RU2623160C9 - Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения - Google Patents

Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения Download PDF

Info

Publication number
RU2623160C9
RU2623160C9 RU2013117285A RU2013117285A RU2623160C9 RU 2623160 C9 RU2623160 C9 RU 2623160C9 RU 2013117285 A RU2013117285 A RU 2013117285A RU 2013117285 A RU2013117285 A RU 2013117285A RU 2623160 C9 RU2623160 C9 RU 2623160C9
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
melitin
peptide
seq
polynucleotide
delivery
Prior art date
Application number
RU2013117285A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013117285A (ru
RU2623160C2 (ru
Inventor
Дэвид Б. Розема
Дэвид Л. Льюис
Даррен Х. Вэйкфилд
Эрик А. Китас
Филипп ХАДВИГЕР
Джон А. ВОЛФ
Инго РОЭЛЬ
Питер МОР
Торстен ХОФМАНН
Керстин ЖАН-ХОФФМАН
Ханс Мартин МЮЛЛЕР
Гюнтер ОТТ
Андрей В. БЛОХИН
Джонатан Д. БЕНСОН
Джеффри С. КАРЛСОН
Original Assignee
Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Эрроухэд Фармасьютикалз, Инк.
Publication of RU2013117285A publication Critical patent/RU2013117285A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2623160C2 publication Critical patent/RU2623160C2/ru
Publication of RU2623160C9 publication Critical patent/RU2623160C9/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к композиции для направленной доставки представляющего интерес полинуклеотида РНК-интерференции в гепатоциты in vivo, и может быть использовано в медицине. Полинуклеотид РНК-интерференции вводят совместно с нацеливающим пептидом мелитина, модифицированным рецепторами асиалогликопротеина (ASGPr), для доставки в клетку печени млекопитающего. Указанные пептиды доставки обеспечивают функциональное проникновение через мембраны клеток печени для возможности перемещения полинуклеотида РНК-интерференции внутрь клеток. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 5 ил., 11 табл., 18 пр.

Description

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Доставка полинуклеотидов и других по существу не проникающих через клеточные мембраны соединений в живую клетку в значительной степени ограничена сложной системой клеточных мембран. Лекарственные средства, используемые в антисмысловой, РНКи и генной терапии, представляют собой относительно большие гидрофильные полимеры и часто несут сильный отрицательный заряд. Обе указанные физические характеристики сильно ограничивают их непосредственную диффузию через клеточную мембрану. По этой причине основным ограничением для доставки полинуклеотида является доставка указанного полинуклеотида через клеточную мембрану в цитоплазму или ядро клетки.
Один способ, который используется для in vivo доставки малой нуклеиновой кислоты, заключатся в присоединении нуклеиновой кислоты либо к малой нацеливающей молекуле, либо к липиду или стеролу. Несмотря на то, что при использовании указанных конъюгатов наблюдается некоторая доставка и активность, необходимая для этих методов очень высокая доза нуклеиновой кислоты делает их непрактичными.
Также было разработано множество реагентов трансфекции, которые обеспечивали достаточно эффективную доставку полинуклеотидов в клетки in vitro. Однако доставка полинуклеотидов in vivo с использованием указанных реагентов трансфекции является сложной и признана неэффективной из-за токсичности in vivo, нежелательных взаимодействий с компонентами сыворотки или слабым направленным действием. Реагенты трансфекции, которые хорошо работают in vitro, катионные полимеры и липиды, как правило, образуют большие катионные электростатические частицы и дестабилизируют клеточные мембраны. Положительный заряд реагентов трансфекции in vitro облегчает связывание с нуклеиновой кислотой через заряд-зарядовые (электростатические) взаимодействия, таким образом, приводя к образованию комплекса нуклеиновая кислота/реагент трансфекции. Положительный заряд также является полезным для неспецифического связывания носителя с клеткой и для слияния с мембраной, ее дестабилизации или разрушения. Дестабилизация мембран облегчает доставку по существу не проникающего через клеточные мембраны полинуклеотида через клеточную мембрану. Хотя указанные свойства облегчают перенос нуклеиновой кислоты in vitro, они обуславливают токсичность и обеспечивают неэффективное направленное действие in vivo. Катионный заряд приводит к взаимодействию с компонентами сыворотки, которое вызывает дестабилизацию взаимодействия полинуклеотид-реагент трансфекции, плохую биодоступность и слабое нацеливание. Мембранная активность реагентов трансфекции, которая может являться эффективной in vitro, часто вызывает токсичность in vivo.
Для доставки in vivo носитель (нуклеиновая кислота и связанный агент доставки) должен быть маленьким, менее 100 нм в диаметре, предпочтительно, менее 50 нм. Еще более маленькие комплексы, менее 20 нм или менее 10 нм, были бы более применимыми. Носители для доставки размером больше 100 нм имеют очень слабый доступ к клеткам in vivo, отличным от клеток кровеносных сосудов. Комплексы, образованные за счет электростатических взаимодействий, склонны агрегировать или распадаться под воздействием физиологических концентраций солей или компонентов сыворотки. Кроме того, катионный заряд на носителях для доставки in vivo приводит к нежелательным взаимодействиям с компонентами сыворотки и, таким образом, слабой биодоступности. Интересно, что сильный отрицательный заряд также может ингибировать направленную доставку in vivo, препятствуя взаимодействию, необходимому для нацеливания, т.е. связыванию направленных лигандов с клеточными рецепторами. Таким образом, для распределения и направленного действия in vivo являются желаемыми почти нейтральные носители. В отсутствие тонкой регуляции разрушающая или дестабилизирующая мембраны активность вызывает токсичность при использовании in vivo. Баланс между токсичностью носителя и доставкой нуклеиновой кислоты легче достигается in vitro, чем in vivo.
В публикации патента США 20040162260 Розема и др. (Rozema et al.) описали способ обратимой регуляции разрушающей мембрану активности мембраноактивного полиамина. Мембраноактивный полиамин обеспечивал средства разрушения клеточных мембран. рН-зависимая обратимая регуляция обеспечивала средство ограничения активности эндосом клеток-мишеней, ограничивая таким образом токсичность. Указанный способ основан на модификации 2-пропионов-3-метилмалеиновым ангидридом аминов в полиамине.
Figure 00000001
Указанная модификация приводила к превращению поликатиона в полианион путем превращения первичных аминов в пары карбоксильных групп (β-карбоксил и γ-карбоксил) и обратимому ингибированию мембранной активности полиамина. Розема и др. (Rozema et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57) показали, что β-карбоксил не обладал полностью явным отрицательным зарядом и сам по себе не был способен ингибировать мембранную активность. Было показано, что добавление γ-карбоксильной группы являлось необходимым для эффективного подавления мембранной активности. Для обеспечения совместной доставки нуклеиновой кислоты и носителя для доставки указанную нуклеиновую кислоту ковалентно связывали с полимером для доставки. Авторы продемонстрировали доставку полинуклеотидов в клетки in vitro с использованием описанной системы доставки на основе биологически лабильного конъюгата. Однако из-за того, что носитель обладал высоким отрицательным зарядом, поскольку и нуклеиновая кислота, и модифицированный полимер имели высокую плотность отрицательного заряда, указанная система не была эффективной для доставки in vivo. Отрицательный заряд, вероятно, подавлял клеточно-специфичное нацеливание и усиливал неспецифический захват ретикулоэндотелиальной системой (RES).
В публикации патента США 20080152661, Розема и др. (Rozema et al.) улучшили способ, описанный в опубликованной патенте США 20040162260, путем устранения высокой плотности отрицательного заряда модифицированного мембраноактивного полимера. Путем использования нейтральной гидрофильной нацеливающей группы (галактозной) и стерической стабилизирующей группы (PEG, ПЭГ) вместо γ-карбоксила 2-пропионо-3-метилмалеинового ангидрида Розема и др. (Rozema et al.) обеспечили сохранение общей растворимости в воде и обратимое подавление мембранной активности с достижением эффективного нацеливания на гепатоциты in vivo. Как и в предыдущих случаях, полинуклеотид был ковалентно связан с полимером трансфекции. Ковалентное присоединение полинуклеотида к полимеру трансфекции поддерживали для обеспечения гарантированной совместной доставки полинуклеотида с полимером трансфекции в клетки-мишени во время введения in vivo путем предотвращения отсоединения полинуклеотида от полимера трансфекции. Совместная доставка полинуклеотида и полимера трансфекции была необходима, поскольку указанный полимер трансфекции обеспечивал транспорт полинуклеотида через клеточную мембрану, либо снаружи клетки внутрь, либо из эндоцитозного компартмента в цитоплазму клетки. В публикации патента США 20080152661 была описана высокоэффективная доставка полинуклеотидов, в частности, олигонуклеотидов РНКи, в клетки печени in vivo с использованием указанного нового усовершенствованного физиологически чувствительного поликонъюгата.
Однако ковалентное присоединение нуклеиновой кислоты к полиамину имело неотъемлемые ограничения. Модификация полимеров для трансфекции для присоединения как нуклеиновой кислоты, так и маскирующих агентов, осложнялась зарядовыми взаимодействиями. Присоединение отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты к положительно заряженному полимеру неизбежно приводит к агрегации, ограничивая, таким образом, концентрацию смеси. Агрегацию можно было бы преодолеть с использованием избытка поликатиона или полианиона. Однако указанный раствор ограничивает отношения, на основе которых могут быть приготовлены нуклеиновая кислота и полимер. Кроме того, присоединение отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты к не модифицированному катионному полимеру вызывало конденсацию и агрегацию комплекса и подавляло модификацию полимера. Модификация полимера с образованием отрицательного полимера нарушала присоединение нуклеиновой кислоты.
Согласно предварительной заявке на патент США 61/307,490, Розема и др. (Rozema et al.) также усовершенствовали технологию, описанную в публикации патента США 20080152661. В предварительной заявке на патент США 61/307,490 (Rozema et al.) показано, что при тщательном выборе нацеливающих молекул и независимом присоединении подходящих нацеливающих молекул независимо к миРНК и к полимеру доставки, можно не соединять миРНК и полимер доставки, сохраняя при этом эффективное нацеливание обоих элементов на клетки in vivo и обеспечивая эффективную функциональную направленную доставку миРНК. Полимеры доставки, используемые в публикации патента США 20080152661 и предварительной заявке на патент США 61/307,490, представляли собой относительно большие синтетические полимеры, поли(винилэфиры) и поли(акрилаты). Более крупные полимеры обеспечивали возможность модификации нацеливающими лигандами для специфического связывания с клетками и молекулами PEG для повышенного экранирования. Более крупные полимеры были необходимы для эффективной доставки, возможно, благодаря повышенной мембранной активности и повышенной защите нуклеиновой кислоты в клеточных эндосомах. Более крупные поликатионы сильнее взаимодействуют как с мембранами, так и с анионными РНК.
Авторы настоящего изобретения разработали улучшенную систему доставки миРНК с использованием намного более маленького пептида доставки. Улучшенная система обеспечивает эффективную доставку миРНК с пониженной токсичностью и, соответственно более широким терапевтическим диапазоном.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно предпочтительному варианту реализации, изобретение относится к композиции для доставки полинуклеотида интерферирующей РНК в клетку печени in vivo, содержащей: а) направленный на рецептор асиалогликопротеина (ASGPr) обратимо маскированный пептид мелитина (пептид доставки) и b) полинуклеотид интерферирующей РНК, конъюгированный с гидрофобной группой, содержащей по меньшей мере 20 атомов углерода (конъюгат РНК). Пептид доставки и конъюгат миРНК синтезируются раздельно и могут поставляться в отдельных контейнерах или в одном контейнере. Полинуклеотид интерферирующей РНК не конъюгирован с пептидом доставки.
Согласно другому предпочтительному варианту реализации, изобретение относится к композиции для доставки полинуклеотида интерферирующей РНК в клетку печени in vivo, содержащей: а) нацеленный на ASGPr обратимо маскированный пептид мелитина (пептид доставки) и b) полинуклеотид интерферирующей РНК, конъюгированный с галактозным кластером (конъюгат РНК). Пептид доставки и конъюгат миРНК синтезируются раздельно и могут поставляться в отдельных контейнерах или в одном контейнере. Полинуклеотид интерферирующей РНК не конъюгирован с полимером.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения нацеленный на ASGPr обратимо маскированный пептид мелитина представляет собой пептид мелитина, обратимо модифицированный путем осуществления реакции первичных аминов указанного пептида с маскирующими агентами, содержащими лиганд ASGPr. Амин является обратимо модифицированным, если отщепление модифицирующей группы приводит к восстановлению указанного амина. Обратимая модификация пептида мелитина маскирующими агентами, описанными в настоящей заявке, приводит к обратимому ингибированию мембранной активности указанного пептида мелитина. В маскированном состоянии обратимо маскированный пептид мелитина не проявляет разрушающей мембрану активности. Для ингибирования мембранной активности и обеспечения нацеливания на клетку, т.е. образования обратимо маскированного пептида мелитина, требуется обратимая модификация более 80% или более 90% аминов на пептиде мелитина.
Предпочтительный маскирующий агент, содержащий лиганд ASGPr, имеет нейтральный заряд и содержит галактозамин или производное галактозамина, содержащее амино-реактивную группу дизамещенного малеинового ангидрида. Другой предпочтительный маскирующий агент, содержащий лиганд ASGPr, содержит галактозамин или производное галактозамина, содержащее поддающееся расщеплению пептидазой дипептид-n-амидобензильное амино-реактивное карбонатное производное. Реакция амино-реактивного карбоната с амином приводит к обратимой модификации амина с образованием амидобензилкарбаматной связи.
Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения пептид мелитина включает мелитин пчелы Apis florea (маленькой или карликовой медоносной пчелы). Apis mellifera (западной или европейской или большой медоносной пчелы). Apis dorsata (гигантской медоносной пчелы), Apis cerana (азиатской медоносной пчелы) или его производные. Предпочтительный пептид мелитина содержит последовательность: Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Xaa18-Trp-Xaa20-Xaa21-Хаа22-Хаа23-Хаа24-Хаа25-Хаа26, где:
Xaa1 представляет собой лейцин, D-лейцин, изолейцин, норлейцин, тирозин, триптофан, валин, аланин, диметилглицин, глицин, гистидин, фенилаланин или цистеин,
Хаа2 представляет собой изолейцин, лейцин, норлейцин или валин,
Хаа3 представляет собой глицин, лейцин или валин,
Хаа5 представляет собой изолейцин, лейцин, норлейцин или валин,
Хаа7 представляет собой лизин, серин, аспарагин, аланин, аргинин или гистидин,
Xaa10 представляет собой аланин, треонин или лейцин,
Xaa11 представляет собой треонин или цистеин,
Xaa12 представляет собой глицин, лейцин или триптофан,
Xaa15 представляет собой треонин или аланин,
Xaa17 представляет собой изолейцин, лейцин, норлейцин или валин,
Xaa18 представляет собой серин или цистеин,
Хаа20 представляет собой изолейцин, лейцин, норлейцин или валин,
Xaa21 представляет собой лизин или аланин,
Хаа22 представляет собой аспарагин или аргинин,
Хаа23 представляет собой лизин или аланин,
Хаа24 представляет собой аргинин или лизин,
Хаа25 представляет собой лизин, аланин или глутамин,
Хаа26 является необязательным и, в случае его наличия, представляет собой глутамин, цистеин, глутамин-NH2 или цистеин-NH2;
и по меньшей мере два из Xaa21, Хаа23 и Хаа25 представляют собой лизин.
Более предпочтительно, мелитин содержит последовательность: Хаа1-Хаа2-Хаа3-Ala-Хаа5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26, где:
Xaa1 представляет собой лейцин, D-лейцин, норлейцин или тирозин,
Хаа2 представляет собой изолейцин, лейцин, норлейцин или валин,
Хаа3 представляет собой глицин, лейцин или валин,
Хаа5 представляет собой изолейцин, валин, лейцин или норлейцин,
Хаа7 представляет собой лизин, серии, аспарагин, аланин, аргинин или гистидин,
Xaa10 представляет собой аланин, треонин или лейцин,
Хаа11 представляет собой треонин или цистеин,
Xaa12 представляет собой глицин, лейцин или триптофан,
Xaa15 представляет собой треонин или аланин,
Xaa17 представляет собой изолейцин, лейцин или норлейцин,
Хаа20 представляет собой изолейцин, лейцин или норлейцин,
Хаа22 представляет собой аспарагин или аргинин, и
Хаа26 представляет собой глутамин или цистеин.
Наиболее предпочтительно, мелитин содержит последовательность: Xaa1-Xaa2-Gly-Ala-Xaa5-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa11-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26, где:
Xaa1, Хаа2, Хаа5, Xaa17 и Хаа20 независимо представляют собой изолейцин, лейцин или норлейцин,
Xaa11 представляет собой треонин или цистеин,
Хаа22 представляет собой аспарагин или аргинин, и
Хаа26 представляет собой глутамин или цистеин.
Предпочтительно маскирующий агент содержит нейтральный гидрофильный дизамещенный алкилмалеиновый ангидрид:
Figure 00000002
,
где R1 содержит нацеливающую на клетку группу. Предпочтительно алкильная группа представляет собой метальную или этильную группу. Предпочтительно нацеливающая группа содержит лиганд рецептора асиалогликопротеина. Пример замещенного алкилмалеинового ангидрида представляет собой производное 2-пропионо-3-алкилмалеинового ангидрида. Нейтральное гидрофильное производное 2-пропионо-3-алкилмалеинового ангидрида образовано в результате присоединения нейтральной гидрофильной группы к 2-пропионо-3-алкилмалеиновому ангидриду через γ-карбоксильную группу 2-пропионо-3-алкилмалеинового ангидрида:
Figure 00000003
где R1 содержит нейтральный лиганд ASGPr, и n=0 или 1. Согласно одному варианту реализации изобретения лиганд ASGPr связан с ангидридом через короткий PEG-линкер.
Предпочтительно маскирующий агент содержит гидрофильное подверженное расщеплению пептидазой (протеазой) дипептид-n-амидобензильное амино-реактивное карбонатное производное. В ферментативно расщепляемых линкерах согласно изобретению используется дипептид, связанный с активированной амидобензилом карбонатной группой. Лиганд ASGPr присоединен к амино-концу дипептида. Активированная амидобензилом карбонатная группа находится на карбокси-конце дипептида. Расщепляемые пептидазой линкеры, подходящие для применения согласно изобретению, имеют следующую структуру:
Figure 00000004
где R4 содержит лиганд ASGPr, и R3 содержит амино-реактивную карбонатную группу, и R1 и R2 представляют собой R-группы аминокислот. Предпочтительный активированный карбонат представляет собой пара-нитрофенол. Однако другие амино-реактивные карбонаты, известные в данной области техники, легко можно использовать вместо пара-нитрофенола. В результате реакции активированного карбоната с амином мелитина происходит связывание нацеливающего соединения, лиганда рецептора асиалогликопротеина, с пептидом мелитина поддающейся расщеплению пептидазой дипептид-амидобензилкарбаматной связью. Ферментативное расщепление дипептида приводит к отделению нацеливающего лиганда от пептида и инициирует реакцию элиминации, приводящую к регенерации амина пептида.
Дипептиды Glu-Gly, Ala-Cit, Phe-Cit («Cit» представляет собой аминокислоту цитруллин) показаны в Примере 3. Несмотря на то, что также допускается присутствие заряженных аминокислот, предпочтительными являются нейтральные аминокислоты.
Предпочтительный маскирующий агент обеспечивает функцию нацеливания за счет аффинности к рецепторам клеточной поверхности, т.е. маскирующий агент содержит лиганд рецептора клеточной поверхности. Предпочтительные маскирующие агенты содержат сахариды, обладающие аффинностью к ASGPr, включая, но не ограничиваясь ими: галактозу, N-ацетилгалактозамин и производные галактозы. Производные галактозы, обладающие аффинностью к ASGPr, хорошо известны в данной области техники. Важным признаком обратимо модифицированного мелитина является то, что более 80% аминов мелитина (в популяции пептидов) модифицированы путем присоединения лигандов ASGPr физиологически лабильными обратимыми ковалентными связями.
Согласно другому варианту реализации изобретения пептиды мелитина согласно изобретению также модифицированы на амино- или карбокси-конце путем ковалентного присоединения пространственного стабилизатора или конъюгата лиганд ASGPr-пространственный стабилизатор. Модификации амино или карбокси-конца пептида могут осуществляться во время синтеза с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Альтернативно, модификация амино- или карбокси-конца может осуществляться путем модификации цистеиновых остатков пептида мелитина, содержащего амино- или карбокси-концевые цистеиновые остатки. Предпочтительно пространственный стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль. Предпочтительно полиэтиленгликоли содержат 1-120 этиленовых звеньев. Согласно другому варианту реализации изобретения размер полиэтиленгликолей предпочтительно составляет менее 5 кДа. Для конъюгатов лиганд ASGPr-пространственный стабилизатор предпочтительный пространственный стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль, содержащий 1-24 этиленовых звеньев.
Конъюгат полинуклеотида РНКи и пептид доставки вводят млекопитающему в фармацевтически приемлемых носителях или разбавителях. Согласно одному варианту реализации изобретения пептид доставки и конъюгат полинуклеотида РНКи можно объединять в растворе до введения млекопитающему. Согласно другому варианту реализации изобретения пептид доставки и конъюгат полинуклеотида РНКи можно совместно вводить млекопитающему в виде отдельных растворов. Согласно другому варианту реализации изобретения пептид доставки и конъюгат полинуклеотида РНКи можно вводить млекопитающему последовательно. В случает последовательного введения пептид доставки можно вводить до введения конъюгата полинуклеотида РНКи. Альтернативно, в случае последовательного введения конъюгат полинуклеотида РНКи можно вводить до введения пептида доставки.
Другие объекты, признаки и преимущества согласно изобретению будут очевидны из следующего подробного описания, сопровождающегося рисунками.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГ.1. Таблица, в которой перечислены пептиды мелитина, подходящие для применения согласно изобретению.
ФИГ.2. Рисунок, показывающий связь кластера GalNAc с РНК.
ФИГ.3. График, показывающий (А) уровень азота мочевины крови (BUN) и (В) уровень креатинина у приматов, которых лечили обратимо модифицированными пептидами мелитина для доставки миРНК и конъюгатами миРНК-холестерин.
ФИГ.4. График, показывающий (А) уровень аспартатаминотрансферазы (AST) и (В) уровень аланинтрансаминазы (ALT) у приматов, которых лечили обратимо модифицированными пептидами мелитина для доставки миРНК и конъюгатами миРНК-холестерин.
ФИГ.5. График, показывающий снижение эндогенного уровня Фактора VII у приматов, которых лечили обратимо модифицированными пептидами мелитина для доставки миРНК и конъюгатами миРНК-холестерин.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящей заявке описан усовершенствованный способ доставки полинуклеотидов интерферирующих РНК (РНКи) в клетки печени млекопитающего in vivo. Согласно изобретению, описана in vivo система доставки полинуклеотида РНКи, в которой используется маленький пептид доставки, мелитин, являющийся производным пептида пчелиного яда, и независимо нацеленный полинуклеотид РНКи. Применение нацеливающих на печень молекул конъюгатов полинуклеотидов РНКи и нацеливающих на рецептор асиалогликопротеина обратимо ингибированных пептидов мелитина обеспечивает эффективную доставку полинуклеотида РНКи в печень.
Поскольку мелитин и полинуклеотиды РНКи независимо нацелены на гепатоциты, концентрация мелитина и полинуклеотидов и отношение между ними ограничивается только растворимостью компонентов, а не растворимостью ассоциированного комплекса или способностью образовывать указанный комплекс. Также полинуклеотид и мелитин можно смешивать в любой момент времени до введения или даже вводить раздельно, что позволяет, соответственно, хранить компоненты отдельно друг от друга, в растворе или в сухом виде.
Изобретение включает системы доставки конъюгата, имеющие следующий состав:
Y-Мелитин-(L-М)x плюс N-T,
где N представляет собой полинуклеотид РНКи, Т представляет собой группу, нацеливающую полинуклеотид (гидрофобную группу, содержащую 20 или более атомов углерода, или галактозный кластер), Мелитин представляет собой пептид мелитина пчелиного яда или его производное, как описано в настоящей заявке, и маскирующий агент М содержит лиганд ASGPr, как описано в настоящей заявке, ковалентно связанный с Мелитином через физиологически лабильную обратимую связь L. Отщепление L приводит к регенерации немодифицированного амина Мелитина. Y является необязательным и, в случае его наличия, содержит полиэтиленгликоль (PEG) или конъюгат лиганд ASGPr-PEG, связанный с амино-концом, карбокси-концом или амино- или карбокси-концевым цистеином Мелитина. Присоединение Y к амино-концу или амино-концевому цистеину является предпочтительным. Х представляет собой целое число больше 1. В немодифицированном состоянии Мелитин является мембраноактивным. Однако пептид доставки Мелитин-(L-М)x не является мембраноактивным. Обратимая модификация первичных аминов Мелитина путем присоединения М приводит к обратимому ингибированию или инактивации мембранной активности Мелитина. Процент модифицированных первичных аминов Мелитина является достаточным для ингибирования мембранной активности полимера и обеспечения нацеливания на гепатоциты. Предпочтительно значение x - более 80% и, более предпочтительно, более 90% первичных аминов Мелитина, что определяется по числу аминов на Мелитине в отсутствие любых маскирующих агентов. Более конкретно, х имеет значение от более 80% и до 100% первичных аминов Мелитина. Отмечено, что мелитин, как правило, содержит 3-5 первичных аминов на амино-конце (если он не модифицирован) и, как правило, 2-4 лизиновых остатка. Таким образом, процентная модификация аминов отражает процентную модификацию аминов в популяции пептидов мелитина. При расщеплении обратимых связей L немодифицированные амины регенерируют, и, соответственно, Мелитин возвращается в его немодифицированное мембраноактивное состояние. Предпочтительная обратимая связь представляет собой рН-лабильную связь. Другая предпочтительная обратимая связь представляет собой расщепляемую протеазами связь. Мелитин-(L-М)x, ASGPr-нацеленный обратимо маскированный мембраноактивный полимер (пептид доставки) и T-N, конъюгат полинуклеотида, синтезируют или получают отдельно. Т и N не являются прямо или не прямо ковалентно связанными с Мелитином, L или М. Электростатическое или гидрофобное соединение полинуклеотида или конъюгата полинуклеотида с маскированным или немаскированным полимером не является необходимым для in vivo доставки полинуклеотида в печень. Маскированный полимер и конъюгат полинуклеотида могут поставляться в одном и том же контейнере или в отдельных контейнерах. Они могут быть объединены до введения, введены совместно или введены последовательно.
Гидрофильные группы указывают в качественном отношении, что указанная химическая группа предпочитает воду. Как правило, такие химические группы являются растворимыми в воде и являются донорами или акцепторами водородных связей с водой. Гидрофильная группа может быть заряженной или незаряженной. Заряженные группы могут быть положительно заряженными (анионными) или отрицательно заряженными (катионными) или заряженными как положительно, так и отрицательно (цвиттерионными). Примеры гидрофильных групп включают следующие химические группы: углеводы, полиоксиэтилен, некоторые пептиды, олигонуклеотиды, амины, амиды, алкоксиамиды, карбоновые кислоты, сульфаты и гидроксилы.
Гидрофобные группы указывают в качественном отношении, что химическая группа избегает воду. Как правило, такие химические группы не растворимы в воде и не склонны образовывать водородные связи. Липофильные группы растворяются в жирах, маслах, липидах и неполярных растворителях и имеют слабую способность или не имеют способности образовывать водородные связи. Углеводороды, содержащие два (2) или более атомов углерода, некоторые замещенные углеводороды, холестерин и производные холестерина являются примерами гидрофобных групп и соединений.
Гидрофобные группы предпочтительно представляют собой углеводороды, содержащие только атомы углерода и водорода. Однако допускается присутствие неполярных заместителей или неполярных гетероатомов, которые поддерживают гидрофобность и включают, например, атом фтора. Термин включает алифатические группы, ароматические группы, ацильные группы, алкильные группы, алкенильные группы, алкинильные группы, арильные группы, аралкильные группы, аралкенильные группы и аралкинильные группы, каждая из которых может быть прямой, разветвленной или циклической. Термин гидрофобная группа также включает: стерины, стероиды, холестерин и производные стероидов и холестерина.
В настоящем документе мембраноактивные пептиды являются поверхностно-активными, амфипатическими пептидами, которые способны оказывать один или более их следующих эффектов на биологическую мембрану: изменение или разрушение мембраны, которое позволяет не проникающим через мембрану молекулам входить в клетку или пересекать мембрану, формирование поры в мембране, фрагментацию мембран или разрушение или растворение мембран. В настоящей заявке мембрана или клеточная мембрана содержит липидный бислой. Изменение или разрушение мембраны можно функционально определить по активности пептида по меньшей мере в одном из следующих анализов: лизис эритроцитов (гемолиз), подтекание липосом, слияние липосом, клеточное слияние, лизис клеток и высвобождение из эндосом. Мембраноактивные пептиды, которые вызывают лизис клеточных мембран, также называются мембранолитическими пептидами. Пептиды, которые предпочтительно вызывают разрушение эндосом или лизосом по сравнению с плазматическими мембранами, считаются эндосомолитическими. Действие (эффект) мембраноактивных пептидов на клеточную мембрану может быть временным. Мембраноактивные пептиды обладают аффинностью в отношении мембраны и вызывают денатурацию или деформацию бислойных структур.
Доставка полинуклеотида в клетку опосредуется пептидом мелитина, разрушающим или дестабилизирующим плазматическую мембрану или внутреннюю мембрану везикулы (такую как мембрана эндосомы или лизосомы), включая образование поры в мембране или разрушение эндосомальных или лизосомальных везикул, что приводит к высвобождению содержимого везикулы в цитоплазму клетки.
Эндосомолитичесие пептиды представляют собой пептиды, которые в ответ на специфические для эндосом факторы окружения, такие как пониженный рН или присутствие литических ферментов (протеаз), способны приводить к разрушению или лизису эндосомы или обеспечивать высвобождение в норме не проникающего через клеточные мембраны соединения, такого как полинуклеотид или белок, из внутриклеточных заключенных в мембрану везикул, таких как эндосома или лизосома. В эндосоме происходит изменение физико-химических свойств эндосомолитических полимеров. Указанное изменение может представлять собой изменение растворимости полимера или способности взаимодействовать с другими соединениями или мембранами в результате изменения заряда, гидрофобности или гидрофильности. Примеры эндосомолитических пептидов включают рН-лабильные или чувствительные к ферментам группы или связи. Обратимо маскированный мембраноактивный пептид, в котором маскирующие агенты присоединены к полимеру через рН-лабильные связи, может, таким образом, считаться эндосомолитическим полимером.
Мелитин в настоящей заявке представляет собой малый амфипатический мембраноактивный пептид, содержащий от примерно 23 до примерно 32 аминокислот, являющийся производным встречающих в природе в пчелином яде пептидов мелитина. Природный мелитин содержит 26 аминокислот и является преимущественно гидрофобным на амино-конце и преимущественно гидрофильным (катионным) на карбокси-конце. Мелитин согласно изобретению может быть выделен из биологического источника или может являться синтетическим. Синтетический полимер создается или производится человеком с использованием химического процесса, а не получается в результате природного биологического процесса. В настоящей заявке мелитин включает природные пептиды пчелиного яда семейства мелитина, которые могут быть обнаружены, например, в яде следующих видов: Apis florea, Apis mellifera, Apis cerana, Apis dorsata, Vespula maculifrons, Vespa magnifica, Vespa velutina, Polistes sp. HQL-2001 и Polistes hebraeus. В настоящей заявке мелитин также включает синтетические пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, идентичную или подобную природным пептидам мелитина. В частности, аминокислотная последовательность мелитина включает последовательности, показанные на Фиг.1. Помимо аминокислот, которые сохраняют свойственную мелитину высокую мембранную активность, могут быть добавлены 1-8 аминокислот к амино- или карбокси-концу пептида. В частности, могут быть добавлены цистеиновые остатки к амино- или карбокси-концу. Перечень на Фиг.1 не является полным, так как легко можно представить другие консервативные аминокислотные замены. Синтетические пептиды мелитина могут содержать природные аминокислоты в L-форме или энантиомерные аминокислоты в D-форме (инвертированные). Однако пептид мелитина должен содержать по существу все аминокислоты в L-форме, либо все аминокислоты в D-форме, но может содержать аминокислоты с противоположным стереоцентром, присоединенные к любому из амино- или карбокси-конца. Аминокислотная последовательность мелитина также может быть обращенной (ретро). Ретро-мелитин может содержать аминокислоты в L-форме или аминокислоты в D-форме (ретроинвертированный). Два пептида мелитина также могут быть ковалентно связаны с образованием димера мелитина. Мелитин может содержать модифицирующие группы, присоединенные либо к амино-концу, либо к карбокси-концу пептида, отличные от маскирующих агентов, которые усиливают тканевую направленность или облегчают in vivo циркуляцию. Однако в настоящей заявке мелитин не включает цепи или полимеры, содержащие более двух пептидов мелитина, ковалентно связанных друг с другом или с другим полимером или скаффолдом.
Маскирование
Пептиды мелитина согласно изобретению включают обратимо модифицированные пептиды мелитина, где обратимая модификация приводит к ингибированию мембранной активности, нейтрализации мелитина с уменьшением положительного заряда и образованию почти нейтрально заряженного полимера, и обеспечивает специфичное к клеточному типу нацеленное действие. Мелитин обратимо модифицирован путем обратимой модификации первичных аминов пептида.
Пептиды мелитина согласно изобретению способны разрушать плазматические мембраны или мембраны эндосом/лизосом. Однако мембранная активность приводит к токсичности при введении пептида in vivo. Таким образом, обратимое маскирование мембранной активности мелитина необходимо для его применения in vivo. Указанное маскирование осуществляют путем обратимого присоединения маскирующих агентов к мелитину с образованием обратимо маскированного мелитина, т.е. пептида доставки. Помимо ингибирования мембранной активности маскирующие агенты обеспечивают клеточно-специфические взаимодействия, т.е. нацеливание.
Важной чертой маскирующих агентов является то, что в агрегате они ингибируют мембранную активность полимера и обеспечивают in vivo нацеливание на гепатоциты. Мелитин является мембраноактивным в немодифицированном (немаскированным) состоянии и не мембраноактивным (инактивированным) в модифицированном (маскированном) состоянии. Количество маскирующих агентов, связанных с пептидом, является достаточным для достижения желаемого уровня инактивации. Желаемую степень модификации мелитина путем присоединения маскирующего агента (агентов) легко определить с использованием подходящих анализов активности пептида. Например, если мелитин обладает мембранной активностью в конкретном анализе, то маскирующий агент связан с указанным пептидом в количестве, достаточном для достижения желаемой степени подавления мембранной активности в указанном анализе. Предпочтительной является модификация ≥80% или ≥90% первичных аминогрупп на популяции пептидов мелитина по результатам определения количества первичных аминов на пептидах в отсутствие каких-либо маскирующих агентов. Также предпочтительной характеристикой маскирующих агентов является то, что их присоединение к пептиду снижает положительный заряд полимера, таким образом, приводя к образованию более нейтрального пептида доставки. Желательно, чтобы маскированный пептид сохранял растворимость в воде.
В настоящей заявке мелитин является маскированным, если модифицированный пептид не обладает мембранной активностью и обладает способностью специфического нацеливания на клетки (т.е. на гепатоциты) in vivo. Мелитин является обратимо маскированным, если расщепление связей, соединяющих маскирующие агенты с пептидом, приводит к восстановлению аминов пептида, что приводит к восстановлению мембранной активности.
Другим важным признаком является то, что маскирующие агенты ковалентно связаны с мелитином физиологически лабильными обратимыми связями. Благодаря использованию физиологически лабильных обратимых линкеров или связей маскирующие агенты можно отщеплять от пептида in vivo, что обеспечивает демаскирование пептида и восстановление активности демаскированного пептида. Путем выбора подходящей обратимой связи можно получать конъюгат, восстанавливающий активность мелитина после его доставки или нацеливания на желаемый тип клеток или определенную внутриклеточную локализацию. Обратимость связей обеспечивает селективную активацию мелитина.
Обратимые ковалентные связи включают обратимые или лабильные связи, которые могут быть выбраны из группы, включающей: физиологически лабильные связи, связи, чувствительные к физиологическим условиям в клетке, рН-лабильные связи, сильно рН-лабильные связи, крайне рН-лабильные связи и расщепляемые протеазами связи.
В настоящей заявке маскирующий агент предпочтительно представляет собой нейтральное (незаряженное) соединение, содержащее лиганд ASGPr и амино-реактивную группу, где реакция указанной амино-реактивной группы с амином пептида приводит к образованию связи лиганда ASGPr с пептидом через обратимую физиологически лабильную ковалентную связь. Амино-реактивные группы выбирают таким образом, чтобы расщепление в ответ на соответствующие физиологические условия (например, пониженное значение рН, такое как в эндосоме/лизосоме, или ферментативное расщепление, такое как в эндосоме/лизосоме) приводило к регенерации амина мелитина. Лиганд ASGPr представляет собой группу, как правило, сахарид, обладающую аффинностью к рецептору асиалогликопротеина. Предпочтительные маскирующие агенты согласно изобретению способны модифицировать полимер (образовывать обратимую связь с полимером) в водном растворе.
Предпочтительно амино-реактивная группа содержит дизамещенный малеиновый ангидрид. Предпочтительно маскирующий агент представлен структурой:
Figure 00000005
где R1 содержит лиганд рецептора асиалогликопротеина (ASGPr), и R2 представляет собой алкильную группу, такую как метильная (-СН3) группа, этильная (-СН2СН3) группа или пропильная (-СН2СН2СН3) группа.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, галактозный лиганд связан с амино-реактивной группой через PEG-линкер, как показано с помощью структуры:
Figure 00000006
где n представляет собой целое число между 1 и 19.
Другая предпочтительная амино-реактивная группа содержит дипептид-амидобензильное амино-реактивное производное карбоната, представленное структурой:
Figure 00000007
где:
R1 представляет собой группу R аминокислоты 1,
R2 представляет собой группу R аминокислоты 2,
R3 представляет собой -CH2-O-C(O)-O-Z, где Z представляет собой галогенид,
Figure 00000008
,
Figure 00000009
,
Figure 00000010
или
Figure 00000011
и R4 содержит лиганд ASGPr.
В результате реакции активированного карбоната с амином мелитина лиганд ASGPr связывается с пептидом мелитина через поддающуюся расщеплению пептидазой дипептид-амидобензилкарбаматную связь.
Figure 00000012
Ферментативное расщепление дипептида приводит к отделению нацеливающего лиганда от пептида и вызывает реакцию элиминации, которая приводит к восстановлению амина пептида. Несмотря на то, что на приведенной выше структуре показан один маскирующий агент, связанный с пептидом мелитина, на практике с указанным пептидом мелитина связано несколько маскирующих агентов, предпочтительно таким образом, что более 80% аминов популяции пептидов мелитина являются модифицированными.
Дипептиды Glu-Gly, Ala-Cit, Phe-Cit («Cit» представляет собой аминокислоту цитруллин) показаны в Примере 3. В приведенной выше структуре Glu-Gly, Ala-Cit, Phe-Cit представляют собой R2-R1. Несмотря на то, что допускается присутствие заряженных аминокислот, предпочтительными являются нейтральные аминокислоты. Возможны другие комбинации аминокислот, при условии, что они расщепляются эндогенной протеазой. Кроме того, 3-5 аминокислот могут использоваться в качестве линкера между амидобензильной группой и нацеливающим лигандом.
Как и в случае маскирующих агентов на основе малеинового ангидрида, лиганд ASGPr может быть связан с поддающимся расщеплению пептидазой дипептид-амидобензилкарбонатом через PEG-линкер.
Мембраноактивный полиамин может быть конъюгирован с маскирующими агентами в присутствии избытка маскирующих агентов. Избыток маскирующих агентов может быть отделен от конъюгированного пептида доставки до введения указанного пептида доставки.
Согласно другому варианту реализации изобретения пептиды мелитина согласно изобретению также модифицированы на амино- или карбоксильном конце, путем ковалентного присоединения пространственного стабилизатора или конъюгата лиганд ASGPr-пространственный стабилизатор. Предпочтительной является модификация гидрофобного конца; амино-конца в случае мелитина, имеющего «прямую» последовательность, и карбокси-конца в случае ретро-мелитина. Предпочтительный пространственный стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль. Модификации амино- или карбокси-конца пептида могут осуществляться во время синтеза с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Альтернативно, модификации амино- или карбокси-конца можно осуществлять путем модификации цистеиновых остатков пептидов мелитина, включая амино- или карбокси-концевые цистеиновые остатки. Полиэтиленгликоли предпочтительно содержат 1-120 этиленовых звеньев. Согласно другому варианту реализации изобретения размер полиэтиленгликолей предпочтительно составляет менее 5 кДа. Для конъюгатов лиганд ASGPr-пространственный стабилизатор (NAG-PEG-модификация) предпочтительный пространственный стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль, содержащий 1-24 этиленовых звеньев. Концевая PEG-модификация в сочетании с обратимым маскированием также снижает токсичность пептидов доставки мелитина. Концевая NAG-PEG-модификация повышает эффективность.
Пространственный стабилизатор
В настоящей заявке пространственный стабилизатор представляет собой неионный гидрофильный полимер (природный, синтетический или не природный), который предотвращает или ингибирует внутримолекулярные или межмолекулярные взаимодействия молекулы, к которой он присоединен в отличие от молекулы, не содержащей пространственный стабилизатор. Пространственный стабилизатор препятствует вовлечению молекулы, к которой он присоединен, в электростатические взаимодействия. Электростатическое взаимодействие представляет собой нековалентное связывание двух или более веществ благодаря силам притяжения между положительными и отрицательными зарядами. Пространственные стабилизаторы могут ингибировать взаимодействие с компонентами крови и, таким образом, ингибировать опсонизацию, фагоцитоз и захват ретикулоэндотелиальной системой. Пространственные стабилизаторы, таким образом, могут повышать время циркуляции в кровотоке молекул, к которым они присоединены. Пространственные стабилизаторы также могут предотвращать агрегацию молекул. Предпочтительный пространственный стабилизатор представляет собой полиэтиленгликоль (PEG) или производное PEG. Молекулы PEG, подходящие для применения согласно изобретению, содержат примерно 1-120 этиленгликолевых мономеров.
Лиганд ASGPr
Нацеливающие группы или фрагменты улучшают фармакокинетические свойства или биораспределение конъюгата, к которому они присоединены, для улучшения клеточно-специфического распределения и клеточно-специфического захвата конъюгата. Галактоза и производные галактозы применяют для обеспечения нацеливания молекул на гепатоциты in vivo путем их связывания с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr), экспрессируемым на поверхности гепатоцитов. В настоящей заявке лиганд ASGPr (или ASGPr-лиганд) содержит галактозу и производное галактозы, обладающее аффинностью к ASGPr, равной или большей по сравнению с аффинностью галактозы. Связывание нацеливающих групп, содержащих галактозу, с рецептором (рецепторами) ASGPr облегчает клеточно-специфическую направленность пептида доставки на гепатоциты и эндоцитоз указанного пептида доставки гепатоцитами.
Лиганды ASGPr могут быть выбраны из группы, включающей: лактозу, галактозу, N-ацетилгалактозамин (GalNAc), галактозамин, N-формилгалактозамин, N-ацетилгалактозамин, N-пропионилгалактозамин, N-н-бутаноилгалактозамин и N-изо-бутаноилгалактозамин (Iobst, S.T. and Drickamer, K. J.B.C. 1996, 277, 6686). Лиганды ASGPr могут быть мономерными (например, содержащими один галактозамин) или мультимерными (например, содержать много галактозаминов).
Согласно одному варианту реализации изобретения пептид мелитина обратимо маскируют путем присоединения маскирующих агентов, содержащих лиганды ASGPr, к ≥80% или ≥90% первичных аминов пептида.
Лабильная связь
Связь или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом одной или более ковалентными связями.
Например, связь может соединять маскирующий агент с пептидом. Образование связи может соединять две отдельные молекулы в одну молекулу или два атома в одну молекулу. Связь может иметь нейтральный заряд или может иметь положительный или отрицательный заряд. Обратимый или лабильный линкер включает обратимую или лабильную связь. Связь может необязательно включать спейсер, который увеличивает расстояние между двумя соединяемыми атомами. Спейсер может также обеспечивать дополнительную подвижность и/или длину связи. Спейсеры могут включать, но не ограничиваются указанными: алкильные группы, алкенильные группы, алкинильные группы, арильные группы, аралкильные группы, аралкенильные группы, аралкинильные группы; каждая из которых может содержать один или более гетероатомов, гетероциклов, аминокислот, нуклеотидов и сахаридов. Спейсерные группы хорошо известны в данной области техники, и предшествующий перечень не ограничивает объем настоящего изобретения.
Лабильная связь представляет собой ковалентную связь, отличную от ковалентной связи с атомом водорода, которая способна селективно разрушаться или расщепляться в условиях, которые не приводят к разрушению или расщеплению других ковалентных связей в той же молекуле. Более конкретно, лабильная связь представляет собой ковалентную связь, которая является менее стабильной (термодинамически) или более быстро разрушается (кинетически) при соответствующих условиях, чем другие не лабильные ковалентные связи в той же молекуле. Расщепление лабильной связи внутри молекулы может приводить к образованию двух молекул. Для специалистов в данной области техники расщепление или лабильность связи в целом описываются с помощью времени полужизни (t½) для расщепления связи (времени, требуемого для расщепления половины связей). Таким образом, лабильные связи включают связи, которые могут селективно расщепляться быстрее, чем другие связи в молекуле.
Подходящие условия определяются типом лабильной связи и хорошо известны в области органической химии. Лабильная связь может быть чувствительной к рН, окислительным или восстановительным условиям или агентам, температуре, концентрации солей, присутствию фермента (такого как эстеразы, включая нуклеазы, и протеазы) или присутствию добавляемого агента. Например, повышенное или пониженное значение рН является подходящим условием для рН-лабильной связи.
Скорость, с которой лабильная группа претерпевает превращение, можно контролировать путем изменения химических составляющих молекулы, содержащей указанную лабильную группу. Например, добавление конкретных химических групп (например, акцепторов или доноров электронов) вблизи лабильной группы может влиять на конкретные условия (например, рН), при которых будет происходить химическое превращение.
В настоящей заявке физиологически лабильная связь представляет собой лабильную связь, которая поддается расщеплению в условиях, которые в норме встречаются или аналогичны встречающимся в теле млекопитающего. Группы физиологически лабильных связей выбираются таким образом, что они претерпевают химическое превращение (например, расщепление) при определенных физиологических условиях.
В настоящей заявке связь, чувствительная к физиологическим условиям в клетке, представляет собой лабильную связь, которая поддается расщеплению в условиях, существующих внутри клеток млекопитающих. Условия внутри клеток млекопитающих включают химические условия, такие как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация солей, встречающиеся или аналогичные встречающимся в клетках млекопитающих. Условия внутри клеток млекопитающих также включают наличие ферментативной активности, в норме присутствующей в клетках млекопитающих, например, активности протеолитических или гидролитических ферментов. Связь, чувствительная к физиологическим условиям в клетке, может также расщепляться в ответ на введение фармацевтически приемлемого экзогенного агента. Физиологически лабильные связи, которые расщепляются при соответствующих условиях со временем полужизни менее 45 мин, считаются сильно лабильными. Физиологически лабильные связи, которые расщепляются при соответствующих условиях со временем полужизни менее 15 мин, считаются крайне лабильными.
Химическое превращение (расщепление лабильной связи) может инициироваться путем добавления фармацевтически приемлемого агента в клетку или может происходить спонтанно, когда молекула, содержащая лабильную связь, достигает соответствующего внутри- и/или внеклеточного окружения. Например, рН-лабильная связь может расщепляться при перемещении молекулы в эндосому с повышенной кислотностью. Таким образом, рН-лабильная связь может считаться расщепляемой в эндосоме связью.
Ферментативно расщепляемые связи могут расщепляться под действием ферментов, таких как присутствующие в эндосоме или лизосоме ферменты или присутствующие в цитоплазме ферменты. Дисульфидная связь может расщепляться при перемещении молекулы в более восстановительные условия клеточной цитоплазмы. Таким образом, дисульфидная связь может считаться расщепляемой в цитоплазме связью.
В настоящей заявке рН-лабильная связь представляет собой лабильную связь, которая селективно разрушается в кислых условиях (рН<7). Такие связи также можно называть эндосомо-лабильными связями, так как клеточные эндосомы и лизосомы имеют рН менее 7. Термин «рН-лабильные» включает связи, которые являются рН-лабильными, сильно рН-лабильными и крайне рН-лабильными.
Реакция ангидрида с амином приводит к образованию амида и кислоты. Для многих ангидридов обратная реакция (образование ангидрида и амина) протекает очень медленно и является энергетически не выгодной. Однако если ангидрид представляет собой циклический ангидрид, то реакция с амином приводит к получению нафтиламина, молекулы, в которой одновременно присутствуют амид и кислота. Присутствие обеих реактивных групп (амида и карбоновой кислоты) в одной молекуле ускоряет обратную реакцию. В частности, продукт реакции первичных аминов с малеиновым ангидридом и производными малеинового ангидрида, полуамидами малеиновой кислоты, превращается обратно в амин и ангидрид в 1×109-1×1013 раз быстрее, чем его нециклические аналоги (Kirby, 1980).
Реакция амина с ангидридом с образованием амида и кислоты.
Figure 00000013
Реакция амина с циклическим ангидридом с образованием нафтиламина.
Figure 00000014
Расщепление нафтиламина с образованием амина и ангидрида является рН-зависимым процессом и сильно ускоряется при кислом значении рН. Указанная рН-зависимая реактивность может использоваться для получения обратимых рН-лабильных связей и линкеров. В качестве такой рН-чувствительной линкерной молекулы использовалась цис-аконитовая кислота. Сначала проводили сочетание γ-карбоксилата с молекулой. На втором этапе либо α-, либо β-карбоксилат сочетали со второй молекулой с образованием рН-чувствительной связи между двумя молекулами. Для расщепления указанного линкера при рН 5 время полужизни составляло между 8 и 24 часами.
Структуры цис-аконитового ангидрида и малеинового ангидрида.
Figure 00000015
Значение рН, при котором происходит расщепление, контролируют с помощью химических составляющих лабильного фрагмента. Скорость превращения полуамидов малеиновой кислоты в амины и малеиновые ангидриды сильно зависит от заместителя (R2 и R3) в системе малеинового ангидрида. Когда R2 представляет собой метил, скорость превращения в 50 раз выше, чем когда R2 и R3 представляют собой водород. Когда алкильные заместители присутствуют на обеих группах R2 и R3 (например, в случае 2,3-диметилмалеинового ангидрида), скорость существенно повышается: в 10,000 раз выше, чем в случае не замещенного малеинового ангидрида. Малеаматная связь, образованная в результате модификации амина 2,3-диметилмалеиновым ангидридом, расщепляется с восстановлением ангидрида и амина со временем полужизни между 4 и 10 мин. при рН 5. Предполагается, что если R2 и R3 представляют собой группы, которые больше водорода, то скорость превращения нафтиламина в амин и ангидрид выше, чем если R2 и/или R3 представляют собой водород.
Сильно рН-лабильная связь: Для расщепления сильно рН-лабильной связи время полужизни при рН 5 составляет менее 45 мин. Способы создания сильно рН-лабильных связей хорошо известны в области химии.
Крайне рН-лабильные связи: Для расщепления крайне рН-лабильной связи время полужизни при рН 5 составляет менее 15 мин. Способы создания крайне рН-лабильных связей хорошо известны в области химии.
Дизамещенные циклические ангидриды, в частности, применимы для присоединения маскирующих агентов к пептидам мелитина согласно изобретению. Они обеспечивают физиологически рН-лабильные связи, легко модифицируют амины, и их расщепление при пониженном значении рН, которое обнаруживается в клеточных эндосомах и лизосомах, приводит к восстановлению указанных аминов. Во-вторых, оказывается,, что α- или β-группа карбоновой кислоты, образованная в ходе реакции с амином, вносит только примерно 1/20 часть ожидаемого отрицательного заряда в заряд полимера (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry, 2003). Таким образом, модификация пептида дизамещенными малеиновыми ангидридами приводит к эффективной нейтрализации положительного заряда пептида, а не к получению пептида с сильно отрицательным зарядом. Для in vivo доставки почти нейтральные пептиды доставки являются предпочтительными.
Конъюгат полинуклеотида РНКи
Изобретатели настоящего изобретения обнаружили, что конъюгация полинуклеотида РНКи с нацеливающей полинуклеотид группой, содержащей либо гидрофобную группу, либо галактозный кластер, и совместное введение указанного конъюгата полинуклеотида РНКи с пептидом доставки, описанным выше, обеспечивает эффективную функциональную доставку полинуклеотида РНКи в клетки печени, в частности, гепатоциты, in vivo. Под термином «функциональная доставка» подразумевается, что полинуклеотид РНКи доставляется в клетку и обладает ожидаемой биологической активностью, последовательность-специфическим подавлением экспрессии гена. Многие молекулы, включая полинуклеотиды, вводимые в сосудистую систему млекопитающего обычно выводятся из тела печенью. Выведение полинуклеотида печенью, где указанный полинуклеотид разрушается или перерабатывается другим образом для его удаления из тела, и где указанный полинуклеотид не вызывает последовательность-специфического подавления экспрессии гена, не считается функциональной доставкой.
Конъюгат полинуклеотида РНКи образуется путем ковалентного связывания полинуклеотида РНКи с нацеливающей полинуклеотид группой. Полинуклеотид синтезируют или модифицируют таким образом, что он содержит реактивную группу А.
Нацеливающая группа также синтезируют или модифицируют таким образом, что он содержит реактивную группу В. Реактивные группы А и В выбраны таким образом, что они могут быть связаны через ковалентную связь с использованием методов, известных в данной области техники.
Нацеливающая группа может быть связана с 3’- или 5’-концом полинуклеотида РНКи. В случае полинуклеотидов миРНК нацеливающая грцппа может быть связана со смысловой или антисмысловой нитью, хотя смысловая нить является предпочтительной.
Согласно одному варианту реализации изобретения группа, нацеливающая полинуклеотид, состоит из гидрофобной группы. Более конкретно, группа, нацеливающая полинуклеотид, состоит из гидрофобной группы, содержащей по меньшей мере 20 атомов углерода. Гидрофобные группы, используемые в качестве нацеливающих полинуклеотид групп в настоящей заявке называются гидрофобными нацеливающими группами. Примеры подходящих гидрофобных групп могут быть выбраны из группы, включающей: холестерин, дихолестерин, токоферол, дитокоферол, дидецил, дидодецил, диоктадецил, дидодецил, диоктадецил, изопреноид и холеамид. Гидрофобные группы, содержащие 6 или меньше атомов углерода, не являются эффективными в качестве нацеливающих полинуклеотид групп, тогда как гидрофобные группы, содержащие от 8 до 18 атомов углерода, обеспечивают повышение эффективности доставки полинуклеотида с повышением размера гидрофобной группы (т.е. повышением числа атомов углерода). Присоединение гидрофобной нацеливающей группы к полинуклеотиду РНКи не обеспечивает эффективную функциональную in vivo доставку полинуклеотида РНКи в отсутствие совместного введения пептида доставки. Несмотря на то, что другими авторами было описано, что конъюгаты миРНК-холестерин доставляют миРНК (миРНК-холестерин) в клетки печени in vivo в отсутствие любых дополнительных носителей для доставки, требуются высокие концентрации миРНК, и наблюдается низкая эффективность доставки. При комбинации с пептидами доставки, описанными в настоящей заявке, наблюдается значительное улучшение доставки полинуклеотида. При обеспечении конъюгата миРНК-холестерин вместе с пептидом доставки согласно изобретению эффективность указанного конъюгата миРНК-холестерин повышается примерно в 100 раз.
Гидрофобные группы, применимые в качестве нацеливающих полинуклеотид групп, могут быть выбраны из группы, состоящей из: алкильной группы, алкенильной группы, алкинильной группы, арильной группы, аралкильной группы, аралкенильной группы и аралкинильной группы, каждая из которых может быть прямой, разветвленной или циклической, холестерина, производного холестерина, стерина, стероида и стероидного производного. Гидрофобные нацеливающие группы предпочтительно представляют собой углеводороды, содержащие только атомы углерода и водорода. Однако возможно наличие заместителей или гетероатомов, которые поддерживают гидрофобность, например, фтора. Гидрофобная нацеливающая группа может быть присоединена к 3’- или 5’-концу полинуклеотида РНКи с использованием методов, известных в данной области техники. Для полинуклеотидов РНКи, содержащих 2 нити, таких как миРНК, гидрофобная группа может быть присоединена к любой из указанных нитей.
Согласно другому варианту реализации изобретения группа, нацеливающая полинуклеотид, содержит галактозный кластер (нацеливающая группа на основе галактозного кластера). В настоящей заявке галактозный кластер включает молекулу, содержащую от двух до четырех концевых производных галактозы. В настоящей заявке термин производное галактозы включает как галактозу, так и производные галактозы, обладающие аффинностью к рецептору асиалогликопротеина, равной или большей по сравнению с аффинностью галактозы. Концевое производное галактозы присоединено к молекуле через ее С-1 атом углерода. Рецептор асиалогликопротеина (ASGPr) является уникальным для гепатоцитов и связывает разветвленные гликопротеины с концевыми остатками галактозы. Предпочтительный галактозный кластер содержит три концевых галактозамина или производных галактозамина, каждый из которых обладает аффинностью к рецептору асиалогликопротеина. Более предпочтительный галактозный кластер содержит три концевых N-ацетилгалактозамина. Другие термины общепринятые в данной области техники, включают галактозу, содержащую три ветви, трехвалентную галактозу и тример галактозы. Известно, что кластеры производных галактозы, имеющие три ветви, связываются с ASGPr с более высокой аффинностью, чем со структурами производных галактозы, содержащих две ветви или одну ветвь (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connolly et ah, 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Мультивалентность необходима для достижения наномолярной аффинности. Присоединение одного производного галактозы, имеющего аффинность к рецептору асиалогликопротеина, не обеспечивает функциональную доставку полинуклеотида РНКи в гепатоциты in vivo при совместном введении с пептидом доставки.
Figure 00000016
Галактозный кластер содержит три производных галактозы, каждое из которых связано с центральной точкой ветвления. Производные галактозы присоединены к центральной точке ветвления через атомы углерода сахаридов С-1. Производное галактозы предпочтительно связано с точкой ветвления через линкеры или спейсеры. Предпочтительный спейсер представляет собой подвижный гидрофильный спейсер (патент США 5885968; Biessen et al. J. Med. Chem. 1995, Vol.39, p.1538-1546). Предпочтительный подвижный гидрофильный спейсер представляет собой PEG-спейсер. Предпочтительный PEG-спейсер представляет собой PEG3-спейсер. Точка ветвления может представлять собой любую малую молекулу, которая допускает присоединение трех производных галактозы и также допускает присоединение указанной точки ветвления к полинуклеотиду РНКи. Пример группы точки ветвления представляет собой ди-лизин. Молекула ди-лизина содержит три аминогруппы, через которые могут быть присоединены три производных галактозы, и карбоксильную реактивную группу, через которую ди-лизин может присоединяться к полинуклеотиду РНКи. Присоединение точкой ветвления к полинуклеотиду РНКи может происходить через линкер или спейсер. Предпочтительный спейсер представляет собой подвижный гидрофильный спейсер. Предпочтительный подвижный гидрофильный спейсер представляет собой PEG-спейсер. Предпочтительный PEG-спейсер представляет собой PEG3-спейсер (три этиленовые единицы). Галактозный кластер может быть присоединен к 3’- или 5’-концу полинуклеотида РНКи с использованием методов, известных в данной области техники. В случае полинуклеотидов РНКи, содержащих 2 нити, таких как миРНК, Галактозный кластер может быть присоединен к любой из указанных нитей.
Предпочтительное производное галактозы представляет собой N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Другие сахариды, обладающие аффинностью к рецептору асиалогликопротеина, могут быть выбраны из перечня, включающего: галактозу, галактозамин, N-формилгалактозамин, N-ацетилгалактозамин, N-пропионилгалактозамин, N-н-бутаноилгалактозамин и N-изо-бутаноилгалактозамин. Аффинность многочисленных производных галактозы к рецептору асиалогликопротеина была исследована (см., например: Iobst, S.T. abd Drickamer, K. J.B.С. 1996, 277, 6686), или ее с легкостью можно определить с использованием типичных методов, известных в данной области техники.
Figure 00000017
Один вариант реализации галактозного кластера
Figure 00000018
Галактозный кластер с PEG-спейсером между точкой ветвления и нуклеиновой кислотой
Термин полинуклеотид или нуклеиновая кислота или полинуклеиновая кислота представляет собой специальный термин, который относится к полимеру, содержащему по меньшей мере два нуклеотида. Нуклеотиды представляют собой мономерные единицы полинуклеотидных полимеров. Полинуклеотиды, содержащие менее 120 мономерных единиц, часто называют олигонуклеотидами. Природные нуклеиновые кислоты имеют дезоксирибозо- или рибозофосфатный скелет.Неприродные или синтетические полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды, которые были полимеризованы in vitro или в бесклеточной системе и содержат такие же или подобные основания, но могут иметь скелет, отличный от природного рибозо- или дезоксирибозофосфатного скелета. Полинуклеотиды можно синтезировать с использованием любого метода, известного в данной области техники. Полинуклеотидные скелеты, известные в данной области техники включают: ПНК (пептидонуклеиновые кислоты), фосфоротиоаты, фосфородиамидаты, морфолины и другие варианты фосфатного скелета нативных нуклеиновых кислот. Основания включают пурины и пиримидины, которые также включают природные соединения аденин, тимин, гуанин, цитозин, урацил, инозин и природные аналоги. Синтетические производные пуринов и пиримидинов включают, но не ограничиваются указанными, модификации, в результате которых к нуклеотиду присоединяют новые реактивные группы, включая, но не ограничиваясь указанными, амины, спирты, тиолы, карбоксилаты и алкилгалогениды. Термин «основание» включает любые из известных аналогов оснований ДНК и РНК. Полинуклеотид может включать рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, синтетические нуклеотиды или любую подходящую комбинацию. Полинуклеотиды могут быть полимеризованы in vitro, могут являться рекомбинантными, содержать гибридные последовательности или производные указанных групп. Полинуклеотид может содержать концевой копирующий фрагмент на 5’-конце, 3’-конце или на обоих, 5’- и 3’-, концах. Кэпирующий фрагмент может представлять собой, но не ограничивается указанными, инвертированный дезоксифрагмент, лишенный азотистого основания, инвертированный дезокситимидиновый фрагмент, тимидиновый фрагмент или 3’-глицерильную модификацию.
Полинуклеотид интерферирующей РНК (РНКи) представляет собой молекулу, способную индуцировать РНК-интерференцию путем взаимодействия с системой пути РНК-интерференции клеток млекопитающих для разрушения или ингибирования трансляции транскриптов информационной РНК (иРНК) трансгена последовательность-специфичным образом. Два первичных полинуклеотида РНКи представляют собой малые (или короткие) интерферирующие РНК (миРНК) и микро РНК (микроРНК). Полинуклеотиды РНКи могут быть выбраны из группы, включающей: миРНК, микроРНК, двунитевую РНК (днРНК), короткую РНК, образующую «шпильку», (РНК-шпилька) и кассеты экспрессии, кодирующие РНК, способные вызывать РНК-интерференцию. миРНК имеет двунитевую структуру, как правило, включающую 15-50 пар оснований и предпочтительно 21-25 пар оснований и содержащую последовательность нуклеотидов, идентичную (абсолютно комплементарную) или почти идентичную (частично комплементарную) кодирующей последовательности в экспрессируемом гене-мишени или РНК в клетке. миРНК может содержать динуклеотидные 3’-«липкие концы». миРНК может состоять из двух гибридизованных полинуклеотидов или одного полинуклеотида, который образует структуру «шпильки». Молекула миРНК согласно изобретению содержит смысловой участок и антисмысловой участок. Согласно одному варианту реализации изобретения миРНК-конъюгат состоит из двух олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент содержит нуклеотидную последовательность антисмысловой нити молекулы миРНК, и второй фрагмент содержит нуклеотидную последовательность смыслового участка молекулы миРНК. Согласно другому варианту реализации изобретения смысловая нить связана с антисмысловой нитью через линкерную молекулу, такую как полинуклеотидный линкер или не нуклеотидный линкер. Микро РНК (микроРНК) представляют собой генные продукты - малые некодирующие РНК, содержащие примерно 22 нуклеотида в длину, которые направлены на разрушение или подавление трансляции их иРНК-мишеней. Если комплементарность между микроРНК и иРНК-мишенью является частичной, то трансляция иРНК-мишени подавляется. Если комплементарность высокая, то иРНК-мишень расщепляется. В случае микроРНК комплекс связывается с сайтами-мишенями, обычно расположенными в 3' UTR иРНК, которые, как правило, имеют только частичную гомологию с микроРНК. «Seed»-область - участок, состоящий примерно из (7) следующих друг за другом нуклеотидов на 5'-конце микроРНК, в котором наблюдается абсолютное спаривание оснований с его мишенью - играет ключевую роль в специфичности микроРНК. Связывание комплекса RISC/микроРНК с иРНК может приводить либо к подавлению трансляции белка, либо к расщеплению и деградации иРНК. Недавно полученные данные указывают на то, что расщепление иРНК происходит преимущественно в том случае, если существует абсолютная гомология по всей длине микроРНК с ее мишенью, а не точное спаривание оснований только в «seed»-области (Pillai et al. 2007).
Кассеты экспрессии полинуклеотида РНКи могут транскрибироваться в клетке с получением малых РНК-«шпилек», которые могут функционировать как миРНК, отдельная смысловая и антисмысловая нить линейной миРНК или микроРНК. Транскрибируемая РНК-полимеразой III ДНК содержит промоторы, выбранные из перечня, включающего: U6-промоторы, H1-промоторы и тРНК-промоторы. Промоторы РНК-полимеразы II включают промоторы U1, U2, U4 и U5, промоторы РНК-«шпильки», промоторы микроРНК и промоторы иРНК.
Перечни известных последовательностей микроРНК можно найти в базах данных, которые поддерживаются исследовательскими организациями, такими как Институт Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute), Центр биоинформатики Пенна (Penn Center for Bioinformatics), Мемориальный онкологический центр им. Слоуна-Кеттеринга (Memorial Sloan Kettering Cancer Center), и Европейская молекулярно-биологическая лаборатория (European Молекулу Biology Laboratory) и другие. Известные эффективные последовательности миРНК и распознаваемые сайты связывания также хорошо представлены в соответствующей литературе. Молекулы РНКи легко конструируют и получают с помощью методов, известных в данной области техники. Кроме того, существуют автоматические инструменты, помогающие найти эффективные и специфические мотивы последовательностей (Pei et al., 2006, Reynolds et al., 2004, Khvorova et al., 2003, Schwarz et al., 2003, Ui-Tei et al., 2004, Heale et al., 2005, Chalk et al., 2004, Amarzguioui et al., 2004).
Полинуклеотиды согласно изобретению могут быть химически модифицированными. Не ограничивающие примеры указанных химических модификаций включают: включение фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, 2'-O-метилрибонуклеотидов, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотидов, 2'-дезоксирибонуклеотидов, нукеотидов с «универсальными основаниями», 5-С-метилнуклеотидов и инвертированного лишенного азотистого основания дезокси-остатка. Показано, что указанные химические модификации при использовании в различных конструкциях полинуклеотидов ингибируют активность полинуклеотида в клетках, в то же время повышая сывороточную стабильность указанных соединений. Химически модифицированные миРНК также могут минимизировать вероятность активации интерферона у людей.
Согласно одному варианту реализации изобретения химически модифицированный полинуклеотид РНКи согласно изобретению содержит дуплекс, включающий две нити, одна или обе из которых могут быть химически модифицированными, где каждая нить содержит от примерно 19 до примерно 29 нуклеотидов. Согласно одному варианту реализации изобретения полинуклеотид РНКи согласно изобретению содержит один или более модифицированных нуклеотидов с сохранением способности опосредовать РНК интерференцию внутри клетки или в воспроизведенной системе in vitro. Полинуклеотид РНКи может быть модифицирован, причем химически модифицированным может быть один или более (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов. Полинуклеотид РНКи согласно изобретению может содержать модифицированные нуклеотиды как процент от общего числа нуклеотидов, присутствующих в полинуклеотиде РНКи. В таком случае полинуклеотид РНКи согласно изобретению может в общем содержать модифицированные нуклеотиды в от примерно 5 до примерно 100% положений нуклеотида (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% положений нуклеотида). Действительный процент модифицированных нуклеотидов, присутствующих в конкретном полинуклеотиде РНКи зависит от общего числа нуклеотидов, присутствующих в полинуклеотиде РНКи. Если полинуклеотид РНКи является однонитевым, то процентная модификация может быть основана на общем числе нуклеотидов, присутствующих в указанном однонитевом полинуклеотиде РНКи. Подобным образом, если полинуклеотид РНКи является двунитевым, то процентная модификация может быть основана на общем числе нуклеотидов, присутствующих в смысловой нити, антисмысловой нити или в смысловой и антисмысловой нитях. Кроме того, действительный процент модифицированных нуклеотидов, присутствующих в конкретном полинуклеотиде РНКи, также может зависеть от общего числа пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в полинуклеотиде РНКи. Например, когда все пиримидиновые нуклеотиды и/или все пуриновые нуклеотиды, присутствующие в полинуклеотиде РНКи, являются модифицированными.
Полинуклеотид РНКи модулирует экспрессию РНК, кодируемой геном. Поскольку множество генов могут иметь некоторую степень гомологии по последовательности друг с другом, может быть сконструирован полинуклеотид РНКи, направленный на класс генов с достаточной гомологией по последовательности. Таким образом, полинуклеотид РНКи может содержать последовательность, которая имеет комплементарность с последовательностями, которые содержатся в различных генах-мишенях, или которые являются уникальными для специфического гена-мишени. Таким образом, может быть сконструирован полинуклеотид РНКи, направленный на консервативные участки последовательности РНК, по которой различные гены имеют гомологию, таким образом, направленный на несколько генов в семействе генов (например, различные изоформы генов, сплайс-варианты, мутантные гены и т.д.). Согласно другому варианту реализации изобретения может быть сконструирован полинуклеотид РНКи, направленный на последовательность, которая является уникальной для специфической последовательности РНК одного гена.
Термин «комплементарность» относится к способности полинуклеотида образовывать водородную связь (связи) с другой полинуклеотидной последовательностью либо по классическому уотсон-криковскому типу, либо по неклассическим типам. В случае молекул полинуклеотида согласно настоящему изобретению свободная энергия связывания молекулы полинуклеотида с ее мишенью (эффекторный сайт связывания) или комплементарной последовательностью является достаточной для возможности поддержания соответствующей функции полинуклеотида, например, ферментативного расщепления иРНК или ингибирования трансляции. Способы определение свободных энергий связывания для молекул нуклеиновой кислоты хорошо известно в данной области техники (Frier et al. 1986, Turner et al. 1987). Процентная комплементарность указывает на процент оснований в непрерывной цепи первой молекулы полинуклеотида, которые могут формировать водородные связи (например, по типу спаривания оснований Уотсона-Крика) со второй последовательностью полинуклеотида (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 являются на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100% комплементарными). Абсолютная комплементарность означает, что все основания непрерывной цепи последовательности полинуклеотида образуют водородные связи с таким же числом следующих друг за другом оснований во второй последовательности полинуклеотида.
Под терминами ингибировать, подавлять или снижать экспрессию гена подразумевается, что экспрессия гена, измеренная по уровню РНК, транскрибируемой с указанного гена, или по уровню полипептида, белка или субъединицы белка, транслируемой с указанной РНК, снижается ниже уровня, наблюдаемого в отсутствие ингибирующего конъюгата полинуклеотида согласно изобретению. В результате ингибирования, подавления или снижения экспрессии гена с использованием полинуклеотида, который доставляется с помощью композиций согласно изобретению, уровень экспрессии предпочтительно ниже уровня, наблюдаемого в присутствии контрольной неактивной нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты с зашифрованной последовательностью или приводящими к инактивации ошибками или в отсутствие конъюгации полинуклеотида с маскированным полимером.
In vivo введение
В фармакологии и токсикологии способ введения представляет собой путь, по которому лекарственное средство, жидкость, яд или другое вещество приводят во взаимодействие с телом организма. В целом, способы введения лекарственных средств и нуклеиновых кислот для лечения млекопитающих хорошо известны в данной области техники и могут применяться для введения композиций согласно изобретению. Соединения согласно настоящему изобретению могут вводиться с помощью любого подходящего способа, наиболее предпочтительно, парентерально, в композиции, соответствующим образом адаптированной для указанного способа. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить путем инъекции, например, внутривенной, внутримышечной, внутрикожной, подкожной или внутрибрюшинной. Соответственно, согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Парентеральные пути введения включают внутрисосудистые (внутривенные, внутриартериальные), внутримышечные, интрапаренхиматозные, внутридермальные, субдермальные, подкожные, внутриопухолевые, внутрибрюшинные, интратекальные, субдуральные, эпидуральные и внутрилимфатические инъекции, для осуществления которых используют шприц и иглу или катетер. «Внутрисосудистый», В настоящей заявке относится к трубчатой структуре, называемой сосудом, которая связана с тканью или органом внутри тела организма. В полости указанной трубчатой структуры биологическая жидкость течет в направлении к части тела или от нее. Примеры биологических жидкостей включают кровь, спинномозговую жидкость (СМЖ), лимфу или желчь. Примеры сосудов включают артерии, артериолы, капилляры, венулы, синусоидные капилляры, вены, лимфатические сосуды, желчные протоки и протоки слюнных или других экзокринных желез. Внутрисосудистый способ включает доставку через кровеносные сосуды, такие как артерия или вена. Кровеносная система обеспечивает системное распространение фармацевтического средства.
Описанные композиции вводят в фармацевтически приемлемых растворах носителя. Термин «фармацевтически приемлемый» относится к таким свойствам и/или веществам, которые приемлемы для млекопитающего с фармакологической/токсикологической точки зрения. Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным субстанциям, композициям и свойствам, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, не вызывают аллергической реакции или других нежелательных или токсических реакций при введении млекопитающему. Предпочтительно, В настоящей заявке термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим федеральным органом или государственным правительством или приведенный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у человека.
Конъюгат полинуклеотид РНКи-нацеливающая группа вводят совместно с пептидом доставки. Совместное введение означает, что полинуклеотид РНКи и пептид доставки вводят млекопитающему таким образом, что они присутствуют в теле млекопитающего в одно и тоже время. Конъюгат олигонуклеотид РНКи-нацеливающая группа и пептид доставки можно вводить одновременно, или они могут доставляться последовательно. Для одновременного введения их можно смешивать до введения. Для последовательного введения первым можно вводить конъюгат полинуклеотид РНКи-нацеливающая группа или пептид доставки.
В случае конъюгатов полинуклеотид РНКи-гидрофобная нацеливающая группа конъюгат РНКи можно вводить за 30 минут до введения пептида доставки. Также в случае конъюгатов полинуклеотид РНКи-гидрофобная нацеливающая группа пептид доставки можно вводить за два часа до введения конъюгата РНКи.
В случае конъюгатов полинуклеотид РНКи-нацеливающая группа на основе галактозного кластера конъюгат РНКи можно вводить за 15 минут до введения пептида доставки. Также для конъюгатов полинуклеотид РНКи-нацеливающая группа на основе галактозного кластера пептид доставки можно вводить за 15 минут до введения конъюгата РНКи.
Терапевтический эффект
Полинуклеотиды РНКи можно доставлять в исследовательских целях или для достижения изменения в клетке, которое является терапевтическим. In vivo доставка полинуклеотидов РНКи применима для реагентов исследований и для различных терапевтических, диагностических целей, для подтверждения мишени, исследования генома, генной инженерии и фармакогеномного применения. Авторы настоящего изобретения описали доставку полинуклеотида РНКи, приводящую к подавлению эндогенной экспрессии гена в гепатоцитах. Уровень экспрессии репортерного (маркерного) гена, измеренной после доставки полинуклеотида, дает достаточные основания ожидать близкие значения уровня экспрессии гена после доставки других полинуклеотидов. Уровень после проведения лечения, который считается благоприятным специалистами в данной области техники, различается в зависимости от заболевания. Например, гемофилия А и гемофилия В вызваны дефицитом Х-связанных факторов свертывания VIII и IX, соответственно. На течение указанных болезней сильно влияет доля фактора VIII или IX в сыворотке от нормального уровня: <2%, тяжелая; 2-5%, средней тяжести; и 5-30%, легкая форма. Таким образом, повышение уровня на 1%-2% от нормального уровня циркулирующего фактора у пациентов с тяжелой формой гемофилией может считаться благоприятным. Уровень более 6% приводит к предотвращению спонтанных кровотечений, но не вторичных по отношению к хирургическому вмешательству или повреждению кровотечений. Подобным образом, подавление гена не должно быть 100% для обеспечения терапевтического благоприятного эффекта. Специалист в области генной терапии сможет обоснованно прогнозировать благоприятный уровень экспрессии гена, специфичного для конкретного заболевания, на основе результатов достаточного уровня маркерного гена. В случае гемофилии, если уровень экспрессии маркерных генов с получением белка сравним по объему с 2% от нормального уровня фактора VIII, то имеются достаточные основания ожидать, что ген, кодирующий фактор VIII, также будет экспрессироваться на подобном уровне. Таким образом, репортерные или маркерные гены служат для получения полезного представления об экспрессии внутриклеточных белков в общем.
Печень представляет собой одну из наиболее важных тканей-мишеней для генной терапии, учитывая ее центральную роль в метаболизме (например, метаболизме липопротеинов при различных гиперхолестеринемиях) и секреции циркулирующих белков (например, факторов свертывания крови при гемофилии). Кроме того, распространены приобретенные нарушения, такие как хронический гепатит (например, вирусная инфекция гепатита В) и цирроз, которые также потенциально можно лечить с помощью терапевтического лечения печени на основе полинуклеотидов. Ряд заболеваний или состояний, оказывающие влияние на печень или находящиеся под влиянием печени, потенциально можно лечить путем снижения (подавления) экспрессии гена в печени. Такие заболевания и состояния печени могут быть выбраны из перечня, включающего: рак печени (включая гепатоклеточную карциному, НСС), вирусные инфекции (включая гепатит), метаболические нарушения, (включая гиперлипидемию и диабет), фиброз и острые повреждения печени.
Количество (доза) пептида доставки и конъюгата РНКи-полинуклеотид, которое предполагается вводить, можно определить эмпирическим путем. Авторы показали эффективное снижение экспрессии гена с использованием миРНК-конъюгата в концентрации 0,1-10 мг/кг массы тела животного и пептида доставки в концентрации 5-60 мг/кг массы тела животного. Предпочтительная концентрация для мышей миРНК-конъюгата составляет 0,25-2,5 мг/кг, и пептида доставки - 10-40 мг/кг. Более предпочтительно, пептид доставки вводят в концентрации примерно 12,5-20 мг/кг. Количество конъюгата РНКи-полинуклеотид можно с легкостью увеличивать, так как указанный конъюгат, как правило, не проявляет токсичности в более высоких дозах.
В настоящей заявке «in vivo» означает происходящий внутри организма, и более конкретно, относится к процессу, который осуществляется в живой ткани или на живой ткани целого живого многоклеточного организма (животного), такого как млекопитающее, в отличие от части организма или мертвого организма.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Синтез мелитина.
Все пептиды мелитина получали с использованием стандартных методов синтеза пептидов, известных в данной области техники. Подходящие пептиды мелитина могут состоять из аминокислот только в L-форме, аминокислот только в D-форме (инвертированные). Независимо от формы аминокислот, L- или D-формы, последовательность пептида мелитина может быть обратной (ретро).
Пример 2. Модификация мелитина.
Модификация производных мелитина по амино-концу. Готовили растворы CKLK-мелитин (20 мг/мл), ТСЕР-HCl (28,7 мг/мл, 100 мМ) и MES-Na (21,7 мг/мл, 100 мМ) в dH2O. В пробирке для сцинтилляционного анализа на 20 мл проводили реакцию между смесью CKLK-Мелитин (0,030 ммоль, 5 мл) и ТСЕР-HCl (1,7 молярных эквивалентов, 0,051 ммоль, 0,51 мл) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем добавляли MES-Na (2 мл) и воду (1,88 мл) в количестве, достаточном для получения конечных концентраций 10 мг/мл Мелитина и 20 мМ MES-Na. Значение рН проверяли и доводили до рН 6,5-7. Готовили раствор NAG-PEG2-Br (100 мг/мл) в dH2O. Добавляли NAG-PEG2-Br (4,75 экв., 0,142 ммоль, 0,61 мл) и раствор оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 48 часов.
Альтернативно, в пробирке для сцинтилляционного анализа на 20 мл проводили реакцию между Cys-мелитином (0,006 ммоль, 1 мл) и ТСЕР-HCl (1,7 молярных эквивалентов, 0,010 ммоль, 100 мкл) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавляли MES-Na (400 мкл) и воду (390 мкл) в количестве, достаточном для получения конечных концентраций 10 мг/мл Мелитина и 20 мМ MES-Na. Значение рН проверяли и доводили до рН 6,5-7. Готовили раствор NAG-PEG8-Малеимид (100 мг/мл) в dH2O. Добавляли NAG-PEG8-Малеимид (2 экв., 0,012 ммоль, 110 мкл) и раствор оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 48 часов.
Образцы очищали на колонке Luna (10 мкм, С18 100Å 21,2×250 мм). Буфер А: H2O 0,1% ТФУ, и Буфер В: MeCN, 10% Изопропиловый спирт, 0,1% ТФУ. Скорость потока 15 мл/мин., от 35% А до 62,5% B в течение 20 мин.
Другие модификации по амино-концу осуществляли с использованием такого же способа. Модификации по карбокси-концу осуществляли с использованием пептидов мелитина, содержащих карбокси-концевые цистеины, вместо пептидов мелитина, содержащих амино-концевые цистеины.
Соединения, которые использовали для модификации Cys-мелитина или мелитина-Cys:
Figure 00000019
N представляет собой целое число от 1 до 120 (молекулярная масса PEG до примерно 5 кДа)
Figure 00000020
Figure 00000021
Пептиды, имеющие ацетил-, диметил- стеароил-, миристоил- и PEG-модификации амино- или карбокси-конца, но не концевых цистеиновых остатков, синтезировали на смоле в процессе синтеза пептидов с использованием типичных методов, известных в данной области техники.
Пример 3. Синтез маскирующих агентов.
А. рН-лабильные маскирующие агенты: Синтез пространственного стабилизатора CDM-PEG и направляющей группы CDM-NAG (N-ацетилгалактозамин). К раствору карбоксидиметилмалеинового ангидрида (CDM, 300 мг, 0,16 ммоль) в 50 мл метиленхлорида добавляли оксалилхлорид (2 г, 10 масс. экв.) и диметилформамид (5 мкл). Реакции позволяли продолжаться в течение ночи, после чего удаляли избыток оксалилхлорида и метиленхлорида посредством ротационного выпаривания с получением хлорангидрида CDM. Указанный хлорангидрид растворяли в 1 мл метиленхлорида. К указанному раствору добавляли 1,1 молярных эквивалентов монометилового эфира полиэтиленгликоля (средняя молекулярная масса MW=550) для получения CDM-PEG или (аминоэтокси)этокси-2-(ацетиламино)-2-дезокси-β-D-галактопиранозид (т.е. аминобисэтоксилэтил NAG) для получения CDM-NAG и пиридин (200 мкл, 1,5 экв.) в 10 мл метиленхлорида. Затем раствор перемешивали в течение 1,5 часов. После этого растворитель удаляли и полученное твердое вещество растворяли в 5 мл воды и очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием градиента 0,1% ТФУ в воде/ацетонитрил.
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Типичный маскирующий агент, представляющий собой дизамещенный малеиновый ангидрид, R1 содержит нейтральный лиганд ASGPr. Предпочтительно маскирующий агент является незаряженным.
Figure 00000025
R представляет собой метил или этил, и n представляет собой целое число от 2 до 100. Предпочтительно PEG содержит от 5 до 20 этиленовых звеньев (n представляет собой целое число от 5 до 20). Более предпочтительно, PEG содержит 10-14 этиленовых звеньев (n представляет собой целое число от 10 до 14). PEG может иметь различную длину, и средняя длина составляет 5-20 или 10-14 этиленовых звеньев. Альтернативно, PEG может иметь монодисперсную, гомогенную или дискретную структуру; содержать, например, ровно 11 или 13 этиленовых звеньев.
Figure 00000026
N представляет собой целое число от 1 до 10. Как показано выше, PEG-спейсер может быть расположен между ангидридной группой и лигандом ASGPr. Предпочтительно PEG-спейсер содержит 1-10 этиленовых звеньев.
Альтернативно, может использоваться алкильный спейсер между ангидридом и N-ацетилгалактозамином.
Figure 00000027
n представляет собой целое число от 0 до 6.
Могут использоваться другие спейсеры или линкеры между ангидридом и N-ацетилгалактозамином. Однако гидрофильный нейтральный (предпочтительно незаряженный) спейсер или линкер является предпочтительным.
В. Поддающиеся расщеплению протеазами (пептидазами) маскирующие агенты. Пептид мелитина также может быть обратимо модифицирован с использованием специальных поддающихся ферментативному расщеплению линкеров. В указанных поддающихся ферментативному расщеплению линкерах используется дипептид, связанный с активированным амидобензилом карбонатным фрагментом. Реакция активированного карбоната с амином пептида приводи к связыванию направленного соединения, такого как лиганд рецептора асиалогликопротеина, с пептидом мелитина через поддающуюся расщеплению пептидазой дипептид-амидобензилкарбаматную связь. Ферментативное расщепление дипептида приводит к отделению нацеливающего лиганда от пептида и инициирует реакцию элиминации, приводящую к восстановлению амина пептида. Синтезировали следующие поддающиеся ферментативному расщеплению линкеры:
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Показаны дипептиды Glu-Gly, Ala-Cit, Phe-Cit ("Cit" представляет собой аминокислоту цитруллин). Допустимы другие комбинации аминокислот. Кроме того, 3-5 аминокислот могут использоваться в качестве линкера между амидобензильной группой и нацеливающим лигандом. Также другие активированные карбонаты, известные в данной области техники, легко можно использовать вместо пара-нитрофенола, используемого в указанных выше соединениях.
Пример 4. Обратимая модификация/маскирование мелитина.
А. Модификация маскирующими агентами на основе малеинового ангидрида. До проведения модификации 5× мг маскирующего агента, содержащего дизамещенный малеиновый ангидрид (например, CDM-NAG) лиофилизировали из 0,1% водного раствора ледяной уксусной кислоты. К высушенному указанному маскирующему агенту, содержащему дизамещенный малеиновый ангидрид, добавляли раствор × мг мелитина в 0,2× мл изотонической глюкозы и 10× мг свободного основания HEPES. После полного растворения ангидрида полученный раствор инкубировали в течение по меньшей мере 30 мин при комнатной температуре до его введения животному. В результате реакции маскирующего агента, содержащего дизамещенный малеиновый ангидрид, с пептидом получали:
Figure 00000032
где R представляет собой мелитин, и R1 содержит лиганд ASGPr (например, NAG). Карбоксил-ангидрид, образованный в ходе реакции между ангидридом и полимерным амином, обладает ~1/20 ожидаемого заряда (Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003). Следовательно, мембраноактивный полимер эффективно нейтрализован, а не превращен в сильно отрицательно заряженный полианион.
В. Модификация с помощью поддающихся расщеплению протеазами маскирующих агентов. 1× мг пептида и 10× мг основания HEPES в концентрации 1-10 мг/мл пептида маскировали путем добавления 2-6× мг амино-реактивных n-нитрофенилкарбонатных или N-гидроксисукцинимидкарбонатных производных NAG-содержащего поддающегося расщеплению протеазами субстрата. Затем раствор инкубировали по меньшей мере в течение 1 часа при комнатной температуре (RT) до введения животным.
Пример 5. миРНК.
миРНК имеют следующие последовательности:
Фактор VII - грызун
смысловая: (Chol)-5' GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT) 3' (Seq. ID 97)
антисмысловая: 5' pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT 3' (Seq. ID 98) или
смысловая 5' GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT 3' (Seq. ID 99)
антисмысловая 5' GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT 3' (Seq. ID 100)
Фактор VII = примат
Смысловая (chol)-5' uuAGGfuUfgGfuGfaAfiiGfgAfgCfuCfaGf(invdT) 3' (Seq. ID 101)
Антисмысловая 5' pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT 3' (Seq. ID 102)
АроВ миРНК:
смысловая (cholC6SSC6)-5' GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA 3' (Seq. ID 103)
антисмысловая 5' uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU 3' (Seq. ID 104)
siLUC
смысловая (chol) 5'-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3' (Seq. ID 105)
антисмысловая 5'-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3' (Seq. ID 106)
строчные буквы = 2'-O-СН3 замена
s = фосфоротиоатная связь
f после нуклеотида=2'-F замена
d перед нуклеотидом=2'-дезокси
Синтез РНК осуществляли на твердофазном носителе с помощью стандартного фосфорамидитного метода на приборе AKTA Oligopilot 100 (GE Healthcare, Фрайбург, Германия) с использованием стекла с контролируемым размером пор (CPG) в качестве твердофазного носителя.
Пример 6. Конъюгаты миРНК-направленная молекула.
А. Синтез кластера GalNAc. Направленный на нуклеотид лиганд, содержащий кластер GalNAc, синтезировали, как описано в публикации патента США 20010207799.
Figure 00000033
В. Конъюгаты кластер GalNAc-миРНК. Кластер GalNAc Примера 6А, выше, конъюгировали с миРНК, как показано на Фиг.2, и как описано ниже.
(1) Соединение 1 (150 мг, 0,082 ммоль, Фиг.2) растворяли в сухом метаноле (5,5 мл) и добавляли 42 мкл метилата натрия (25% раствор в МеОН). Смесь перемешивали в атмосфере аргона в течение 2 часов при комнатной температуре. Добавляли равное количество метанола, а также порции анионообменного материала Amberlite IR-120 для достижения рН ~7,0. Материал Amberlite удаляли посредством фильтрования. Раствор сушили над Na2SO4 и растворитель удаляли при пониженном давлении. Соединение 2 получали с количественным выходом в виде белой пены. ТСХ (SiO2, дихлорметан (ДХМ)/МеОН 5:1+0,1% СН3СООН): Rf 2=0,03; для детектирующего раствора использовали серную кислоту (5%) в МеОН с последующим нагреванием. ИЭР-МС, прямой ввод, отрицательная ионизация; [М-Н]-1 рассчитано: 1452,7; [М-Н]1- измерено: 1452,5.
(2) Соединение 2 (20 мг, 0,014 ммоль. Фиг.2) выпаривали совместно с пиридином и дихлорметаном. Осадок растворяли в безводном диметилформамиде (ДМФА, 0,9 мл) и добавляли раствор N-гидроксисукцинимида (NHS) в ДМФА (1,6 мг, 0,014 ммоль) при перемешивании в атмосфере аргона. При 0°С медленно добавляли раствор N,N’-дициклогексилкарбодиимида (DCC) в ДМФА (3,2 мг, 0,016 ммоль). Реакции позволяли нагреваться до комнатной температуры и смесь перемешивали в течение ночи. Соединение 3 использовали без дополнительной очистки для конъюгации с РНК.
(3) Синтез амино-модифицированной РНК. РНК, содержащую С-6-амино-линкер на 5'-конце смысловой нити, получали с помощью стандартного фосфорамидитного метода на твердофазном носителе в объеме 1215 мкмоль с использованием прибора АКТА Oligopilot 100 (GE Healthcare, Фрайбург, Германия) и стекла с контролируемым размером пор в качестве твердофазного носителя. РНК, содержащую 2'-O-метилнуклеотиды, получали с использованием соответствующих фосфорамидитов, 2'-O-метилфосфорамидитов и ТФУ-гексиламинолинкер-амидита. Расщепление и удаление защитных групп, а также очистку проводили с помощью методов, известных в данной области техники (Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84).
Амино-модифицированную РНК характеризовали с помощью анионообменной ВЭЖХ (чистота: 96,1%) и идентичность подтверждали с помощью ИЭР-МС ([М+Н]1+ рассчитано: 6937,4; [М+Н]1+ измерено: 6939,0. Последовательность: 5'-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3'; u,c: 2'-O-метилнуклеотиды соответствующих оснований, s: фосфоротиоат.
(4) Конъюгация кластеров GalNAc с РНК. РНК (2,54 мкмоль), содержащую С-6 амино-линкер на 5'-конце, лиофилизировали и растворяли в 250 мкл буфера на основе бората натрия (0,1 моль/л бората натрия, рН 8,5, 0,1 моль/л KCl) и 1,1 мл ДМСО. После добавления 8 мкл N,N-диизопропилэтиламина (DIPEA) к раствору РНК медленно добавляли раствор соединения 3 (теор. 0,014 ммоль, Фиг.2) в ДМФА при непрерывном перемешивании. Реакционную смесь перемешивали при 35°С в течение ночи. За реакцией следили с помощью ОФ-ВЭЖХ (Resource RPC, 3 мл, буфер: А: 100 мМ ацетат триэтиламмония (ТЕАА, 2,0 М, рН 7,0) в воде. В: 100 мМ ТЕАА в 95% ацетонитриле, градиент: 5% В - 22% B в 20 CV). После осаждения РНК с использованием ацетата натрия (3 М) в EtOH при -20°С конъюгат РНК очищали с использованием условий, описанных выше. Чистые фракции объединяли и желаемое соединение, представляющее собой конъюгат 4, осаждали с использованием смеси ацетат натрия/ЕЮН с получением чистого конъюгата РНК. Конъюгат 4 выделяли с выходом 59% (1,50 мкмоль). Чистоту конъюгата 4 оценивали с помощью анионо-обменной ВЭЖХ (чистота: 85,5%) и идентичность подтверждали с помощью ИЭР-МС ([М+Н]1+ рассчитано: 8374,4; [М+Н]1+измерено: 8376,0.
(5) Конъюгат 4 (смысловую нить) гибридизовали с 2'-O-метил-модифицированной антисмысловой нитью. Конъюгат миРНК получали путем смешивания эквимолярного раствора комплементарных нитей в буфере для гибридизации (20 мМ фосфат натрия, рН 6,8; 100 мМ хлорид натрия), нагревали на водяной бане при 85-90°С в течение 3 мин. и охлаждали до комнатной температуры в течение 3-4 часов. Образование дуплексов подтверждали с помощью нативного гель-электрофореза.
C. Конъюгаты гидрофобная группа-миРНК.
(1) Конъюгация миРНК с алкилъными группами. Модифицированную 5'-С10-NHS-эфиром смысловую нить миРНК (NHSC10-миРНК или СОС9-миРНК) получали с использованием модификатора 5'-карбоксигруппы C10-амидита от компании Glen Research (Вирджиния, США). Активированную РНК, все еще присоединенную к твердому носителю, использовали для конъюгации с липофильными аминами, перечисленными в Таблице 1, ниже. 100 мг смысловой нити CPG (нагрузка 60 мкмоль/г, 0,6 мкмоль РНК) смешивали с 0,25 ммоль соответствующего амина, полученного из компании Sigma Aldrich Chemie GmbH (Тауфкирхен, Германия) или Fluka (Sigma-Aldrich, Бухс, Швейцария).
Таблица 1
Липофильные амины, используемые в образовании конъюгатов гидрофобная группа-миРНК
№ Липофильный амин мг ммоль растворитель
2 N-Гексиламин 25 0,25 1 мл CH2Cl2
3 Додециламин 50 0,25 0,55 мл CH3CN, 0,45 мл CH2Cl2
4 Октадециламин 67 0,25 1 мл CH2Cl2
5 Дидециламин 74 0,25 1 мл CH2Cl2
6 Дидодециламин 88 0,25 1 мл CH2Cl2
7 Диоктадециламин 67 0,12 0,45 мл CH2Cl2, 0,45 мл циклогексана
Смесь перемешивали в течение 18 часов при 40°С. РНК отщепляли от твердого носителя и защитные группы удаляли с помощью водного раствора гидроксида аммония (NH3, 33%) при 45°С в течение ночи. 2'-защитную группу удаляли с помощью ТЕА×3HF при 65°С в течение 3,5 часов. Неочищенные олигорибонуклеотиды очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ (Resource RPC, 3 мл, буфер: А: 100 мМ ТЕАА в воде. В: 100 мМ ТЕАА в 95% CH3CN, градиент: 3% В - 70% B в 15 CV, за исключением Nr 7: градиент от 3% В до 100% B в 15 CV).
Для получения миРНК но основе однонитевой РНК эквимолярные количества комплементарных смысловых и антисмысловых нитей смешивали в буфере для гибридизации (20 мМ фосфат натрия, рН 6,8; 100 мМ хлорид натрия), нагревали при 80°С в течение 3 мин. и охлаждали до комнатной температуры в течение 3-4 часов. миРНК, направленные против мРНК фактора VII, характеризовали с помощью гель-электрофореза.
(2) Конъюгация миРНК с холестерином - Конъюгаты миРНК-холестерин синтезировали с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Холестерин можно присоединять к 5'- или 3'-концу смысловой или антисмысловой нити миРНК. Предпочтительным является присоединение к 5'-концу смысловой нити миРНК. Конъюгат миРНК-холестерин также можно получать после синтеза миРНК с использованием нитей РНК, содержащих реактивную группу (например, тиол, амин или карбоксил) с помощью стандартных методов, известных в данной области техники.
In Vivo доставка миРНК
Пример 7. Введение полинуклеотидов РНКи in vivo и доставка в гепатоциты. Конъюгаты полинуклеотидов РНКи и маскированных пептидов мелитина синтезировали, как описано выше. Мыши шести-восьминедельного возраста (линия C57BL/6 или ICR, масса каждого животного ~18-20 г) были получены из компании Harlan Sprague Dawley (Индианаполис, Индиана). Мышей содержали по меньшей мере в течение 2 дней до инъекции. Животные имели неограниченный доступ к пище, представляющей собой корм для грызунов Harlan Teklad (Harlan, Мэдисон, Висконсин). Мышам инъецировали 0,2 мл раствора пептида доставки и 0,2 мл конъюгатов миРНК в хвостовую вену. В случае одновременного введения пептида доставки и миРНК конъюгат миРНК добавляли к модифицированному пептиду до инъекции и вводили общее количество. Композиция являлась растворимой и не агрегировала в физиологических условиях. Растворы вводили путем инфузии в хвостовую вену. Предполагается, что инъекции в другие сосуды, например, ретроорбитальная инъекция, являются настолько же эффективными.
Крысы Wistar Han массой 175-200 г были получены из компании Charles River (Уилмингтон, Массачусетс). Крыс содержали по меньшей мере в течение 1 недели до инъекции. Объем инъекции для крыс составлял, как правило, 1 мл.
Определения уровня АроВ в сыворотке. Мышей не кормили в течение 4 часов (16 ч для крыс) до забора сыворотки путем кровопускания из подчелюстной области. У крыс кровь собирали из яремной вены. Уровень белка АроВ в сыворотке определяли с помощью стандартных методов «сэндвич»-ИФА. Вкратце, поликлональные козьи анти-мышиные антитела к АроВ и кроличьи анти-мышиные антитела к АроВ (Biodesign International) использовали в качестве иммобилизированных и идентифицирующих антител, соответственно. После этого наносили конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи анти-кроличьи антитела IgG (Sigma) для связывания комплекса АроВ/антитело. Затем измеряли абсорбцию в ходе колориметрической реакции с тетраметилбензидином (ТМВ, Sigma) с помощью ридера для микропланшетов Tecan Safire2 (Австрия, Европа) при 450 нм.
Измерение активности плазматического Фактора VII (F7). Образцы плазмы животных готовили путем забора крови (9 объемов) (путем кровопускания из подчелюстной области для мышей или из яремной вены для крыс) в центрифужные микропробирки, содержащие 0,109 моль/л антикоагулянта цитрата натрия (1 объем) в соответствии со стандартными методами. Активность F7 в плазме измеряли с помощью хромогенного метода с использованием набора BIOPHEN VII (Hyphen BioMed/Aniara, Мэйсон, Огайо) в соответствии с рекомендациями производителя. Абсорбцию в ходе колориметрического анализа измеряли с помощью ридера для микропланшетов Tecan Safire2 при 405 нм.
Пример 8. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина - Дозозависимый эффект пептида мелитина. Мелитин обратимо модифицировали CDM-NAG, как описано выше. Указанное количество мелитина затем вводили совместно с 200 мкг конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше.
Таблица 2
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и CDM-NAG по сравнению с обратимо ингибированным CDM-PEG пептидом мелитина.
Название пептида Модификация миРНК, мкг Пептид, мкг % снижениеa
Apis florea (Seq. ID 1) L-форма 5× CDM-PEG 200 800 0
200 100 25
200 200 51
5× CDM-NAG 200 400 78
200 800 87
200 1200 94
a Снижение относительно уровня у животных, которым инъецировали изотонический раствор глюкозы
Пример 9. In vivo снижение эндогенного уровня Фактора VII после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у крыс. Указанный мелитин обратимо модифицировали 5× CDM-NAG, как описано выше. Затем указанное количество мелитина, в мг на кг массы тела животного, вводили совместно с конъюгатом холестерин-миРНК Фактора VII в концентрации 3 мг/кг. Эффект на уровень Фактора VII определяли, как описано выше.
Таблица 3
Подавление активности Фактора VII в нормальных клетках печени у крыс, которых лечили конъюгатом миРНК Фактора VII - холестерин и обратимо ингибированным CDM-NAG мелитином.
Seq. ID Пептид Пептид, мкгa Снижение Фактора VIIb
1 GIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ 1 30
3 83
10 90
20 95
11 YIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ 1 93
3 97
a мг пептид на килограмм массы тела животного
b Снижение относительно уровня у животных, которым инъецировали изотонический раствор глюкозы
Пример 10. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей, мелитин в L-форме по сравнению с D-формой. Мелитин обратимо модифицировали CDM-NAG, как описано выше. Затем указанное количество мелитина вводили совместно с 50 мкг конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше.
Таблица 4
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у 1ышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и указанным обратимо ингибированным CDM-NAG пептидом мелитина.
Название пептида Модификация миРНК, мкг Пептид, мкг % снижение
Leu-Мелитин (Seq. ID 7), L-форма 5× CDM-NAG 50 25 15
50 50 70
50 100 90
50 200 90
50 400 90
Leu-Мелитин (Seq. ID 7), D-форма 5× CDM-NAG 50 25 30
50 50 80
50 100 90
Пример 11. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей; прямая последовательность по сравнению с обращенной (ретро) последовательностью. Мелитин обратимо модифицировали CDM-NAG (5×), как описано выше. Затем указанное количество мелитина вводили совместно с указанным количеством конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше.
Таблица 5
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и указанным обратимо ингибированным CDM-NAG пептидом мелитина.
Seq. ID модификация Пептид миРНК процентное снижение
1 GIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ 200 мкг 90
400 мкг 80
95 Ретроинвертированнаяa Метокси QQRKRKIWSILAALGTTLVKLVAGIC-NH2 30мг/кг 39
92 ретроинвертированная QQRKRKIWSILAPLGTTLVKLVAGIC-NH2 400 мкг 85
20мг/кг 94
95 ретроинвертированная QQRKRKIWSILAALGTTLVKLVAGIC-NH2 20мг/кг 91
93 ретроинвертированная QQKKKKIWSILAPLGTTLVKLVAGIC-NH2 20мг/кг 70
96 ретроинвертированная QKRKNKIWSILTPLGTALVKLIAGIG-NH2 20 мг/кг 70
a - ретроинвертированная = прямая аминокислотная последовательность мелитина является обращенной, и все аминокислоты представляют собой аминокислоты в D-форме (Глицин (G) является ахиральным)
Пример 12. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей, степень модификации мелитина. Мелитин обратимо модифицировали с помощью указанного количества CDM-NAG, как описано выше. Затем 50 мкг мелитина вводили совместно с 100 мкг конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше.
Процентную модификацию аминов мелитина определяли с помощью TNBS-анализа для свободных аминов пептида. 20 мкг пептида переносили в прозрачный 96-луночный планшет (NUNC 96), содержащий 190 мкл 50 мМ буфера BORAX (pH 9) и 16 мкг тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS). Образцам позволяли реагировать с TNBS в течение ~15 минут при комнатной температуре и затем измеряли A420 с помощью ридера для планшетов Safire. Процент модифицированных аминов рассчитывали следующим образом: (Аконтроль-Аобразец)/(Аконтроль-Апустая лунка)×100. Модификация более 80% аминов обеспечивала оптимальное маскирование и активность мелитина.
Таблица 6
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и обратимо модифицированным CDM-NAG мелитином в указанной степени.
Название пептида Модификация миРНК, мкг пептид, мкг % модифицированных аминова % снижение
1× CDM-NAG 100 50 68 74
Leu-Мелитин (Seq. ID 7), L-форма 2× CDM-NAG 100 50 88 88
5× CDM-NAG 100 50 98 82
a определяли с помощью анализа с использованием тринитробензолсульфоната натрия (TNBS)
Пример 13. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей; производные пептида мелитина. Пептиды мелитина, содержащие указанную последовательность, обратимо модифицировали CDM-NAG (5×), как описано выше. Затем вводили указанное количество мелитина совместно с указанным количество конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше.
Таблица 7
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и указанным обратимо ингибированным CDM-NAG пептидом мелитина.
Название пептида пептидa, мкг миРНКb, мкг процентное снижение
CBZ-Mel(Seq. ID 1) 100 80 96
Mel-NH2 (Seq. ID 1) 50 100 86
Ацетил-dMel-NH2 (Seq. ID 1) 100 100 89
G1A (Seq. ID 2) 100 100 88
G1C (Seq. ID 3) 100 100 37
G1F dMel (Seq. ID 4) 100 50 94
G1H (Seq. ID 5) 400 100 78
G1dI (Ile в D-форме в положении 1, Seq. ID 6) 50 100 34
G1L d-Mel (Seq. ID 7) 50 100 91
G1L d(1-11)-1(12-26) (Seq. ID 7) 100 100 70
G1Nle (Seq. ID 8) 100 100 96
G1V (Seq. ID 9) 100 100 91
GlW (Seq. ID 10) 200 200 96
G1Y dMel (Seq. ID 11) 100 50 95
G1Y-Mel-NH2 (Seq. ID 11) 200 200 94
G12L (Seq. ID 13) 80 100 58
G12W (Seq. ID 14) 80 100 51
N22T Mel-NH2 (Seq. ID 15) 50 100 34
G1Y, K7N (Seq. ID 16) 80 100 32
G1Y, K7A (Seq. ID 17) 400 100 83
G1L, K7S (Seq. ID 18) 100 100 89
G1L, K7R (Seq. ID 19) 100 100 92
G1L, K7H (Seq. ID 20) 100 100 97
G1L, T11C dMel (Seq. ID 21) 100 50 81
G1L, G12L (Seq. ID 22) 400 100 93
G1L, T15C dMel (Seq. ID 24) 100 100 95
G1L, S18C (Seq. ID 25) 100 100 93
G1L, K21A (Seq. ID 28) 100 100 95
G1Y, K23A (Seq. ID 29) 100 100 42
G1L, R24A (Seq. ID 30) 100 100 87
G1Y, K25A (Seq. ID 31) 100 100 77
G1Y, Q26C(Seq. ID 32) 100 100 93
G1Y, K7A, K21A (Seq. ID 35) 100 100 14
G1L, T11C, S18C dMel (Seq. ID 38) 100 100 88
T11G, T15G, S18G (Seq. ID 39) 50 100 32
T11A, T15A, S18A (Seq. ID 40) 50 100 38
G1L, I2L, 15L, I17L, I20L (Seq. ID 43) 400 100 96
G1L, I2Nle, I5Nle, I17Nle, I20Nle (Seq. ID 44) 100 100 99
G1L, I2V, I5V, I17V, I20V (Seq. ID 45) 100 100 24
диметил-dMel I2L, I5L, T11C, I17L, I20L dMel (Seq. ID 46) 100 100 87
диметил-dMel I2Nle, I5Nle, T11C, I17Nle, I20Nle dMel (Seq. ID 47) 100 100 78
Apis Mellifera (большая медоносная пчела; Seq. ID 50) 400 100 72
C-Mel G1L (Seq. ID 51) 100 100 89
C-dMel G1Nle (Seq. ID 52) 100 100 84
Диметил G-Mel G1L (Seq. ID 53) 100 100 91
PEG(5k)-KLK-dMel G1Y (Seq. ID 56) 300 100 72
CKLK-Mel GIL (Seq. ID 57) 150 100 91
миристоил-CKLK-Mel GIL (Seq. ID 57) 80 100 96
CKLK-dMel G1Nle (Seq. ID 58) 200 100 84
Ацетил-CKLK-dMel G1Nle (Seq. ID 58) 100 200 97
PEG24-GKLK-Mel GIL (Seq. ID 59) 50 100 85
Mel-Cys (Seq. ID 62) 400 100 83
G1L Mel-Cys (Seq. ID 63) 400 100 82
G1L dMel-C (Seq. ID 63) 50 100 93
G1Nle Mel-C (Seq. ID 64) 400 50 89
G1L Mel-KLKC (Seq. ID 65) 100 100 97
G1Y Mel-PLGIAGQC (Seq. ID 66) 100 100 79
G1L, Mel-KKKKK (Seq. ID 67) 400 100 96
G1Y dMel-GFKGC (Seq. ID 68) 400 100 96
CFK-G1L dMel-C (Seq. ID 69) 100 100 79
G1L Mel (1-23) (Seq. ID 71) 400 100 69
G1L, L5V, A10T, T15A Mel (1-23) (Seq. ID 72) 400 100 69
G1L, L5V, A10T, T15A, N22G, K23E dMel (1-23) (Seq. ID 73) 400 100 92
G1L ретроMel-KLK-стеароил (Seq. ID 75) 400 100 50
G1L ретроMel-стеароил (Seq. ID 74) 400 100 56
G1L ретро-dMel-KLK-PEG(5k) (Seq. ID 75) QQRKRKIWSILAPLGTTLVKLVAGIC-(N-PDP-PE)-NH2 dMel (Seq. ID 92) 100 100 32
(РЕ = диолеолилфосфатидил этаноламин) 400 200 55
Ac-CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2 (Seq. ID 90) 400 200 85
(Ac-CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2)2 (Seq. 400 200 45
ID 90)
a мкг пептида на мышь
b мкг миРНК на мышь
dMel = Пептид мелитина, содержащий аминокислоты в D-форме
Пример 14. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей; поддающиеся ферментативному расщеплению маскирующие агенты. Мелитин обратимо модифицировали с помощью указанного количества поддающихся ферментативному расщеплению маскирующих агентов, как описано выше. Затем вводили 200-300 мкг маскированного мелитина совместно с 50-100 мкг конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше. Модифицированный поддающимся расщеплению пептидазой дипептид-амидобензилкарбаматом мелитин являлся эффективным пептидом для доставки миРНК. Предпочтительным является применение пептида мелитина в D-форме в комбинации с поддающимися ферментативному расщеплению маскирующими агентами. Несмотря на то, что требовалось большее количество пептида для такого же снижения уровня гена-мишени, терапевтический индекс был либо не изменен, либо улучшен (по сравнению с тем же пептидом, маскированным CDM-NAG) из-за более стабильного маскирования пептида.
Таблица 8
Подавление активности Фактора VII в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК Фактора VII - холестерин и G1L-мелитином (D-форма) (Seq. ID 7), обратимо ингибированным указанным поддающимся ферментативному расщеплению маскирующим агентом.
Пептид NAG-связь мкг, пептид мкг, миРНК процентное снижение
количествоa тип
G1Ld-Mel (Seq. ID 7) 5× CDM-NAG 200 100 97
5× NAG-AlaCit 200 50 96
5× NAG-GluGly 200 50 96
5× NAG-PEG4-PheCit 200 50 94
5× NAG-PEG7-PheCit 200 50 86
5× CDM-NAG 300 50 98
2× NAG-GluGly 300 50 95
4× NAG-GluGly 300 50 95
6× NAG-GluGly 300 50 82
а Количество маскирующего агента на амин мелитина, используемое в реакции маскирования.
Пример 15. In vivo снижение уровня эндогенного АроВ после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина у мышей; пептиды мелитина, модифицированные на амино-конце. Пептиды мелитина, содержащие указанные PEG-модификации на амино-конце, синтезировали, как описано выше. Модифицированные PEG на амино-конце пептиды мелитина затем обратимо модифицировали 5× CDM-NAG, как описано выше. Затем указанное количество мелитина вводили совместно с 100-200 мкг конъюгата миРНК АроВ-холестерин. Эффект на уровень АроВ определяли, как описано выше. Добавление PEG размером менее 5 кДа приводило к снижению токсичности пептидов мелитина. Модификация PEG размером более 5 кДа по амино-концу приводила к снижению эффективности (данные не представлены).
Таблица 9
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у мышей, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и указанным обратимо ингибированным CDM-NAG пептидом мелитином.
Пептид количество NAG PEG пептид, мкг миРНК, мкг процентное снижение
G1L (Seq. ID 7) 5× 25 100 0
50 100 72
100 100 94
5× 150 100 91
400 100 97
5× NAG-(PEG)2 25 100 15
50 100 83
CKLK-Mel G1L (Seq. ID 57) 5× NAG-(PEG)4 25 100 58
50 100 81
100 100 94
5× NAG-(PEG)8 25 100 58
50 100 89
100 100 96
Ацетил-CKLK-dMel G1Nle (Seq. ID 58) 5× 100 200 90
200 100 90
PEG (1k) 150 100 93
CRLR-Mel 5× PEG (1k) 100 100 93
CKFR-Mel 5× PEG (1k) 100 100 81
CKLK-Mel G1L (Seq. ID57) 5× PEG (5k) 100 100 90
Пример 16. Другие последовательности производных мелитина, которые, как известно, обладают мембранной активностью.
Таблица 10
Пептиды мелитина, обладающие мембранной активностью.
Seq. ID Последовательность Название пептида
76 GIGAVLKVLTTGLPALISWISRKKRQQ I5V, A10T, T15A, N22R, R24K, K25R Mel-Q
77 GIGARLKVLTTGLPR ISWIKRKRQQ I5R, A10T, T15R, L16A, N22R, K25Q
78 GIGAILKVLSTGLPALISWIKRKRQE A10S, T15A, N22R, K25Q, Q26E
79 GIGAVLKVLTTGLPALIGWIKRKRQQ I5V, A10T, T15A, S18G, N22R, K25Q
80 GIGAVLKVLATGLPALISWIKRKRQQ I5V, T15A, N22R, K25Q
81 GIGAVLKVLSTGLPALISWIKRKRQQ I5V, A10S, T15A, N22R, K25Q
82 GIGAILRVLATGLPTLISWIKNKRKQ K7R
83 GIGAILKVLATGLPTLISWIKRKRKQ N22R
84 GIGAILKVLATGLPTLISWIKKKKQQ N22K, R24K, K25Q
85 GIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQGSKKKK Mel-GSKKKK
86 KKGIGAILKVLATGLPTLISWIKNKRKQ KK-Mel
87 GIGAILEVLATGLPTLISWIKNKRKQ K7E Mel
88 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKR I5V, T15A, N22R, 25-26Δ
89 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR I5V, T15A, N22R, 23-26Δ
94 QKRKNKIWSILTPLGTALVKLIAGIG-NH2 Обратный Q25K Mel
Пример 17. Снижение уровня Фактора VII у приматов после доставки миРНК Фактора VII с помощью пептида доставки мелитина. NAG-PEG2-G1L-мелитин маскировали путем проведения реакции с 10× CDM-NAG, как описано выше. G1L-мелитин маскировали путем проведения реакции с 5× CDM-NAG, как описано выше. На 1 день вводили маскированный NAG-PEG2-G1L-мелитин в концентрации 1 мг/кг, маскированный G1L-мелитин в концентрации 1 мг/кг или маскированный G1L-мелитин в концентрации 3 мг/кг совместно с конъюгатом холестерин-миРНК Фактора VII в концентрации 2 мг/кг приматам макакам-крабоедам (Масаса fascicularis) (самцам, 3,0-8,0 кг). 2 мл/кг вводили в подкожную вену с использованием внутривенного катетера 22-25 калибра. В качестве контроля другой группе приматов вводили G1L-мелитин в концентрации 10 мг/кг совместно с контрольной миРНК, холестерин-миРНК люциферазы, в концентрации 2 мг/кг. В указанные выше моменты времени (обозначенные на Фиг.3-5) собирали образцы крови и проводили исследование на Фактор VII и маркеры токсичности. Кровь собирали из бедренной вены. Приматов не кормили в течение ночи перед всеми заборами крови. Исследования крови на азот мочевины крови (BUN), аланинтрансаминазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST) и креатинин проводили на приборе Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics) в соответствии с рекомендациями производителя. Уровень Фактора VII определяли, как описано выше. Значительное снижение уровня Фактора VII наблюдали при дозе пептида менее 1 мг/кг. При дозе пептида 10 мг/кг пептида не наблюдали значительной токсичности. Таким образом, маскированные пептиды мелитина имели терапевтический индекс 5-10.
Пример 18. Снижение уровня АроВ у приматов после доставки миРНК АроВ с помощью пептида доставки мелитина. G1L-мелитин был маскирован путем реакции с 5× CDM-NAG, как описано выше. На 1 день приматам макакам-крабоедам (Масаса fascicularis) вводили маскированный G1L-мелитин в концентрации 2 мг/кг совместно с миРНК chol-АроВ в концентрации 2 мг/кг. В указанные моменты времени (Таблица 11) собирали образцы крови и проводили исследование на уровень белка АроВ и маркеры токсичности. Исследования крови на азот мочевины крови (BUN), аланинтрансаминазу (ALT), аспартатаминотрансферазу (AST) и креатинин проводили на приборе Cobas Integra 400 (Roche Diagnostics) в соответствии с рекомендациями производителя. Уровень АроВ определяли, как описано выше. Не наблюдалось повышения уровня BUN, креатинина или AST. Наблюдалось только временное несущественное повышение уровня AST на 2 день (1 день после инъекции). Снижение уровня АроВ достигало примерно 100% на 11 день, и уровень оставался низким в течение 31 дня.
Таблица 11
Подавление активности АроВ в нормальных клетках печени у приматов, которых лечили конъюгатом миРНК АроВ-холестерин и маскированным CDM-NAG мелитином G1L.
день 4 1 2 4 8 11 15 18 25 31
BUN (мг/дцл) 21 26 22 23 27 27 28 22 22 22
Креатинин (мг/дцл) 0,8 0,9 0,9 0,7 0,8 0,8 0,9 0,9 0,9 0,9
AST (Ед/л) 25 27 71 30 37 27 32 29 39 50
ALT (Ед/л) 34 33 58 49 50 46 46 41 39 44
ароВ (мг/дцл) 1072 1234 198 23 4 0 34 43 76 184

Claims (36)

1. Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени in vivo, содержащая:
РНКи-А + Мелитин-(L-Gal)x,
где Мелитин представляет собой мембраноактивный пептид мелитина,
L представляет собой физиологически лабильную связь,
Gal представляет собой лиганд рецептора асиалогликопротеина (ASGPr),
x представляет собой целое число, имеющее значение выше чем 80% первичных аминов Мелитина,
L связывает Gal с первичным амином в мелитине,
РНКи представляет собой полинуклеотид РНК-интерференции,
А представляет собой гидрофобную группу, содержащую по меньшей мере 20 атомов углерода, или галактозный кластер, причем указанный галактозный кластер включает молекулу, содержащую на конце от двух до четырех производных галактозы, причем каждое производное галактозы обладает аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина, равной или превышающей аффинность галактозы, и А связана либо с 3'-, либо с 5'- концом РНКи ковалентной связью.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что полинуклеотид РНК-интерференции выбран из группы, состоящей из: ДНК, РНК, днРНК, миРНК и микроРНК.
3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что клетка печени представляет собой гепатоцит.
4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что лиганды ASGPr обратимо связаны по меньшей мере с 90% аминов множества пептидов мелитина.
5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид мелитина выбран из перечня последовательностей, состоящего из: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 96.
6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что пептид мелитина состоит из аминокислот в D-форме.
7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что L представляет собой дизамещенный малеамат.
8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что L представляет собой амидобензилкарбамат.
9. Композиция по п. 7, дополнительно содержащая полиэтиленгликоль (PEG), ковалентно связанный с амино-концом пептида мелитина.
10. Композиция по п. 7, дополнительно содержащая конъюгат лиганд ASGPr-PEG, ковалентно связанный с амино-концом пептида мелитина.
11. Композиция по п. 8, дополнительно содержащая полиэтиленгликоль (PEG), ковалентно связанный с амино-концом пептида мелитина.
12. Композиция по п. 8, дополнительно содержащая конъюгат лиганд ASGPr-PEG, ковалентно связанный с амино-концом пептида мелитина.
13. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что лиганд ASGPr выбран из группы, состоящей из лактозы, галактозы, N-ацетилгалактозамина (GalNAc), галактозамина, N-формилгалактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионилгалактозамина, N-н-бутаноилгалактозамина и N-изо-бутаноилгалактозамина.
14. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что ковалентная связь представляет собой физиологически лабильную связь.
15. Композиция по п. 14, отличающаяся тем, что физиологически лабильная связь является ортогональной по отношению к L.
16. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что галактозный кластер состоит из тримера N-ацетилгалактозамина.
17. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что гидрофобная группа состоит из холестерина.
18. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что указанная композиция представлена в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе.
19. Способ подавления экспрессии гена, который экспрессируется в клетке печени млекопитающего, включающий инъекцию в сосуд указанного млекопитающего композиции по п. 1, где полинуклеотид РНКи имеет последовательность, идентичную части последовательности указанного гена.
20. Способ получения композиции системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетки печени in vivo, включающий:
a) получение мембраноактивного пептида мелитина, далее Мелитин;
b) получение множества незаряженных маскирующих агентов, каждый из которых содержит лиганд ASGPr, ковалентно связанный с дизамещенным малеиновым ангидридом или дипептид-амидобензильным амино-реактивным карбонатом;
c) модифицирование более 80% первичных аминов популяции пептидов мелитина, полученных на этапе а), маскирующими агентами этапа b) с получением Мелитин-(L-Gal)x,
где Gal представляет собой лиганд ASGPr,
L представляет собой физиологически лабильную связь,
x представляет собой целое число, имеющее значение выше чем 80% первичных аминов Мелитина;
d) связывание полинуклеотида РНК-интерференции с гидрофобной группой А, содержащей по меньшей мере 20 атомов углерода, или галактозным кластером, причем указанный галактозный кластер включает молекулу, содержащую на конце от двух до четырех производных галактозы, причем каждое производное галактозы обладает аффинностью в отношении рецептора асиалогликопротеина, равной или превышающей аффинность галактозы, с получением РНКи-А;
f) объединение полученных компонентов РНКи-A и Мелитин-(L-Gal)x с получением композиции, содержащей РНКи-А+Мелитин-(L-Gal)x.
RU2013117285A 2010-12-17 2011-12-16 Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения RU2623160C9 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061424191P 2010-12-17 2010-12-17
US61/424,191 2010-12-17
US13/326,433 2011-12-15
US13/326,433 US8501930B2 (en) 2010-12-17 2011-12-15 Peptide-based in vivo siRNA delivery system
PCT/US2011/065525 WO2012083185A2 (en) 2010-12-17 2011-12-16 Peptide-based in vivo sirna delivery system

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2013117285A RU2013117285A (ru) 2015-01-27
RU2623160C2 RU2623160C2 (ru) 2017-06-22
RU2623160C9 true RU2623160C9 (ru) 2018-02-26

Family

ID=46245391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013117285A RU2623160C9 (ru) 2010-12-17 2011-12-16 Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения

Country Status (15)

Country Link
US (3) US8501930B2 (ru)
EP (1) EP2651420B1 (ru)
JP (2) JP5926739B2 (ru)
KR (1) KR20140012624A (ru)
CN (1) CN103547272B (ru)
AU (2) AU2011343532B2 (ru)
BR (1) BR112013011702A2 (ru)
CA (1) CA2816042C (ru)
MX (1) MX346145B (ru)
NZ (1) NZ611662A (ru)
PE (1) PE20140180A1 (ru)
RU (1) RU2623160C9 (ru)
SG (1) SG189945A1 (ru)
WO (1) WO2012083185A2 (ru)
ZA (1) ZA201302900B (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2809635C1 (ru) * 2022-10-10 2023-12-14 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"(МГУ) Конъюгаты монометил ауристатина е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора для направленного транспорта в опухолевые клетки печени

Families Citing this family (154)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080281041A1 (en) * 1999-06-07 2008-11-13 Rozema David B Reversibly Masked Polymers
WO2008131419A2 (en) * 2007-04-23 2008-10-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycoconjugates of rna interference agents
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
US9850296B2 (en) 2010-08-10 2017-12-26 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
US9517257B2 (en) 2010-08-10 2016-12-13 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Erythrocyte-binding therapeutics
CN108117586A (zh) 2010-08-10 2018-06-05 洛桑聚合联合学院 红细胞结合性治疗剂
NZ608972A (en) 2010-10-01 2015-09-25 Moderna Therapeutics Inc Engineered nucleic acids and methods of use thereof
BR112013014115A2 (pt) * 2010-12-29 2019-09-24 Arrowhead Res Corporation conjugados de fornecimento de polinucleotídeos in vivo apresentando ligações enzimáticas sensíveis
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
CA2832115C (en) 2011-04-08 2021-03-02 Tufts Medical Center, Inc. Pepducin design and use
KR102167524B1 (ko) 2011-06-30 2020-10-20 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
EP3453761A1 (en) 2011-08-29 2019-03-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
CN110201187A (zh) 2011-12-16 2019-09-06 现代泰克斯公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
AU2013243952A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
WO2014089146A1 (en) * 2012-12-04 2014-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for in vivo delivery of antisense compounds
AU2014204012B2 (en) 2013-01-03 2018-03-29 Washington University Compositions and methods for polynucleotide transfection
AU2014223432A1 (en) 2013-02-28 2015-09-03 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat EPAS1-related diseases
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
AU2014268529C1 (en) * 2013-05-22 2020-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. TMPRSS6 iRNA compositions and methods of use thereof
JP6702862B2 (ja) * 2013-07-11 2020-06-03 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． オリゴヌクレオチド−リガンドコンジュゲートおよびそれらの調製方法
CN105451743B (zh) * 2013-08-07 2019-11-19 箭头研究公司 用于在活体中递送RNAi触发子至肿瘤细胞的聚偶联物
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
EP3065783A4 (en) 2013-11-06 2017-06-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Dual molecular delivery of oligonucleotides and peptide containing conjugates
EP3065758B1 (en) 2013-11-06 2019-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Peptide containing conjugates for dual molecular delivery of oligonucleotides
US10953101B2 (en) 2014-02-21 2021-03-23 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
US10946079B2 (en) 2014-02-21 2021-03-16 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Glycotargeting therapeutics
SG10202010936RA (en) * 2014-02-21 2020-12-30 Ecole Polytecnique Fed De Lausanne Epfl Epfl Tto Glycotargeting therapeutics
US10046056B2 (en) 2014-02-21 2018-08-14 École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) Glycotargeting therapeutics
EP3647318B1 (en) 2014-04-28 2021-06-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
RU2734658C2 (ru) 2014-05-01 2020-10-21 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии ангиопоэтин-подобного белка 3
BR112016022855B1 (pt) 2014-05-01 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos e composições para modular a expressão de pkk e seus usos
KR102149571B1 (ko) 2014-05-01 2020-08-31 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 성장 호르몬 수용체 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
LT3137596T (lt) 2014-05-01 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti komplemento b faktoriaus ekspresijos moduliavimui
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
TW201620526A (zh) 2014-06-17 2016-06-16 愛羅海德研究公司 用於抑制α－１抗胰蛋白酶基因表現之組合物及方法
US10517898B2 (en) 2014-11-20 2019-12-31 The Regents Of The University Of California Compositions and methods related to hematologic recovery
WO2016085852A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Tmprss6 irna compositions and methods of use thereof
US9803205B2 (en) 2015-03-17 2017-10-31 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of factor XII
JP7021076B2 (ja) 2015-05-29 2022-02-16 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｈｉｆ２αの遺伝子発現を阻害する組成物及び方法
JP2018520154A (ja) * 2015-07-02 2018-07-26 ワシントン・ユニバーシティＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ポリヌクレオチドのトランスフェクションのためのペプチド・ポリヌクレオチド複合体
IL256622B2 (en) 2015-07-10 2023-09-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of diacylglycerol acyltransferase 2 (dgat2)
KR101935095B1 (ko) * 2015-07-31 2019-01-04 이화여자대학교 산학협력단 신규한 세포투과성 펩타이드
SI3331892T1 (sl) 2015-08-06 2019-10-30 Hoffmann La Roche Postopki za pripravo derivatov gaINAc kisline
JO3769B1 (ar) * 2015-08-07 2021-01-31 Arrowhead Pharmaceuticals Inc علاج RNAi لعدوى فيروس التهاب الكبد B
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
BR112018005409A2 (pt) * 2015-09-19 2018-10-09 Ecole Polytecnique Fed De Lausanne terapêutica de glicodirecionamento.
WO2017053722A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of kras expression
JOP20210043A1 (ar) 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
PE20181180A1 (es) 2015-11-06 2018-07-20 Ionis Pharmaceuticals Inc MODULAR LA EXPRESION DE APOLIPOPROTEINA (a)
EP4119569A1 (en) 2015-11-06 2023-01-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
EP3374386A1 (en) 2015-11-13 2018-09-19 Oasis Pharmaceuticals, LLC Protease-activated receptor-2 modulators
PL3377510T3 (pl) * 2015-11-16 2021-05-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Amidofosforyn klastra GalNAc
EP3411480A4 (en) 2016-02-02 2020-01-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGETE IL4R, TRPA1, OR F2RL1
CA3011946A1 (en) * 2016-03-07 2017-09-14 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Targeting ligands for therapeutic compounds
MA45328A (fr) 2016-04-01 2019-02-06 Avidity Biosciences Llc Compositions acide nucléique-polypeptide et utilisations de celles-ci
CN114736256A (zh) 2016-06-06 2022-07-12 箭头药业股份有限公司 5’-环膦酸酯修饰核苷酸
PT3484524T (pt) 2016-07-15 2023-02-15 Ionis Pharmaceuticals Inc Composições e métodos para a modulação de smn2
WO2018017814A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 President And Fellows Of Harvard College Peptidoglycan glycosyltransferase inhibitors of sed proteins for treating bacterial infections
JOP20170161A1 (ar) 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
SG11201901841TA (en) * 2016-09-02 2019-03-28 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Targeting ligands
WO2018053142A2 (en) 2016-09-14 2018-03-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for modulating erythropoiesis
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
CN110177544A (zh) 2016-11-29 2019-08-27 普尔泰克健康有限公司 用于递送治疗剂的外泌体
WO2018112032A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for targeting tumor-infiltrating tregs using inhibitors of ccr8 and tnfrsf8
WO2018112365A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating colorectal cancer and melanoma using parabacteroides goldsteinii
WO2018112363A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating cancer using parabacteroides
WO2018112364A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Combination therapies for treating melanoma
WO2018112360A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Evelo Biosciences, Inc. Combination therapies for treating cancer
SG10202107429WA (en) 2017-01-06 2021-08-30 Avidity Biosciences Inc Nucleic acid-polypeptide compositions and methods of inducing exon skipping
IL267959B1 (en) * 2017-01-10 2024-03-01 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Alpha-1 antitrypsin (AAT) RNAi agents, preparations containing AAT RNAi agents and their uses
US20200121739A1 (en) 2017-01-18 2020-04-23 Evelo Biosciences, Inc. Bacteria for treating cancer
US20190365830A1 (en) 2017-01-18 2019-12-05 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating cancer
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
WO2018197926A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 Robert Penchovsky Methods for creating novel antibacterial agents using chimeric antisense oligonucleotides
WO2018215049A1 (en) 2017-05-23 2018-11-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for galnac oligonucleotide conjugates
US11253579B2 (en) 2017-06-16 2022-02-22 The University Of Chicago Compositions and methods for inducing immune tolerance
EP3645546A4 (en) 2017-06-30 2021-12-01 Solstice Biologics, Ltd. CHIRAL PHOSPHORAMIDITIS AUXILIARIES AND THEIR METHODS OF USE
PE20200746A1 (es) 2017-07-06 2020-07-24 Arrowhead Pharmaceuticals Inc AGENTES DE iARN PARA LA INHIBICION DE LA EXPRESION DE ALFA-ENAC Y METODOS DE USO
GB201711809D0 (en) 2017-07-21 2017-09-06 Governors Of The Univ Of Alberta Antisense oligonucleotide
WO2019046401A1 (en) 2017-08-29 2019-03-07 Evelo Biosciences, Inc. TREATMENT OF CANCER USING BLAUTIA STRAIN
MX2020002648A (es) 2017-09-11 2020-07-22 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Agentes de iarn y composiciones para inhibir la expresion de la apolipoproteina c-iii (apoc3).
CN117701562A (zh) 2017-09-14 2024-03-15 箭头药业股份有限公司 用于抑制血管生成素-样3(ANGPTL3)的表达的RNAi剂和组合物以及使用方法
MX2020003596A (es) 2017-10-04 2020-07-22 Avidity Biosciences Inc Composiciones de acido nucleico-polipeptido y usos de las mismos.
WO2019079294A1 (en) 2017-10-17 2019-04-25 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAI-BASED AGENTS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING ASIALOGLYCOPROTEIN RECEPTOR 1 RECEPTOR 1
EP3719127A4 (en) 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE WITH IT, MANUFACTURING METHOD AND USE
WO2019105435A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2019105414A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CA3083968C (en) 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
AU2018378812A1 (en) 2017-12-06 2020-07-09 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating muscle atrophy and myotonic dystrophy
TW201936201A (zh) 2017-12-14 2019-09-16 美商堅固生物科技公司 基因之非病毒生產及遞送
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
JP7436030B2 (ja) 2017-12-29 2024-02-21 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 複合体及びその調製方法と使用
EP3740575A1 (en) 2018-01-15 2020-11-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of dnm2 expression
US11332733B2 (en) 2018-02-12 2022-05-17 lonis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
WO2019169143A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using turicibacter sanguinis
WO2019169168A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using agathobaculum
WO2019169138A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using paraclostridium benzoelyticum
WO2019169160A1 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Evelo Biosciences, Inc. Compositions and methods for treating cancer using ruminococcus gnavus
WO2019178057A1 (en) 2018-03-12 2019-09-19 Evelo Biosciences, Inc. Methods of treating cancer using burkholderia
WO2019217527A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing fxi expression
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
JP2021533800A (ja) 2018-08-21 2021-12-09 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドSuzhou Ribo Life Science Co., Ltd. 核酸、当該核酸を含む薬物組成物及び複合体ならびにその使用
WO2020047229A1 (en) 2018-08-29 2020-03-05 University Of Massachusetts Inhibition of protein kinases to treat friedreich ataxia
US11273137B2 (en) 2018-09-04 2022-03-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods and compositions to prevent and treat disorders associated with mutations in the ODC1 gene
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
US11896674B2 (en) 2018-09-30 2024-02-13 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. SiRNA conjugate, preparation method therefor and use thereof
JP2022513482A (ja) 2018-12-21 2022-02-08 アビディティー バイオサイエンシーズ，インク． 抗トランスフェリン受容体抗体およびその使用
AU2020219355A1 (en) 2019-02-07 2021-09-30 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for Hepatitis B virus infection
CN114949201A (zh) 2019-03-12 2022-08-30 哈佛大学校长及研究员协会 治疗癌症的方法和组合物
WO2020214974A1 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
US20200330499A1 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
WO2020247782A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Avidity Biosciences, Inc. Nucleic acid-polypeptide compositions and uses thereof
US20220226269A1 (en) 2019-06-12 2022-07-21 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for modulation of an interspecies gut bacterial pathway for levodopa metabolism
KR20220042116A (ko) 2019-06-18 2022-04-04 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 B형 간염 바이러스(HBV) 백신 및 HBV-타케팅 RNAi의 조합
AU2020297008A1 (en) 2019-06-18 2022-02-17 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis B virus (HBV) vaccines and HBV-targeting RNAi
WO2021022110A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Evelo Biosciences, Inc. Inducing immune effects using bacteria of the genus bifidobacterium
JP2022552249A (ja) 2019-10-14 2022-12-15 アストラゼネカ・アクチエボラーグ Ｐｎｐｌａ３発現のモジュレーター
CN111041025B (zh) * 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CA3163848A1 (en) 2020-01-06 2021-07-15 Dong In Lee Composition for preventing or treating macular degeneration, containing cell permeable nucleic acid complex as active ingredient
EP4051292A4 (en) 2020-02-28 2023-12-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATING SMN2
CN115485385A (zh) 2020-03-04 2022-12-16 瑞泽恩制药公司 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物
WO2021178612A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
EP4121063A1 (en) 2020-03-19 2023-01-25 Avidity Biosciences, Inc. Compositions and methods of treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
AR121672A1 (es) 2020-03-26 2022-06-29 Arrowhead Pharmaceuticals Inc AGENTES DE ARNi PARA INHIBIR LA EXPRESIÓN DE PNPLA3, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE ESTA, Y MÉTODOS DE USO
EP4157264A1 (en) 2020-05-27 2023-04-05 The Regents of the University of California Compositions and methods for transdifferentiating cells
CA3185614A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis d virus infection
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
JP2023540806A (ja) 2020-09-11 2023-09-26 アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 骨格筋への送達プラットフォームおよび使用の方法
AU2021342158A1 (en) 2020-09-11 2023-04-13 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Lipid conjugates for the delivery of therapeutic agents
EP4211243A2 (en) 2020-09-11 2023-07-19 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for inhibiting expression of dux4, compositions thereof, and methods of use
WO2022056454A2 (en) 2020-09-14 2022-03-17 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating hpv-positive cancers
WO2022060986A2 (en) 2020-09-16 2022-03-24 President And Fellows Of Harvard College Methods of treating an individual that has failed an anti-pd-1/anti-pd-l1 therapy
EP4221721A1 (en) * 2020-10-02 2023-08-09 Musc Foundation for Research Development Advanced cell-permeable peptide carriers
IL302817A (en) 2020-11-18 2023-07-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
US20240009269A1 (en) * 2020-11-20 2024-01-11 The Johns Hopkins University Membrane-active peptides and methods for reversible blood- brain barrier opening
WO2022133230A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
WO2022152869A1 (en) 2021-01-15 2022-07-21 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Use of oligonucleotides for individuals with hepatic impairment
IL307882A (en) * 2021-04-23 2023-12-01 Microbio Shanghai Co Ltd Cyclic-N-acetylgalactosamine (GALNAC) peptide conjugates for drug delivery to liver cells
JP2024517686A (ja) 2021-04-26 2024-04-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 膜貫通プロテアーゼ、セリン６（ＴＭＰＲＳＳ６）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
WO2022234346A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Twinpig Biolab, Inc. Peptides targeting macrophages, and conjugates, compositions, and uses thereof
US11549112B1 (en) 2021-06-21 2023-01-10 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi agents for inhibiting expression of xanthine dehydrogenase (XDH), pharmaceutical compositions thereof, and methods of use
WO2023281434A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Use of oligonucleotides for individuals with renal impairment
WO2023150181A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating cancer
WO2023233290A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rnai agents targeting pd-l1
WO2023245060A2 (en) 2022-06-15 2023-12-21 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents for inhibiting expression of superoxide dismutase 1 (sod1), compositions thereof, and methods of use
WO2024010867A1 (en) * 2022-07-06 2024-01-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Reversible, covalent polynucleotide condensation approach for enhanced gene delivery

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001609B1 (ru) * 1996-05-10 2001-06-25 Вольф Бертлинг Переносчик для доставки вещества в эукариотические клетки и способ его получения
US20030220264A1 (en) * 1999-06-07 2003-11-27 Rozema David B. Reversible modification of membrane interaction
US20040162235A1 (en) * 2003-02-18 2004-08-19 Trubetskoy Vladimir S. Delivery of siRNA to cells using polyampholytes
WO2010129672A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Miragen Therapeutics Lipophilic polynucleotide conjugates

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US8137695B2 (en) 2006-08-18 2012-03-20 Arrowhead Madison Inc. Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides
EP1102785B1 (en) 1999-06-07 2013-02-13 Arrowhead Research Corporation COMPOSITIONS FOR DRUG DELIVERY USING pH SENSITIVE MOLECULES
US7091186B2 (en) * 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
EP1506218B1 (en) * 2002-05-24 2017-04-12 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Reversible modification of membrane interaction
US7816337B2 (en) 2003-02-18 2010-10-19 Roche Madison Inc. Reversible attachment of a membrane active polymer to a polynucleotide
ES2381201T3 (es) * 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
TWI412367B (zh) * 2006-12-28 2013-10-21 Medarex Llc 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
CA2702028A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Rxi Pharmaceuticals Corp. Tripartite rnai constructs
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
EP2424877A4 (en) * 2009-04-28 2013-01-02 Harvard College SUPERCHARGED PROTEINS FOR CELL PENETRATION
EA024534B1 (ru) 2010-02-24 2016-09-30 Эрроухэд Рисерч Корпорейшн КОНЪЮГИРОВАННАЯ СИСТЕМА ДОСТАВКИ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК (миРНК) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ
RU2582235C2 (ru) 2010-12-29 2016-04-20 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Низкомолекулярные конъюгаты для внутриклеточной доставки нуклеиновых кислот

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA001609B1 (ru) * 1996-05-10 2001-06-25 Вольф Бертлинг Переносчик для доставки вещества в эукариотические клетки и способ его получения
US20030220264A1 (en) * 1999-06-07 2003-11-27 Rozema David B. Reversible modification of membrane interaction
US20040162235A1 (en) * 2003-02-18 2004-08-19 Trubetskoy Vladimir S. Delivery of siRNA to cells using polyampholytes
WO2010129672A1 (en) * 2009-05-05 2010-11-11 Miragen Therapeutics Lipophilic polynucleotide conjugates

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN C.P. et al., "Synthetic PEGylated Glycoproteins and their Utility in Gene Delivery", BIOCONJUG CHEM, 2007, v. 18, n. 2, p. 371-378. *
WOLFRUM C. et al . , "Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs", NATURE BIOTECH., 2007, v. 25, n. 10, p. 1149-1157. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2809635C1 (ru) * 2022-10-10 2023-12-14 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова"(МГУ) Конъюгаты монометил ауристатина е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора для направленного транспорта в опухолевые клетки печени

Also Published As

Publication number Publication date
AU2011343532B2 (en) 2015-08-13
BR112013011702A2 (pt) 2017-10-24
WO2012083185A8 (en) 2013-06-06
CN103547272B (zh) 2017-04-12
ZA201302900B (en) 2014-07-25
AU2011343532A1 (en) 2013-05-09
US8501930B2 (en) 2013-08-06
EP2651420B1 (en) 2018-10-03
MX346145B (es) 2017-03-09
US20120165393A1 (en) 2012-06-28
PE20140180A1 (es) 2014-02-21
WO2012083185A3 (en) 2013-10-10
EP2651420A4 (en) 2014-08-06
JP2016188207A (ja) 2016-11-04
US9526796B2 (en) 2016-12-27
MX2013006747A (es) 2013-08-07
RU2013117285A (ru) 2015-01-27
SG189945A1 (en) 2013-06-28
CA2816042C (en) 2020-05-12
AU2015210397A1 (en) 2015-09-03
EP2651420A2 (en) 2013-10-23
CN103547272A (zh) 2014-01-29
US20130281658A1 (en) 2013-10-24
US20150352221A1 (en) 2015-12-10
AU2015210397B2 (en) 2017-04-20
JP2014507392A (ja) 2014-03-27
CA2816042A1 (en) 2012-06-21
US9107957B2 (en) 2015-08-18
WO2012083185A2 (en) 2012-06-21
RU2623160C2 (ru) 2017-06-22
KR20140012624A (ko) 2014-02-03
NZ611662A (en) 2015-03-27
JP5926739B2 (ja) 2016-05-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2623160C9 (ru) Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения
US10316316B2 (en) Compositions for targeted delivery of siRNA
US8802773B2 (en) In vivo polynucleotide delivery conjugates having enzyme sensitive linkages
RU2619453C2 (ru) КОНЪЮГАТЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ in vivo, СОДЕРЖАЩИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ К ФЕРМЕНТАТИВНОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ СВЯЗИ
TWI565476B (zh) 基於肽之活體內ｓｉＲＮＡ傳遞系統

Legal Events

Date Code Title Description
HZ9A Changing address for correspondence with an applicant
TC4A Change in inventorship

Effective date: 20180116

TK4A Correction to the publication in the bulletin (patent)
TH4A Reissue of patent specification
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20191217