CN107236036A - 一种制备重组人凝血八因子的方法 - Google Patents

一种制备重组人凝血八因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种制备重组人凝血八因子的方法，包括以下步骤：构建表达人凝血八因子的细胞株；将构建的人凝血八因子表达细胞株接种到培养基中，振荡培养一段时间，至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，以1:5的传代比例细胞传代，振荡培养至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，获得种子液；将获得的种子液接种到细胞反应器的培养基中，培养一段时间，使细胞液的细胞密度达到2～6×106cells/ml；然后向细胞液中加入外源的血管性血友病因子并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液，其中，在所述补料培养过程中，控制细胞液中血管性血友病因子活性与人凝血八因子活性比为2～12:1；从获得的细胞原液中分离纯化出重组人凝血八因子。

Description

一种制备重组人凝血八因子的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种制备重组人凝血八因子的方法。
背景技术
A型血友病是由于人体凝血八因子缺乏或者不正常而导致的一种凝血功能障碍疾病，其主要表现是，活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，轻微创伤后即出现出血倾向。凝血八因子在凝血级联反应中作为活化型的九因子的辅因子激活十因子，进而刺激内源性凝血反应的发生。
天然人凝血八因子(FVIII)是一种大分子糖蛋白，由重链和轻链结合而成，总分子量330KD，血浆中含量约0.2mg/L，以结合血管性血友病因子(VWF)的形式存在。重组人FVIII与天然FVIII有相同的生理，药理和免疫特征，并且有杜绝HIV、HDV、蛋白病毒等病源传播的优点，因此，重组FVIII蛋白表达的研究成为A型血友病治疗的一个重要趋势。
目前大规模制备重组八因子的两种方法均有缺陷，血清培养基方法由于需要外源添加动物血清，从而带来了病毒潜在污染的风险。而VWF与FVIII基因的共表达方法，八因子的表达量比较低，细胞株构建方法复杂，达不到产业化需求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种安全高效可产业化应用的制备重组人凝血八因子的方法。
本发明的制备重组人凝血八因子的方法包括以下步骤：
(1)构建表达人凝血八因子的细胞株；
(2)将步骤(1)构建的人凝血八因子表达细胞株接种到培养基中，振荡培养一段时间，至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，以1:5的传代比例细胞传代，振荡培养至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，获得种子液；
(3)将步骤(2)获得的种子液接种到细胞反应器的培养基中，培养一段时间，使细胞液的细胞密度达到2～6×106cells/ml；然后向细胞液中加入外源的血管性血友病因子并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液，其中，在所述补料培养过程中，控制细胞液中血管性血友病因子活性与人凝血八因子活性比为2～12:1；
(4)从步骤(3)获得的细胞原液中分离纯化出重组人凝血八因子。
本发明克服了现有技术中为了得到稳定的凝血八因子必须要在同一个细胞株中共表达八因子和VWF的难点。本发明提出了一种有效的细胞培养途径，通过将FVIII和VWF的含量控制在一定的优化范围内，使FVIII的表达被大量累积，并且本发明的制备工艺表达细胞构建难度小，特别适合工业化大量生产重组人凝血八因子。
较佳地，步骤(1)中，所述表达人凝血八因子的细胞株为构建的单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII和B区有缺失的FVIII片段。
较佳地，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述培养基为无血清细胞培养液。
较佳地，步骤(2)中，将步骤(1)构建的人凝血八因子表达细胞株以0.8～9×105cells/ml的接种量进行接种。
较佳地，步骤(2)中，振荡培养的条件为：转速50～140转/分钟，培养温度25～39℃；振荡培养时间为4～5天。
较佳地，步骤(3)中，种子液接种到细胞反应器的接种量为6～12v/v％。
较佳地，步骤(3)中，种子液的培养时间为3～7天。
较佳地，步骤(3)中，所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧50～90％，pH 7～7.5，搅拌转速50～80转/分钟，培养温度32～39℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.6～1.8g/L。
较佳地，步骤(3)中，所述细胞原液的细胞密度为1～2×107cells/ml。
本发明的效果包括：1)本发明不添加外源动物血清，避免了潜在的病毒污染风险。
2)本发明表达人凝血八因子的细胞株构建方法简单，重组人凝血八因子表达量高，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
本发明提供了一种利用哺乳动物细胞培养制备重组人凝血八因子的方法，将外源的血管性血友病因子添加到表达重组人凝血八因子的无血清细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为2～12:1。
本发明将血管性血友病因子(VWF)按照一定的比例直接添加到重组八因子的细胞培养液中，可大大提高重组八因子的表达量，这种方法为大规模扩大八因子的产量提供了一种简单实用的实现路径。
以下，作为示例，具体说明制备重组人凝血八因子的方法。
表达细胞的准备
表达人凝血八因子的细胞株的构建。构建方法可为常规分子生物学重组蛋白制备方法。构建出的表达人凝血八因子的细胞株优选为单独表达人凝血八因子的细胞株。表达的FVIII包括全长FVIII和B区有缺失的FVIII片段。
表达细胞的扩种培养
将表达人凝血八因子的细胞接种到培养基中，振荡培养至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，优选地，2.0×106cells/ml＜细胞密度≤2.5×106cells/ml，获得种子液。表达人凝血八因子的细胞可以0.8～9×105cells/ml的接种量进行接种。表达细胞的扩种培养可以将构建的人凝血八因子表达细胞接种到三角瓶中，经过摇瓶培养、传代、摇瓶培养获得种子液。传代比例可为1:5。振荡培养的条件可为：转速50～140转/分钟，培养温度25～39℃。振荡培养时间可为4～5天。
细胞反应器培养
将种子液接种到细胞反应器的培养基中进行培养，使细胞液的细胞密度达到2～6×106cells/ml。其中，培养基优选为无血清细胞培养液，这样可以避免外源血清带来病毒污染的风险。种子液接种到细胞反应器的接种量可为6～12v/v％。培养时间可为3～7天。然后向细胞液中加入外源VWF并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液。在补料培养过程中，控制细胞液中VWF活性与FVIII活性比为2～12:1。通过将两者的活性比控制在该范围内，可以使FVIII的表达量更高。补料培养的条件可为：补料培养过程中控制溶氧50～90％，pH 7～7.5，搅拌转速50～80转/分钟，培养温度32～39℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.6～1.8g/L。最终获得的细胞原液的细胞密度可为1～2×107cells/ml。
凝血八因子产品的制备
从获得的细胞原液中分离纯化出重组人凝血八因子产品。分离方法可采用常规的方法，例如离心、过滤。纯化方法例如可为镍离子亲和层析纯化等。获得的重组人凝血八因子中VWF既可除去，也可仍旧保留，与FVIII形成复合物。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1
1)表达细胞的准备
构建八因子表达细胞；并将其驯化为无血清培养的八因子表达细胞。
2)表达细胞的扩种培养
将驯化为无血清培养的八因子表达细胞以8×l05cells/ml接种三角摇瓶，培养基为无血清培养基，培养温度35℃，摇瓶转速为80转/分钟；无血清培养约4天后细胞密度达到2×l06cells/ml，以1:5的比例传代，摇瓶培养，培养温度38℃，转速60转/分钟，至细胞密度达到2×l06cells/ml。
3)VWF的准备
制备VWF。
4)八因子活性分析样品的制备
用含有不同活性重组VWF，培养24小时后，收集细胞培养液进行八因子活性分析。
5)八因子活性分析方法
收集步骤4)获得的细胞培养液并对其进行八因子活性分析，分析方法采用人凝血因子VIII测定法(一期法)，参考中国药典三部附录XN人凝血因子VIII测定法，具体步骤如下。
A.试剂：
(1)3.8％枸橼酸钠：取枸橼酸钠9.5g，加水溶解并稀释至250ml；
(2)咪唑缓冲液(pH7.3)：取咪唑0.68g和氯化钠1.17g，加水使溶解成100ml，加入0.1mol/L盐酸溶液42.2ml，再加水稀释至200ml，即得；
(3)稀释液：取1体积的3.8％的枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20％人血白蛋白至终浓度为1％；
(4)激活的部分凝血活酶(APTT)试剂；
(5)人凝血因子VIII缺乏血浆：为人凝血因子VIII含量低于1％的人血浆或人工基质血；
(6)0.05mol/L氯化钙溶液：取氯化钙(CaCl2·2H2O)147g，加水溶解并稀释至1000ml，配制成lmol/L的氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成0.05mol/L氯化钙溶液。
B.人凝血因子VIII标准液的制备：
用缺乏人凝血因子VIII的血浆将标准品稀释成每1ml含1IU凝血因子VIII，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释，置冰浴待用。
C.待测样品溶液的制备：
用缺乏人凝血因子VIII的血浆将待检测样品稀释成每1ml含1IU凝血因子VIII，再用稀释液进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
D.样品的检测：
(1)取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间(一般5min)，加入凝血因子VIII缺乏血浆0.1ml、不同稀释度的人凝血因子VIII标准溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间(一般5min)，加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。将标准溶液人凝血因子VIII效价(IU/ml)的对数对其相应的凝固时间(秒)的对数进行直线回归处理，求出直线回归方程。
(2)取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间(一般5min)，加入缺乏凝血因子VIII的血浆0.1ml、待测样品溶液0.1ml，混匀，置于37℃水浴保温一定时间(一般5min)，加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。
(3)计算待测样品溶液人凝血因子VIII效价，再乘以稀释倍数，即为待测样品人凝血因子VIII效价(IU/ml)。检测结果如表1所示。
表1不同添加量的VWF对八因子活性的影响
检测结果见表1，检测结果显示在不同添加VWF浓度的培养中，细胞生长密度基本一致，相互误差不超过15％，但八因子活性却因为VWF的添加得到了100-300％的提高。说明外源VWF的添加大大提高了重组人凝血八因子的表达。而且，VWF的添加量在5IU时(即VWF与八因子活性比为2:1时)，效果最为明显。
6)细胞反应器培养
按照步骤4)的方法，将种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中培养。然后在细胞液中加入VWF，并对细胞液进行补料培养，在补料培养过程中，控制细胞液中血管性血友病因子活性与人凝血八因子活性比为2～12:1，补料培养条件为：补料培养过程中控制溶氧50～90％，pH 7～7.5，搅拌转速50～80转/分钟，培养温度32～39℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.6～1.8g/L，获得细胞原液。
7)凝血八因子的分离纯化
对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因子产品。

Claims (9)

1.一种制备重组人凝血八因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建表达人凝血八因子的细胞株；
（2）将步骤（1）构建的人凝血八因子表达细胞株接种到培养基中，振荡培养一段时间，至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，以1:5的传代比例细胞传代，振荡培养至细胞密度达到1.5～2.5×106cells/ml，获得种子液；
（3）将步骤（2）获得的种子液接种到细胞反应器的培养基中，培养一段时间，使细胞液的细胞密度达到2～6×106cells/ml；然后向细胞液中加入外源的血管性血友病因子并对细胞液进行补料培养，获得细胞原液，其中，在所述补料培养过程中，控制细胞液中血管性血友病因子活性与人凝血八因子活性比为2～12:1；
（4）从步骤（3）获得的细胞原液中分离纯化出重组人凝血八因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述表达人凝血八因子的细胞株为构建的单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII和B区有缺失的FVIII 片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）和/或步骤（3）中，所述培养基为无血清细胞培养液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将步骤（1）构建的人凝血八因子表达细胞株以0.8～9×105cells/ml的接种量进行接种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，振荡培养的条件为：转速50～140转/分钟，培养温度25～39℃；振荡培养时间为4～5天。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，种子液接种到细胞反应器的接种量为6～12 v/v%。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，种子液的培养时间为3～7天。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧50～90%，pH 7～7.5，搅拌转速50～80转/分钟，培养温度32～39℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖浓度维持在0.6～1.8g/L。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述细胞原液的细胞密度为1～2×107cells/ml。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114195904A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 成都蓉生药业有限责任公司 一种生产长效重组人凝血因子viii的重组细胞的分批补料培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776260A (zh) * 2012-07-26 2012-11-14 上海泰龙生物医药科技有限公司 一种高效表达重组人凝血八因子的方法
CN104630131A (zh) * 2015-01-15 2015-05-20 上海交通大学 一种稳定表达人凝血八因子的cho细胞株及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102776260A (zh) * 2012-07-26 2012-11-14 上海泰龙生物医药科技有限公司 一种高效表达重组人凝血八因子的方法
CN104630131A (zh) * 2015-01-15 2015-05-20 上海交通大学 一种稳定表达人凝血八因子的cho细胞株及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
彭林 等: ""重组凝血因子Ⅶ表达和合成机制的研究进展"", 《中国药科大学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114195904A (zh) * 2021-12-27 2022-03-18 成都蓉生药业有限责任公司 一种生产长效重组人凝血因子viii的重组细胞的分批补料培养方法

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