RU2561466C2 - Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора - Google Patents
Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2561466C2 RU2561466C2 RU2013123459/10A RU2013123459A RU2561466C2 RU 2561466 C2 RU2561466 C2 RU 2561466C2 RU 2013123459/10 A RU2013123459/10 A RU 2013123459/10A RU 2013123459 A RU2013123459 A RU 2013123459A RU 2561466 C2 RU2561466 C2 RU 2561466C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- domain
- deleted
- gene
- factor viii
- fviii
- Prior art date
Links
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims abstract description 130
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims abstract description 119
- 229940105778 coagulation factor viii Drugs 0.000 title claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 21
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 title abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 62
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims abstract description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 claims abstract description 21
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 claims abstract description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims abstract description 6
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 claims description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 6
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 4
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 3
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 claims description 3
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 3
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 claims description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 claims 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 abstract description 100
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 abstract 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 29
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 29
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 25
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 6
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 3
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010042546 GCGGCCGC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 2
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- -1 that is Proteins 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000782219 Bos taurus von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N Ellagic acid Chemical compound OC1=C(O)C(OC2=O)=C3C4=C2C=C(O)C(O)=C4OC(=O)C3=C1 AFSDNFLWKVMVRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N Ellagic acid Natural products OC1=C(O)[C@H]2OC(=O)c3cc(O)c(O)c4OC(=O)C(=C1)[C@H]2c34 ATJXMQHAMYVHRX-CPCISQLKSA-N 0.000 description 1
- 229920002079 Ellagic acid Polymers 0.000 description 1
- 101710120810 Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101710089384 Extracellular protease Proteins 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 108010089133 GGTACC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000782195 Homo sapiens von Willebrand factor Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 229960002852 ellagic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000004132 ellagic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010015866 endodeoxyribonuclease NheI Proteins 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001576 membenolytic effect Effects 0.000 description 1
- FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N methylellagic acid Natural products O1C(=O)C2=CC(O)=C(O)C3=C2C2=C1C(OC)=C(O)C=C2C(=O)O3 FAARLWTXUUQFSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для рекомбинантного получения фактора свертываемости крови VIII (FVIII) человека с делецией В-домена. Конструируют плазмиду для экспрессии рекомбинантного FVIII человека с делетированным В-доменом, в клетках СНО, нокаутных по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR), включающую область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla, участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональные элементы гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, последовательность Козак; открытую рамку считывания гена FVIII человека с делетированным В-доменом; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса EMCV; открытую рамку считывания DHFR, экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим FVIII человека с делетированным В-доменом (IRES DHFR). Полученной плазмидой трансформируют клетку СНО с получением клетки-продуцента указанного фактора. Изобретение позволяет существенно повысить эффективность продукции в клетках СНО и сократить затраты на получение фармацевтически значимого рекомбинантного FVIII человека с делецией В-домена. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 4 пр.
Description
Область техники.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения фактора свертываемости крови VIII человека.
Предшествующий уровень техники.
Дефицит фактора свертывания крови VIII человека (фVIII) является причиной гемофилии А. Врожденная гемофилия А, вызываемая повреждениями в гене фVIII, наблюдается с частотой 1:5000-7000 мужчин. Ген фактора VIII расположен в X-хромосоме. Его общая длина составляет около 190 Кб, ген включает 26 экзонов размером от 69 п. о. до 3106 п. о. (Toole, Knopf et al., Nature, 1984, Nov, 312 (5992): 342-7). Экспрессия гена фактора VIII локализована в клетках печени, ген фактора VIII (фVIII) содержит регуляторные последовательности гепатоцитов. Продукт гена фVIII после удаления секреционного лидерного пептида длиной 19 аминокислот состоит из доменов А1-А2-В-А3-С1-С2, общая длина 2332 аминокислот.
Поскольку фVIII - секретируемый белок, он подвергается ряду посттрансляционных модификаций в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Наиболее существенные модификации фVIII - N-гликозилирование (около 25 сайтов, преимущественно в домене В), сульфатирование 6 остатков тирозина, О-гликозилирование и конверсия в двухцепочечную форму специфическим протеолизом на границе доменов В и A3. Зрелый фVIII, выделяемый из плазмы крови, практически полностью конвертирован в двухцепочечную форму, состоящую из тяжелой цепи (А1-А2-В) размером от 90 до 200 кДа и легкой цепи размером 80 кДа. Цепи фVIII соединены нековалентно, их взаимодействие опосредовано ионами меди, координированными в доменах А1 и A3. Фактор VIII в кровотоке образует комплекс со специфическим шапероном - фактором фон Виллебрандта (vWF) - и покидает этот комплекс при активации. Гетерогенность размеров тяжелой цепи обусловлена распадом фVIII по многим сайтам в составе В-домена, минимальная форма тяжелой цепи фVIII 90 кДа вообще не содержит остатков В-домена. Нормальная концентрация фVIII в кровотоке (1 международная единица (МБ) фVIII в 1 мл) составляет около 200 нг/мл, период полувыведения фVIII у человека около 20 ч.
Поскольку эффективная терапия гемофилии А основана на регулярных внутривенных инъекциях препаратов фVIII в дозе 250-2000 ME, мировое потребление фVIII является весьма значительным. В терапии гемофилии применяются: 1) препараты природного фактора VIII, 2) препараты рекомбинантного полноразмерного фVIII, 3) препараты рекомбинантного фактора VIII с делетированным В-доменом, вариант BDD SQ (делеция области 746-1639, отсчет по зрелому полипептиду).
Лекарственные препараты природного фVIII обычно получают из фракции криопреципитата донорской плазмы при помощи нескольких стадий хроматографической очистки. Часть препаратов природного фVIII очищают иммунноаффинной хроматографией, при этом происходит удаление vWF. Лекарственные препараты рекомбинантного фVIII также не содержат vWF и проходят многостадийную очистку, включающую иммунноаффинную хроматографию (или эквивалентную стадию - очистку на иммобилизованном пептиде), а также проходят процедуру вирус-инактивации.
Гетерологичная экспрессия гена фVIII крайне малоэффективна. Вследствие того что мРНК фVIII нестабильна и содержит транскрипционные сайленсеры в области открытой рамки считывания белка, уровень трансляции белка-предшественника фVIII снижен в десятки раз по сравнению с другими белками сходной длины. Около 90% предшественника фVIII не покидает эндоплазматический ретикулум вследствие связывания с шаперном BiP и последующей деградации. Зрелый секретированный фVIII также подвергается интенсивной деградации внеклеточными протеазами. Делеционный вариант фVIII BDD SQ в меньшей степени подвержен удерживанию в эндоплазматическом ретикулуме и протеолитической инактивации в культуральной среде, однако до 90% секретированного продукта подвергается обратному связыванию с мембраной клеток-продуцентов, в основном за счет специфического взаимодействия с фосфатидилсерином. Вследствие этих особенностей мРНК и белка фVIII известные промышленно пригодные системы получения рекомбинантного фVIII отличаются весьма низкой продуктивностью - от 0,5 до 10 МЕ/мл, т.е. не более 1 мг/л, при этом продуктивность систем экспрессии делеционного варианта фVIII в целом выше, чем систем экспрессии полноразмерного фVIII. Вариант делеции В-домена BDD SQ был использован при получении зарегистрированного лекарственного препарата фVIII "мороктоког альфа" (Lind, Larsson et al., Eur J Biochem., 1995, Aug 15, 232 (1): 19-27), другие варианты делеции В-домена в качестве лекарственных средств не использовались.
Исходный метод создания клеток-продуцентов делеционного варианта фVIII BDD SQ описан в патенте США US 4868112. Метод включает в себя конструирование плазмиды, содержащей область открытой рамки считывания (ОРС) фVIII с делецией области B-домена под контролем немедленного раннего промотора цитомегаловируса (CMV) и ген дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR) под контролем промотора SV40, последующей трансфекции данной плазмиды в культивируемые клетки линий COS-1 (обезьяна) или СНО DUKX-B11 (китайский хомячок, инактивация одного аллеля гена DHFR), получению колоний стабильно трансфицированных клеток в среде, не содержащей гипоксантин и тимидин, и последующей селекции наиболее продуктивных клонов в среде, содержащей метотрексат (ингибитор DHFR). При использовании данного метода генерации линий-продуцентов максимальная опубликованная скорость секреции целевого белка в культуральную среду (удельная продуктивность) составляла 2 МЕ/млн клеток/день. Культивация клеток производилась в присутствии сыворотки крупного рогатого скота, содержащей vWF быка, плотно связывающийся с фVIII и защищающий его от захвата на мембрану и протеолитической деградации. Метод получения продуцента без использования сыворотки животных не был предложен.
Известные способы увеличения продуктивности линий-продуцентов фVIII BDD SQ имеют в своей основе внесение точечных аминокислотных замен или замену отдельных участков фVIII человека на гомологичные фрагменты фVIII млекопитающих. В частности, в патентах США US 6376463, US 7122634 описано внесение точечных мутаций в домены A и создание слитных белков фактора VIII человека и фактора VIII свиньи. Данные способы не имеют практической пригодности при создании лекарственных препаратов фVIII, хотя и могут быть основой решений для генотерапии гемофилии А, поскольку внесение мутаций в ОРС гена фVIII может привести к расширению спектра алло- и ауто-антител у больных гемофилией, в том числе за счет развития вторичной резистентности к фVIII свиньи (Parker, Craddock et al., J Thromb Haemost., 2004, Apr; 2 (4): 605-11.).
Другие известные способы улучшения клеток-продуцентов, не связанные с изменением структуры целевого белка, основаны на инсерции в геном культивируемых клеток генетических конструкций, кодирующих бицистронную РНК, то есть РНК с двумя транслируемыми областями - целевого гена и селекционного маркера. Популяцию стабильно трансфицированных такими генетическими конструкциями клеток подвергали продолжительной селекции в присутствии метотрексата (МТХ), что должно было приводить к амплификации в геноме трансфицированной генетической конструкции. Данный подход был описан в патенте США US 6114146 для клеток линий 293 и SK-HEP1 и плазмиды pCMVF/EDHPro, содержащей ОРС фVIII BDD SQ и ОРС DHFR, соединенных участком ДНК, содержащим сайт внутреннего связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита. При культивировании колоний стабильно трансфицированных клеток в присутствии возрастающих концентраций МТХ и последующего получения клональных линий методом предельных разведений были созданы линии-продуценты, секретирующие фVIII BDD SQ со скоростью от 0,1 до 3 МЕ/млн клеток/день. Как и в описанных выше случаях, получение продуцентов по предлагаемой в патенте методике требует применения эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, что приводит к образованию плотного комплекса фактора VIII и vWF быка и существенного завышения измеряемой концентрации фVIII в культуральной среде (по сравнению с концентрацией фVIII в бессывороточной среде).
Получение линий-продуцентов фVIII BDD SQ при помощи бицистронного вектора с промотором CMV и селекционным маркером DHFR описано в патенте РФ RU 2429294, в данном случае используется безбелковая ростовая среда, но уровень продукции фVIII не превышает 0,5 МЕ/мл для суспензионной культуры с плотностью 1,2 млн клт/мл.
Наиболее близкий по технической реализации аналог настоящего изобретения - это описанная в патенте США US 6358703 система экспрессии гена фVIII, включающая трансфекцию бицистронного плазмидного вектора pCIS25DTR, кодирующего ген фVIII с делецией В-домена и ген DHFR, в клетки линии НКВ11. Полученные первичные олигоклональные линии продуцентов в дальнейшем подвергали селекции в присутствии возрастающих концентраций МТХ, клонированию методом предельных разведений и адаптации к бессывороточной среде, содержащей раствор белков плазмы человека (то есть vWF человека). Использование полученной данным способом клональной линии-продуцента для культивации в 15-литровом перфузионном биореакторе позволило достичь суммарной продуктивности 4 млн МЕ/день, что соответствует удельной продуктивности 10-30 МЕ/млн клт/день. Несмотря на заявленные очень высокие показатели продуктивности, данное промышленное решение имет ряд существенных недостатков, а именно основано на применении гибридной линии клеток, полученной слиянием культивируемых клеток человека линии 293S и раковых клеток лимфомы Беркитта, активно секретирующих иммуноглобулин и культивируемых в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в составе культуральной среды. Культивационная среда для выращивания в биореакторе не содержала сыворотку, однако была снабжена раствором белков плазмы крови человека, которые могут быть контаминированы вирусами человека и прионами. Кроме того, раковые культивируемые клетки человека также могут быть источниками вирусных инфекций и не являются оптимальными предшественниками для получения промышленных линий-продуцентов фармацевтических белков (патентная заявка США US 2006/0099685 A1 п. 0058).
Краткое описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание высокопродуктивной технологии получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена для биофармацевтического производства.
Технический результат достигался путем создания новой экспрессионной плазмидной ДНК p1.1-F8BDD, кодирующей открытую крамку считывания белка фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена, и создания на ее основе клональной клеточной линии-продуцента.
В основе данной технологии лежит разработанная плазмидная ДНК p1.1-F8BDD длиной 16282 п. о. (SEQ ID NO: 1, Фиг. 1), состоящая из:
- фрагмента ДНК длиной 4389 п. о., содержащего последовательность 4371 п. о. (SEQ ID NO: 1 6460-10830), кодирующую ОРС фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена и синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом, SEQ ID NO: 1 6451-6459), обеспечивающую инициацию трансляции мРНК,
- фрагмента 11893 п. о. плазмиды p1.1 (SEQ ID NO: 2, Фиг. 2), содержащего регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию целевого белка:
- 5' и 3' нетранслируемые области (НТО) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, включающие соответственно функциональный промотор (5' НТО) и терминатор и сигнал полиаденилирования (3'НТО) этого гена, а также фланкирующие нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающие эухроматинизацию сайтов инсерции и транскрипционную активность генетической кассеты в геноме СНО;
- последовательность фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата - дигидрофолатредуктазы (DHFR) и регуляторные элементы для экспрессии DHFR - последовательность IRES вируса энцефаломиокардита. (EMCV), обеспечивающая бицистронную экспрессию в животных клетках и сигнал полиаденилирования;
- область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla, обеспечивающей устойчивость бактерий к антибиотику ампициллину, позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в E.coli.
Плазмида p1.1-F8-BDD содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AscI (16), PvuI (1409), FseI (5213), AbsI (6446), PsiI (7737), NheI (10835).
Плазмида была введена в клетки СНО DG-44 методом липосомальной трансфекции (Straus S.E. et al, J. Virol., 1981, Jul; 39 (1): 290-4) при помощи культивирования в безбелковой среде, не содержащей гипоксантин и тимидин и дополнительно содержащей 50 нМ ингибитора DHFR метотрексата (МТХ), были получены олигоклональные линии стабильно трансфицированных клеток. Для отобранной олигоклональной линии с высокой продуктивностью была проведена амплификация кассеты в геноме путем последовательных культивирований в присутствии возрастающих концентраций метотрексата. Была получена поликлональная линия клеток, устойчивых к высокой концентрации метотрексата, и продуцирующая увеличенные количества целевого белка, и использована для клонирования методом предельного разведения. Полученные клоны клеток-продуцентов были проанализированы методами иммуноферментного анализа и коагулометрии и были отобраны клоны, дающие максимальный уровень экспрессии целевого белка. Среди них был выбран клон DG-P1.1-F8BDD-S3, при культивировании которого в суспензионной культуре в бессывороточной среде конечная активность В-домен делетированного фактора свертываемости крови VIII составляла 40±9 МЕ/мл при концентрации клеток 1,7 млн/мл. Полученная клеточная линия депонирована в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН, регистрационный номер №РККК(П) 756D.
Целью настоящего изобретения является предоставление плазмиды для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом, в частности плазмиды p1.1-F8BDD. Также целью настоящего изобретения является предоставление моноклональной линии клеток млекопитающего, в частности клеток яичника китайского хомячка, - продуцентов рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным B доменом, содержащей в геноме множественные копии экспрессионной кассеты, соответствующей линеаризованной экспрессионной плазмиде, в частности плазмиде p1.1-F8BDD. Иллюстративным примером указанной моноклональной линии клеток являются клетки яичника китайского хомячка клона DG-P1.1-F8BDD-S3.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В доменом с использованием указанных клеток.
Подробное описание настоящего изобретения
Для реализации настоящего изобретения главной технической задачей явилось создание технологии высокопродуктивного получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена для биофармацевтического производства с использованием культивируемых клеток яичника китайского хомячка, адаптированных к суспезионному культивированию в безбелковой среде, содержащих в геноме множественные копии генетической кассеты, представляющей собой линеаризованную экспрессионную плазмиду, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий фактор свертываемости крови VIII с делецией В-домена под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке.
Термин «экспрессионная плазмида» («экспрессионная плазмидная ДНК») означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в него гена, например, такие как промотор, терминатор, сигнал полиаденилирования. Конкретным примером генетических элементов, необходимых для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена в составе экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, является, но не ограничивается им, промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка.
Фрагментом ДНК, кодирующим рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII с делецией В-домена согласно настоящему изобретению, является ген, кодирующий ОРС полипептида фактора VIII с делецией В-домена, который может быть получен, например, как указано в Примере 1. Также указанный фрагмент ДНК может быть получен, например, с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке PCT WO 2005071077.
Последовательность гена, кодирующего ОРС рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена человека согласно настоящему изобретению, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1 (нуклеотиды 6460-10830). Аминокислотная последовательность секретируемого фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 3, и приведена на Фигуре 4, и представляет собой продукт трансляции нуклеотидов 6460-10830 последовательности ОРС SEQ ID NO: 1 без 19 первых аминокислот секреционного лидерного пептида. В-домен фактора VIII заменен на линкерный пептид длиной 14 аминокислот, частично отделяющийся в ходе пост-трансляционного процессинга фVIII BDD (SEQ ID NO: 3, аминокислоты 741-754), в котором первые пять аминокислот представляют собой аминокислотную последовательность N-концевого участка В-домена фVIII, а последующие девять аминокислот представляют собой аминокислотную последовательность С-концевого участка В-домена фVIII. Часть молекул зрелого секретированного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена человека согласно настоящему изобретению может содержать один или несколько протеолитических разрывов полипептидной цепи, преимущественно после остатка Arg740, и представлять собой двухцепочечную форму фактора свертываемости крови VIII. Степень превращения одноцепочечной формы в двухцепочечную не влияет на биологическую активность фактора свертываемости крови VIII, для целей настоящего изобретения эти формы полностью эквивалентны.
Чтобы обеспечить эффективную трансляцию гена в клетках китайского хомячка, предпочтительно, чтобы ОРС предварялась последовательностью для кэп-зависимой инициации трансляции (последовательность Козак), например, синтетической.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу тот же белок, могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 1 нуклеотиды 6460-10830), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько аминокислотных остатков в определенном сайте будут делетированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации. Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу такой же функциональный белок, могут быть выявлены путем экспрессии фрагментов ДНК, имеющих мутацию, описанную выше, в соответствующей клетке и установления активности экспрессируемого продукта.
Фактор свертываемости крови VIII человека - это неэнзиматический кофактор системы свертывания крови, образующий плотный нековалентный комплекс с активрованным фактором IX и ускоряющий реакцию протеолитического расщепления фактора X до активированного фактора X. Природный фактор свертываемости крови VIII человека в кровотоке преимущественно циркулирует в двухцепочечной форме, то есть представляет собой гетеродимер тяжелой и легкой цепи, при этом тяжелая цепь может частично или полностью содержать область В-домена. Основные варианты тяжелой цепи природного фактора VIII имеют массу от 90 до 150 кДа, легкая цепь - около 80 кДа. Рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена в одноцепочечной форме имеет массу около 170 кДа, в двухцепочечной - около 90 кДа у тяжелой цепи и около 80 кДа у легкой цепи. Рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII с делетированным В-доменом полностью сохраняет прокоагулянтную активность, при этом его удельная прокоагулянтная активность, выраженная в международных единицах на один миллиграмм чистого белка, выше на 20-40% из-за меньшей молекулярной массы делетированного варианта.
Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный белок обладает свойствами рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека, определяются по его способности уменьшать время свертывания (коагуляции) плазмы крови человека с удаленным фактором VIII. Так, например, активность рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека можно детектировать по уменьшению времени образования сгустка в плазмы крови с удаленным фактором VIII после смешивания исследуемого раствора фактора VIII, плазмы крови с удаленным фактором VIII, контактного активатора свертывания эллаговой кислоты и раствора хлорида кальция. Время свертывания плазмы, смешанной с несколькими разведениями исследуемого раствора, и сопоставляют измеренные времена образования сгустка с временами образования сгустка, полученными для нескольких разведений стандарта активности фактора VIII - нормальной плазмы крови или раствора изолированного фактора VIII. Концентрацию фактора VIII человека определяют при помощи иммуноферментного анализа в сравнении со стандартом - плазмой крови или раствором очищенного фактора VIII с известным содержанием. Удельную активность фактора VIII определяют как отношение прокоагулянтной активности и концентрации фактора VIII и выражают в МЕ/мг. Считается, что вариант белка обладает свойствами рекомбинантного фактора VIII свертываемости крови человека при условии, что удельная активность указанного варианта составляет не ниже 1% от удельной активности природного фактора VIII человека, то есть не менее 50 МЕ/мг.
Экспрессионная плазмида согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК, кодирующий фактор свертываемости крови VIII с делецией В-домена под контролем промотора и регуляторных элементов, функционирующих в эукариотической клетке. В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к экспрессии в клетке-реципиенте, такие как плазмиды pcDNA3.1, pCMV-Myc, pDEF38 и подобные им, но список плазмид не ограничивается ими.
Конкретным вариантом реализации настоящего изобретения является плазмида p1.1-F8BDD длиной 16282 п. о. (SEQ ID NO 1), которая содержит следующие функциональные элементы, перечисленные в порядке их расположения:
1. область начала репликации плазмиды pUC (150-283), открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla (965-1924), позволяющие проводить препаративную наработку плазмиды в Е. coli;
2. участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), представляющий собой фрагмент конкатемера терминальных повторов вируса Эпштейна-Барр (1960-2361), обеспечивающей увеличение частоты интеграции генетической кассеты в геном клеток СНО и увеличение скорости амплификации кассеты в геноме;
3. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «выше по течению» (2373-6443), включающий нетранскрибируемые области этого гена, промотор этого гена, первый интрон этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фактора VIII человека в геноме клеток СНО;
4. синтетическую последовательность Козак (сайт связывания рибосом) (6451-6459), обеспечивающую кэп-зависмую инициацию трансляции мРНК в животных клетках;
5. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена (6460-10830);
6. последовательность внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита EMCV (10855-11442), обеспечивающая кэп-независимую инициацию трансляции второго цистрона бицистронной РНК в животных клетках;
7. последовательность, кодирующую открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (11456-12018) - фактора устойчивости трансфецированных клеток к воздействию метотрексата;
8. фрагмент последовательности, фланкирующей ген фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка «ниже по течению» (12020-16278), включающий терминатор и сигнал полиаденилирования, а также нетранскрибируемые области этого гена, обеспечивающий конститутивную экспрессию гена фактора VIII человека в геноме клеток СНО.
Плазмида p1.1-F8-BDD содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AscI (16), PvuI (1409), FseI (5213), AbsI (6446), PsiI (7737), NheI (10835).
Структура плазмиды p1.1-F8-BDD приведена на Фигуре 1.
Плазмида p1.1-F8-BDD сконструирована на базе экспрессионной плазмиды p1.1, разработанной авторами настоящего изобретения ранее и подробно описанной в патентной заявке РФ 2011146243, целиком включенной в настоящее описание посредством ссылки. Плазмида p1.1 содержит функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена в клетках СНО, фланкированные 5' и 5' НТО этого гена, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), обеспечивающий реинициацию трансляции на бицистронной мРНК в клетках млекопитающих и полное генетическое сцепление уровней продукции целевого белка и DHFR; ОРС DHFR мыши, экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR) и обеспечивающую устойчивость стабильно трансфицированных клеток к отсутствию в среде тимидина и дозозависимую устойчивость к воздействию метотрексата (МТХ), что позволяет вести направленную селекцию высокопродуктивных клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме СНО; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и ускорение процесса амплификации амплификации целевого гена в геноме под действием МТХ. Использование плазмиды p1.1 позволяет осуществлять высокочастотную интеграцию и ускоренную амплификацию экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, а также получать линии-продуценты с высоким уровнем продукции целевого белка и высокой стабильностью.
При помощи созданной плазмиды согласно настоящему изобретению, в частности плазмиды p1.1-F8-BDD, можно трансформировать эукариотическую клетку, предпочтительно иммортализованную клетку китайского хомячка. Выбор конкретной линии клеток не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. После проведения одного или нескольких раундов селекции и клонирования популяции трансформированных клеток могут быть получены клональные линии-продуценты рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека. Методология и приемы селекции и клонирования клеток известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования и селекции трансформантов уровень экспрессии фактора свертываемости крови VIII человека может варьироваться, факт транзиентной экспрессии целевого белка будет иметь место при условии успешной трансформации клетки- реципиента, факт стабильной экспрессии целевого белка будет иметь место при успешном проведении раунда селекции популяции клеток-трансформантов.
«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например электропорацию, использование трансфекционных агентов, например метод, описанный в техническом документе компании Invitrogen, Inc. "Lipofectamine® 2000 Reagent" Pub. No. MAN0000995 Rev. Date 20 July 2012.
Согласно настоящему изобретению «клеточная линия - продуцент фактора свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом» означает клональную линию клеток млекопитающих, обладающую способностью к продукции и секреции фактора свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом, когда она согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «клеточная линия - продуцент фактора свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом» также означает линию клеток, которые способна секретировать фактор свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом в количестве не менее чем 5 МЕ/мл при концентрации клеток 1-2 млн/мл, более предпочтительно не менее чем 20 МЕ/мл при концентрации клеток 1-2 млн/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Указанный фактор свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом секретируется указанными клетками в культивационную среду.
Среди клеток млекопитающих предпочтительно использование клеток китайского хомячка (Cricetulus griseus), предпочтительно клеток яичника (СНО). В качестве примера предпочтительных клеток яичника китайского хомячка может быть приведена линия СНО DG44 (Invitrogen cGMP banked, США; Mol Cell Biol 5, 1750-1759 Kaufman RJ et al. 1985). Круг сублиний СНО не ограничен каким-либо образом, например, могут быть использованы сублинии СНО CHOZN DHFR, СНО DUKX B11 и подобные им.
Конкретным примером линии для получения продуцента фактора свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом согласно настоящему изобретению является линия СНО DG44, но спектр линий клеток не ограничиваются ей.
Линия СНО DG44 характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками:
- Данные по видовой принадлежности: китайский хомячок Cricetulus griseus, яичник.
- Контроль видовой идентичности: кариологический, изоферментный (ЛДГ и Г6ФДГ).
- Маркерные признаки и методы их оценки: иммунологические, цитогенетические, биохимические, физиологические:
- Морфология: эпителиоподобная.
- Кариология: 2n=22, пределы изменчивости по числу хромосом 10-28, модальное число хромосом 22, псевдодиплоид, имеются микрохромосомы, количество полиплоидов 9,0%.
- Биохимия: Дигидрофолатредуктазная активность по резистентности к метотрексату.
- Условия выращивания: среда - бессывороточная, определенного химического состава, CD Opti СНО (Invitrogen, США), температура - +37°C, концентрация CO2 - 8%, скорость перемешивания - 120-130 об/мин.
- Культуральные свойства: способ культивирования - суспензионный, посевная доза - 300000 на мл., кратность рассева - 1:2-1:6, процедура пересева - центрифугирование суспензии на скорости 1200 об/мин, 5 мин, ресуспендирование в новой ростовой среде. Оптимальная плотность 1,0-1,2×106 клеток/мл.
Трансформация клеток линии СНО DG44 плазмидой p1.1-F8BDD с последующей селекцией и клонированием приводит к получению клеточных линий-продуцентов рекомбинантного фактора VIII человека с делетированным В-доменом.
Линия-продуцент DG-P1.1-F8BDD-S3 обеспечивает синтез и секрецию рекомбинантного фактора VIII человека с делетированным В-доменом в количестве 40±9 ME конечной активности В-домен делетированного фактора свертываемости крови VIII на 1 мл среды при концентрации клеток 1,7 млн/мл при культивировании в суспензионной культуре в бессывороточной среде. Линия-продуцент DG-P1.1-F8BDD-S3 депонирована в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН, регистрационный номер №РККК(П) 756D.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантного фактора VIII человека с делетированным В-доменом в клетках млекопитающих, включающего культивирование в питательной среде описанных выше клеток млекопитающих - продуцентов рекомбинантного фактора VIII человека с делетированным В-доменом, и выделение полученного целевого рекомбинантного белка из культуральной жидкости.
Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.
Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Для получения фармацевтически значимого рекомбинантного фактора VIII человека с делетированным В-доменом предпочтительно использование бессывороточной питательной среды для культивирования.
Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием CO2 (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°C, предпочтительно в пределах от 30 до 38°C. Обычно, выращивание в течение от 12 часов до 4 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде или в цитоплазме клетки.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищен методами хроматографии и/или концентрирования.
Особенности созданной экспрессионной плазмиды, линии клеток и результаты практического применения изобретения приведены на следующих фигурах.
Краткое описание Фигур.
На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1-F8BDD. Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBV TR - участок терминального повтора вируса Эпштейна-Барр человека; CHOEEF1AUFR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 5' нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; transcription start - точка начала транскрипции, TATA - ТАТА-бокс, СНО EEF1A intron 1 - первый интрон гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV); DHFR - открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках; CHOEEF1ADFR - функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, 3' нетранслируемая область этого гена и нетранскрибируемая область, фланкирующая этот ген; Kozak - область, кодирующая последовательность Козак для кэп-зависимой инициации трансляции, F8-BDD ORF - ОРС фактора VIII с делетированным В-доменом. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионного вектора p1.1. Используются обозначения аналогично фигуре 1.
На Фигуре 3 показана схема получения плазмид p1.1-F8BDD. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, кольцевые плазмиды обозначены кружками, линейные фрагменты ДНК - прямоугольниками; названия использовавшихся для клонирования эндонуклеаз рестрикции, указаны курсивом, названия олигонуклеотидных праймеров использовавшихся при ПЦР указаны прямым шрифтом.
На Фигуре 4 показана аминокислотная последовательность полипептида, секретируемого клетками DG-P1.1-F8BDD-S3 (продукт экспрессии плазмиды с p1.1-F8BDD без секреционного лидерного пептида).
На Фигуре 5 приведены результаты иммуноблотинга секретированного и внутриклеточного фVIII BDD для линии 3-В8. Используются следующие обозначения: «heavy chain» и «light chain» - гибридизация с моноклональными антителами к тяжелой и легкой цепи фVIII соответственно; "CMV» и «CHEF1» - образцы, соответствующие клеткам линии DG-BDDFVIII-18 (промотор CMV, описана в патенте РФ RU 2429294) и 3-В8 (промотор CHEF1) соответственно. Приведенные для каждого из антител дорожки соответствуют одной мембране, разделение в 7.5% ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях, молекулярные массы указаны в кДа.
На Фигуре 6 приведена электрофореграмма белковых фракций промывок колонок и элюатов при очистке фVIII. Восстанавливающие условия, окраска Кумасси синим. Исследуемые фракции сконцентрированы и обессолены переосаждением белков трихлоруксусной кислотой. Используются следующие обозначения: полосы легкой цепи - LC, полоса тяжелой цепи - НС, полоса одноцепочечного предшественника - HC+LC. ММС wash - фракции промывки колонки Capto ММС, SP el - фракции элюции колонки Sepharose SP, VIII ff - фракция проскока для колонки VIII Select, VIII el - фракция элюции с колонки VIII Select, М - маркер молекулярных масс. Молекулярные массы указаны в кДа.
Практическая применимость настоящего изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение генетической конструкции p1.1-F8BDD, кодирующей белок человеческого фактора свертываемости крови VIII с делецией В домена, для трансфекции линии клеток CHO-DG-44.
Получение экспрессионной конструкции проводили согласно общей схеме, представленной на Фиг. 3. Для получения ОРС фактора VIII с делегированным В-доменом методом ПЦР со специфических праймеров O1KpnIfor и O1HindIIIrev, 02HmdIIIfor и 02B1pIrev (SEQ ID NO:4-7, соответственно) были получены два ПЦР-продукта F1 и F2, фланкирующие область делеции. В качестве матрицы использовали коммерчески доступный клон pCMV6-XL4/NM_000132. Олигонуклеотиды были синтезированы ЗАО ″Евроген″, РФ. ПЦР проводили при помощи смеси Tersus polymerase mix (ЗАО ″Евроген″, РФ) на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reseach, США).
ПЦР продукты очищали используя набор реактивов ″Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System″ (″Promega″, США) по протоколу производителя, и клонировали в вектор pAL-ТА (Евроген) ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва) по методике производителя фермента. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма DH5α, с генотипом F-φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relAl. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е. coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42°C на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC (20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 250 мМ KCl, 10 мМ MgCl2) и инкубировали при 37°C 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой 2xYT-агар (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 18 г/л агара), содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, и помещали в термостат на 37°C на 18 часов. Отдельные клоны трансформантов инокулировали в 5 мл питательного бульона LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, наращивали 18 часов при 37°C и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по протоколу производителя. Полностью секвенировали области вставки полученных плазмид с праймеров Т7 и SP6 с использованием набора BigDye Terminator v. 3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, США) и капиллярного секвенатора ABI PRISM 3730 genetic analyzer (Applied Biosystems, США), анализ данных вели при помощи программы Chromas 1.45 (Technelysium Pty Ltd, Australia).
Фрагмент F3 fVIII получали без использования ПЦР, при препаративной рестрикции плазмиды pCMV6-XL4/NM_000132, эндонуклеазами NotI и KpnI. Продукты рестрикции смешивали 6:1 с буфером для нанесения «6х Loading dye» («Fermentas», Литва) и проводили разделение в 1% агарозном геле с добавлением бромистого этидия (0,4 мкг/мл). Для выделения ДНК полосу, визуализированную при помощи УФ, вырезали из агарозного геля, помещали в пробирку объемом 1,5 мл, после чего проводили выделение ДНК, ноабором реактивов "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) согласно по протоколу производителя.
Сборку фрагментов F1-F3 проводили в векторе pAL-TA с образованием плазмиды pALTA/F123. Отбор клонов Е. coli проводился методом ПЦР с клонов с использованием праймера Odelf и стандартных праймеров к последовательности вектора T7prom (SEQ ID NO: 9) и SP6 (SEQ ID NO: 10). ПЦР с колоний Е. coli проводили с использованием набора реактивов «ScreenMix-HS» (ЗАО Евроген, Россия), по методике производителя, помещая образцы бактериальных клонов в пробирки с 10 мкл готовой смеси для ПЦР. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, позитивные клоны наращивали в 5 мл среды LB с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл 18 часов при 37°C и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов "Wizard Plus SV Minipreps" («Promega», США) по протоколу производителя. Полностью секвенировали области вставки полученных плазмид с праймеров T7prom (SEQ ID NO: 9) и SP6 (SEQ ID NO: 10) и специфического праймера Odelf (SEQ ID NO: 8), как описано выше.
Полученный исскуственный фрагмент гена В-домен делетированного фактора VIII лигировали с рестрицированной по сайту BlpI и дефосфорилированной плазмидой pOptivec/F8.
Для создания плазмиды pOptivec/F8 использовался вектор pOptivec, полученный путем рециркуляризации линейного вектора pOptivec-TOPO (Invitrogen, США) при инкубации в деионизованной воде 30 минут с последующим лигированием ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва) по методике производителя фермента. Плазмида pOptivec была рестрицирована эндонуклеазой NotI и лигирована с фрагментом NotI-NotI плазмиды pCMV6-XL4/NM_000132 (Origene, США) с образованием плазмиды pOptivec/F8. Фрагмент BlpI-BlpI pOptivec/FS был заменен на фрагмент BlpI-BlpI pALTA/F123 с образованием плазмиды pOptivec/F8BDD. ПЦР-анализ колоний вели с использованием двух пар специфических праймеров 8sq4f (SEQ ID NO: 11) и 8sq5r (SEQ ID NO: 12) или CMV for (SEQ ID NO: 13) и 8sq15r (SEQ ID NO: 14). При помощи праймеров AD-8-AbsF (SEQ ID NO: 15), и AD-ONheI-R (SEQ ID NO: 16), и pOptivec/F8BDD в качестве матрицы получили ПЦР-продукт, содержащий открытую рамку считывания фактора VIII свертываемости крови человека с делетированным В-доменом. Полученный продукт ПЦР клонировали в вектор PAL-TA и анализировали секвенированием области вставки, используя праймеры к последовательностям вектора T7prom (SEQ ID NO: 9) и SP6 (SEQ ID NO: 10), а также специфические праймеры к последовательности гена фактора VIII делетированным В-доменом - 8sq1f, 8sq2f, 8sq3f (SEQ ID NO: 17-19 соответственно), 8sq4f (SEQ ID NO: 11), 8sq5f, 8sq12f, 8sq13f, 8sq14f, 8sq15f (SEQ ID NO: 20-24 соответственно), 8sq5r (SEQ ID NO: 12), 8sq15r (SEQ ID NO: 14), 8sq2r, 8sq3r, 8sq4r, 8sq12r, 8sq13r, 8sq14r (SEQ ID NO: 25-30 соответственно). После обнаружения клонов с корректной нуклеотидной последовательностью области вставки плазмиду PAL-F8BDD рестрицировали AbsI и NheI и переносили фрагмент, содержащий ОРС F8BDD с участком консенсусной последовательности Козак в рестрицированный эндонуклеазами AbsI и NheI вектор p1.1 (SEQ ID NO: 2) с образованием экспрессионной плазмиды p1.1-F8BDD (SEQ ID NO: 1). Открытую рамку считывания делеционного варианта BDD-FVHI, а также области основных функциональных элементов экспрессионной конструкции секвенировали, как описано выше. Для секвенирования области ОРС и функциональных элементов экспрессионной плазмиды использовали специфические праймеры к последовательности гена фактора VIII делетированным В-доменом - 8sq1f, 8sq2f, 8sq3f (SEQ ID NO: 17-19 соответственно), 8sq4f (SEQ ID NO: 11), 8sq5f, 8sq12f, 8sq13f, 8sq14f, 8sq15f (SEQ ID NO: 20-24 соответственно), 8sq5r (SEQ ID NO: 12), 8sq15r (SEQ ID NO: 14), 8sq2r, 8sq3r, 8sq4r, 8sq12r, 8sq13r, 8sq14r (SEQ ID NO: 25-30 соответственно), а также праймеры к последовательностям вектора SQ-3CH1-R, SQ-5CH6-F, IRESArev (SEQ ID NO: 31-33 соответственно). Результаты сравнивали с теоретически предсказанными последовательностями гена фактора FVIII свертываемости крови человека с делетированным В-доменом и соответствующих регуляторных элементов, нуклеотидных замен не было обнаружено.
Полученная экспрессионная конструкиця фактора свертываемости VIII человека с делетированым В-доменом в векторе p1.1-F8BDD имеет размер 16282 п. о. и содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции AscI (16), PvuI (1409), FseI (5213), AbsI (6446), PsiI (7737), NheI (10835). Данная конструкция предназначена для трансфекции эукариотических клеток геном фактора свертываемости VIII человека с делетированым В-доменом с последующим отбором и амплификацией по сцепленному признаку DHFR+. Сообщает клеткам-реципиентам следующие фенотипические признаки: при трансформации прокариот - устойчивость к ампицилину, карбенициллину; при трансфекции эукариот ограниченная устойчивость к метотрексату, увеличивающаяся при селективном отборе, экспрессия рекомбинантного фактора FVIII свертываемости крови человека с делетированным В-доменом.
Созданную генетическую конструкцию использовали для получения линии-продуцента.
Пример 2. Получение первичных поликлональных линий клеток СНО DG-44, стабильно трансфицированных плазмидой p1.1-F8BDD.
Экспрессионная плазмида p1.1-F8BDD, кодирующая рекомбинантный фактор свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена по варианту SQ, была сконструирована по методике, приведенной в Примере 1, выращена в препаративных количествах в штамме E.coli ТОР 10 (Invitrogen, Ltd., США), очищена при помощи набора EndoFree Plasmid MaxiKit, (Qiagen, США), линеаризована эндонуклеазой рестрикции Pvul (Fermentas, Литва) с разрушением гена бета-лактамазы и стерилизована фильтрованием.
Клетки линии CHO-DG-44 (Invitrogen, Ltd., США) культивировали в безбелковой среде CD DG-44 (Gibco, США) с 8 тМ L-глутамина и 0,018% сурфактанта Pluronic F-68 (BASF Inc., США). Данная культуральная среда содержит достаточные количества гипоксантина и тимидина для поддержания роста клеток, дефектных по гену dhfr. Клетки выращивали в стерильных одноразовых колбах Эрленмеера (30 мл суспензии в колбах вместимостью 125 мл) на орбитальной качалке при 130 об/мин в атмосфере, содержащей 8% углекислого газа при температуре 37°C. Подсчет плотности клеточной суспензии и доли живых клеток проводится в счетной камере Горяева, при окрашивании трипановым синим. Пассирование культуры проводили по достижении плотности 1,2 млн клт/мл, посевная концентрация 0,3 млн клт/мл. За 48 ч и 24 ч до трансфекции клетки дополнительно пассировали до посевной концентрации 0,3 млн клт/мл.
Трансфекцию линеаризованной плазмиды p1.1-F8BDD проводили при помощи липосомного реагента Unfectin-56 (Unifect Group, Россия) в бессывороточной среде CD DG-44 (Invitrogen), используя 1,5×107 клеток в 30 мл среды в колбе Эрленмеера, 18 мкг плазмидной ДНК и 15 мкл трансфекционного агента. Смешивание ДНК и трансфекционного реагента проводили по методике производителя агента.
Культуру клеток выращивали 48 ч без смены среды, после чего отбирали аликвоту культуральной жидкости для определения концентрации фVIII (0,048 МЕ/мл по ИФА) и высевали клетки в лунки 96-луночных культуральных планшетов по 50 тыс. клеток на лунку в среду СНО A (Invitrogen) с 8 мМ аланил-глутамина («Invitrogen») и 50 нМ метотрексата, по 200 мкл среды в лунку и растили 14 дней при 37°C, 5% CO2. После прохождения селекции стабильно трансфицированных клеток, делящихся в отсутствие гипоксантина и тимидина и в присутствие ингибитора DHFR метотрексата, в лунках с крупными делящимися колониями клеток отбирали культуральную среду для определения концентрации секретированного фVIII методом иммуноферментного анализа. В 96 лунках, содержащих фVIII в максимальной концентрации (от 0,1 до 1 МЕ/мл), проводили замену среды и повторное тестирование через 4 дня. Клетки из 48 лунок с наибольшей концентрацией фVIII пересаживали в лунки 24-луночных планшетов, выращивали до покрытия монослоем не менее 50% поверхности в 80% лунок и повторно тестировали методом ИФА. Клетки из 18 лунок с наибольшей концентрацией фVIII переносили в лунки 6-луночных неадгезионных планшетов и вносили в лунки по 5 мл среды Opti СНО (Invitrogen) с 8 мМ аланил-глутамина («Invitrogen») и 50 нМ метотрексата. Поскольку среда Opti СНО содержит сурфактант Pluronic F-68, клетки теряют способность распластываться на дне лунок и образовывают неприкрепленный слой. Культуры растили до достижения концентрации клеток около 1 млн клт/мл, измеряли концентрацию секретированного фVIII и три наиболее продуктивные олигоклональные линии пересаживали в колбы Эрленмейера и в дальнейшем растили при постоянном перемешивании. Для дальнейшей работы была выбрана олигоклональная линия 3-В8 (Таблица 1), секретировавшая преимущественно корректно процессированные варианты цепей фVIII (Фигура 5).
| Таблица 1 | ||
| Концентрация секретированного фVIII для первичных олигоклональных линий-продуцентов. Измерение при помощи ИФА с моноклональными антителами против тяжелой цепи фVIII и поликлональными антителами против полной молекулы фVIII | ||
| Название образца | Концентрация фVIII, МЕ/мл | Стандартное отклонение, МЕ/мл |
| 2-F6 | 2,1 | 0,35 |
| 3-В8 | 5,4 | 0,37 |
| 4-Н6 | 2,2 | 0,09 |
Пример 3. Амплификация целевого гена под действием метотрексата и получение клональных линий-продуцентов фVIII.
Амплификацию целевого гена в геноме клеток отобранной линии 3-В8 проводили в суспензионной культуре, добавляя в культуральную среду метотрексат в возрастающих концентрациях до момента падения жизнеспособности культуры. При обнаружении падения жизнеспособности культуру культивировали при постоянной концентрации метотрексата до восстановления жизнеспособности >85%, после чего концентрацию метотрексата удваивали. Процесс амплификации считали законченным, когда жизнеспособность клеток переставала восстанавливаться после 20 дней культивирования. Ход амплификации и показатели продуктивности культуры приведены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Динамика секреции фVIII при амплификации целевого гена | ||
| Название линии/ популяции клеток | Концентрация метотрексата на момент измерения | Уровень секреции фVIII, МЕ/мл |
| 3-В8 | 50 нМ | 5,4±0,4* |
| 3-В8 1К | 1 мкМ | 20,1* |
| 3-В8 1К 4К | 4 мкМ | 18,6** |
| 13B4F | 50 нМ→500 нМ→1 мкМ→4 мкМ→клонирование | 39,0±5,5*** |
| 11А4Н | 50 нМ→500 нМ→1 мкМ→4 мкМ→клонирование | 39,4±3,4*** |
| 21А7В | 50 нМ→500 нМ→1 мкМ→4 мкМ→клонирование | 34,4±0,8*** |
| Примечания: | ||
| * - измерение концентрации фVIII по ИФА, стандарт - полноразмерный рекомбинантный фVIII. | ||
| ** - измерение активности фVIII одностадийным коагулометрическим методом. | ||
Полученная поликлональная популяция клеток 3-В8 1K 4К была использована для получения клональных линий-продуцентов методом предельного разведения. Клетки клонировали в условиях адгезионного культивирования в среде CD СНО-А с 8 мМ аланил-глутамина («Invitrogen»), по 200 мкл среды в каждую лунку планшета при 37°C, 5% CO2 в течение 21 дня. Метотрексат не включали в состав среды при клонировании и не использовали при дальнейшем культивировании. Рост одиночных колоний наблюдали и документировали на 14-й день культивирования. В 10 планшетах было получено 361 одиночная колония. Выросшие колонии переносили в 24-луночные планшеты и при помощи ИФА осуществляли скрининг кондиционированной среды из лунок, содержащих активно растущие колонии. Клональные линии с наилучшими уровнями секреции продолжали растить в адгезионной культуре и затем реадаптировали к условиям суспензионного культивирования в течение трех последовательных пассажей в лунках 6-луночных планшетов, используя среду Pro СНО 4 (Lonza, США) с 8 мМ L-глутамина. Скрининг кондиционированной среды из лунок 6-луночных планшетов проводили при помощи ИФА и коагулометрического измерения активности фVIII. Три выбранные линии с высокой продуктивностью и временем деления менее 40 ч выращивали в условиях суспензионного культивирования в перемешиваемых колбах Эрленмейера. Основные параметры трех отобранных линий приведены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| Основные свойства клональных линий-продуцентов фVIII | |||
| Название линии | Конечный уровень секреции фVIII, МЕ/мл* | Удельная продуктивность, МЕ/млн клт/день* | Время деления, ч |
| 13B4F | 39,0±5,5 | 6,45 | 26 |
| DG-P1.1-F8 BDD-S3 (11А4Н) | 39,4±3,4 | 7,74 | 29 |
| 21А7В | 34,4±0,8 | 6,21 | 43 |
| Примечания: * - измерение активности фVIII хромогенным тестом. | |||
В качестве основной линии-продуцента был выбран клон 11А4Н, обладавший максимальной удельной продуктивностью и временем деления клеток менее 30 ч. Линия-продуцент была обозначена как DG-P1.1-F8 BDD-S3, сохранена в форме исследовательского клеточного банка в криоампулах, депонирована в Специализированную коллекцию культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур 05.02.2013 г. под номером РККК (П) 756Д. Линия DG-P1.1-F8 BDD-S3 была протестирована на постоянство уровня секреции при продолжительном культивировании. Было установлено, что конечная активность фVIII в кондиционированной среде, определяемая в моменты пассирования культуры, существенно не меняется в течение 60 дней последовательного культивирования (данные не приводятся). Таким образом, полученная клеточная линия потенциально пригодна для промышленного применения, т.е. сохраняет постоянную продуктивность на период времени, достаточный для подготовки посевного материала и проведения 10 циклов периодического культивирования в биореакторе большого объема.
Пример 4. Выделение целевого белка из супернатанта культуры линии DG-P1.1-F8BDD.
Препаративное культивирование линии DG-P1.1-F8BDD вели в перемешиваемых колбах Эрленмейера с использованием бессывороточной среды Pro СНО 4 с добавлением 8 мМ L-глютамина. Проводили посев культуры на плотности 0,3 млн клт/мл и заменяли 7/8 объема культуральной суспензии каждые 96 ч на свежую культуральную среду.
Получаемые порции клеточной суспензии немедленно осветляли центрифугированием и наносили на колонку с сорбентом Capto ММС (GE Healthcare, США). Колонку промывали высокосолевым раствором и элюировали фVIII раствором, содержащим 50% этиленгликоля и 0,8 М аргинина гидрохлорида. Элюат разбавляли водой в 12 раз и наносили на колонку SP Sepharose FF (GE Healthcare), колонку промывали раствором, содержащим 0,15 М NaCl, и элюировали фVIII раствором, содержащим 0,4 М NaCl. К раствору полуочищенного целевого белка добавляли маннитол до конечной концентрации 0,2 М и полученный стабилизированный раствор замораживали и хранили для последующей очистки.
Объединенные порции замороженного раствора полуочищенного фVIII подвергали окончательной очистке при помощи аффинного сорбента VIII Select (GE Healthcare) по инструкции производителя сорбента. Элюированный с аффинной колонки раствор целевого белка разбавляли водой в 12 раз, наносили на колонку с сорбентом Capto Q (GE Healthcare), удаляли протеолитические фрагменты фVIII промывкой раствором, содержащим 0,3 М NaCl, после чего к выходу колонки присоединяли колонку с гель-фильтрационным сорбентом Superdex 200 (GE Healthcare), предварительно уравновешенную изотоническим раствором, содержащим все вспомогательные вещества для получения лекарственной формы фVIII (хлорид натрия, сахарозу, хлорид кальция, гистидин гидрохлорид, полисорбат-80). Проводили элюцию фVIII с колонки Capto Q при помощи раствора, содержащего 0,4 М NaCl, и продолжали подавать элюирующий раствор на тандемно соединенные колонки до выхода фракции мономера фVIII с гель-фильтрационной колонки. Полученный раствор очищенного мономерного фVIII разделяли на аликвоты и замораживали. В образцах элюата со всех стадий очистки определяли активность фVIII, содержание общего белка по методу Брэдфорд, содержание белков штамма-продуцента и ДНК штамма-продуцента. Основные параметры очистки фVIII приведены в Таблице 4, результаты гель-электрофореза фракций элюата и промывки колонок приведены на Фигуре 6.
| Таблица 4 | |||||||
| Показатели фракций элюата фVIII по стадиям хроматографической очистки | |||||||
| Тип хроматографии | Сорбент | Объем, мл | Белок, мг/мл | Активность, МЕ/мл* | Удельная активность, МЕ/мг | Выход стадии | Выход общий |
| Культуральная среда | - | 320 | - | 36,3 | - | - | - |
| Мультимодальная анионообменная | Capto ММС | 17 | 0,233 | 496,9 | 2133 | 73% | 73% |
| Катионообменная | SP Sepharose | 10 | 0,271 | 538,1 | 1986 | 64% | 46% |
| Аффинная | VIII Select | 11 | 0,046 | 382,0 | 8304 | 78% | 36% |
| Анионообменная+гель-фильтрация | Capto Q+Superdex 200 | 10 | 0,026** | 284,1 | 10925 | 68% | 24% |
| Примечание: | |||||||
| * - активность фVIII определена одностадийным коагулометрическим методом, 1 МЕ при определении данным методом эквивалента 1,4 МЕ, определенной хромогенным методом для делеционных вариантов фVIII. | |||||||
| ** - концентрация общего белка определена по оптической плотности раствора на 280 нм. | |||||||
Полученный прототип формулированного раствора активной фармацевтической субстанции фVIII обладал удельной активностью около 11 тыс. МЕ/мг общего белка при измерении одностадийным методом, что соответствует фармакопейным требованиям для лекарственных препаратов делеционного варианта фVIII.
Описанные в настоящих примерах методики применимы для создания линий клеток-продуцентов рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делецией В-домена на основе любых эукариотических клеточных линий, имеющих генетический нокаут гена dhfr, как прикрепленных, так и суспензионных, а также трансфецированных как описанным методом, так и с использованием других липосомальных агентов, а также методами кальций-фосфатной трансфекции, нуклеофекции или микроинъекции.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Claims (10)
1. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом в клетках яичника китайского хомячка (СНО), нокаутных по гену дигидрофолатредуктазы, в следующей последовательности по существу состоящая из области начала репликации плазмиды pUC, открытой рамки считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотического промотора гена bla; участка терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функционального промотора и первого интрона гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 5′ нетранслируемой областью этого гена; консенсусной последовательности Козак; открытой рамки считывания гена, кодирующего фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом; внутреннего сайта связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытой рамки считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом (IRES DHFR); и функционального терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 3′ нетранслируемой областью этого гена.
2. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что ген фактор свертываемости крови VIII человека кодирует полипептид фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В доменом, последовательность аминокислот которого приведена в SEQ ID NO: 3.
3. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.
4. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дигидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.
5. Плазмида по п. 1, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является вектор p1.1-F8BDD, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.
6. Клетка яичника китайского хомячка (СНО) - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом, трансформированная плазмидой по пп. 1-5.
7. Клетка по п. 6, отличающаяся тем, указанной клеткой является клетка яичника китайского хомячка моноклональной линии DG-P1.1-F8BDD-S3, депонированной в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН под регистрационным номером №РККК (П) 756Д.
8. Способ получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делетированным В-доменом, включающий следующие стадии:
- культивирование в питательной среде клеток по п. 6; и
- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.
- культивирование в питательной среде клеток по п. 6; и
- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что культивируют клетки яичника китайского хомячка моноклональной линии DG-P1.1-F8BDD-S3, депонированной в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН, регистрационный номер №РККК (П) 756Д.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что питательная среда для культивирования является бессывороточной.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123459/10A RU2561466C2 (ru) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013123459/10A RU2561466C2 (ru) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2013123459A RU2013123459A (ru) | 2014-11-27 |
| RU2561466C2 true RU2561466C2 (ru) | 2015-08-27 |
Family
ID=53381225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013123459/10A RU2561466C2 (ru) | 2013-05-22 | 2013-05-22 | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2561466C2 (ru) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110172442B (zh) * | 2019-05-16 | 2022-05-13 | 上海苹谱医疗科技有限公司 | 一种人诱导多潜能干细胞、构建方法及其用途 |
| CN114195904B (zh) * | 2021-12-27 | 2022-12-06 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种生产长效重组人凝血因子viii的重组细胞的分批补料培养方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2337965C2 (ru) * | 2006-08-07 | 2008-11-10 | Государственное учреждение Гематологический научный центр (ГНЦ) РАМН | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая последовательность белка фактора vii человека, линия клеток внк/f7, трансформированная плазмидной днк |
| RU2429294C2 (ru) * | 2009-10-23 | 2011-09-20 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА |
-
2013
- 2013-05-22 RU RU2013123459/10A patent/RU2561466C2/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2337965C2 (ru) * | 2006-08-07 | 2008-11-10 | Государственное учреждение Гематологический научный центр (ГНЦ) РАМН | Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая последовательность белка фактора vii человека, линия клеток внк/f7, трансформированная плазмидной днк |
| RU2429294C2 (ru) * | 2009-10-23 | 2011-09-20 | Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ORLOVA N.A. et al., Stable Expression of Recombinant Factor VIII in CHO Cells Using Methotrexate-Driven Transgene Amplification, Acta Naturae, 2012, v.4, n.1, p.93-100. ОРЛОВА Н.А. и др., Высокопродуктивная линия-продуцент фактора свертывания крови VIII человека на основе вектора с нетранслируемыми областями гена фактора элонгации трансляции 1 альфа китайского хомячка, Материалы Международной конференции "Биология"наука XXI века", Москва, 2012, с. 655-656. DB "EBI Dbfetch" N * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2013123459A (ru) | 2014-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7610948B2 (ja) | 改変された幹細胞メモリーｔ細胞、その作製方法およびその使用方法 | |
| EP3289081B1 (en) | Compositions and methods for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders | |
| ES2230908T3 (es) | Procedimiento para la preparacion de celulas recombinantes. | |
| AU2017224111A1 (en) | Transposon system and methods of use | |
| ES2574584T3 (es) | Transfección estable sin suero y producción de proteinas humanas recombinantes en líneas celulares humanas | |
| JP2014012014A (ja) | 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ） | |
| US20230383276A1 (en) | Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor | |
| JP7026906B2 (ja) | 転写調節融合ポリペプチド | |
| CN105593239A (zh) | 选择真核宿主细胞的新型选择载体和方法 | |
| US20250049854A1 (en) | Cells comprising a suppressor of gene expression and/or a syntheticpathway activator and/or an inducible payload | |
| JP2009538144A (ja) | 真核細胞株を用いたタンパク質産生 | |
| RU2561466C2 (ru) | Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом в клетках сно, клетка сно - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора | |
| US20190233843A1 (en) | Transposon system and methods of use | |
| JP2021137015A (ja) | 治療用タンパク質の製造方法 | |
| RU2488633C1 (ru) | ЭКСПРЕССИОННЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНОЙ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ, ВЫСОКОЧАСТОТНОЙ ИНТЕГРАЦИИ И УСИЛЕННОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ЭКСПРЕССИОННОЙ КАССЕТЫ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, БИЦИСТРОННАЯ мРНК, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ ЛИНИЙ ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННОГО ВЕКТОРА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ | |
| RU2429294C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ pOptivec/F8BDD, КОДИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-OV-F8BDD-18, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ФАКТОР СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ VIII ЧЕЛОВЕКА С ДЕЛЕЦИЕЙ В-ДОМЕНА | |
| JP3449418B2 (ja) | 内因性レトロウイルス様配列内への遺伝子標的化による発現の増大 | |
| RU2469093C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pCID-PROC, КОДИРУЮЩАЯ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА, И КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ DG-CID-PROC-1, ПРОДУЦИРУЮЩАЯ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2646111C2 (ru) | Экспрессионный плазмидный лентивирусный вектор для гетерологической экспрессии рекомбинантного человеческого белка cd44 | |
| CN120249403A (zh) | 一种在cho细胞中整合基因的方法及其应用 | |
| RU2500818C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рАР227, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, ЛИНИЯ КЛЕТОК Cricetulus griseus CHO 2H5 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ФАКТОРА VIII СВЕРТЫВАЕМОСТИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА VIII | |
| CN105400819A (zh) | 一种细胞可回复性永生化的多顺反子载体及其构建方法 | |
| HK1256714B (en) | Methods of manufacturing therapeutic proteins | |
| BR122025004697B1 (pt) | Sistemas para modificar um genoma eucariótico, pluralidade de ácidos nucleicos, vetor, e proteína de fusão | |
| Thalmann | Identification of novel modulators towards high cell density and high-producing Chinese hamster ovary suspension cell cultures as well as their application in biopharmaceutical protein production |