RU2405567C1 - Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis - Google Patents
Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2405567C1 RU2405567C1 RU2009146103/15A RU2009146103A RU2405567C1 RU 2405567 C1 RU2405567 C1 RU 2405567C1 RU 2009146103/15 A RU2009146103/15 A RU 2009146103/15A RU 2009146103 A RU2009146103 A RU 2009146103A RU 2405567 C1 RU2405567 C1 RU 2405567C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- activity
- vaccine
- antigens
- pasteurella
- strain
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики, в частности для получения вакцины против пастереллеза животных.The invention relates to veterinary microbiology and biotechnology, can be used in the development of means of specific prophylaxis, in particular for obtaining a vaccine against animal pasteurellosis.
Известен способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования пастерелл в жидкой питательной среде, исследование физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированном их и инактивацией формалином (Патент РФ №2246316, Бюл. №5, опубл. 20.02.2005, МКИ7 А61К 39/02). Известный способ получения вакцины против пастереллеза животных основан на технологии выращивания пастерелл (P.multocida сероварианты А, В, D, штаммы №1231, 681, Т-80) при производстве противопастереллезных вакцин, включающий определение и установление рН, типичности и чистоты роста производственных штаммов, концентрации микробных клеток в культуре, обеспечивающий получение стандартизованных по количеству микробных клеток в препарате. В соответствии с разработанной технологией выращивания производственное глубинное культивирование пастерелл проводят обычно до 12-14 часов, достигая при этом максимального числа клеток, находящихся в культуре во время стационарной фазы роста. Культивирование прекращают тогда, когда концентрация микробов перестает увеличиваться. Обычно производственную противопастереллезную вакцину готовят с высокой концентрацией бактериальных клеток с оптической плотностью до 25 млрд м.кл./см3 пастерелл каждого штамма и которая в большинстве случаев реактогенна.There is a method of obtaining a vaccine against pasteurellosis of animals by culturing pasteurella in a liquid nutrient medium, the study of physico-chemical and biological indicators during the growth of bacterial mass, followed by termination of pasteurella cultivation, concentrated by formalin inactivation (RF Patent No. 2246316, Bull. No. 5, publ. . 02.20.2005, MKI 7 A61K 39/02). A known method of producing a vaccine against pasteurellosis of animals is based on the technology of growing pasteurella (P.multocida serovariants A, B, D, strains No. 1231, 681, T-80) in the production of anti-pasteurellosis vaccines, including determining and establishing the pH, typicality and purity of growth of production strains , the concentration of microbial cells in the culture, providing a standardized number of microbial cells in the preparation. In accordance with the developed cultivation technology, industrial deep cultivation of pasteurells is usually carried out up to 12-14 hours, while achieving the maximum number of cells in culture during the stationary growth phase. Cultivation is stopped when the concentration of microbes ceases to increase. Typically, a production anti-pasteurellosis vaccine is prepared with a high concentration of bacterial cells with an optical density of up to 25 billion cubic meters / cm 3 of pasteurellum of each strain and which in most cases is reactogenic.
Недостатком известного способа является низкое качество целевого продукта, выявляемое в низкой иммуногенности.The disadvantage of this method is the low quality of the target product, detected in low immunogenicity.
Известен также способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования P.multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, исследования физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированием их и инактивацией формалином, отличающийся тем, что дополнительно определяют в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы, активность растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации, а прекращение культивирования пастерелл осуществляют при ее значении для P.multocida серологических вариантов А, В, D как 1:512-1024, 1:1024-2048, 1:1024-2048 соответственно, при этом целевой продукт получают концентрированием в 3-5 раз культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы (патент РФ №2310473, БИ №27, 2007).There is also a method of obtaining a vaccine against pasteurellosis of animals by culturing P.multocida serological variants A, B, D in a liquid nutrient medium, studying physicochemical and biological parameters during the growth of the bacterial mass, followed by stopping the cultivation of pasteurellas, concentrating them and inactivating with formalin, characterized the fact that the activity of soluble surface antigens in the reaction is additionally determined in the culture fluid freed from the bacterial mass passive hemagglutination, and the termination of pasteurellum cultivation is carried out at its value for P.multocida serological options A, B, D as 1: 512-1024, 1: 1024-2048, 1: 1024-2048, respectively, while the target product is obtained by concentration of 3 -5 times the culture fluid freed from the bacterial cell mass (RF patent No. 2310473, BI No. 27, 2007).
Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения его иммуногенной активности.The objective of the claimed technical solution is to improve the quality of the target product by increasing its immunogenic activity.
Поставленная задача решается в способе получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования P.multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, определения в культуральной жидкости активности растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл концентрированием их и инактивацией формалином тем, что дополнительно культивируют Pasteurella haemolytica, инактивированную бактериальную массу центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см3 с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант, а целевой продукт получают добавлением к супернатанту формалина в конечной концентрации 0,12-0,15%.The problem is solved in a method of obtaining a vaccine against pasteurellosis of animals by culturing P.multocida serological variants A, B, D in a liquid nutrient medium, determining the activity of soluble surface antigens in the culture fluid in a passive hemagglutination reaction during the growth of the bacterial mass, followed by the termination of pasteurellum cultivation by concentration them and formalin inactivation by the fact that Pasteurella haemolytica, an inactivated bacterial mass by centrifuger, is additionally cultivated at 6000-8000 m / min, the resulting precipitate was resuspended in 0.1-0.2 M phosphate buffer, pH 7.2-7.4 to a concentration of 40-100 billion m.kl. / cm 3, followed by heating for 30-60 min at 56-60 ° C, then the reaction medium is centrifuged at 10000-15000 rpm, the supernatant is separated, and the target product is obtained by adding formalin to the supernatant at a final concentration of 0.12-0.15%.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения вакцины против пастереллезов животных, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».In the patent and scientific and technical literature, technical solutions are not known containing the modes of obtaining a vaccine against animal pasteurellosis, similar to the claimed, i.e. the proposal meets the criterion of "novelty."
Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».All modes of the method are feasible in laboratory and industrial conditions, aimed at solving a real technical problem, i.e. the proposal is “industrially applicable”.
Впервые предложен способ получения вакцины против пастереллезов животных путем культивирования Р.multocida серологических вариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica в жидкой питательной среде. Также впервые разработаны режимы получения вакцины против пастереллеза животных, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта и ускорение способа, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».For the first time, a method for producing a vaccine against animal pasteurellosis by cultivating P.multocida serological variants A, B, D and Pasteurella haemolytica in a liquid nutrient medium is proposed. Also, for the first time, modes of obtaining a vaccine against animal pasteurellosis were developed, which allows to obtain a non-obvious positive effect - improving the quality of the target product and accelerating the method, i.e. the proposal meets the criteria of "novelty" and "inventive step".
Способ иллюстрируется на следующих примерах.The method is illustrated in the following examples.
Пример 1.Example 1
Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.An aluminum hydroxide vaccine is obtained against pasteurellosis of cattle and sheep.
Для этого отобраны производственные штаммы: Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, production strains were selected: P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 10% by volume of the nutrient medium and mixed thoroughly in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. The cultivation is carried out at a temperature of 37 ° C for 10 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 и 1:8 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. Cultivation is carried out until the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPHA, in particular, this indicator of the level of activity for P. multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica after 10 hours of cultivation was equal to 1: 512; 1: 1024; 1: 1024 and 1: 8 respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The resulting bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 37 ° C ± 1 ° C, stirring periodically every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см3 с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант.At the end of inactivation, 3 liters of bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 6000-8000 rpm, the resulting precipitate is resuspended in 0.1-0.2 M phosphate buffer with a pH of 7.2-7.4 to a concentration of 40-100 billion mcl / cm 3 followed by heating for 30-60 minutes at 56-60 ° C, then the reaction medium is centrifuged at 10000-15000 rpm, the supernatant is separated.
Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096, 1:5120, 1:5120 и 1:32 соответственно, к супернатанту добавляют формалин в конечной концентрации 0,12-0,15% и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 12 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:12).The resulting supernatant (cell-free culture fluid) was concentrated on an ultrafiltration unit 5 times, after which the concentrates were examined in RPHA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P. multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica was determined in the range 1: 4096, 1: 5120, 1: 5120 and 1:32, respectively, formalin is added to the supernatant at a final concentration of 0.12-0.15% and a vaccine is prepared according to a known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 12 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:12).
Пример 2.Example 2
Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.An aluminum hydroxide vaccine is obtained against pasteurellosis of cattle and sheep.
Для этого отобраны три производственных штамма Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, three production strains of P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica were selected, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 10% of the volume of the nutrient medium and mixed thoroughly in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. Cultivation is carried out at a temperature of 37 ° C for 8 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024, 1:512 и 1:16 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. The cultivation is carried out until the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPGA, in particular, this indicator of the level of activity for P. multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica was equal to 1: 512 after 8 hours of cultivation; 1: 1024, 1: 512 and 1:16 respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The resulting bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 37 ° C ± 1 ° C, stirring periodically every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 6000-8000 об/мин, полученный осадок ресуспендируют в 0,1-0,2 М фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 до концентрации 40-100 млрд м.кл./см3 с последующим прогреванием в течение 30-60 мин при 56-60°C, далее реакционную среду центрифугируют при 10000-15000 об/мин, отделяют супернатант.At the end of inactivation, 3 liters of bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 6000-8000 rpm, the resulting precipitate is resuspended in 0.1-0.2 M phosphate buffer with a pH of 7.2-7.4 to a concentration of 40-100 billion mcl / cm 3 followed by heating for 30-60 minutes at 56-60 ° C, then the reaction medium is centrifuged at 10000-15000 rpm, the supernatant is separated.
Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 3 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:2048, 1:4096, 1:2048 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 11 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:11).The resulting supernatant (cell-free culture liquid) was concentrated in an ultrafiltration unit 3 times, after which the concentrates were examined in RPHA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P. multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica was determined in the range of 1: 2048 , 1: 4096, 1: 2048 and 1:64, respectively, and prepare the vaccine according to the known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 11 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:11).
Пример 3.Example 3
Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастереллеза крупного рогатого скота и овец.An aluminum hydroxide vaccine is obtained against pasteurellosis of cattle and sheep.
Для этого отобраны три производственных штамма Р.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 11% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°C в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, three production strains of P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica were selected, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 11% of the volume of the nutrient medium and mixed thoroughly in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. Cultivation is carried out at a temperature of 36 ° C for 9 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024 и 1:2048 и 1:16 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. The cultivation is carried out until the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPGA, in particular, this indicator of the level of activity for P.multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica was equal to 1: 1024 after 9 hours of cultivation; 1: 1024 and 1: 2048 and 1:16, respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The resulting bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 37 ° C ± 1 ° C, stirring periodically every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РИГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:4096, 1:8192 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).At the end of inactivation, 3 liters of the bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 15 thousand rpm. The resulting supernatant (cell-free culture liquid) was concentrated 4 times on an ultrafiltration unit, after which the concentrates were examined in RIGA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P. multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica was determined in the range of 1: 4096; 1: 4096, 1: 8192 and 1:64, respectively, and prepare the vaccine according to the known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 10 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:10).
Пример 4.Example 4
Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.An emulsified pig pasteurellosis vaccine is obtained.
Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 12% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 38°C в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, three production strains of P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica were selected, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 12% of the volume of the nutrient medium and thoroughly mixed in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. The cultivation is carried out at a temperature of 38 ° C for 10 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 и 1:8 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. The cultivation is carried out until the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPHA, in particular, this indicator of the level of activity for P.multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica after 10 hours of cultivation was equal to 1: 512; 1: 1024; 1: 1024 and 1: 8 respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 38°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The resulting bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 38 ° C, periodically stirring every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РИГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов P.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:5120; 1:5120 и 1:16 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).At the end of inactivation, 3 liters of the bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 15 thousand rpm. The resulting supernatant (cell-free culture fluid) was concentrated in an ultrafiltration unit 5 times, after which the concentrates were examined in RIGA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P.multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica was determined in the range of 1: 4096; 1: 5120; 1: 5120 and 1:16, respectively, and prepare a vaccine according to a known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 10 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:10).
Пример 5.Example 5
Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.An emulsified pig pasteurellosis vaccine is obtained.
Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°C в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, three production strains of P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica were selected, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 10% by volume of the nutrient medium and mixed thoroughly in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. Cultivation is carried out at a temperature of 37 ° C for 8 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:512 и 1:32 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. The cultivation is carried out until the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPGA, in particular, this indicator of the level of activity for P. multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica was equal to 1: 512 after 8 hours of cultivation; 1: 1024; 1: 512 and 1:32 respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°C±1°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The resulting bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 37 ° C ± 1 ° C, stirring periodically every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученную культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:2048; 1:4096; 1:2048 и 1:64 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 11 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:11).At the end of inactivation, 3 liters of the bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 15 thousand rpm. The resulting culture fluid is concentrated on an ultrafiltration unit 5 times, after which the concentrates are examined in RPGA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P.multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica is determined in the range of 1: 2048; 1: 4096; 1: 2048 and 1:64, respectively, and prepare the vaccine according to the known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 11 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:11).
Пример 6.Example 6
Получают эмульгированную вакцину против пастереллеза свиней.An emulsified pig pasteurellosis vaccine is obtained.
Для этого отобраны три производственных штамма P.multocida серологических вариантов А, В, D №1231, 681, Т-80 и Pasteurella haemolytica, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 8% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°C в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.For this, three production strains of P.multocida of serological variants A, B, D No. 1231, 681, T-80 and Pasteurella haemolytica were selected, which are seeded in an industrial bioreactor with a production medium at the rate of 8% of the volume of the nutrient medium and thoroughly mixed in a volume bioreactor 300 liters with adjustable temperature, pH, stirrer speed and aeration. For the cultivation of pasteurells, nutrient media are used based on the Hottinger reagent with a pH of 7.9-8.0 and an amine nitrogen content of at least 178-180 mg%. Cultivation is carried out at a temperature of 36 ° C for 9 hours. Each strain is grown separately.
Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для P.multocida серовариантов А, В, D и Pasteurella haemolytica через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024; 1:2048 и 1:8 соответственно.The optical concentration of bacterial cells is determined by the KFK-2 photometric method using a calibration curve. At all stages of the technological production of the vaccine, the activity of surface soluble antigens in the reaction of passive hemagglutination (RPHA) with antibodies obtained on surface soluble pasteurell antigens is determined every 1.5-2 hours. The object of the study is the supernatant - a culture fluid freed from the cells by double centrifugation at 14,000 rpm and filtering through sterilizing plates. Cultivation is carried out to the maximum accumulation of surface soluble antigens in the growth medium, determined by the level of titers in RPGA, in particular, this indicator of the level of activity for P.multocida serovariants A, B, D and Pasteurella haemolytica was 9: 10 after cultivation; 1: 1024; 1: 2048 and 1: 8, respectively.
Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 36°C, периодически перемешивая каждые 4 часа.The obtained bacuspension is inactivated with formalin to a final concentration of 0.3% to the total volume for 24 hours at 36 ° C, periodically stirring every 4 hours.
По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов P.multocida А, В, D и Pasteurella haemolytica в диапазоне 1:4096; 1:4096; 1:8192 и 1:32 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу (например, по патенту №2311199), т.е. к полученной баксуспензии добавляют равное количество адъюванта, полученного, например, смешиванием 10 кг минерального масла Маркол 52 и 1 кг эмульгатора 139 (соотношение эмульгатор 139 и масло Маркол 52 равно 1:10).At the end of inactivation, 3 liters of the bacterial suspension of each strain are taken, centrifuged at 15 thousand rpm. The resulting supernatant (cell-free culture liquid) was concentrated 4 times on an ultrafiltration unit, after which the concentrates were examined in RPGA and the activity of surface soluble antigens of all 3 serological variants of P.multocida A, B, D and Pasteurella haemolytica was determined in the range of 1: 4096; 1: 4096; 1: 8192 and 1:32, respectively, and prepare the vaccine according to the known method (for example, according to patent No. 2311199), i.e. to the obtained slurry add an equal amount of adjuvant obtained, for example, by mixing 10 kg of mineral oil Markol 52 and 1 kg of emulsifier 139 (the ratio of emulsifier 139 and Markol oil 52 is 1:10).
Иммунологическую активность полученных вакцин согласно примерам 1-3 сравнивали с иммунологической активностью известного технического решения по результатам заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после двухкратной иммунизации мышей опытной вакциной и известной. Полученные опыты показали, что после заражения мышей смертельной дозой смесью вирулентных штаммов P.multocida сероварианта A, P.multocida сероварианта В, P.multocida сероварианта D и Pasteurella haemolytica через 28 дней после их двухкратной иммунизации в опытных группах в живых сохранилось 50-60% мышей, в то время как в контрольной группе мышей, вакцинированной известной вакциной, пало 100% животных.The immunological activity of the obtained vaccines according to examples 1-3 was compared with the immunological activity of the known technical solution according to the results of infection of mice with a deadly dose of a mixture of virulent strains of P.multocida serovariant A, P.multocida serovariant B, P.multocida serovariant D and Pasteurella haemolytica 28 days after two immunization of mice with an experienced and known vaccine. The obtained experiments showed that after infection of mice with a lethal dose of a mixture of virulent strains of P.multocida of serovariant A, P.multocida of serovariant B, P.multocida of serovariant D and Pasteurella haemolytica, 28-60 days after their double immunization in the experimental groups, 50-60% survived mice, while in the control group of mice vaccinated with a known vaccine, 100% of the animals fell.
Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемая вакцина против пастереллеза животных позволяет повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 2 раза, а также в 1,5 раза увеличить сроки хранения целевого продукта.As shown by the results of experimental studies, the proposed vaccine against animal pasteurellosis can improve the quality of the target product by increasing its activity by 2 times, and also by 1.5 times increasing the shelf life of the target product.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146103/15A RU2405567C1 (en) | 2009-12-14 | 2009-12-14 | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009146103/15A RU2405567C1 (en) | 2009-12-14 | 2009-12-14 | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2405567C1 true RU2405567C1 (en) | 2010-12-10 |
Family
ID=46306317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009146103/15A RU2405567C1 (en) | 2009-12-14 | 2009-12-14 | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2405567C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744744C1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Vaccine against manchemiosis, bibershteiniosis and pasterelosis of large and small cattle associated inactivated, method for its preparation |
-
2009
- 2009-12-14 RU RU2009146103/15A patent/RU2405567C1/en not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2744744C1 (en) * | 2020-04-17 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Vaccine against manchemiosis, bibershteiniosis and pasterelosis of large and small cattle associated inactivated, method for its preparation |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sizonenko et al. | The New Efficiency of the «Srmp»–Listerias Growth-Promoting Factor during Factory Cultivation” | |
| CN110643522A (en) | Culture medium, culture method and application of pasteurella multocida | |
| RU2405567C1 (en) | Method of obtaining vaccine against animal pasteurellosis | |
| CN109536437B (en) | Culture method of suspension cell virus capable of maintaining stability and producing high-titer virus antigen | |
| RU2687488C1 (en) | Poly-strain formolated vaccine against calves pneumonia streptococcal etiology | |
| CN113755368B (en) | Fujian chicken mycoplasma synoviae and culture medium thereof | |
| RU2414929C1 (en) | Animal's pasteurellosis vaccine | |
| RU2309767C1 (en) | Method for manufacturing vaccine against pseudomonosis in swine | |
| RU2311199C1 (en) | Vaccine against pasteurellosis in animals | |
| CN108949606A (en) | A kind of chicken virus mycoplasma high density fermentation culture technique | |
| RU2310473C1 (en) | Method for production of vaccine against animal pasteurellosis | |
| RU2325183C1 (en) | Production method of animal colibacillosis vaccine | |
| CN113957007A (en) | Inactivated vaccine for mycoplasma synoviae | |
| RU2803269C1 (en) | Nutrient medium for the cultivation of pasteurella in industrial bioreactors | |
| RU2723580C1 (en) | Method for producing salmon fish vibriosis adsorbed vaccine | |
| RU2316345C1 (en) | Method for manufacturing associated vaccione against colibacteriosis, salmonellosis, streptococcosis and enterococcal infection in nutrias | |
| RU2288002C1 (en) | Method for preparing vaccine against enterococcus infection in nutrias | |
| US20200181565A1 (en) | Bacterial Growth on Non-Animal Derived Media | |
| US20070092961A1 (en) | Process to cultivate Brevundimonas diminuta for filtration validation | |
| RU2723711C1 (en) | Method for preparing vaccine with aluminium hydroxide against mastitis of cows streptococcal aetiology | |
| RU2246316C1 (en) | Mixed inactivated aluminum hydroxide-containing vaccine against infectious pneumonia and salmonellosis in pigs and method for it preparing | |
| RU2687373C2 (en) | Method of obtaining brucellar biomass of vaccine strains at deep cultivation using a minimally invasive liquid nutrient medium | |
| RU2722668C1 (en) | Method of producing inactivated vaccine against pulmonary diseases of young animals of productive animals | |
| RU2431664C1 (en) | Method for preparing fish aeromonosis vaccine | |
| CN109078003B (en) | Large-scale production method of mycoplasma hyopneumoniae live vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20111215 |