CN114195904B

CN114195904B - 一种生产长效重组人凝血因子viii的重组细胞的分批补料培养方法

Info

Publication number: CN114195904B
Application number: CN202111620095.3A
Authority: CN
Inventors: 费保进; 向雨秘; 聂艳桃; 梁洪
Original assignee: Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-12-06
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114195904A

Abstract

本发明提供了一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，包括在pH为6.7～7.05，溶氧量30％～50％，搅拌转速100～150rpm条件下，向含有细胞基础培养基中接种生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株，并多次补加含有Cell Boost 2和细胞基础培养基的补料培养基的步骤。本发明培养方法细胞活率高、培养周期长、发酵液体积大，且单位体积产长效重组人凝血因子VIII的产量高，具有非常好的产业化推广应用价值。

Description

一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的发酵培养方法。

背景技术

血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病,病症多为自发性或轻度外伤后出血不止,轻则造成患者终生残疾,重则短时间即可危及患者生命。血友病尚无根治办法,目前的治疗方法主要为替代疗法,通过长期输注血浆、缺失的凝血因子的方式来治疗。人凝血因子VIII(coagulation factor VIII，FVIII)是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，作为凝血因子IXa的辅因子，参与凝血因子X的激活。FVIII遗传性缺乏将导致甲型血友病(或血友病A)。静注FVIII制品替代治疗甲型血友病，是当前的主要治疗手段。由于静注天然结构的FVIII在体内半衰期短，预防性治疗需要一周静注3-4次，开发长效FVIII有助于提高治疗便利性和患者依从性。长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白能明显提高FVIII的稳定性和体内半衰期，达到降低预防性治疗每周用药频次的目的。目前，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是通过质粒转染生产长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的最主要载体细胞之一。

然而，凝血因子VIII的体外表达水平比在哺乳细胞中生产的其它重组蛋白质低至少两到三倍，导致其生产过程产能较低。为了满足大量的需求，往往通过对细胞克隆、培养介质的改进以期提高其体外表达水平，但改进难度大、成本高、周期长。因此，如果能通过对产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的发酵培养工艺进行改进，提高产能产量，将具有非常重要的产业意义。

在哺乳动物细胞培养过程中产生和积累的毒性代谢物及生长抑制代谢物，如乳酸已广为人知。作为细胞中枢代谢中的主要毒性代谢产物之一，乳酸抑制细胞生长，诱导细胞凋亡并减少重组治疗产品的表达水平。乳酸浓度持续升高与产物表达量下降的关联在CHO细胞中几乎成为一种共识。目前，针对在细胞培养过程中出现代谢废物这一现象，已经有许多试图解决该问题的细胞工程策略，如使用RNA干扰技术下调乳酸脱氢酶A(LdhA)的表达，可降低乳酸的产生，但不影响细胞生长且也不影响人血小板生成素的表达水平；通过过表达苹果酸-天冬氨酸穿梭途径(MAS)中的Aralar1，乳酸的代谢从产生转变到消耗；保持果糖转运蛋白(GLUT5)的稳定表达，避免碳源转化为乳酸；通过人丙酮酸羧化酶的过表达或密码子优化导致乳酸产量显著下降，细胞表达水平显著提升并改善目的蛋白糖基化。上述研究都涉及到基因的调控，引入新的DNA、RNA或者过表达非治疗用目的蛋白，还需要对终产品的临床安全性做全方位的评估，步骤非常繁杂且成本和工艺要求高，不适于大规模推广。

动物细胞大规模培养中使用的培养方式主要是分批培养(Batch)、分批补料培养(又称流加培养，Fed-batch Culture)和灌流培养(Perfusion)三种。分批培养在发酵过程中，除了气体和为调节pH而加入的酸碱溶液外，与外界没有其他物料的交换；分批补料培养在发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定的营养物质等物料；灌流培养发酵过程中，除了以某种速度向发酵系统中补加一定的营养物质等物料，同时以相同速度流出培养液。分批补料培养中还包括一种反复补料分批式操作，是指在单一补料分批式操作的基础上，每隔一定时间按一定比例放出一部分培养液，这种培养方式介于分批补料培养和灌流培养之间。由于分批培养在生产中，人力、物力、动力消耗大，生产周期短，生产效率低，实际应用中远没有后两种培养方式多。灌流培养对设备的合理性和加料设备的精确性要求高，营养成分的利用率和产物浓度都比前两种培养方式低，污染菌种/细胞株的风险也大于前两种培养方式，在实际应用中，往往适用于不稳定产品的发酵，而稳定产品的发酵往往使用分批补料培养，即使是反复补料分批式操作，也存在污染菌种/细胞株的风险，因此，单一补料分批式分批补料培养是应用更为广泛的培养方式。

然而，在分批补料培养过程中细胞在经历对数生长期、平台期后会进入衰退期，期间细胞密度、细胞活率急剧下降，大大影响重组蛋白产量，一般13天后细胞活率就会陡降至50％以下，因此实际生产中整个培养周期不超过14天。在补料过程中添加基础培养基能延长培养周期，但往往带来稀释产量的负面作用，且常规分批补料式培养最终收获发酵液体积有限，一般不足初始培养体积的2倍，常为1.5倍左右。为延长培养周期，提高细胞活率，同时提升重组蛋白产量，如何对培养工艺进行优化，减少细胞培养过程中乳酸的产生和积累，改善细胞的后期生长状况，提高细胞表达量并降低细胞凋亡率，是目前亟待解决的问题。

对于重组细胞而言，除了在发酵过程中考虑对细胞生长的优化，重组细胞在传代过程中容易出现质粒不稳定的现象，培养基组成、分批补料策略和培养条件等因素均可能对重组细胞的质粒稳定性造成影响。因此，对于特定的产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法的研究，需要在保证质粒稳定性，提高表达量的同时，增强细胞活率，延长培养周期，获得更大的发酵液体积和产量，对各项培养条件的考量更加复杂。目前，还未见对产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养工艺的报道。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，填补目前对于产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞进行分批补料培养工艺条件优化研究的空白，本发明提供了一种细胞活率高、培养周期长、发酵液体积和单位体积产量高的产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的培养方法。

本发明提供了一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，包括如下步骤：

(1)接种培养：将生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株接种于生物反应器的初始培养基中，温度36～38℃发酵培养；所述初始培养基含有细胞基础培养基；

(2)补料发酵：维持步骤(1)的温度发酵培养72-144小时，开始补加补料培养基，每24小时补加一次，每次补加补料培养基的量为初始培养基体积的7％～25％；在发酵144-240小时后，调整温度至30～35℃，继续发酵培养；所述补料培养基中含有Cell Boost 2和细胞基础培养基；

其中，所述发酵培养的条件是：pH为6.7～7.05，溶氧量30％～50％，搅拌转速100～150rpm。

进一步地，上述生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株为：含有人VIII-Fc基因和人IGG1 Fc片段基因的二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞株CHO DG44，所述人VIII-Fc基因的序列如SEQ ID NO.1所示，人IGG1 Fc片段基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，上述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基、OPM-CHO CDP3培养基、OPM-CHO CD11V培养基或

Vero培养基。

更进一步地，上述细胞基础培养基为OPM-CHO CDP3培养基、OPM-CHO CD11V培养基或

Vero培养基时，所述初始培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40～80μM/L，优选为40μM/L；

所述补料培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40～80μM/L，优选为40μM/L，所述补料培养基中Cell Boost 2的含量为1％～3％，优选为2％。

更进一步地，步骤(1)所述接种的细胞密度为30～100万/mL，优选为35万/mL。

更进一步地，步骤(1)所述发酵培养温度为37℃；和/或步骤(2)所述调整温度为34～35℃。

更进一步地，上述细胞基础培养基为OPM-CHO CD11V培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1～4次每次补加初始培养基体积的7～10％；

第5～6次每次补加初始培养基体积的11～14％；

之后每次补加初始培养基体积的19～22％。

优选地：

第1～4次每次补加初始培养基体积的8.3％；

第5～6次每次补加初始培养基体积的12.5％；

第7～11次每次补加初始培养基体积的20.8％。

更进一步地，上述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1～4次每次补加初始培养基体积的7～9％；

第5～7次每次补加初始培养基体积的9～14％；

之后每次补加初始培养基体积的7～9％。

优选地：

第1～4次每次补加初始培养基体积的7.2％；

第5～7次每次补加初始培养基体积的9.6％；

第7～11次每次补加初始培养基体积的7.2％。

进一步地，上述发酵培养的条件是：pH为6.9～7.0，溶氧量40％，搅拌转速130rpm。

本发明的有益效果：本发明利用分批补料培养工艺的优化，通过对葡萄糖含量的控制，达到了控制乳酸产生的效果，及延长培养周期，提升产量的目的。发酵后期第12天开始乳酸含量低于12mmol/L，发酵终点收获日乳酸含量低于3mmol/L。本发明生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的培养方法能够保证高的细胞活率，培养336±6小时(14天)，细胞活率不低于80％；培养384±6小时(16天)，细胞活率不低于70％，因而培养周期比传统的分批补料培养的周期延长(不小于384小时，16天)。本发明获得的发酵液体积高达初始体积的2.2～3.0倍，即使在培养384±12小时(16天)后，长效重组人凝血因子VIII活性产量不低于372小时(15天)内任意时间点活性产量。本发明方法是一种细胞活率高、培养周期长、发酵液体积和单位体积产量高的产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的培养方法，具有非常好的产业化推广应用价值。

本发明中，所述的CDM4PERMAb培养基购买于HYCLONE公司；OPM-CHO CDP3培养基和OPM-CHO CD11V培养基购买于上海奥浦迈生物科技有限公司；

Vero培养基购买于上海源培生物科技股份有限公司。

Cell Boost 2为HYCLONE公司的一款商业化的补料试剂，主要成分为氨基酸，维生素和葡萄糖。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为1L生物反应器中长效重组人凝血因子VIII的分批补料式培养活细胞数和产量。

图2为1L生物反应器中长效重组人凝血因子VIII的分批补料式培养细胞活率。

图3为CDM4PERMAb培养基配制的不同浓度(2％和3％)的Cell Boost 2溶液作为补料培养基对培养过程中活细胞密度、细胞活率、葡萄糖和乳酸量的影响结果。

图4为CDM4PERMAb培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液作为补料培养基培养第12至16天长效重组人凝血因子VIII的活性产量变化。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

本发明使用台盼蓝染色法计数培养过程中活细胞数。人凝血因子VIII活性由COAMATIC FactorⅧ试剂盒(购自Chromogenix公司)进行测定。

实施例1、长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株的构建

1材料与方法

1.1细胞、质粒及菌株

真核表达质粒pRH由成都蓉生药业有限责任公司构建；二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-DG44)购自Invitrogen公司；大肠杆菌TOP10为成都蓉生药业有限责任公司保存。

1.2主要试剂

阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；CDM4PERMAb无血清培养基购自HyClone公司；胎牛血清(FBS)购自PAA公司；限制性内切酶及各种修饰酶购自TaKaRa公司；1kb DNA marker购自NEB；蛋白marker、APS、TEMED、聚丙烯酰胺浓缩液购自Bio-Rad公司；MTX、次黄嘌呤和胸苷(HT)购自Sigma；DNA片段凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。

1.3细胞复苏

将CHO/DG44细胞株从液氮复苏于30ml CDM4PERMAb无血清培养基，37℃，5％CO2摇床转速100rpm进行悬浮培养，为细胞转染做准备。

1.4重组质粒的构建

人VIII-Fc基因序列如下：

ATGCAAATAGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTTTTGCGATTCTGCTTTAGTGCCACCAGAAGATACTACCTGGGTGCAGTGGAACTGTCATGGGACTATATGCAAAGTGATCTCGGTGAGCTGCCTGTGGACGCAAGATTTCCTCCTAGAGTGCCAAAATCTTTTCCATTCAACACCTCAGTCGTGTACAAAAAGACTCTGTTTGTAGAATTCACGGATCACCTTTTCAACATCGCTAAGCCAAGGCCACCCTGGATGGGTCTGCTAGGTCCTACCATCCAGGCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACACTTAAGAACATGGCTTCCCATCCTGTCAGTCTTCATGCTGTTGGTGTATCCTACTGGAAAGCTTCTGAGGGAGCTGAATATGATGATCAGACCAGTCAAAGGGAGAAAGAAGATGATAAAGTCTTCCCTGGTGGAAGCCATACATATGTCTGGCAGGTCCTGAAAGAGAATGGTCCAATGGCCTCTGACCCACTGTGCCTTACCTACTCATATCTTTCTCATGTGGACCTGGTAAAAGACTTGAATTCAGGCCTCATTGGAGCCCTACTAGTATGTAGAGAAGGGAGTCTGGCCAAGGAAAAGACACAGACCTTGCACAAATTTATACTACTTTTTGCTGTATTTGATGAAGGGAAAAGTTGGCACTCAGAAACAAAGAACTCCTTGATGCAGGATAGGGATGCTGCATCTGCTCGGGCCTGGCCTAAAATGCACACAGTCAATGGTTATGTAAACAGGTCTCTGCCAGGTCTGATTGGATGCCACAGGAAATCAGTCTATTGGCATGTGATTGGAATGGGCACCACTCCTGAAGTGCACTCAATATTCCTCGAAGGTCACACATTTCTTGTGAGGAACCATCGCCAGGCGTCCTTGGAAATCTCGCCAATAACTTTCCTTACTGCTCAAACACTCTTGATGGACCTTGGACAGTTTCTACTGTTTTGTCATATCTCTTCCCACCAACATGATGGCATGGAAGCTTATGTCAAAGTAGACAGCTGTCCAGAGGAACCCCAACTACGAATGAAAAATAATGAAGAAGCGGAAGACTATGATGATGATCTTACTGATTCTGAAATGGATGTGGTCAGGTTTGATGATGACAACTCTCCTTCCTTTATCCAAATTCGCTCAGTTGCCAAGAAGCATCCTAAAACTTGGGTACATTACATTGCTGCTGAAGAGGAGGACTGGGACTATGCTCCCTTAGTCCTCGCCCCCGATGACAGAAGTTATAAAAGTCAATATTTGAACAATGGCCCTCAGCGGATTGGTAGGAAGTACAAAAAAGTCCGATTTATGGCATACACAGATGAAACCTTTAAGACTCGTGAAGCTATTCAGCATGAATCAGGAATCTTGGGACCTTTACTTTATGGGGAAGTTGGAGACACACTGTTGATTATATTTAAGAATCAAGCAAGCAGACCATATAACATCTACCCTCACGGAATCACTGATGTCCGTCCTTTGTATTCAAGGAGATTACCAAAAGGTGTAAAACATTTGAAGGATTTTCCAATTCTGCCAGGAGAAATATTCAAATATAAATGGACAGTGACTGTAGAAGATGGGCCAACTAAATCAGATCCTCGGTGCCTGACCCGCTATTACTCTAGTTTCGTTAATATGGAGAGAGATCTAGCTTCAGGACTCATTGGCCCTCTCCTCATCTGCTACAAAGAATCTGTAGATCAAAGAGGAAACCAGATAATGTCAGACAAGAGGAATGTCATCCTGTTTTCTGTATTTGATGAGAACCGAAGCTGGTACCTCACAGAGAATATACAACGCTTTCTCCCCAATCCAGCTGGAGTGCAGCTTGAGGATCCAGAGTTCCAAGCCTCCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTTTTTGATAGTTTGCAGTTGTCAGTTTGTTTGCATGAGGTGGCATACTGGTACATTCTAAGCATTGGAGCACAGACTGACTTCCTTTCTGTCTTCTTCTCTGGATATACCTTCAAACACAAAATGGTCTATGAAGACACACTCACCCTATTCCCATTCTCAGGAGAAACTGTCTTCATGTCGATGGAAAACCCAGGTCTATGGATTCTGGGGTGCCACAACTCAGACTTTCGGAACAGAGGCATGACCGCCTTACTGAAGGTTTCTAGTTGTGACAAGAACACTGGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAGATATTTCAGCATACTTGCTGAGTAAAAACAATGCCATTGAACCAAGAAGCTTCTCCCAGAATCCACCAGTCTTGAAACGCCATCAACGGGAAATAACTCGTACTACTCTTCAGTCAGATCAAGAGGAAATTGACTATGATGATACCATATCAGTTGAAATGAAGAAGGAAGATTTTGACATTTATGATGAGGATGAAAATCAGAGCCCCCGCAGCTTTCAAAAGAAAACACGACACTATTTTATTGCTGCAGTGGAGAGGCTCTGGGATTATGGGATGAGTAGCTCCCCACATGTTCTAAGAAACAGGGCTCAGAGTGGCAGTGTCCCTCAGTTCAAGAAAGTTGTTTTCCAGGAATTTACTGATGGCTCCTTTACTCAGCCCTTATACCGTGGAGAACTAAATGAACATTTGGGACTCCTGGGGCCATATATAAGAGCAGAAGTTGAAGATAATATCATGGTAACTTTCAGAAATCAGGCCTCTCGTCCCTATTCCTTCTATTCTAGCCTTATTTCTTATGAGGAAGATCAGAGGCAAGGAGCAGAACCTAGAAAAAACTTTGTCAAGCCTAATGAAACCAAAACTTACTTTTGGAAAGTGCAACATCATATGGCACCCACTAAAGATGAGTTTGACTGCAAAGCCTGGGCTTATTTCTCTGATGTTGACCTGGAAAAAGATGTGCACTCAGGCCTGATTGGACCCCTTCTGGTCTGCCACACTAACACACTGAACCCTGCTCATGGGAGACAAGTGACAGTACAGGAATTTGCTCTGTTTTTCACCATCTTTGATGAGACCAAAAGCTGGTACTTCACTGAAAATATGGAAAGAAACTGCAGGGCTCCCTGCAATATCCAGATGGAAGATCCCACTTTTAAAGAGAATTATCGCTTCCATGCAATCAATGGCTACATAATGGATACACTACCTGGCTTAGTAATGGCTCAGGATCAAAGGATTCGATGGTATCTGCTCAGCATGGGCAGCAATGAAAACATCCATTCTATTCATTTCAGTGGACATGTGTTCACTGTACGAAAAAAAGAGGAGTATAAAATGGCACTGTACAATCTCTATCCAGGTGTTTTTGAGACAGTGGAAATGTTACCATCCAAAGCTGGAATTTGGCGGGTGGAATGCCTTATTGGCGAGCATCTACATGCTGGGATGAGCACACTTTTTCTGGTGTACAGCAATAAGTGTCAGACTCCCCTGGGAATGGCTTCTGGACACATTAGAGATTTTCAGATTACAGCTTCAGGACAATATGGACAGTGGGCCCCAAAGCTGGCCAGACTTCATTATTCCGGATCAATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTTTCTTGGATCAAGGTGGATCTGTTGGCACCAATGATTATTCACGGCATCAAGACCCAGGGTGCCCGTCAGAAGTTCTCCAGCCTCTACATCTCTCAGTTTATCATCATGTATAGTCTTGATGGGAAGAAGTGGCAGACTTATCGAGGAAATTCCACTGGAACCTTAATGGTCTTCTTTGGCAATGTGGATTCATCTGGGATAAAACACAATATTTTTAACCCTCCAATTATTGCTCGATACATCCGTTTGCACCCAACTCATTATAGCATTCGCAGCACTCTTCGCATGGAGTTGATGGGCTGTGATTTAAATAGTTGCAGCATGCCATTGGGAATGGAGAGTAAAGCAATATCAGATGCACAGATTACTGCTTCATCCTACTTTACCAATATGTTTGCCACCTGGTCTCCTTCAAAAGCTCGACTTCACCTCCAAGGGAGGAGTAATGCCTGGAGACCTCAGGTGAATAATCCAAAAGAGTGGCTGCAAGTGGACTTCCAGAAGACAATGAAAGTCACAGGAGTAACTACTCAGGGAGTAAAATCTCTGCTTACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTCATCTCCAGCAGTCAAGATGGCCATCAGTGGACTCTCTTTTTTCAGAATGGCAAAGTAAAGGTTTTTCAGGGAAATCAAGACTCCTTCACACCTGTGGTGAACTCTCTAGACCCACCGTTACTGACTCGCTACCTTCGAATTCACCCCCAGAGTTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTTCTGGGCTGCGAGGCACAGGACCTCTACGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO.1)

人IGG1 Fc片段基因如下：

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA(SEQ IDNO.2)

下划线为小鼠IgK信号序列。

本发明rhFVIII-Fc的序列即为将上述两个基因序列分别构建重组质粒pRH-VIII-Fc和pRH-Fc后，共转染CHO-DG44细胞，在转染阳性的细胞中共表达上述两种蛋白，并通过细胞固有的组装程序，将上述二者通过二硫键组装成异源二聚体。

人VIII-Fc基因以及Fc片段基因添加酶切位点和kozak序列后由苏州金唯智生物科技有限公司合成，分别通过内切酶位点，BssHⅡ/Sal I，SalⅠ/XbaⅠ将目的基因克隆到质粒pRH上得到重组质粒pRH-VIII-Fc和pRH-Fc，由CMV启动子控制其表达，表达载体上含有DHFR基因作为筛选标记基因。经双酶切鉴定和测序分析验证重组表达质粒的正确性。

1.5CHO细胞转染

实验所使用的宿主细胞是CHO-DG44，制备转染用重组质粒，细胞转染用阳离子脂质体转染法。转染前一天，将对数生长期的CHO-DG44以无抗生素培养基CDM4PERMAb培养于6孔细胞板，2ml/孔，补加10％FBS和HT，待细胞生长至90％时，取上述构建的重组质粒pRH-VIII-Fc 4μg，pRH-Fc 1μg和真核细胞脂质体转染试剂10μl(Lipofectamine2000，Invitrogen)于200μl上述无抗生素培养基中轻轻混匀，静置5分钟，再将上述表达质粒和脂质体转染试剂混合物加于细胞孔中，轻轻摇匀，于37℃，5％CO2静置培养6h。6h后更换新鲜培养基CDM4PERMAb，补加10％FBS和HT，37℃继续培养24h；用0.25％胰酶消化细胞，分种于96孔板中，用不含HT的筛选培养基于37℃培养，每3d更换新鲜培养液直至克隆出现。并测定凝血因子VIII的活性。

1.6工程细胞株的筛选及表达

阳性细胞克隆依次从96孔板转入24孔板、T25方瓶和摇瓶中进行逐级筛选和放大培养，将筛选的细胞株分别用MTX进行逐步加压和极限稀释法进行数轮亚克隆筛选，并在过程中监测人凝血因子VIII-Fc融合蛋白在上清中的活性，最终筛选得到表达量较高的工程细胞株。最后通过SDS-PAGE鉴定表达的人凝血因子VIII-Fc融合蛋白。

经过以上方法的筛选，筛选得到的工程细胞株为长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株。

实施例2、长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株的分批补料式培养(Fed-batch)

(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按35万/ml细胞密度接种于初始培养体积为350ml添加40μM/L铜离子(CuSO₄·5H₂O)的OPM-CHO CD11V培养基的1L Applikon玻璃生物反应器中，控制器为Applikon的my-control，37.0℃，pH 7.0，40％溶氧，130rpm转速培养，为第0天；控制pH碱液为1mol/L Na₂CO₃。

(2)补料发酵：接种发酵144h后细胞数量达到200万/mL，按照下表初始培养体积的百分比/24h补加补料培养基，其中补料培养基为用OPM-CHO CD11V培养基配制的2％的CellBoost 2溶液，并添加CuSO₄·5H₂O至铜离子浓度40μM/L；接种发酵240小时后，降温至34.0℃培养。

(3)结果：由图1和2可知，分批补料式培养至第17天细胞活率仍有92.9％，产量峰值在第17天达到2443.94IU/ml，而活细胞数的峰值是第12天的2375万/ml。发酵液体积高达初始体积的2.6倍，培养过程中葡萄糖浓度变化如下表，单位g/L：

培养过程中乳酸含量变化如下表，单位mmol/L：

单位体积产长效重组人凝血因子VIII的产量为2443.94IU/mL。

实施例3、7L生物反应器中长效重组人凝血因子VIII的分批补料式培养(Fed-batch)

(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按38.3万/ml细胞密度接种于初始培养体积为2.9L CDM4PERMAb培养基的7LApplikon玻璃生物反应器中，控制器为Applikon的ez-control，37.0℃，pH为6.70～7.05，40％溶氧，100rpm转速培养，为第0天；

(2)补料发酵：接种发酵96h后，按照下表初始培养体积的百分比/24h补加补料培养基，其中补料培养基为用CDM4PERMAb培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液；接种发酵240小时后，降温至35.0℃培养。

(3)结果：由图1和2可知，分批补料式培养至第17天细胞活率仍有75％，产量峰值在第17天达到1000IU/ml以上，而活细胞数的峰值是第10天的1285万/ml。培养过程中葡萄糖浓度变化如下表，单位g/L：

以下通过实验例证明本发明的有益效果。

实验例1、不同种类补料试剂和含不同浓度Cell Boost 2的补料培养基对分批补料培养的影响

1、实验方法

首先，将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按50万/ml细胞密度接种于30ml CDM4PERMAb(HYCLONE)培养基中，37.0℃，5.0％二氧化碳，100rpm转速培养。接种发酵72h后以起始培养体积的20％/24h分为二组进行分批补料发酵：a.补加CDM4PERMAb(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％Cell Boost 2(HYCLONE)；b.补加CDM4PERMAb(HYCLONE)培养基，其中培养基含有1.2％CHO Xtreme Feed(Sartorius Stedium)，发酵至第14天终止培养，发现a组培养得到的长效重组人凝血因子VIII产量为b组的2.5倍以上，因此，优选为采用Cell Boost 2作为补料培养基的补料试剂。

进一步对Cell Boost 2的用量进行筛选：

(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按35万/ml细胞密度接种于初始培养体积为350ml CDM4PERMAb培养基的1LApplikon玻璃生物反应器中，控制器为Applikon的my-control，37.0℃，pH 6.9，40％溶氧，130rpm转速培养，为第0天；控制pH碱液为1mol/L Na₂CO₃。

(2)补料发酵：接种发酵72h后，设置三个实验组，分别按照下表初始培养体积的百分比/24h补加补料培养基，其中补料培养基分别为用a.CDM4PERMAb培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液；b.CDM4PERMAb培养基配制的3％的Cell Boost 2溶液；c.CDM4PERMAb培养基配制的5％的Cell Boost 2溶液；接种发酵192小时后，降温至34.0℃培养。

a组：

b组：

c组：

注：由于Cell Boost 2本身含有大量葡萄糖，所以不同浓度Cell Boost 2补料培养基配制后，按照补加葡萄糖的量换算不同实验组的补料体积比例。

2、实验结果：如下表：

其中c组由于第11天细胞活率已经很低(低至45.7％)，因此不再继续补料，此方案结果不佳。

而a组和b组培养过程中活细胞密度(VCD)，活率(VIA)，葡萄糖(GLC)，乳酸(LAC)变化趋势如图3所示，其中a组在培养末期的5天(D12～D16)，长效重组人凝血因子VIII的活性产量趋势如图4所示。

可以看出，a组补料培养基为CDM4PERMAb培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液显示了最佳的培养结果，分批补料培养至第16天细胞活率仍有74.2％，当天乳酸含量低，仅为为1.2mmol/L，且重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白活性产量在培养末期一直处于增长，最高产量达到1084.05IU/mL。

实验例2、不同pH对分批补料培养的影响

(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按35万/ml细胞密度接种于初始培养体积为350ml CDM4PERMAb培养基的1LApplikon玻璃生物反应器中，控制器为Applikon的my-control，37.0℃，40％溶氧，130rpm转速培养，为第0天；设置三个实验组，pH分别为6.9，7.0，7.1，控制pH碱液为1mol/L Na₂CO₃。

(2)补料发酵：接种发酵72h后，按照下表初始培养体积的百分比/24h补加补料培养基，其中补料培养基为用CDM4PERMAb培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液；接种发酵192小时后，降温至34.0℃。

(3)结果：如下表：

pH 6.9和pH 7.0显示了相似的分批补料培养结果，分批补料式培养至第16天细胞活率仍有70％以上，且重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白单位体积活性产量在培养末期未出现明显的降低，pH为7.1时，细胞活性和产量都出现了显著的下降，因此，本发明培养过程优选为将pH值控制在7.1以下，结合实施例3的及结果，在发酵培养过程中pH值优选控制为6.70～7.05，更优选为6.9～7.0。

实验例3、铜离子及其浓度对OPM-CHO CD11V基础培养基分批补料培养的影响

(1)接种培养：将实施例1制备得到的长效重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白CHO(DG44)细胞株按35万/ml细胞密度接种于初始培养体积为350ml OPM-CHO CD11V培养基的1L Applikon玻璃生物反应器中，控制器为Applikon的my-control，37.0℃，pH 7.0，40％溶氧，130rpm转速培养，为第0天；控制pH碱液为1mol/L Na₂CO₃。

(2)补料发酵：接种发酵144h后，按照下表初始培养体积的百分比/24h补加补料培养基，其中补料培养基为用OPM-CHO CD11V培养基配制的2％的Cell Boost 2溶液；接种发酵240小时后，降温至34.0℃培养。

(3)结果：如下表：

可见，对于OPM-CHO CD11V基础培养基而言，基础培养基和补料培养基添加铜离子浓度40μM/L显示了最佳的分批补料培养结果，分批补料培养至第17天细胞活率仍有90％以上，产量峰值在第17天达到2443.94IU/ml，说明铜离子的加入显著提高了本发明重组CHO细胞生产长效重组人凝血因子VIII的产量。进一步提高铜离子浓度至60μM/L、80μM/L，对长效重组人凝血因子VIII的产量无明显提高。因此，优选铜离子添加量为40μM/L。

综上，本发明提供了一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，细胞活率高、培养周期长、发酵液体积大，且单位体积产长效重组人凝血因子VIII的产量高，具有非常好的产业化推广应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都蓉生药业有限责任公司

<120> 一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法

<130> GY163-2021P0113762CC

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5055

<212> DNA

<213> VIII-Fc

<400> 1

atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60

accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120

ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180

acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240

gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300

gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360

ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420

gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480

aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540

gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600

gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660

tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720

gctgcatctg ctcgggcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780

ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840

accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900

cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960

gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa 1020

gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa 1080

gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat 1140

gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact 1200

tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc 1260

cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg 1320

aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct 1380

attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg 1440

ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500

gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560

ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620

actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680

gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740

agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800

aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860

cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920

tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980

attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040

atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100

atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160

atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220

agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280

ttctcccaga atccaccagt cttgaaacgc catcaacggg aaataactcg tactactctt 2340

cagtcagatc aagaggaaat tgactatgat gataccatat cagttgaaat gaagaaggaa 2400

gattttgaca tttatgatga ggatgaaaat cagagccccc gcagctttca aaagaaaaca 2460

cgacactatt ttattgctgc agtggagagg ctctgggatt atgggatgag tagctcccca 2520

catgttctaa gaaacagggc tcagagtggc agtgtccctc agttcaagaa agttgttttc 2580

caggaattta ctgatggctc ctttactcag cccttatacc gtggagaact aaatgaacat 2640

ttgggactcc tggggccata tataagagca gaagttgaag ataatatcat ggtaactttc 2700

agaaatcagg cctctcgtcc ctattccttc tattctagcc ttatttctta tgaggaagat 2760

cagaggcaag gagcagaacc tagaaaaaac tttgtcaagc ctaatgaaac caaaacttac 2820

ttttggaaag tgcaacatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg 2880

gcttatttct ctgatgttga cctggaaaaa gatgtgcact caggcctgat tggacccctt 2940

ctggtctgcc acactaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtacaggaa 3000

tttgctctgt ttttcaccat ctttgatgag accaaaagct ggtacttcac tgaaaatatg 3060

gaaagaaact gcagggctcc ctgcaatatc cagatggaag atcccacttt taaagagaat 3120

tatcgcttcc atgcaatcaa tggctacata atggatacac tacctggctt agtaatggct 3180

caggatcaaa ggattcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaatgaaaa catccattct 3240

attcatttca gtggacatgt gttcactgta cgaaaaaaag aggagtataa aatggcactg 3300

tacaatctct atccaggtgt ttttgagaca gtggaaatgt taccatccaa agctggaatt 3360

tggcgggtgg aatgccttat tggcgagcat ctacatgctg ggatgagcac actttttctg 3420

gtgtacagca ataagtgtca gactcccctg ggaatggctt ctggacacat tagagatttt 3480

cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat 3540

tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gagccctttt cttggatcaa ggtggatctg 3600

ttggcaccaa tgattattca cggcatcaag acccagggtg cccgtcagaa gttctccagc 3660

ctctacatct ctcagtttat catcatgtat agtcttgatg ggaagaagtg gcagacttat 3720

cgaggaaatt ccactggaac cttaatggtc ttctttggca atgtggattc atctgggata 3780

aaacacaata tttttaaccc tccaattatt gctcgataca tccgtttgca cccaactcat 3840

tatagcattc gcagcactct tcgcatggag ttgatgggct gtgatttaaa tagttgcagc 3900

atgccattgg gaatggagag taaagcaata tcagatgcac agattactgc ttcatcctac 3960

tttaccaata tgtttgccac ctggtctcct tcaaaagctc gacttcacct ccaagggagg 4020

agtaatgcct ggagacctca ggtgaataat ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccag 4080

aagacaatga aagtcacagg agtaactact cagggagtaa aatctctgct taccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctcat ctccagcagt caagatggcc atcagtggac tctctttttt 4200

cagaatggca aagtaaaggt ttttcaggga aatcaagact ccttcacacc tgtggtgaac 4260

tctctagacc caccgttact gactcgctac cttcgaattc acccccagag ttgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggttctgggc tgcgaggcac aggacctcta cgacaaaact 4380

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 4440

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 4500

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 4560

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 4620

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 4680

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 4740

cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 4800

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 4860

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 4920

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 4980

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 5040

tctccgggta aatga 5055

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> IGG1 Fc

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 120

ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 180

tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 240

ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 300

cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 360

tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 420

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 480

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 540

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 600

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 660

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 720

ctctccctgt ctccgggtaa atga 744

Claims

1.一种生产长效重组人凝血因子VIII的重组细胞的分批补料培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）接种培养：将生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株接种于生物反应器的初始培养基中，温度36~38℃发酵培养；所述初始培养基含有细胞基础培养基；

（2）补料发酵：维持步骤（1）的温度发酵培养72-144小时，开始补加补料培养基，每24小时补加一次，每次补加补料培养基的量为初始培养基体积的7%~25%；在发酵144-240小时后，调整温度至30~35℃，继续发酵培养；所述补料培养基中含有Cell Boost 2和细胞基础培养基；

其中，所述发酵培养的条件是：pH为6.7~7.05，溶氧量30%~50%，搅拌转速100~150 rpm；所述生产长效重组人凝血因子VIII的细胞株为：含有人VIII-Fc基因和人IGG1 Fc片段基因的二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞株CHO DG44，所述人VIII-Fc基因的序列如SEQID NO.1所示，人IGG1 Fc片段基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基或OPM-CHO CD11V培养基；

所述初始培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40~80 μM/L；

所述补料培养基中还添加有铜离子，所述铜离子浓度为40~80 μM/L，所述补料培养基中Cell Boost 2的含量为1%~3%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始培养基中铜离子浓度为40μM/L，所述补料培养基中铜离子浓度为40μM/L，所述补料培养基中Cell Boost 2的含量为2%。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述接种的细胞密度为30~100万/mL。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述接种的细胞密度为35万/mL。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵培养温度为37℃。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述调整温度为34~35℃。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为OPM-CHO CD11V培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1~4次每次补加初始培养基体积的7~10%；

第5~6次每次补加初始培养基体积的11~14%；

之后每次补加初始培养基体积的19~22%。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为OPM-CHO CD11V培养基，所述补加补料培养基的量为：第1~4次每次补加初始培养基体积的8.3%；

第5~6次每次补加初始培养基体积的12.5%；

第7~11次每次补加初始培养基体积的20.8%。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基培养基，所述补加补料培养基的量为：

第1~4次每次补加初始培养基体积的7~9%；

第5~7次每次补加初始培养基体积的9~14%；

之后每次补加初始培养基体积的7~9%。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞基础培养基为CDM4PERMAb培养基培养基，所述补加补料培养基的量为：第1~4次每次补加初始培养基体积的7.2%；

第5~7次每次补加初始培养基体积的9.6%；

第7~11次每次补加初始培养基体积的7.2%。

11.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件是：pH为6.9~7.0，溶氧量40%，搅拌转速130 rpm。