литров культуральной среды. Инактивацию бактериальных клеток нагреванием осуществляют после окончания их культивирования в ферментере при температуре плюс 78-80°C, в течение 1-1,2 ч.As a nutrient medium using an environment of the following composition, vol. %: Hottinger cook 15-18, Casein hydrolyzate 1.5-2.0, Glycerin 1-1.5, Glucose 1-1.5, NaCl - 0.5, Dry yeast extract - 0.5, Water (tap) - the rest is up to 100, in which the content of amino nitrogen is 160-180 mg%. During the cultivation process, the pH is automatically maintained in the range of 6.8-7.2 by adding 5% NaOH or HCl to the culture medium. The level of dissolved oxygen in the indicated ranges of values is maintained by supplying air to the culture medium and rotating the mixer with an increasing speed of the mixer from 100 rpm at the stage of accumulation of microbial cells to 10 billion cubic meters / cm 3 and up to 300-350 revolutions per minute - until the bacterial cells reach the stationary phase of growth. In the case of foam formation during mixing, an antifoam, for example, Barvanol brand, from 0.015-0.02 l per 100 liters of culture medium is added to the culture medium. Inactivation of bacterial cells by heating is carried out after the end of their cultivation in the fermenter at a temperature of plus 78-80 ° C, for 1-1.2 hours
Культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях до достижения накопления бактериальных клеток 60-80 млрд м.к./см3 без использования доливного метода осуществляют в течение 16-20 ч, доливным методом - в течение 24-26 часов.The cultivation of bacterial cells in deep conditions until the accumulation of bacterial cells reaches 60-80 billion cubic meters / cm 3 without using the top-up method is carried out for 16-20 hours, the top-up method - for 24-26 hours.
По окончании концентрирования полученный концентрат в виде инактивированных бактериальных клеток ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 250-300 млрд.м.кл./см3 для последующего получения антигена в РА, РСК, РДСК и антигена РБП, или стерильной дистиллированной водой (очищенной) до концентрации 200 млрд м.к./см3 для последующего получения антигена КР с молоком.At the end of concentration, the resulting concentrate in the form of inactivated bacterial cells is resuspended in sterile 1% phenolized physiological saline to an optical concentration of 250-300 billion cubic meters / cm 3 for the subsequent production of antigen in RA, CSC, RDSK and RPS antigen, or sterile of distilled water (purified) to a concentration of 200 billion MK / cm 3 for the subsequent receipt of the CD antigen from milk.
Поставленная задача в части способа получения антигена из штамма Brucella abortus 19 для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, используемой в диагностических тест-системах, решается тем, что он ключает технологические операции, описанные выше при получении концентрата культуры клеток бруцелл для приготовления бруцеллезных антигенов, за исключением операции инактивации выросших бактериальных клеток и изменением этапа ресуспендирования полученного концентрата. В данном способе по окончании концентрирования полученный концентрат (антиген) ресуспендируют стерильным физиологическим раствором до оптической концентрации 200 млрд м.к./см3 для последующей иммунизации животных-продуцентов для получения сыворотки.The task in terms of the method of obtaining the antigen from the strain of Brucella abortus 19 to obtain brucellosis diagnostic serum, used in diagnostic test systems, is solved by the fact that it includes the technological operations described above when receiving the brucella cell culture concentrate for the preparation of brucellosis antigens, with the exception of the operation inactivation of the grown bacterial cells and changing the stage of resuspension of the obtained concentrate. In this method, upon completion of the concentration, the resulting concentrate (antigen) is resuspended in sterile saline to an optical concentration of 200 billion cubic meters / cm 3 for subsequent immunization of animal producers to obtain serum.
Поставленная задача в части способа получения сыворотки бруцеллезной диагностической решается тем, что проводят гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим отбором крови, отделением сыворотки, ее стерилизацией, при этом гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют, по меньшей мере, трехкратным подкожным введением антигена, первые два из которых осуществляют антигеном для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, полученным описанным выше способом (без использования операции инактивирования, т.е. «живой» культурой), а третье - антигеном (концентратом), полученным описанным выше способом, включающим инактивирование выросших бактериальных клеток.The task in terms of the method for producing brucellosis diagnostic serum is solved by hyperimmunization of animal producers with a brucellosis antigen followed by blood sampling, separation of serum, its sterilization, while hyperimmunization of animal producers is carried out by at least three subcutaneous administration of antigen, the first two of which carry out the antigen to obtain brucellosis diagnostic serum obtained by the method described above (without using inactivir cultivation, that is, a "live" culture), and the third - an antigen (concentrate) obtained by the method described above, including inactivation of the grown bacterial cells.
В качестве животных-продуцентов используют быков массой не мене 300 кг. Антиген вводят в область средней трети шеи, при этом первое введение антигена осуществляют на первый день в количестве 5 см3 антигена (75 млрд мк.кл.), второе - на 14 день в количестве 8 см3 (120 млрд м.кл.), третье - на 21 день в количестве 10 см3 (150 млрд мк.кл.), после чего на 28 день проводят взятие пробы крови, и при наличии в пробе достаточных титров антител (в РА не ниже 1:800, а в РСК не ниже 1:20) на 29-30 день осуществляют производственный отбор крови. Кровь выдерживают при температуре 37-38°C в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°C на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку. Стерилизацию сыворотки осуществляют путем ее фильтрации через стерилизующие фильтры «Durapore» размером 30′′ с диаметром пор 0,22 мкм или аналогичные по характеристикам. Полученная сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:800, а в РСК не ниже 1:20. После расфасовки сыворотку лиофилизируют.Bulls weighing at least 300 kg are used as animal producers. The antigen is introduced into the region of the middle third of the neck, with the first administration of the antigen being carried out on the first day in the amount of 5 cm 3 antigen (75 billion microliters), the second on the 14th day in the amount of 8 cm 3 (120 billion microliters) and the third - on day 21 in the amount of 10 cm 3 (150 billion microliters of cells), after which a blood sample is taken on day 28, and if there are sufficient antibody titers in the sample (in RA not lower than 1: 800, and in CSC not lower than 1:20) on day 29-30 carry out production blood sampling. Blood is kept at a temperature of 37-38 ° C for 2-3 hours, and then placed in a refrigerator at 2-8 ° C for 3-5 days, after which the serum is separated. Serum is sterilized by filtration through a 30 ″ Durapore sterilizing filter with a pore diameter of 0.22 μm or similar in performance. The obtained sterile serum has a titer in RA of not less than 1: 800, and in CSC not less than 1:20. After packaging, the serum is lyophilized.
Поставленная задача в части способа получения единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК решается тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором, который выдерживают 7-10 дней при температуре 4-6°C, после чего концентрат разводят 0,5% фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 18-22 млрд м.к./см3.The problem in terms of the method of obtaining a single brucellosis antigen in RA, RSK and RDSK is solved by the fact that receive a bacterial cell concentrate according to claim 1, resuspended in sterile 1% phenolized physiological saline solution, which is kept for 7-10 days at a temperature of 4-6 ° C, after which the concentrate is diluted with 0.5% phenolized physiological saline to an optical concentration of 18-22 billion cubic meters / cm 3 .
Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) решается тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором, который окрашивают бенгальской розовой, при этом добавляют 1%-ный раствор бенгальской розовой из расчета 6% раствора на оптическую концентрацию 200 млрд м.к. в 1 см3 и оставляют на 20-24 часа, затем окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс оборотов в минуту, затем окрашенную массу микробных клеток ресуспендируют до оптической концентрации 90-100 млрд м.к./см3 буферным разбавителем, состав которого содержит растворенных в 100 литрах очищенной или дистиллированной воды следующих компонентов: гидроокиси натрия - 2,0 кг, фенола - 0,5 кг, молочной кислоты - 20,5 кг, хлористого натрия - 0,9 кг.The problem in terms of the method of producing brucellosis antigen for rose bengal samples (RBP) is solved by the fact that a bacterial cell concentrate according to claim 1 is obtained, resuspended in sterile 1% phenolized isotonic solution, which is stained with Bengal pink, while 1% is added - Bengal pink solution at the rate of 6% solution at an optical concentration of 200 billion cu.m. in 1 cm 3 and left for 20-24 hours, then the stained concentrate is centrifuged at 15-17 thousand revolutions per minute, then the stained mass of microbial cells is resuspended to an optical concentration of 90-100 billion MK / cm 3 with a buffer diluent, the composition of which contains the following components dissolved in 100 liters of purified or distilled water: sodium hydroxide - 2.0 kg, phenol - 0.5 kg, lactic acid - 20.5 kg, sodium chloride - 0.9 kg.
Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком решается тем, что получают концентрат микробных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильной дистиллированной водой (очищенной), добавляют 25-35% от объема культуральный среды протраву, в качестве которой используют 0,5%-ный водный раствор сернокислого железа, после чего концентрат с протравой нагревают до 43-45°C и выдерживают 25-35 минут, полученный концентрат окрашивают составом, содержащим гематоксилин или 2,3,5-трифенилтетразоль хлористый, и выдерживают при комнатной температуре в течение 15-24 часа, после чего окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс. оборотов в минуту (пока весь окрашенный концентрат не пройдет через центрифугу), затем окрашенную массу ресуспендируют 1%-ным фенолизированным физраствором до оптической концентрации 100 млрд м.к. в 1 см3.The problem in terms of a method for producing brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk is solved by the fact that a microbial cell concentrate according to claim 1 is obtained, resuspended in sterile distilled water (purified), add 25-35% of the volume of the culture medium etched, as which use a 0.5% aqueous solution of iron sulfate, after which the concentrate with mordant is heated to 43-45 ° C and incubated for 25-35 minutes, the resulting concentrate is stained with a composition containing hematoxylin or 2,3,5-triphenyltetrazole chlorides th, and kept at room temperature for 15-24 hours, after which the colored concentrate is centrifuged at 15-17 thousand rpm (until the entire colored concentrate passes through the centrifuge), then the colored mass is resuspended with 1% phenolized saline solution to optical concentration of 100 billion m.k. in 1 cm 3 .
Технический результат, достигаемый заявляемой группой изобретения, заключается в увеличении накопления бруцелл - выхода бактериальных клеток за один цикл, и, соответственно, изготавливаемых из них антигенов, и устранении их контаминации посторонней микрофлорой в процессе концентрирования. Увеличение выхода коцентрата (сырья для получения антигенов) составляет минимум на 15%, при применении доливного метода - в 2 раза.The technical result achieved by the claimed group of the invention is to increase the accumulation of brucella - the output of bacterial cells in one cycle, and, accordingly, the antigens made from them, and the elimination of their contamination by extraneous microflora during the concentration process. The increase in the yield of the concentrate (raw materials for producing antigens) is at least 15%, when applying the topping method - 2 times.
Технический результат обеспечивается за счет усовершествования заявляемой технологии, в частности изменения технологии культивирования и концентрирования бактериальных клеток, исключения из технологии ультрафтльтационной установки, используемой в известных решениях для концентрирования бактериальных клеток. В заявляемом способе культивирование и концентрирование осуществляется в одной емкости, что исключает потери бактериальных клеток, и, соответственно увеличивает выход готового продукта. Используемые в способе технологические параметры являются легко контролируемыми, что исключает возможность операторской ошибки, и соответственно, положительно сказывается на процессе производства и качестве готового продукта.The technical result is achieved by improving the inventive technology, in particular, changing the technology of culturing and concentrating bacterial cells, eliminating from the technology the ultrafiltration unit used in known solutions for concentrating bacterial cells. In the inventive method, cultivation and concentration is carried out in one tank, which eliminates the loss of bacterial cells, and, accordingly, increases the yield of the finished product. The technological parameters used in the method are easily controlled, which eliminates the possibility of operator error, and, accordingly, positively affects the production process and the quality of the finished product.
В заявляемом способе для концентрирования (осаждения) бактериальной массы предложено использовать КМЦ (карбоксиметилцеллюлозы), что имеет ряд преимуществ: при удлинении на сутки технологического процесса снижаются трудовые затраты (операторы участвуют только при закачке КМЦ и декантации надосадочной жидкости, что составляет по времени 0,5-1 час, в зависимости от объема бактериальной массы); исключается дорогое оборудование, исключается потеря бакмассы из-за возможного разрыва мембран кассеты ее контаминация. Это все ведет к снижению затрат на приготовление антигена. Кроме того, в заявляемом способе в процессе культивирования предложено использовать доливной метод, который заключается в культивировании бактерий при засевной 1,5-2,5 млрд м.к./мл, на половине от всего объема питательной среды в течении 16-18 часов, концентрация микробных клеток при этом достигается 50-60 млрд м.к./мл, затем доливается вторая половина питательной среды и культивирование продолжается до стационарной фазы роста (до 24-26 часов), оптическая концентрация микробных клеток достигается 95-105 млрд м.к./мл, что на 30% увеличивает выход сырья. Растворенный кислород с 16-18 часа поддерживается в культуре на уровне 40-45%, резкое увеличение растворенного кислорода в культуре говорит о наступлении стационарной фазы, что подтверждается методом отбора контрольных проб, pH в культуре поддерживается автоматически 5% растворами NaOH и HCl в пределах 6,8-7,2.In the inventive method for the concentration (sedimentation) of the bacterial mass, it is proposed to use CMC (carboxymethyl cellulose), which has several advantages: by prolonging the process by 24 hours, labor costs are reduced (operators participate only in the injection of CMC and decantation of the supernatant, which is 0.5 in time -1 hour, depending on the volume of the bacterial mass); expensive equipment is excluded, the loss of back mass due to a possible rupture of the cassette membranes, its contamination is excluded. This all leads to lower costs for the preparation of antigen. In addition, in the inventive method in the cultivation process, it is proposed to use the replenishment method, which consists in the cultivation of bacteria with a sowing of 1.5-2.5 billion cubic meters / ml, half of the total volume of the nutrient medium for 16-18 hours, the concentration of microbial cells is reached 50-60 billion MK./ml, then the second half of the nutrient medium is added and cultivation continues until the stationary phase of growth (up to 24-26 hours), the optical concentration of microbial cells is reached 95-105 billion MK ./ml, which by 30% increases the yield of raw materials. From 16-18 hours, dissolved oxygen is maintained in the culture at the level of 40-45%, a sharp increase in dissolved oxygen in the culture indicates the onset of the stationary phase, as confirmed by the control sampling method, the pH in the culture is automatically maintained by 5% NaOH and HCl solutions within 6 , 8-7.2.
Наиболее близкими решениями, известными из уровня техники, касающимися наборов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК И РДСК, для диагностики бруцеллеза животных в РБП и для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком, являются изобретения, представленные в RU 2361610, МПК: A61K 39/10, A61K 39/40, A61P 31/04.The closest solutions known from the prior art regarding kits for diagnosing animal brucellosis in RA, RSK and RDSK, for diagnosing animal brucellosis in RBP and for diagnosing animal brucellosis in KR with milk are the inventions presented in RU 2361610, IPC: A61K 39 / 10, A61K 39/40, A61P 31/04.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК по патенту RU 2361610 содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.The diagnostic kit for the diagnosis of animal brucellosis in RA, RSK and RDSK according to patent RU 2361610 contains a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK, lyophilized brucellosis diagnostic serum and lyophilized healthy cattle blood serum.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РБП содержит антиген бруцеллезный для РБП, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.The diagnostic kit for the diagnosis of animal brucellosis in BPD contains brucellosis antigen for BPD, brucellosis diagnostic serum lyophilized and healthy cattle lyophilized blood serum.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком содержит антиген бруцеллезный для КР и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную.The diagnostic kit for the diagnosis of animal brucellosis in CR with milk contains brucellosis antigen for CR and lyophilized brucellosis diagnostic serum.
Однако в перечисленных наборах присутствуют антигены, полученные способом, характеризующимся высоким риском контаминации антигенов в процессе их получения, и с большими потерями продукта в процессе производства, что уменьшает количественный выход продукта за один цикл.However, the listed sets contain antigens obtained by a method characterized by a high risk of contamination of antigens in the process of their production, and with large losses of the product during production, which reduces the quantitative yield of the product in one cycle.
Задачей изобретения в части наборов компонентов для диагностики бруцеллеза животных является снижение количество брака в процессе производства за счет исключения возможности контаминации антигенов в процессе их получения.The objective of the invention in terms of sets of components for the diagnosis of animal brucellosis is to reduce the number of defects in the production process by eliminating the possibility of contamination of antigens in the process of their production.
Кроме того, в заявляемых наборах использован антиген и сыворотка, в технологии производства которых изменен режим культивирования, методика концентрирования и состав среды культивирования, что приводит к получению большего количества продукта за один цикл.In addition, the claimed kits used antigen and serum, in the production technology of which the cultivation mode was changed, the concentration method and the composition of the cultivation medium, which leads to a larger amount of product per cycle.
Использование для диагностики бруцеллеза наборов из нескольких компонентов позволяет унифицировать серологическую диагностику бруцеллеза животных и контролировать правильность постановки серологических реакций во всех ветеринарных лабораториях страны.The use of sets of several components for the diagnosis of brucellosis allows to unify the serological diagnosis of animal brucellosis and to control the correctness of the formulation of serological reactions in all veterinary laboratories of the country.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам, а также сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.The problem in terms of the test system (set of components) for the diagnosis of animal brucellosis in RA, RSK and RDSK is solved by the fact that it contains a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK and brucellosis diagnostic lyophilized serum obtained by the methods described above, as well as healthy cattle lyophilized blood serum.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в роз-бенгал пробе (РБП) решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный для РБП, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам, а также сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.The task in terms of the test system (set of components) for the diagnosis of animal brucellosis in the rose bengal test (RBP) is solved by the fact that it contains brucellosis antigen for RBP, brucellosis diagnostic lyophilized serum obtained by the methods described above, as well as healthy blood serum cattle lyophilized.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный для КР и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам.The task in terms of the test system (set of components) for the diagnosis of animal brucellosis in a ring reaction (CR) with milk is solved by the fact that it contains brucellosis antigen for CR and lyophilized brucellosis diagnostic serum obtained by the methods described above.
Группа изобретений характеризуется следующими примерами.The group of inventions is characterized by the following examples.
Пример 1. Приготовление концентрата для получения единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП)Example 1. Preparation of a concentrate to obtain a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK, as well as to obtain a brucellosis antigen for a rose-bengal sample (RBP)
Для производственного культивирования бруцелл использовали посевной материал из штамма Brucella abortus 19 с оптической концентрацией 30 млрд м.к. объемом 10 л, который засевали в биореактор со 150 л стерильной питательной средой, содержащей, об. %: перевар Хоттингера - 15, гидролизат казеина - 1,5, глицерин - 1,0, глюкоза - 1,0, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой экстракт сухой - 0,5, вода - до 100. Содержание аминного азота в питательной среде составило 160 мг %. Концентрация бактериальных клеток при засеве питательной среды составила 1,8 млрд м.кл./см3. Производственное культивирование проводили глубинным доливным методом. При культивировании pH поддерживали в пределах 7,0, а температуру - в пределах 37,0°C. Уровень растворенного в культуральной среде кислорода до накопления 10 млрд м.к./см3, в течение 4 часов, поддерживали 15 мг/л, скорость оборотов мешалки составляла 100 об/мин; далее уровень растворенного в культуральной среде кислорода поднимали до 40 мг/л и поддерживали в течение 12 часов, а скорость оборотов мешалки увеличивали до 300 об/мин. На высоких оборотах мешалки для предотвращения пенообразования в культуральную среду добавляли Барванол в количестве 25 см3. Через 12 часов получали оптическую концентрацию бактериальных клеток в культуральной среде 50 млрд м. к./см3. Затем добавили в этот же реактор еще 150 л питательной среды и продолжали культивировать еще 9 часов в этом же режиме (температура в пределах 37,0°C, растворенный кислород в культуральной среде в пределах 40 мг/л). Через 9 часов наблюдали резкое увеличение содержания растворенного кислорода в культуральной среде, при этом оптическая концентрация бактериальных клеток составляла 95 млрд м.кл./см3, которую определяли по контрольной пробе, что является критерием того, что культура находится в стационарной фазе. Общее время культивирования составило 25 часов. По окончании культивирования в культуральную среду вносили 30 л 1,25% раствор КМЦ, после чего культуральную среду инактивировали нагревом ее до 80°C и выдерживанием при данной температуре в течение 1 часа. Затем биореактор с культуральной средой охлаждали до 10°C и данную температуру поддерживали в течение 48 часов. Надосадочную жидкость сливали из биореактора, а 70 л осадка - инактивированных клеток бруцелл с оптической концентрацией 400 млрд м.кл./см3, ресуспендировали в биореакторе стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до 300 млрд м.кл./см3 бактериальной суспензии. Инактивированную бактериальную суспензию сливали в стерильные бутыли и хранили в холодильнике при температуре 6°C 10 дней для последующего использования в приготовлении единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП).For the industrial cultivation of Brucella, seed from the Brucella abortus 19 strain with an optical concentration of 30 billion c.M. was used. volume of 10 l, which was seeded in a bioreactor with 150 l of sterile nutrient medium containing, about. %: Hottinger digest - 15, casein hydrolyzate - 1.5, glycerin - 1.0, glucose - 1.0, sodium chloride - 0.5, dry yeast extract - 0.5, water - up to 100. Amine nitrogen content in culture medium was 160 mg%. The concentration of bacterial cells during inoculation of the nutrient medium amounted to 1.8 billion mcl / cm 3 . Production cultivation was carried out by the deep top-up method. During cultivation, the pH was maintained within 7.0, and the temperature within 37.0 ° C. The level of oxygen dissolved in the culture medium prior to the accumulation of 10 billion MK / cm 3 for 4 hours was maintained at 15 mg / l, the stirrer speed was 100 rpm; Further, the level of oxygen dissolved in the culture medium was raised to 40 mg / L and maintained for 12 hours, and the stirrer speed was increased to 300 rpm. At high revolutions of the mixer, Barvanol was added to the culture medium in an amount of 25 cm 3 to prevent foaming. After 12 hours, an optical concentration of bacterial cells in the culture medium of 50 billion mc / cm 3 was obtained. Then another 150 L of culture medium was added to the same reactor and cultivation was continued for another 9 hours in the same mode (temperature within 37.0 ° C, dissolved oxygen in the culture medium within 40 mg / L). After 9 hours, a sharp increase in the content of dissolved oxygen in the culture medium was observed, while the optical concentration of bacterial cells was 95 billion mcl / cm 3 , which was determined by the control sample, which is a criterion that the culture is in the stationary phase. The total cultivation time was 25 hours. At the end of cultivation, 30 L of 1.25% CMC solution was added to the culture medium, after which the culture medium was inactivated by heating it to 80 ° C and keeping it at this temperature for 1 hour. Then the bioreactor with the culture medium was cooled to 10 ° C and this temperature was maintained for 48 hours. The supernatant was discharged from the bioreactor, and 70 l of the sediment was inactivated brucella cells with an optical concentration of 400 billion cubic meters / cm 3 , resuspended in the bioreactor with sterile 1% phenolized physiological saline to 300 billion cubic meters / cm 3 of bacterial suspension . The inactivated bacterial suspension was poured into sterile bottles and stored in a refrigerator at a temperature of 6 ° C for 10 days for subsequent use in the preparation of a single brucellosis antigen for RA, RSK and RDSK, as well as for the production of brucellosis antigen for a rose bengal sample (RBP).
Пример 2. Приготовление концентрата для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молокомExample 2. Preparation of a concentrate to obtain brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk
Концентрат изготавливали аналогично примеру 1, но для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл использовали стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об. %: перевар Хоттингера - 18, гидролизат казеина - 2, глицерин - 1,0, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой экстракт сухой - 0,5, вода - до 100. Содержание аминного азота в питательной среде составило 180 мг %. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевали в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составила 2,0 млрд м.кл./см3. Культивирование осуществляли 22 часа до накопления 42 млрд м.кл./см3.The concentrate was made analogously to example 1, but to obtain seed and industrial cultivation of brucella, a sterile nutrient medium based on the Hottinger digest containing vol. %: Hottinger digest - 18, casein hydrolyzate - 2, glycerin - 1.0, glucose - 1.5, sodium chloride - 0.5, dry yeast extract - 0.5, water - up to 100. Amine nitrogen content in the nutrient medium amounted to 180 mg%. To obtain seed, a pure culture of the strain Brucella abortus 19 was seeded in microfermenter with this nutrient medium. The concentration of seeds amounted to 2.0 billion mcl / cm 3 . The cultivation was carried out 22 hours before the accumulation of 42 billion mcl / cm 3 .
Производственное культивирование проводили глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании pH поддерживали в пределах 7,0, а температуру - в пределах 37,0°C. Уровень растворенного в культуральной среде кислорода до накопления 10 млрд м.к./см3, в течение 3 часов, поддерживали 23 мг/л, скорость оборотов мешалки составляла 100 об/мин; далее уровень растворенного в культуральной среде кислорода поднимали до 45 мг/л и поддерживали в течение 13 часов, а скорость оборотов мешалки увеличивали до 350 об/мин. Через 13 часов получали оптическую концентрацию в культуральной среде 60 млрд м.к./см3. Затем в реактор добавляли еще 150 л питательной среды и продолжали культивирование еще 10 часов в этом же режиме (температура в пределах 37,0°C, растворенный кислород в культуральной среде в пределах 45 мг/л). Чтобы погасить пену, в культуральную среду вносили 40 мл барванола. Через 10 часов растворенный кислород в культуральной среде резко поднимался, при взятии контрольной пробы в данный момент было определено, что культура находится в стационарной фазе и оптическая концентрация составила 100 млрд м.кл./см3. Общее время культивирования составило 26,0 часов. По окончании культивирования в культуральную среду вносили 30 л 1,2% раствора КМЦ, культуральную среду прогревали до 80°C, инактивировали в течение 1 часа, а затем охлаждали биореактор с культуральной средой до 10°C и данную температуру поддерживали в течение 48 часов. Надосадочную жидкость из биореактора сливали, а 85 л осадка - инактивированных клеток бруцелл с оптической концентрацией 400 млрд м.кл./см3 ресуспендировали стерильной дистиллированной водой (очищенной) до концентрации 200 млрд м.кл./см3 и использовали для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком.Production cultivation was carried out by the in-depth method in a bioreactor in a nutrient medium of the same composition. During cultivation, the pH was maintained within 7.0, and the temperature within 37.0 ° C. The level of oxygen dissolved in the culture medium prior to the accumulation of 10 billion MK / cm 3 for 3 hours was maintained at 23 mg / l, the stirrer speed was 100 rpm; Further, the level of oxygen dissolved in the culture medium was raised to 45 mg / L and maintained for 13 hours, and the stirrer speed was increased to 350 rpm. After 13 hours, an optical concentration of 60 billion cubic meters / cm 3 was obtained in the culture medium. Then another 150 L of culture medium was added to the reactor and cultivation was continued for another 10 hours in the same mode (temperature within 37.0 ° C, dissolved oxygen in the culture medium within 45 mg / L). To quench the foam, 40 ml of barvanol was added to the culture medium. After 10 hours, dissolved oxygen in the culture medium rose sharply, while taking a control sample at the moment it was determined that the culture was in the stationary phase and the optical concentration was 100 billion cubic meters / cm 3 . The total cultivation time was 26.0 hours. At the end of the cultivation, 30 l of a 1.2% CMC solution was added to the culture medium, the culture medium was heated to 80 ° C, inactivated for 1 hour, and then the bioreactor with the culture medium was cooled to 10 ° C and this temperature was maintained for 48 hours. The supernatant was discharged from the bioreactor, and 85 l of the sediment of inactivated brucella cells with an optical concentration of 400 billion mcl / cm 3 was resuspended with sterile distilled water (purified) to a concentration of 200 billion mcl / cm 3 and used to obtain brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk.
Пример 3. Получение единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСКExample 3. Obtaining a single brucellosis antigen in RA, RSK and RDSK
Полученный концентрат бактериальных клеток по примеру 1 ресуспендировали стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до концентрации 18-20 млрд м.кл./см3. Активность и специфичность полученного антигена из концентрата устанавливали при его титровании в РА со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (в среднем 19 млрд м.кл./см3), дает реакцию интенсивностью в 2 креста с разведением сыворотки 1:500 (конечное разведение 1:1000), что свидетельствует о его соответствии Международному стандарту.The obtained bacterial cell concentrate according to example 1 was resuspended in sterile 1% phenolized physiological saline to a concentration of 18-20 billion cubic meters / cm 3 . The activity and specificity of the obtained antigen from the concentrate was established by titration in RA with a standard serum sample against Brucella abortus. The proposed antigen containing a smaller number of cells (on average 19 billion mcl / cm 3 ) gives a reaction of 2 cross intensities with a dilution of serum of 1: 500 (final dilution of 1: 1000), which indicates its compliance with the International standard.
Пример 4. Получение бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП)Example 4. Obtaining brucellosis antigen for rose bengal samples (RBP)
Для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) концентрат антигена в объеме 50 л с оптической плотностью 300 млрд м.к., изготовленный по примеру 1, ресуспендировали стерильным 1%-ным фенолизированным фенолизированным раствором до 200 млрд м.кл./см3 с получением 75 л, который окрашивали бенгальской розовой, при этом добавляли 4,5 л 1%-ного раствора бенгальской розовой (из расчета 6% раствора на оптическую концентрацию 200 млрд м.к./см3) и оставляли на сутки. Окрашенный концентрат центрифугировали при 15 тыс. оборотов в минуту, затем окрашенную массу ресуспендировали до оптической концентрации 90-100 млрд м.к./см3 буферным разбавителем. В результате получали быстрое, в течение часа, полное яркое и равномерное окрашивание микробной клетки.To obtain a brucellosis antigen for a rose bengal sample (RBP), an antigen concentrate in a volume of 50 l with an optical density of 300 billion cubic meters, made according to Example 1, was resuspended with a sterile 1% phenolized phenolized solution up to 200 billion cubic meters / cm 3 to obtain 75 l, which was stained with Bengal pink, while 4.5 l of a 1% solution of Bengal pink was added (based on a 6% solution at an optical concentration of 200 billion cubic meters / cm 3 ) and left for a day. The colored concentrate was centrifuged at 15 thousand rpm, then the colored mass was resuspended to an optical concentration of 90-100 billion MK / cm 3 with buffer diluent. The result was a fast, within an hour, complete bright and uniform staining of the microbial cell.
Активность и специфичность полученного антигена устанавливали при его титровании в РБП со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (90 млрд м.кл./см3), дает реакцию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 1:10, содержащей 100 ME, 1-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (50 ME), и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), что свидетельствует о его стандартности.The activity and specificity of the obtained antigen was established by titration in RBP with a standard serum sample against Brucella abortus. The proposed antigen, containing a smaller number of cells (90 billion mcl / cm 3 ), gives a reaction of 4 cross intensities with a 1:10 dilution serum containing 100 ME, 1-2 crosses with a 1:20 dilution serum ME), and a negative reaction with serum at a dilution of 1:35 (28.5 ME), which indicates its standard.
Пример 5. Получение бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молокомExample 5. Obtaining brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk
Для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком в ресуспендированную бактериальную массу антигена, изготовленного по примеру 2, добавляли 25-35% от объема бактериальной массы протравы, в качестве которой использовали 0,5%-ный водный раствор сернокислого железа, после чего концентрат с протравой нагревали до 45°C и выдерживали 30 минут. Полученный концентрат окрашивали гематоксилином (или 2,3,5-трифенилтетразолем хлористым ТУ 6-09-07-1646-87 (ЧДА, C19H15CN4)) и выдерживали при комнатной температуре 24 часа, после чего окрашенный концентрат центрифугировали при 15 тыс оборотов в минуту, затем окрашенную массу ресуспендировали 1%-ным фенолизированным физраствором до оптической концентрации 95-100 млрд м.к. в 1 см3.To obtain a brucellosis antigen for a ring reaction (CR) with milk, 25-35% of the volume of the bacterial mass of the mordant, which was used as a 0.5% aqueous solution of ferrous sulfate, was added to the resuspended bacterial mass of the antigen made in Example 2 whereupon the concentrate with mordant was heated to 45 ° C and held for 30 minutes. The resulting concentrate was stained with hematoxylin (or 2,3,5-triphenyltetrazole chloride TU 6-09-07-1646-87 (ChDA, C 19 H 15 CN 4 )) and kept at room temperature for 24 hours, after which the colored concentrate was centrifuged at 15 thousand revolutions per minute, then the colored mass was resuspended in 1% phenolized saline to an optical concentration of 95-100 billion m in 1 cm 3 .
Гематоксилиновую краску в одном из вариантов готовили традиционным методом, в другом - ускоренным. Согласно традиционному методу навеску гематоксилина массой 10 г растворяли в 150 мл 95%-ного спирта этилового ректификованного и добавляли к 500 мл насыщенного раствора алюмоаммонийных квасцов (15%-ный раствор в дистиллированной воде), приготовленного в стеклянной посуде. Полученную смесь окисляли озонированным воздухом, образующимся при воздействии ультрафиолетового света, получаемого с использованием ртутно-кварцевой лампы, в открытой стеклянной, фарфоровой или эмалированной емкости с широким горлом при комнатной температуре в течение 3 суток, после чего смесь фильтровали и добавляли 125 мл глицерина и 125 мл метилового спирта. В таком соотношении ингредиентов заготавливали необходимое количество краски. Раствор оставляли при комнатной температуре в открытой бутыли на 1-3 мес для созревания, затем вновь фильтровали через фильтровальную бумагу и хранили в закрытой емкости. Готовая краска имела красно-малиновый цвет. Перед использованием раствор краски перемешивали и фильтровали через бумагу.Hematoxylin paint in one of the options was prepared by the traditional method, in another - accelerated. According to the traditional method, a 10 g sample of hematoxylin was dissolved in 150 ml of 95% rectified ethyl alcohol and added to 500 ml of a saturated solution of aluminum-ammonium alum (15% solution in distilled water), prepared in a glass dish. The resulting mixture was oxidized with ozonized air generated by exposure to ultraviolet light obtained using a mercury-quartz lamp in an open glass, porcelain or enameled container with a wide neck at room temperature for 3 days, after which the mixture was filtered and 125 ml of glycerol and 125 were added ml of methyl alcohol. In this ratio of ingredients, the required amount of paint was prepared. The solution was left at room temperature in an open bottle for 1-3 months to mature, then again filtered through filter paper and stored in a closed container. The finished paint had a crimson red color. Before use, the paint solution was mixed and filtered through paper.
Для приготовления гематоксилиновой краски ускоренным методом использовали четыре компонента: навеску гематоксилина массой 10 г вносили в колбу с 150 мл спирта этилового ректификованного, нагревали до 50-60°C и растворяли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке; навеску алюмоаммонийных квасцов [NH4Al(SO4)·12 Н2О] массой 45 г растворяли в 500 мл дистиллированной воды и нагревали до закипания (95-98°C); навеску натрия иодата (NaO3) массой 1,0 г растворяли в 10 мл дистиллированной воды, нагретой до кипения; глицерин - 150 мл. В таком соотношении компонентов заготавливали необходимое количество краски. В колбу с горячим раствором алюмоаммонийных квасцов вносили глицерин, добавляли спиртовой раствор гематоксилина и затем раствор иодата натрия. Сразу после внесения последнего компонента краска приобретала интенсивный красно-малиновый цвет. После внесения каждого компонента полученный раствор тщательно перемешивали.To prepare the hematoxylin paint using the accelerated method, four components were used: a 10 g sample of hematoxylin was introduced into a flask with 150 ml of rectified ethyl alcohol, heated to 50-60 ° C and dissolved with constant stirring on a magnetic stirrer; a sample of aluminum ammonium alum [NH 4 Al (SO 4 ) · 12 H 2 O] weighing 45 g was dissolved in 500 ml of distilled water and heated to boiling (95-98 ° C); a sample of sodium iodate (NaO 3 ) weighing 1.0 g was dissolved in 10 ml of distilled water, heated to boiling; glycerin - 150 ml. In this ratio of components, the required amount of paint was prepared. Glycerin was added to the flask with a hot solution of aluminum ammonium alum, an alcoholic solution of hematoxylin and then a solution of sodium iodate were added. Immediately after making the last component, the paint acquired an intense red-crimson color. After adding each component, the resulting solution was thoroughly mixed.
Полученный концентрат окрашивают гематоксилином из расчета 3% краски на концентрат культуры клеток с оптической концентрации 200 млрд м.к. в 1 см3.The resulting concentrate is stained with hematoxylin at the rate of 3% dye for the cell culture concentrate with an optical concentration of 200 billion m. in 1 cm 3 .
Активность и специфичность полученного по данному примеру антигена устанавливали при его титровании с 10 пробами свежего парного или охлажденного коровьего молока, содержащими в 2 см3 40, 20 и 10 ME антител. Предлагаемый антиген содержит меньшее количество клеток (95-100 млрд м.кл./см3), что обусловливает его более высокую активность.The activity and specificity of the antigen obtained in this example was established by titration with 10 samples of fresh fresh or chilled cow's milk containing 2 cm 3 of 40, 20 and 10 ME antibodies. The proposed antigen contains a smaller number of cells (95-100 billion mcl / cm 3 ), which leads to its higher activity.
Claims (38)
в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %.6. The method according to p. 1, characterized in that as a nutrient medium using an environment of the following composition, vol.%:
in which the content of amino nitrogen is 160-180 mg%.
в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %.19. The method according to p. 14, characterized in that as a nutrient medium using an environment of the following composition, vol.%:
in which the content of amino nitrogen is 160-180 mg%.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014139329/10A RU2593712C2 (en) | 2014-09-30 | 2014-09-30 | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014139329/10A RU2593712C2 (en) | 2014-09-30 | 2014-09-30 | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014139329A RU2014139329A (en) | 2016-04-20 |
| RU2593712C2 true RU2593712C2 (en) | 2016-08-10 |
Family
ID=55789226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014139329/10A RU2593712C2 (en) | 2014-09-30 | 2014-09-30 | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2593712C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687373C2 (en) * | 2016-12-28 | 2019-05-13 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2085212C1 (en) * | 1996-08-15 | 1997-07-27 | Николай Данилович Скичко | Method of preparing the common brucellosis antigen for pa, pck and pdck |
| WO1998008951A1 (en) * | 1996-08-28 | 1998-03-05 | Innogenetics N.V. | New brucella antigens, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits |
| RU2163141C1 (en) * | 2000-07-20 | 2001-02-20 | Мельник Николай Васильевич | Method of preparing brucellosis antigen for rose bengal specimen |
| RU2361610C1 (en) * | 2008-03-20 | 2009-07-20 | Открытое Акционерное Общество "Институт Биотехнологий Ветеринарной Медицины" | Way of reception of brucellous antigen from strain brucella abortus 19 for manufacturing of uniform brucellous antigen for aa (agglutination assay), cfr (complement fixation reaction) and lcfr (long-term complement fixation reaction), brucellous antigen for rose bengal assay (rba) and brucellous antigen for ring test (rt) with milk, way of manufacturing of brucellous diagnostic serum and diagnostic sets |
-
2014
- 2014-09-30 RU RU2014139329/10A patent/RU2593712C2/en active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2085212C1 (en) * | 1996-08-15 | 1997-07-27 | Николай Данилович Скичко | Method of preparing the common brucellosis antigen for pa, pck and pdck |
| WO1998008951A1 (en) * | 1996-08-28 | 1998-03-05 | Innogenetics N.V. | New brucella antigens, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits |
| RU2163141C1 (en) * | 2000-07-20 | 2001-02-20 | Мельник Николай Васильевич | Method of preparing brucellosis antigen for rose bengal specimen |
| RU2361610C1 (en) * | 2008-03-20 | 2009-07-20 | Открытое Акционерное Общество "Институт Биотехнологий Ветеринарной Медицины" | Way of reception of brucellous antigen from strain brucella abortus 19 for manufacturing of uniform brucellous antigen for aa (agglutination assay), cfr (complement fixation reaction) and lcfr (long-term complement fixation reaction), brucellous antigen for rose bengal assay (rba) and brucellous antigen for ring test (rt) with milk, way of manufacturing of brucellous diagnostic serum and diagnostic sets |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2687373C2 (en) * | 2016-12-28 | 2019-05-13 | Российская Федерация, от имени которой выступает Министерство обороны Российской Федерации | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2014139329A (en) | 2016-04-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2593712C2 (en) | METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS) | |
| RU2361610C1 (en) | Way of reception of brucellous antigen from strain brucella abortus 19 for manufacturing of uniform brucellous antigen for aa (agglutination assay), cfr (complement fixation reaction) and lcfr (long-term complement fixation reaction), brucellous antigen for rose bengal assay (rba) and brucellous antigen for ring test (rt) with milk, way of manufacturing of brucellous diagnostic serum and diagnostic sets | |
| CN110643522A (en) | Culture medium, culture method and application of pasteurella multocida | |
| RU2549434C2 (en) | Method for making brucellosis diagnostic serum | |
| RU2538158C1 (en) | Method of production of vaccine associated against colibacillosis, streptococcosis and staphylococcosis of cattle | |
| RU2098486C1 (en) | Method of bacteremia diagnosis | |
| CN110452854A (en) | A method of separation mycoplasma ovine pneumoniae | |
| US3534136A (en) | M.g. inoculum for poultry | |
| RU2163141C1 (en) | Method of preparing brucellosis antigen for rose bengal specimen | |
| CN107137705B (en) | The production method of pseudorabies gE gene delection viral inactivation vaccines | |
| RU2767782C1 (en) | Nutrient medium for obtaining listeria biomass | |
| RU2415434C2 (en) | Method for producing erythrocytic antigen for serum diagnostics of brucellosis | |
| RU2268748C2 (en) | Method for production of diagnosis serum against l-form brucella | |
| RU2728217C1 (en) | Liquid nutrient medium for cultivation of vibrio cholerae in matrasses and bottles | |
| RU2041947C1 (en) | Culture medium for isolation of diphtheritic microbe | |
| RU2792438C1 (en) | Selective nutrient medium with mannitol, bile and polymyxin to detect bacteria of the genera proteus, morganella, providencia, dry | |
| RU2725733C1 (en) | Transport liquid nutrient medium for maintaining the viability of the brucellous microbe | |
| RU2086259C1 (en) | Mixed inactivated vaccine for control of chlamydiosis, campylobacteriosis, salmonellosis and leptospirosis in sheep and goats | |
| SU840736A1 (en) | Method of determining antibiotic lactocid activity at alcoholic fermentation | |
| CN110241090B (en) | Method for producing porcine pseudorabies virus antigen by full suspension cell culture | |
| RU2422832C1 (en) | Method of producing erythrocytic diagnostic histoplasmosis and coccidiodomycosis antigen | |
| RU2266956C2 (en) | Broth for brucelle isolation | |
| RU2376034C1 (en) | Method for manufacturing of polyvalent serum against psevdomenosis of agricultural animals | |
| RU2333948C2 (en) | Nutritional medium for growing causative agent of tularemia | |
| RU2405567C1 (en) | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis |