CN104630131A - 一种稳定表达人凝血八因子的cho细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株及其应用。本发明提供一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/H9C2，所述细胞株的保藏号为：CCTCC No：C2014191。本发明所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，能够稳定表达人凝血八因子，细胞传代40次后，通过活性试剂盒检测，细胞培养上清液中人凝血八因子保持在7IU/ml以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株及其应用。
背景技术
甲型血友病是由于人体凝血八因子缺乏或者不正常而导致的一种凝血功能障碍疾病，其主要表现是，活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，轻微创伤后即出现出血倾向。凝血八因子在凝血级联反应中作为活化型的九因子的辅因子激活十因子，进而刺激内源性凝血反应的发生。甲型血友病这种遗传性的凝血功能障碍疾病是由于患者体内的凝血八因子的量不足或者质有缺陷，大约每5000个男性中出现一例甲型血友病患者。全球大约有10万人患有甲型血友病，国内大约2万人患有血友病，但是由于国外拜耳，惠氏等产品价格昂贵，以及进出口限制，导致很多人没有治疗药物。
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。CHO细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势。
自20世纪70年代，从血浆纯化提取来源的凝血八因子已经出现，但是需要严格的血浆供体筛选以及复杂的病毒减毒工艺以减少病毒交叉感染。1992年从转染的哺乳动物细胞中产生了重组凝血八因子，其在生化及凝血功能方面与血浆来源八因子性质一样，与血浆来源八因子也有相同的药代动力学性质，半衰期均为12小时左右。
国内治疗血友病药物凝血八因子生产厂家华兰生物，北京天坛生物，上海生物制品研究所均是通过血浆提取得到凝血八因子，但是血浆来源的凝血八因子有以下缺陷：1.血浆来源有限；2.血浆若含有病毒，则容易造成交叉感染，而基因重组获得的人凝血八因子则克服了以上缺陷。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株及其应用，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/H9C2，所述细胞株的保藏号 为：CCTCC No：C2014191。
本发明所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，能够稳定表达人凝血八因子，该细胞株能够分泌表达人凝血八因子到细胞培养上清液中，所分泌的人凝血八因子能够通过凝血八因子试剂盒检测(如Coamatic FVIII试剂盒，货号：N0148543，Chromogenix，意大利)。该细胞株在细胞传代40次后，人凝血八因子的表达水平稳定，即在相同的培养条件下，细胞传代40次后，通过活性试剂盒检测，细胞培养上清液中人凝血八因子保持在7IU/ml。
本发明所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株宿主细胞为CHO-S细胞，带有绿色荧光和G418抗性作为筛选标签，基因组中带有能够被确认的特征序列。
具体来说，所述细胞株所带有的绿色荧光标签，能够在荧光显微镜下显著地观察到；通过流式细胞仪的FITC-H通道检测，处于对数生长期的该细胞株的绿色荧光强度与宿主细胞CHO-S有显著的差异。此外，该细胞株基因组中带有的如SEQ ID No.1所示的特征序列能够用PCR法进行扩增，并用测序的方法予以确认。
本发明第二方面提供所述稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株在人凝血八因子制备领域的应用。
本发明所述的CHO细胞株能够运用于人凝血八因子的制备，所述细胞株可使用无血清培养基长时间，所分泌的人凝血八因子能够通过凝血八因子检测试剂盒检测，细胞传代40次后，细胞培养上清液中人凝血八因子表达量可达7IU/ml。
本发明第三方面提供一种人凝血八因子，由保藏号为CCTCC No：C2014191的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生，所述人凝血八因子能够通过凝血八因子检测试剂盒检测。
本发明实施例中使用的Coamatic FVIII试剂盒是诊断人体内的凝血八因子含量的，所以用这个试剂盒检测说明我们细胞株所表达的凝血八因子具有跟人体内凝血八因子相同的生物活性。
本发明第四方面提供所述稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株和所述人凝血八因子在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。
如上所述，本发明所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，能够稳定表达人凝血八因子，细胞传代40次后，通过活性试剂盒检测，细胞培养上清液中人凝血八因子保持在7IU/ml以上。
附图说明
图1显示为本发明CHO细胞株H9C2的7天生长曲线；
图2显示为本发明CHO细胞株H9C2的7天人凝血八因子表达曲线；
图3显示为本发明CHO细胞株传代40次人凝血八因子表达曲线；
图4显示为本发明CHO细胞株H9C2的放大100倍的荧光照片；
图5显示为本发明CHO细胞株H9C2和CHO-S细胞用流式细胞仪的FITC-H通道检测绿色荧光；
图6是通过PCR扩增CHO细胞株H9C2基因组的特征序列片段；
图7显示为本发明CHO细胞株H9C2中质粒与市场上第四代产品Xythna质粒在人凝血八因子B结构域内保留不同的氨基酸残基。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1
使用CHO细胞株H9C2制备凝血八因子：
1实验方法
CHO细胞株H9C2的7天连续培养
将保藏号为CCTCC No：C2014191的CHO细胞株H9C2按照1×105个/ml接种到2ml体系中，该体系是在6孔细胞培养板中，培养基为CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入20μl的Anti-clumping Agent。由于该细胞株含有G418抗性标签，需加入终浓度为800μg/ml的G-418 Disulfate。接种后立即计数以确定实际的接种密度。将六孔板放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞培养箱中的摇床上培养，转速为：125±5rpm。
培养2天(接种时记为第一天，此处为第二天，即接种第二天)开始每天观察细胞生长情况，计数。计数时先取50μL培养液(即吹打细胞分散均匀的液体)，加入50μL的0.4％台盼蓝染色液，而后加150μL的PBS溶液稀释，用血细胞计数板进行计数。每次记录活细胞数、死细胞数(被台盼蓝染成蓝色的为死细胞)。计数的同时需要取样，每次取上清200μL留样并使用Coamatic Factor VIII检测试剂盒测定人凝血八因子表达量。取样后补加培养基以维持体系的体积为2ml。
绘制生长曲线：通过每天获得的活细胞数、活力绘制细胞株的生长曲线，并在同一坐标上用柱状图表示人凝血因子表达量的随时间的变化情况(凝血八因子浓度的检测方法同实施例2)。
当细胞活力不足30％时，收取细胞培养上清液至50ml离心管，2000rpm转速4度低温离心10分钟，将上清液转移至新的50ml离心管后，在-80度保存。
2实验结果
如图1显示的是CHO细胞株H9C2的7天生长曲线，如图2显示的是CHO细胞株H9C2的7天人凝血因子表达曲线，基于此，我们分析H9C2细胞株每传代第三天人凝血八因子表达量达到 最大值。
实施例2
CHO细胞株H9C2表达人凝血八因子的稳定性检测：
1实验方法
(1)细胞株的连续传代
将保藏号为CCTCC No：C2014191的CHO细胞株H9C2按照1×105个/ml接种到2ml体系中，该体系是在6孔细胞培养板中，培养基为CD CHO Serum-Free Medium for CHO Cells，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入20μl的Anti-clumping Agent。由于该细胞株含有G418抗性标签，需加入终浓度为800μg/ml的G-418Disulfate。放置在37℃，相对湿度70-80％，5％二氧化碳细胞培养箱中的摇床上培养，转速为：125±5rpm。
培养2天后观察细胞生长情况，计数。计数时先取50μL培养液(即吹打细胞分散均匀的液体)，加入50μL的0.4％台盼蓝染色液，而后加150μL的PBS溶液稀释，用血细胞计数板进行计数。每次记录活细胞数、死细胞数(被台盼蓝染成蓝色的为死细胞)，计算重悬到2ml后重新接种为1×105个/ml浓度所需要的体积。计数后，通过1000rpm离心5分钟收集所有细胞，移除所有上清留样，加入2ml新鲜的培养基重悬，按照计算后的体积接种入一个新的6孔细胞培养板。如此操作记为传1代。
(2)细胞培养上清液中凝血八因子浓度的检测
Coamatic Factor VIII检测试剂盒各试剂的配制：FR粉末(Coamatic FVIII试剂盒，货号：N0148543，Chromogenix，意大利，这个试剂盒中是两瓶FR粉末，一瓶SI粉末，一瓶10X Buffer，每瓶FR粉末中加入3ml去离子水)中加入3ml去离子水，缓慢摇匀，直至瓶底部无固形物，并离心，分装，于-80℃冻存。SI中加入6ml去离子水(SI瓶中加入6ml去离子水)，缓慢摇匀，直至瓶底部无固形物，并离心，分装，于4℃放置备用。FVIII buffer使用10倍buffer液体用去离子水在检测时稀释用。
使用Coamatic Factor VIII检测试剂盒检测H9C2连续传代上清中的表达量。取培养液上清200μL于1.5mL离心管，并于13000rpm，4℃下离心30s，去除细胞对检测吸光值的影响。取新的1.5mL离心管，加入400μL反应缓冲液(即由10X buffer稀释成为1X的buffer)，并加入离心后的上清5μL，稀释80倍。混匀后，取出20μL加入到盛有在380μL反应缓冲液(即由10X buffer稀释成为1X的buffer)的离心管中，混匀。取50μL至酶标条中，并加入50μL培养基作为阴性对照，于37℃预热4min，FR与SI一同预热。4分钟后，每孔加入50μL FR溶液，于37℃，2min。 2分钟后，每孔加入50μL SI溶液，于37℃反应2min。2分钟后，加入20％乙酸终止反应，在405nm波长下检测吸光值。
2.数据处理
1)用阴性对照和空白对照的平均值作为本底值，测得数据减去本底值即为真实值。
2)以不同稀释梯度标准品的人凝血八因子浓度作为横坐标，以不同稀释梯度标准品对应的真实值作为纵坐标，作图，在一定范围内拟合出线性的标准曲线，并使得R2>0.95，由此获得标准曲线的拟合公式，此范围成为线性范围。
3)在待测样品的真实值中寻找3个在线性范围内的值，代入拟合公式，计算出的浓度乘以待测样品的稀释倍数，最后取平均值，即为待测样品中凝血八因子的浓度。
以传代时间为横坐标，绘制H9C2每一代的生长3天后的凝血八因子的表达量。
如图3所示，细胞株H9C2经过连续传代后，每一代的细胞培养至第3天传代时收取上清，用Coamatic Factor VIII检测试剂盒测定人凝血因子表达量。
3实验结果
如图3所示，细胞株H9C2经过连续传代后，每一代的细胞培养至第3天传代时收取上清，用Coamatic Factor VIII检测试剂盒测定人凝血因子表达量。通过将第3天的人凝血因子表达量对传代数目作图，能够分析H9C2在人凝血因子表达量上的稳定性。图2显示，H9C2在目前的培养条件和接种密度下，培养3天获得的人凝血因子活性约为7IU/mL，图3显示在40代内人凝血因子活性维持在7IU/mL左右，说明CHO细胞株H9C2的人凝血因子表达量在40代内是稳定的。
实施例3
CHO细胞株H9C2带有的绿色荧光标签的检测
1实验方法
(1)荧光显微镜观察
CHO细胞株H9C2在对数生长期(一般为接种后的第2-3天)，将细胞悬液取出加入10mm细胞培养皿(上海卧宏生物科技有限公司)中，用倒置荧光显微镜(奥林巴斯，日本)观察绿色荧光情况。在放大40倍的情况下可以观察到绿色荧光，放大100倍拍摄绿色荧光照片，同时拍摄相同位置的白光照片作为对照。
如图4显示的是CHO细胞株H9C2的在荧光显微镜下观察，放大100倍时拍摄的荧光照片，并且有相同位置的白光照片作为对照。如图4显示，该细胞株处于对数生长期，通过照片可以观察到大部分细胞有明亮的绿色荧光。
(2)流式细胞仪检测
将CHO细胞株H9C2和CHO-S细胞按照3×105个/ml的密度分别接种到10mm皿中，培养基体系10ml，加入终浓度为8mM的谷氨酰胺、加入40μL的Anti-clumping Agent。在125rpm的摇床上培养2天后，进入对数生长期，取细胞悬液并计数，细胞密度应达到1×106个/ml以上，将细胞再用移液管吹匀，取1ml进行检测。
取1ml的CHO-S细胞悬液，使用流式细胞仪进行检测，检测通道为FITC-H，调节电压使得细胞群集中在合适的位置，并调节荧光强度至基线位置(所有细胞的荧光强度在101-102之间)。
取1ml的H9C2细胞悬液，按照相同的参数用流式细胞仪检测，通道为FITC-H。
分别输出两种细胞的散点图和FITC-H通道的峰型图，以CHO-S细胞为阴性对照，通过FlowJo 7.5软件确定CHO细胞株H9C2的绿色荧光比例。
2实验结果
如图5显示的是CHO细胞株H9C2和CHO-S细胞用流式细胞仪的FITC-H通道检测绿色荧光，所得到的散点图和FITC-H通道的峰型图。从图5可以定性地观察到，CHO细胞株H9C2与CHO-S所显示的峰型有显著差异；进一步地，CHO细胞株H9C2大部分细胞的荧光强度在102-104之间，而阴性对照CHO-S的所有细胞的荧光强度在101-102之间。综上所述，经流式细胞仪检测，CHO细胞株H9C2相对于CHO-S有显著的绿色荧光。
实施例4
转染质粒及CHO细胞株H9C2基因组中的特征序列的检测
1实验方法
(1)细胞株基因组的提取
首先，需要配制以下溶液。
10×GB(水溶液)：670mM Tris,PH＝8.8
166mM Ammonium Sulfate
65mM MgCl2
10×proteinase K:称取10mg proteinase K溶解在1ml去离子水中。
收集对数生长期的CHO细胞株H9C2、宿主细胞CHO-S，重悬在新鲜的培养基中，每份细胞数为1×106个，4000rpm转速4度离心5分钟，离心后除去上清，用PBS重悬后洗1遍，4000rpm转速4度离心5分钟。
弃上清，每份样品加入50μL消化液(1×GB，1％β-巯基乙醇，0.5％Triton X-100)，重悬，将液体转移到干净的微量离心管中。
在PCR仪上，95℃消化5分钟，加入5μL的10×proteinase K，55℃消化1小时。将微量离心管涡旋震荡后，使沉淀重悬，55℃继续消化1小时，95℃消化5分钟。
将微量离心管高速离心，取上清液保存在-20度，即为细胞株的基因组提取物。
(2)特征序列的扩增
进行特征序列扩增的样品为：细胞株构建使用的载体(pGMAX)，CHO-S基因组提取物，CHO细胞株H9C2基因组提取物。
第一次扩增，使用如下的引物：
FVIII-sense-1：ATGGATTCTGGGGTGCCACAACTC(SEQ ID No.2)
FVIII-antisense-1：TCGCCGGACACGCTGAACTTG(SEQ ID No.3)
根据KOD-Plus(TOYOBO，日本)提供的操作方法，每份样品配制如下的PCR体系：
94℃预变性2min后进入循环，PCR反应的循环条件如下所示。
第二次扩增以第一次扩增的PCR产物为模板进行，使用如下的引物：
FVIII-sense-2:GGTGATTATTACGAGGACAGTTATGAAG(SEQ ID No.4)
FVIII-antisense-2:CCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACG(SEQ ID No.5)
根据KOD-Plus提供的操作方法，每份样品配制如下的PCR体系。
94℃预变性2min后进入循环，PCR反应的循环条件如下所示。
完成第二次扩增后，每份产物取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，确定特征片段的大小，如果特征片段存在，并被成功扩增，应在1000bp位置看到明亮的条带。
(3)测序确认和比对
将全部PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并将PCR产物进行测序确认(上海华津生物科技有限公司)。
对比细胞株构建使用的载体、H9C2细胞株基因组扩增获得的特征片段的序列是否一致，并与理论序列进行比对，如SEQ ID No.1所示。
2实验结果
如图6显示的是通过PCR扩增CHO细胞株H9C2基因组的特征序列片段，即通过PCR法扩增获得的产物的3％琼脂糖凝胶电泳照片。
如图6显示，泳道1是分子量Marker，泳道2是构建细胞株用载体的阳性对照，泳道3是H9C2 细胞株基因组提取物，泳道4是宿主CHO-S细胞基因组提取物。如图6的电泳照片显示，泳道2和泳道3在200bp附近位置观察到明亮的条带，而泳道4在这个位置没有此条带。
将泳道2，3在200bp附近位置的PCR产物测序，通过测序比对，其序列均如SEQ ID No.1所示。因此，细胞株H9C2的基因组中带有SEQ ID No.1所示的特征序列，特征序列中包含多肽肽段RSFSQNSRHPSTRQKQFNATPPVLKRHQRE(SEQ ID No.6)，与xyntha质粒对应位置的对比结果如图7所示。
综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
分类命名：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/H9C2
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏日期：2014年10月10日
保藏地址：中国武汉武汉大学
保藏编号：CCTCC NO：C2014191 。
Claims (6)
1.一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-S/H9C2，所述细胞株的保藏号为：CCTCC No：C2014191。
2.如权利要求1所述的一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，其特征在于，所述细胞株在细胞传代40次后，人凝血八因子的表达水平稳定，细胞培养上清液中人凝血八因子保持在7IU/ml。
3.如权利要求1所述的一种稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株，其特征在于，所述细胞株宿主细胞为CHO-S细胞，带有绿色荧光和G418抗性作为筛选标签，基因组中带有特征序列SEQ ID No.1。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株在人凝血八因子制备领域的应用。
5.一种人凝血八因子，由保藏号为CCTCC No：C2014191的CHO细胞株或其传代细胞株分泌产生。
6.如权利要求1-3任一权利要求所述的稳定表达人凝血八因子的CHO细胞株和权利要求5所述的人凝血八因子在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。
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