RU2542385C2 - Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека - Google Patents
Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2542385C2 RU2542385C2 RU2012137126/10A RU2012137126A RU2542385C2 RU 2542385 C2 RU2542385 C2 RU 2542385C2 RU 2012137126/10 A RU2012137126/10 A RU 2012137126/10A RU 2012137126 A RU2012137126 A RU 2012137126A RU 2542385 C2 RU2542385 C2 RU 2542385C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- plasmid
- vegf165
- pcmv
- pharmaceutical composition
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 title claims abstract description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 title claims abstract 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 title abstract 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 130
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 70
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 3
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 17
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 13
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 241001648319 Toronia toru Species 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 3
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 201000002818 limb ischemia Diseases 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- -1 monosubstituted sodium phosphates Chemical class 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 2
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 2
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 2
- 210000002465 tibial artery Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008391 A1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical group [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241001244729 Apalis Species 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101000579126 Mus musculus Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N Sodium cation Chemical compound [Na+] FKNQFGJONOIPTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100478714 Streptomyces griseus strR gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- JCYWCSGERIELPG-UHFFFAOYSA-N imes Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1N1C=CN(C=2C(=CC(C)=CC=2C)C)[C]1 JCYWCSGERIELPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012859 sterile filling Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
- A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к композициям для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, и может быть использовано в медицине. Способ предусматривает трансформацию штамма E. coli TOP10 плазмидой pCMV-VEGF165, культивирование штамма в подходящих для накопления биомассы условиях с последующим выделением плазмиды pCMV-VEGF165 в сверхскрученной форме и последующую лиофилизацию плазмиды pCMV-VEGF165, которую проводят при обязательном присутствии в лиофилизируемом растворе криопротектанта, стабилизатора рН, антиоксиданта и иных веществ, позволяющих получить изотонический раствор для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0 и обеспечивающих сохранение сверхскрученной формы плазмиды pCMV-VEGF165 при последующем хранении. Способ лечения ишемии тканей и/или органов человека заключается во введении внутримышечно человеку эффективного количества полученной фармацевтической композиции. Изобретение позволяет получить пригодную для терапии фармацевтическую композицию плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 с сохранением свойств основного вещества при продолжительном хранении при температуре +2-+8°С. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 5 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму-продуценту плазмидной ДНК и фармацевтической композиции на ее основе, обладающей способностью вызывать рост кровеносных сосудов (васкуляризации) в области введения и ее применению в комплексной терапии для реваскуляризации при ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза, а также в лечении ран и язв различного генеза.
Предшествующий уровень техники
Генотерапия с использованием свободной плазмидной ДНК (naked DNA) для целей терапии заболеваний или вакцинации против патогенов либо антигенов раковых клеток предполагает создание готовых лекарственных форм терапевтической ДНК, которые могут храниться, перевозиться и использоваться специалистами в неблагоприятных условиях, в частности при положительной или повышенной температуре. Физическая и химическая стабильность плазмидной ДНК при хранении в значительной степени определяется составом вспомогательных веществ, ее концентрацией или содержанием в готовой лекарственной форме и условиями хранения (Schleef M, Schmidt Т. Animal-free production of ccc-supercoiled plasmids for research and clinical applications. J Gene Med. 2004; 6 Suppl 1:845-53). Основным процессом, изменяющим фармацевтически активную форму плазмидной ДНК при хранении, является распад цепи ДНК, в ходе которого образуется кольцевая релаксированная форма плазмиды и, в дальнейшем, линейная двухцепочечная форма. Известно, что при хранении замороженного раствора плазмидной ДНК при температуре ниже минус 80°С распад сверхскрученной формы практически не наблюдается (Walther W, Stein U, Voss С, Schmidt Т, Schleef M, Schlag PM. Stability analysis for long-term storage of naked DNA: impact on nonviral in vivo gene transfer. Anal Biochem. 2003; 318(2):230-5). Такой способ хранения плазмидной ДНК не может быть широко использован в клинической практике, поскольку учреждения здравоохранения и аптеки в большинстве случаев не обладают необходимым холодильным оборудованием. Перевозка готовых лекарственных форм с сохранением столь низкой температуры продукта также крайне затруднительна. При подборе надлежащего состава и концентраций вспомогательных веществ могут быть получены растворы плазмидных ДНК, стабильных в течение 12 месяцев при хранении при температуре 4°С или более трех лет при хранении при температуре минус 20°С (Przybylowski M, Bartido S, Borquez-Ojeda О, Sadelain M, Riviere I. Production of clinical-grade plasmid DNA for human Phase I clinical trials and large animal clinical studies. Vaccine. 2007; 25(27):5013-24).
Наиболее распространенным способом создания более стабильных готовых лекарственных форм макромолекул является лиофилизация. Как правило, лиофилизованные лекарственные формы стабильны при хранении при температуре 4°С в течение нескольких лет, в ряде случаев возможно хранение продукта при комнатной температуре в течение нескольких месяцев или даже двух лет. Лиофилизация также позволяет изменять концентрацию действующего вещества - флаконы могут быть заполнены концентрированным раствором небольшого объема, а при растворении продукта перед использованием объем может быть увеличен до необходимого. Также возможна лиофилизация гипотонических растворов и последующее растворение лиофилизата солевым раствором или раствором нормальной осмоляльности (Anchordoquy TJ, Armstrong TK, Molina MC. Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes. J Pharm Sci. 2005; 94(6):1226-36).
При лиофилизации растворов плазмидной ДНК обычно ожидается увеличение стабильности продукта при последующем хранении, однако сама процедура замораживания и сублимации в вакууме может существенно повреждать сверхскрученные плазмидные ДНК (Anchordoquy TJ, Armstrong TK, Molina MC, Allison SD, Zhang Y, Patel MM, et al. Physical stabilization of plasmid DNA-based therapeutics during freezing and drying. In: Costantino HR, Pikal MJ, editors. Lyophilization of biopharmaceuticals. AAPS press; 2004. pp.605-41). В частности, лиофилизация ДНК из замороженного водного раствора, не содержащего вспомогательных веществ, вызывает удаление координированных молекул воды, то есть гидратной оболочки молекулы ДНК, что приводит к потере структурной целостности молекулы ДНК (Poxon SW, Hughes JA. The effect of lyophilization on plasmid DNA activity. Pharm Dev Technol. 2000; 5(1):115-22). Такие нарушения конформации молекулы ДНК, распад комплементарных связей между азотистыми основаниями и частичное нарушение стэкинга приводят к практическим нежелательным последствиям - падению биологической активности плазмидной ДНК до 25% от исходной (Anchordoquy TJ, Armstrong ТК, Molina MC. Low molecular weight dextrans stabilize nonviral vectors during lyophilization at low osmolalities: concentrating suspensions by rehydration to reduced volumes. J Pharm Sci. 2005; 94(6): 1226-36).
Известно, что потеря координированных молекул воды, удаляемых при сублимации, может быть скомпенсирована при введении в лиофилизуемый раствор нелетучих гидрофильных веществ, в качестве которых обычно используют сахара и полиолы (Maitani Y, Aso Y, Yamada A, Yoshioka S. Effect of sugars on storage stability of lyophilized liposome/DNA complexes with high transfection efficiency. Int J Pharm. 2008; 356(1-2):69-75). Большая часть известных технических решений по стабилизации ДНК при лиофилизации относится к области получения лиофильно высушенных липосом, содержащих ДНК (Патент США 7,323,297), таким образом применимость этих решений для раствора "голой" плазмидной ДНК представляется неочевидной. В работе (Quaak S, Haanen J, Beijnen J, Nuijen B. Naked Plasmid DNA Formulation: Effect of Different Disaccharides on Stability after Lyophilisation. AAPS PharmSciTech, Vol.11, No.1, March 2010) было исследовано влияние нескольких дисахаридов на процесс лиофилизации плазмидной ДНК и было установлено, что сахароза, используемая в массовом отношении 20:1 с ДНК дает наиболее стабильную при хранении готовую лекарственную форму. Вместе с тем, в данной работе не были рассмотрены вопросы влияния рН и солевого состава раствора на стабильность плазмидной ДНК, не исследованы композиции, дающие изотонический раствор ДНК при концентрации менее 5 мг/мл и не были исследованы моносахариды, потенциально пригодные для получения стабильных лиофилизованных препаратов макромолекул.
Описание Фигур:
1. На Фигуре 1 показана карта экспрессионной плазмиды pCMV-VEGF165 (длина 4859 пар оснований). Используются следующие обозначения: «CMV early promoter/enhancer region» - область промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса; enhancer region - область энхансера; «CMV promoter» - область промотора цитомегаловируса; «ТАТА box» - ТАТА-элемент; «transcription start» - точка начала транскрипции; «Kozak» - последовательность Козак; «start codon» - старт-кодон, первый кодон открытой рамки считывания VEGF165; «VEGF165» - открытая рамка считывания (ОРС) полипептида васкулярно-эндотелиального фактора роста человека 165; «stop codon» - стоп-кодон; «SV40 рА term» - сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40; «CMV forward primer» - область отжига стандартного праймера CMV forward; «M13 forward20 primer» - область отжига стандартного праймера М13 fbrward20; «M13 pUC fwd primer» - область отжига стандартного праймера M13 pUC fwd; «pBR322ori» - область начала репликации плазмиды pBR322; «f1 origin» - участок инициации репликации бактериофага f1; «AmpR promoter» - прокариотический промотер гена bla; «NTPII (neomycin phosphotransferase; KanR» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
2. Фигура 2. Ангиограммы пациента 74 лет с хронической ишемией нижних конечностей. Диагноз: атеросклероз, бедренно-подколенная окклюзия с обеих сторон IIб-III ст. (боли в покое). Показатели при поступлении: лодыжечно-плечевой индекс - 0,48 (справа), 0,32 (слева); чрескожное напряжение кислорода - 61 мм рт.ст. Пациент получал ФК в составе стандартной комплексной терапии (декстраны, дезагреганты). Показатели через 90 сут: дистанция безболевой ходьбы 130 м; лодыжечно-плечевой индекс 0,5 (справа), 0,57 (слева); чрескожное напряжение кислорода - 78 мм рт.ст. А, Б - ангиограммы до лечения: на уровне верхней и средней третей бедер (А); на уровне голеней (Б); В, Г - ангиограммы через 90 сут после использование препарата «Неоваскулген» в составе комплексной терапии: на уровне верхней и средней третей бедер (В); на уровне голеней (Г). Стрелками указаны удовлетворительно наполненные кровеносные сосуды, в т.ч. и развитые коллатерали.
Краткое описание настоящего изобретения
Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание штамма-продуцента плазмидной ДНК и физиологически приемлемой фармацевтической композиции, обеспечивающей стабильность готовой лекарственной формы плазмидной ДНК в течение длительного времени и пригодной для генотерапии.
Фармацевтическая композиция содержит очищенную плазмидную ДНК, кодирующую васкулярно-эндотелиальный фактор роста человека (VEGF) под контролем функциональных генетических элементов, обеспечивающих экспрессию гена в клетках человека, и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества в виде, по меньшей мере, одного криопротектанта, обладающего свойствами наполнителя, и стабилизатора рН, в эффективных количествах, обеспечивающих получение изотонического раствора для инъекций с концентрацией очищенной плазмидной ДНК от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0.
Фармацевтическая композиция может быть использована для получения раствора для инъекций для внутримышечного, внутривенного или внутриартериального, подкожного и внутрикожного введения. Также может быть применена для накожного введения в гелевой основе; для имплантации на резорбируемом или нерезорбируемом носителе.
Фармкомпозиция предназначена для приготовления ex tempore или иным путем раствора для внутримышечного или иных путей внутреннего введения пациенту (больному, пострадавшему человеку, животному) с целью индукции развития в тканях кровеносных сосудов.
Одним из показаний к применению фармкомпозиции могут служить хронические ишемические состояния различной этиологии, включая ишемическую болезнь сердца, хронические облитеризующие заболевания сосудов нижних конечностей; ситуации, нуждающиеся для исправления в индукции репаративных процессов в тканях, например обширные, длительно не заживающие раны (язвы), в том числе ожоговые, местные повреждения, включая переломы и дефекты костей.
Способ применения фармацевтической композиции заключается во введении ее человеку (или животным) таким способом и в таком количестве, которые обеспечат лечебный эффект в зависимости от нозологической формы и медицинских показаний.
Подробное описание настоящего изобретения
Плазмидная ДНК, кодирующая васкулярно-эндотелиальный фактор роста человека может быть получена путем лигирования области открытой рамки считывания (ОРС) кДНК ВЭФР человека с плазмидным вектором, обеспечивающим экспрессию кодируемых генов в клетках человека, а также репликацию плазмиды в клетках Esherichia coli. Примерами таких векторов являются плазмиды семейства pcDNA, pCMV- Script и pBK-CMV (источник - электронная база данных http://addgene.org/vector-database/). Необходимым компонентом такого вектора является эукариотический промотор, предпочтительно выбранный из группы немедленного раннего промотора цитомегаловируса (CMV), фактора элонгации трансляции 1 альфа человека (EFIa), убиквитина С человека (Ubc), вакуолизирующего вируса обезьяны (SV40), фосфоглицераткиназы 1 мыши (PGK), бета-актина человека, но не ограниченный данной группой. Более предпочтительная группа векторов для экспрессии гена ВЭФР в клетках человека содержит немедленный ранний промотор цитомегаловируса (далее - промотор CMV), ген устойчивости к действию антибиотика и участок начала репликации (ориджин репликации) средней или высокой копийности, выбранный из группы ориджинов репликации ColE1, pUC, pBR322, p15A. Более предпочтительная группа векторов включает ген устойчивости к антибиотику канамицин, кодирующий неомицин-фофсфотрансферазу (NPT II), что позволяет исключить использование антибиотиков ампициллиновой группы в процессе производства плазмиды. В качестве векторов для получения целевой плазмидной ДНК могут быть также использованы плазмиды, кодирующие ОРС других генов. Целевая плазмидная ДНК может быть получена из таких плазмидных ДНК путем удаления области ОРС постороннего гена рестрикцией, выделения "акцепторного" фрагмента ДНК и последующего лигирования с ним "донорного" фрагмента ДНК, кодирующего ОРС кДНК ВЭФР человека. Примером такой "акцепторной" плазмиды является плазмида pEGFP-N2.
Область открытой рамки считывания кДНК ВЭФР человека может быть выбрана из четырех известных сплайс-вариантов, кодирующих изоформы ВЭФР с длиной аминокислотной цепи 121, 145, 165, 189. Предпочтительной изоформой ВЭФР для получения плазмидной ДНК является сплайс-вариант 165 аминокислот. Область ОРС кДНК ВЭФР человека может быть получена из суммарной кДНК тканей человека или синтезирована из перекрывающихся олигонуклеотидов. В синтетической области ОРС кДНК ВЭФР человека часть или все кодоны могут быть заменены на синонимичные, такой синтетический фрагмент кДНК может заменять природный, если он обеспечивает сравнимое с природным время жизни кДНК и сравнимую с природной эффективность трансляции целевого гена. Используемая для получения целевой плазмиды кДНК ВЭФР может содержать известные полиморфизмы (замены единичных нуклеотидов), не изменяющие аминокислотный состав кодируемого полипептида. Использование кДНК ВЭФР, содержащих такие полиморфизмы, не изменяет свойств получаемой целевой плазмиды.
Наиболее предпочтительным вариантом плазмиды, кодирующей ВЭФР и предназначенной для медицинского использования, является продукт лигирования области ОРС ВЭФР изоформы 165 аминокислот и акцепторного фрагмента плазмиды pBK-CMV.
Данная плазмидная ДНК, согласно настоящему изобретению обозначаемая как pCMV-VEGF165, длиной 4859 пар оснований, представленна в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1. Структура плазмиды pCMV-VEGF165 приведена на Фиг.1.
Указанная плазмида размером 4859 п.о. состоит из:
1. Участка 1-361; 968-4859 вектора pBK-CMV, включающего
1.1. элементы обеспечивающие экспрессию целевого гена в клетках млекопитающих: промотора/энхансера ранних генов цитомегаловируса (4626-355), включающую область энхансера (4684-231) и область промотора цитомегаловируса (274-355); ТАТА-элемент (320-326); точку начала транскрипции (349); сигнал полиаденилирования и терминатор вируса SV40 (1306-1531);
1.2. элементы, обеспечивающие поддержание плазмиды в бактериальной клетке, участок инициации репликации бактериофага f1 (1583-1995); прокариотический промотер гена bla (2058-2086); последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину (2519-3313); область начала репликации плазмиды pBR322 (3907-4526);
2. Участка 362-967, включающего последовательность Козак (380-391), которая располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена, открытую рамку считывания гена VEGF165 (392-964), стоп-кодон (965-967).
Указанная плазмида содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: NdeI (1); BamHI (364); EcoRI (373); BsrGI (854); XmaI (969); Acc651 (978); Bell (1307); NarI (2650); ApaLI (4254); PciI (4568). Структура плазмиды приведена на Фиг.1.
Плазмида была получена с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и клонированных участков кДНК человека (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).
Элементы плазмиды перечислены в порядке их расположения. Взаимный порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы плазмиды.
В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, содержащие ген VEGF165 под контролем эукариотического промотора.
Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же регуляторные элементы могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.
Для получения штамма-продуцента плазмидная ДНК pCMV-VEGF165 может быть введена (трансформирована) в бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники. И хотя в зависимости от вида клетки и условий культивирования полученного трансформанта копийность и общее содержание плазмиды pCMV-VEGF165 в бактериальной суспензии может варьироваться, факт присутствия целевой плазмиды будет иметь место при условии успешной трансформации клетки - реципиента.
«Трансформация клетки плазмидой» означает введение плазмиды в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению «бактериальная клетка-продуцент плазмиды pCMV-VEGF165» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к поддержанию, репликации и накоплению плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Используемый здесь термин «бактериальная клетка-продуцент плазмиды pCMV-VEGF165» также означает клетку, которая способна накапливать плазмиду pCMV-VEGF165 в количестве не менее чем 1 мг/л (или 1 мкг/109 клеток), более предпочтительно не менее чем 10 мг/л. Указанная плазмида pCMV-VEGF165 накапливается в указанной клетке предпочтительно в кольцевой сверхскрученной форме.
Предпочтительно использование бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, для трансформации плазмидой pCMV-VEGF165, кодирующей ВЭФР под контролем промотора CMV.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.
Предпочтительными вариантами штамма-реципиента для получения продуцента плазмиды pCMV-VEGF165 являются штаммы Е. coli, производные от непатогенного штамма K12 и содержащие инактивированный ген системы репарации ДНК recAl, a также инактивированный ген эндонуклеазы end A1. Примерами таких штаммов являются DH5alpha, DH10B, XL-lBlue, ТОРЮ.
Конкретным примером штамма-реципиента для получения продуцента плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению является, но не ограничивается им, штамм Escherichia coli ТОРЮ. Штамм Escherichia coli ТОРЮ характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими признаками и генетическими признаками.
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные палочки образуют нити; на агаризованной среде - блестящие полупрозрачные выпуклые средние колонии с ровным краем. Штамм хранится в следующих условиях: среда Лурье-Бертрана, 1% глюкозы, 10% глицерина. Штамм размножается в следующих условиях - среда Лурье-Бертрана.
Генетические особенности штамма. Генотип штамма - Δ(агаА-leu)7697, [araD139]B/r, Δ(codB-lacI)3, φp80dlacZ58(M15), galK0, mcrA0, galU-, recA1, endA1, nupG-, rpsL-(strR), Δ(mcrC-mrr)715.
Трансформация штамма Escherichia coli TOP 10 плазмидой pCMV-VEGF165 приводит к получению штамма-продуцента TOP10/pCMV-VEGF165, который обеспечивает биосинтез плазмиды pCMV-VEGF165 в количестве 5-20 мг/л культуры при культивировании в перемешиваемых колбах в течение 12-20 ч в среде Лурье-Бертрана с добавлением канамицина до 30 мкг/мл, при этом не менее 70% плазмиды pCMV-VEGF165 находится в сверхскрученной форме.
Способ получения высокоочищенной плазмиды pCMV-VEGF165 согласно настоящему изобретению включает культивирование описанной выше бактерии в питательной среде, подходящей для выращивания указанных прокариотических клеток, сбор биомассы клеток, ресуспендирование клеток, их щелочной лизис, селективную ренатурацию плазмидной ДНК кислым раствором, отделение осадка, концентрирование ультрафильтрацией, отделение посторонних примесей и РНК гель-фильтрацией в высокосолевом растворе, отделение остаточной геномной ДНК, эндотоксина и родственных примесей аффинной (тиофильной) хроматографией, окончательную очистку анионообменной хроматографией и последующее концентрирование и обессоливание раствора очищенной плазмиды pCMV-VEGF165 при помощи ультрафильтрации/диафильтрации. Получаемый препарат плазмиды pCMV-VEGF165, пригодной для последующего получения фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы, характеризуется следующими основными признаками.
1) Доля родственных примесей (релаксированной кольцевой и линейной форм плазмиды) - не более 5% (здесь и далее - доля от концентрации основного вещества).
2) Доля геномной ДНК E. coli - не более 1%.
3) Доля РНК - не более 1%.
4) Доля общего белка - не более 0,1%.
5) Содержание эндотоксина - не более 50 ЕЭ на 1 мг основного вещества.
Раствор плазмидной ДНК pCMV-VEGF165, пригодный для последующего получения фармацевтической композиции и готовой лекарственной формы, может быть получен при помощи других стандартных методов выделения и очистки ДНК, известных специалисту в данной области техники, например метода термического лизиса бактерий в присутствии детергента, метода избирательного осаждения РНК при помощи хлорида кальция, метода разделения сверхскрученной и релаксированной форм плазмиды при помощи градиентной элюции и ряда других методов, описанных в (D.M.F. Prazeres, "Plasmid Biopharmaceuticals: Basics, Applications and Manufacturing", John Wiley & Sons, Inc. (2011) ISBN: 978-0-470-23292-7).
Готовая лекарственная форма плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 должна быть пригодна для проведения внутримышечных инъекций и не должна приводить к существенному изменению свойств основного вещества при продолжительном хранении. Возможная готовая лекарственная форма плазмиды pCMV-VEGF165 может быть выбрана из группы замороженного раствора, жидкого раствора, лиофилизата, т.е. лиофильно высушенного раствора, аморфной пленки, но не ограничивается ими.
Предпочтительными вариантами готовой лекарственной формы являются жидкий раствор или лиофилизат, поскольку они могут храниться при положительной температуре, т.е. в стандартных фармацевтических холодильниках, и не требуют значительного времени для подготовки к инъекции.
Наиболее предпочтительным вариантом готовой лекарственной формы является лиофилизат, поскольку отсутствие воды потенциально замедляет химические реакции распада цепей ДНК, приводящие к превращению сверхскрученной плазмидной ДНК в релаксированную кольцевую форму. Кроме того, при хранении жидкой лекарственной формы плазмидной ДНК возможен продолжительный контакт раствора с материалом резиновой пробки, потенциально содержащим экстрагируемые ионы переходных металлов, ускоряющих распад цепей ДНК путем катализа образования гидроксил радикалов.
Получение лиофилизата, то есть аморфной или микрокристаллической пористой массы, требует присутствия в лиофилизуемом растворе вспомогательных веществ, выполняющих функции криопротектанта, стабилизатора рН, хелатирующего агента, антиоксиданта, наполнителя и т.д. Минимально возможный набор вспомогательных веществ может включать в себя, по меньшей мере один, криопротектант, обладающий свойствами наполнителя и стабилизатор рН. Вспомогательное вещество, являющееся криопротектантом и наполнителем, может быть выбрано из группы, включающей моно- и дисахариды, полиолы и полимеры, такие как: сахароза, лактоза, трегалоза, маннитол, сорбитол, глюкоза, раффиноза, поливинилпирролидон или их сочетания. Стабилизатор рН может быть выбран из группы, включающей цитрат натрия, фосфат натрия, Трис-HCl, Трис-ацетат, глицин и другие аминокислоты.
При исследовании различных фармацевтических композиций плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 нами было неожиданно обнаружено, что наилучшую стабильность при хранении при температуре +2-+8°С обеспечивает сочетание вспомогательных веществ глюкозы и фосфата натрия рН=7,8.
При сохранении неизменного объема раствора до и после лиофилизации, наилучший состав раствора, обеспечивающий сохранение свойств плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 в процессе лиофилизации и при последующем хранении представляет собой:
1. Плазмидная ДНК от 0,1 до 10 мг/мл, предпочтительно от 0,5 до 4 мг/мл, более предпочтительно от 0,8 до 1,2 мг/мл.
2. Глюкоза (декстроза) от 200 до 400 мМ, предпочтительно от 250 до 350 мМ, более предпочтительно от 280 мМ до 320 мМ.
3. Фосфат натрия (смесь тризамещенного, двузамещенного и однозамещенного фосфатов натрия) в концентрации от 3 до 30 мМ, предпочтительно от 5 до 20 мМ, более предпочтительно от 8 до 12 мМ.
4. рН раствора от 7,0 до 9,0, предпочтительно от 7,2 до 8,5, более предпочтительно от 7,4 до 8,2.
Особенности плазмиды, использованной для создания штамма-продуцента и фармацевтической композиции приведены на Фигуре 1.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1.
Получение раствора очищенной плазмидной ДНК pCMV-VEGF165
Подготовка посевного материала
Проводят оживление емкости консервированного штамма-продуцента ТОР10/pCMV-VEGF165 из рабочего банка, выращивают инокулят в жидкой среде в объеме 50 мл.
Биосинтез пДНК
Готовят к работе ферментер с колбой 10 л, стерилизуют колбу со средой, асептически монтируют линии подачи и отвода, калибруют КиПП, инокулируют ферментер и ведут культивирование 8 часов до достижения постоянной концентрации растворенного кислорода (стационарная фаза роста культуры) при фиксированной скорости мешалки 1000 об/мин, после чего прекращают аэрацию и охлаждают колбу. Пробу культуральной суспензии передают на анализ плотности культуры.
Получение биомассы
Биомассу, то есть осадок клеток, отделяют от культуральной жидкости в напольной высокоскоростной центрифуге периодического действия с бакетным ротором. Супернатант культуральной жидкости передают на обеззараживание автоклавированием. Полученную биомассу хранят в центрифужных стаканах в низкотемпературном холодильнике. Пробу полученной биомассы передают на анализ содержания и подлинности целевого вещества.
Суспендирование биомассы, лизис и нейтрализация
Размороженную биомассу переносят в бак для лизиса и суспендируют верхнеприводной мешалкой в растворе для суспендирования. Проводят лизис клеток раствором гидроксида натрия и додецилсульфата натрия при перемешивании верхнеприводной мешалкой в течение 5 минут. При перемешивании добавляют раствор ацетата калия для нейтрализации и одновременного получения осадка клеточного дебриса, геномной ДНК, связанной с гистонами, и белков. Образование осадка происходит за счет перехода додецилсульфата натрия в нерастворимую калиевую соль и коагуляции мицелл. Одновременно с этим при нейтрализации раствора происходит ренатурация плазмидной ДНК.
Получение осветленного лизата
Полученную суспензию переносят в центрифужные стаканы и отделяют осадок в напольной высокоскоростной центрифуге периодического действия с бакетным ротором. Осадок в стаканах передают на обеззараживание автоклавированием. Осветленный раствор плазмидной ДНК, дополнительно содержащий родственные соединения - релаксированную и линейную форму плазмидной ДНК, а также посторонние примеси - остаточную геномную ДНК, РНК, белки и LAL-эндотоксин собирают в питающий бак ультрафильтрационной установки.
Ультрафильтрация
Проводят концентрирование раствора плазмидной ДНК методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке при помощи половолоконных картриджей с порогом отсечения 500 кДа. В процессе ультрафильтрации дополнительно происходит 9-кратное удаление всех молекул размером меньше 300 кДа, то есть белков, транспортной РНК, LAL-эндотоксина, коротких фрагментов геномной ДНК. Предписанная степень концентрирования - 9 раз. Концентрированный раствор плазмиды собирают в стеклянную емкость, промывают ультрафильтрационную установку раствором для гель-фильтрации и объединяют с концентрированным раствором плазмидной ДНК.
Гель-фильтрация
Первый процесс глубокой хроматографической очистки проводят методом гель-фильтрации на крупнопористом декстрановом сорбенте Sepharose 6 Fast Flow "GE Lifesciences». Используют высокосолевой раствор, содержащий 2.1 М сульфата аммония и 10 мМ ЭДТА-Na, что позволяет одновременно с разделением молекул по размеру проводить удерживание примесей РНК и LAL-эндотоксина сорбентом за счет неспецифического гидрофобного взаимодействия. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор полуочищенной плазмидной ДНК, содержащий 2.1 М сульфата аммония, собирают в стеклянную бутыль.
Аффинная хроматография
Второй процесс глубокой хроматографической очистки ведут методом тиофильной (псевдоаффинной) хроматографии на сорбенте PlasmidSelect Xtra «GE Lifesciences". Для промывки колонны используют раствор, содержащий 2.0 М сульфата аммония, полуочищенный раствор наносят на колонну при концентрации сульфата аммония 2,1 М. При нанесении раствора все формы ДНК и часть остаточной РНК адсорбируются на сорбенте, остаточные белки и эндотоксин не адсорбируются. После нанесения колонну промывают раствором с концентрацией сульфата аммония 2,0 М, при этом происходит элюция остаточных РНК, геномной ДНК и родственных соединений плазмидной ДНК. Основное вещество HSCI-01 элюируют раствором с концентрацией сульфата аммония 1,7 М. Колонну регенерируют и очищают раствором гидроксида натрия 0,1 М. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор полуочищенной плазмидной ДНК, содержащий 1.7 М сульфата аммония, собирают в стеклянную бутыль, разбавляют водой для инъекций в соотношении 1:2.
Аниоонообменная хроматография
Третий процесс глубокой хроматографической очистки ведут методом аниоонообменной хроматографии на сорбенте SOURCE 30Q «GE Lifesciences". Основное вещество адсорбируют на колонне и проводят промывку раствором, содержащим 0,4 М хлорида натрия. При промывке колонны происходит замена катиона основного вещества с иона аммония на ион натрия и элюция остаточного эндотоксина. Основное вещество элюируют раствором 1 М хлорида натрия. Раствор примесей и промывочные растворы собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Раствор очищенной плазмидной ДНК собирают в стеклянную бутыль.
Ультрафильтрация и диафильтрация
Раствор очищенной плазмидной ДНК концентрируют ультрафильтрацией на установке с половолоконным модулем с порогом отсечения мембраны 300 кДа. По достижении концентрации 0,25% установку переводят в режим диафильтрации и проводят исчерпывающую замену буфера на воду для инъекций. Фильтрат собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Сконцентрированный раствор сливают в стеклянную бутыль, определяют концентрацию сверхскрученной плазмидной ДНК и хранят при температуре ниже минус 70°С.
Пример 2. Получение вариантов лиофилизата для исследования стабильности
Для получения вариантов фармацевтической композиции использовали обессоленный раствор плазмидной ДНК pCMV-VEGF 165 с концентрацией около 2,5 мг/мл и остаточным содержанием Трис-HCl рН=7,5 и NaCl не более 1 мМ. В качестве криопротектантов исследовали глюкозу, сахарозу и лактозу качества не ниже требований Европейской Фармакопеи. В качестве стабилизатора рН использовали раствор фосфата натрия с рН в диапазоне от 7,2 до 9,0. Сахариды использовали в конечной концентрации 300 мМ, фосфат натрия в конечной концентрации 10 мМ. Такие концентрации вспомогательных веществ обеспечивают изотоничность раствора при внутреннем введении. Конечная концентрация ДНК в получаемых фармацевтических композициях составляла 1 мг/мл. Лиофилизацию проводили в стеклянных флаконах вместимостью 5 мл, снабженных полуоткрытыми лиофилизационными резиновыми пробками и заполненных порциями по 1,2 мл исследуемых растворов. Режим лиофильной сушки для всех исследуемых образцов приведен в таблице 1.
| Таблица 1 | ||
| Режим лиофильной сушки | ||
| Название стадии | Продолжительность, мин | Температура, °С |
| 1) Замораживание раствора: | ||
| а) | 30 | -50 |
| б) | 300 | -50 |
| 2) Лиофилизация: | ||
| а) | 60 | -30 |
| б) | 930 | -30 |
| в) | 60 | -10 |
| г) | 480 | -10 |
| д) | 60 | 20 |
| е) | 360 | 20 |
| 3) Досушивание: | ||
| а) | 60 | 40 |
| б) | 600 | 40 |
Давление в рабочей камере во время сушки 60 мкбар, температура продукта по окончании этапа замораживания должна быть не выше минус 45°С, то есть на два градуса ниже температуры фазового перехода (glass transition temperature) для глюкозы и более чем на 10 градусов ниже для остальных сахаров. Температура продукта по окончании лиофилизации должна быть не ниже минус 15°С. Измерение температуры продуктов проводили при помощи термопар, вмороженных во флаконы с имитаторами продукта, содержащими все вспомогательные вещества, но не содержащих ДНК. По окончании досушивания проводили герметизацию флаконов в атмосфере стерильного осушенного воздуха сжатием полок. Выгруженные флаконы укупоривали алюминиевыми колпачками. Для сравнения стабильности при хранении при повышенной температуре использовали раствор фосфата натрия рН=7,8, полученный смешиванием растворов двузамещенного фосфата натрия и однозамещенного фосфата натрия в молярном соотношении 91,5:8,5. Лиофилизованные укупоренные флаконы хранили при температуре +37°С в суховоздушном термостате, 1 раз в месяц извлекали очередные флаконы, растворяли лиофилизат и определяли долю релаксированной плазмидной ДНК при помощи аналитической ионообменной хроматографии. Результаты измерений представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Доля релаксированной плазмидной ДНК при хранении при повышенной температуре | ||||
| Время хранения, месяцев | ||||
| Криопротектант | 0 | 1 | 2 | 3 |
| Глюкоза | 2,2% | 2,8% | 5,3% | 10,0% |
| Сахароза | 2,1% | 6,2% | 8,4% | 10,4% |
| Мальтоза | 2,3% | 7,0% | 8,8% | 14,6% |
| Лактоза | 2,2% | 9,0% | 9,6% | 18,5% |
Было установлено, что использование глюкозы в качестве криопротектанта дает наименьшую скорость распада сверхскрученной плазмидной ДНК при массовом соотношении сахарид:ДНК 1:50 и рН=7,8.
Для фармацевтической композиции, основанной на глюкозе, исследовали зависимость стабильности сверхскрученной плазмидной ДНК от рН раствора и концентрации фосфата натрия (при рН 7,8). Было установлено, что стабильность сверхскрученной плазмидной ДНК не изменяется существенным образом при варьировании концентрации фосфата натрия от 5 до 20 мМ (данные не приводятся). При варьировании рН раствора было установлено (таблица 3), что в диапазоне рН от 7,8 до 9,0 существенных изменений стабильности при хранении не наблюдается, но при рН 7,2 стабильность сверхскрученной плазмиды снижается.
| Таблица 3 | ||||
| Доля релаксированной плазмидной ДНК при хранении при повышенной температуре, варьирование рН | ||||
| pH | 0 мес | 1 мес | 2 мес | 3 мес |
| 7,2 | 2,2% | 4,09% | 7,63% | 15,17% |
| 7,8 | 2,2% | 2,80% | 5,30% | 10,00% |
| 8,4 | 2,3% | 2,76% | 3,34% | 10,69% |
| 9 | 2,1% | 2,51% | 2,97% | 8,39% |
Таким образом, по данным ускоренного хранения оптимальная фармацевтическая композиция может быть выбрана для диапазона рН от 7,8 до 9,0 и концентрации фосфата натрия от 5 до 20 мМ. Поскольку концентрация ионизуемых фосфатных групп в составе ДНК при концентрации ДНК 1 мг/мл составляет около 3 мМ, и концентрация буферных солей должна существенно превышать суммарную концентрацию ионизуемых групп в составе основного вещества, оптимальная концентрация фосфата натрия была выбрана как 10 мМ. Оптимальный рН раствора был выбран как 7,8, поскольку эта величина наиболее близка к физиологическому рН (7,2-7,4). Однако следует учитывать, что рН, с одной стороны, должен быть как можно ближе к 7,2, а с другой стороны, чем он выше, тем выше стабильность плазмиды (до 9,0). Вероятно, что при температуре хранения +2-+8°С при рН 7,0-9,0 плазмидная ДНК сохранит стабильность, достаточную для геннотерапии.
Пример 3.
Формулирование раствора очищенной плазмидной ДНК и получение готовой лекарственной формы
Ведут процесс получения плазмидной ДНК, как указано в Примере 1, до завершения стадии анионообменной хроматографии. Последующие стадии проводят, как указано ниже.
Ультрафильтрация и диафильтрация
Раствор очищенной плазмидной ДНК концентрируют ультрафильтрацией на установке с половолоконным модулем с порогом отсечения мембраны 300 кДа. По достижении концентрации 0,15% установку переводят в режим диафильтрации и проводят исчерпывающую замену буфера на раствор 10 мМ фосфата натрия, рН 7,8 и 4,4% (300 мМ) глюкозы в воде для инъекций. Фильтрат собирают в тару и утилизируют в установленном порядке. Сконцентрированный формулированный раствор сливают в стеклянную бутыль, определяют концентрацию сверхскрученной плазмидной ДНК и доводят раствор до конечной концентрации 0,1%.
Стерильная фильтрация
Готовый раствор субстанции передают в чистую зону класса А и проводят стерильное фильтрование при помощи дисковых мембранных фильтров в депирогенизированные стерильные бутылки для инфузионных растворов 250 мл по ГОСТ 19808-86. Проводят отбор проб для передачи в ОКК, закрывают бутылки пробками резиновыми, укупоривают колпачками алюминиевыми и замораживают в карантинной зоне склада.
Размораживают формулированный раствор субстанции пДНК и передают в чистую зону класса А. Вскрывают бутылки и проводят стерильное фильтрование при помощи дисковых мембранных фильтров в депирогенизированные стерильные бутылки для инфузионных растворов 250 мл по ГОСТ 19808-86. Проводят стерильный розлив в стерильные "инсулиновые" флаконы 5 мл по ГОСТ 19808-86. Закрывают флаконы пробками резиновыми по ТУ38.006.269-90 и передают на стадию лиофильной сушки.
Флаконы помещают на полки лиофильной сушки, замораживают при -45°С и ведут трехэтапную вакуумную сушку. Закрывают пробки, извлекают флаконы и укупоривают колпачками алюминиевыми по ГОСТ Р 51314-99.
Пример 4.
Проверка стабильности готовой лекарственной формы pCMV-VEGF165
Флаконы со стерильным лиофилизатом плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре +4°С в течение 2,5 лет и проводили анализ доли родственных примесей при помощи ионообменной хроматографии один раз в 6 месяцев. Результаты анализа представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Стабильность готовой лекарственной формы при хранении при температуре +4°С | ||||||
| Норма | На момент выпуска | 6 мес хранения | 12 мес хранения | 18 мес хранения | 24 мес хранения | 30 мес хранения |
| Релаксированная и линейная плазмидная ДНК менее 5% по ионообменной ВЭЖХ | 3,0% | 3,0% | 3,3% | 3,7% | 4,1% | 4,0% |
Таким образом, лекарственная форма плазмидной ДНК pCMV-VEGF165 стабильна при хранении в течение двух лет.
Пример 5.
Проверка эффективности использования фармацевтической композиции
При применении фармкомпозиции, включающей помимо плазмидной конструкции вспомогательные вещества, у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей были получены результаты подтверждения ее эффективности, демонстрирующие преимущества перед введением только лишь плазмиды. Данный факт установлен при исследовании, проведенным с вовлечением 75 пациентов с 2а-3 ст. хронической ишемии (по А.В.Покровскому-Фонтейну). В качестве критериев проанализированы: длина безболевой ходьбы, чрезкожно определяемое напряжение кислорода, лодыжечно-плечевой индекс и линейная скорость кровотока в задней большеберцовой артерии.
- Длина безболевой ходьбы. На фоне лечения у пациентов клинической группы ДБХ через 3 мес наблюдения составила 236,49±193,49 м (от 50 до 1200 м), а через 6 мес - 284,73±242,02 м (от 20 до 1500 м). Прирост среднего значения пути, который пациент мог пройти без боли, в исследуемой группе составил 149,47 м, значение медианы увеличилось на 127,5 м, различия были статистически достоверны (Р=0,006).
В контрольной группе среднее расстояние, проходимое пациентом, уменьшилось на 1,42 м, значение медианы увеличилось на 35,00 м, различие между показателями оказалось статистически недостоверным. Различия в динамике показателя между группами (+150,89 по среднему значению и +92,5 по значению медианы) были статистически достоверны (Р=0,001).
- Чрезкожно определяемое напряжение кислорода. В клинической группе отмечалась непрерывная тенденция к увеличению среднего значения признака ТКНК с 76,69±9,96 мм рт.ст. при первом визите до 85,42±10,87 мм рт.ст. при четвертом. В контрольной группе отмечалась противоположная динамика: снижение среднего значения показателя с 76,89±55,76 мм рт.ст. до 75,37±61,57 мм рт.ст. за аналогичный период наблюдения. Отмеченные различия между значениями признаков в клинической группе были достоверны, а в контрольной группе статистически недостоверны (Р=0,096), т.е. показатель у данных больных практически не претерпел изменений в ходе стандартного лечения. Зафиксированные различия в приросте среднего значения показателя ТКНК между группами (+10,25) и медианы (+8,00) были значимы (0,0001). Относительный прирост показателя в группах составил: в клинической группе +12,40±17,69% и в контрольной -2,12±4,38% (Р=0,001).
- Лодыжечно-плечевой индекс ЛПИ, измеренный на целевой конечности, у пациентов клинической группы имел тенденцию к росту, а среди пациентов из группы контроля - к снижению. Так, в клинической группе с исходной величины 0,513±0,182 показатель вырос на фоне применения препарата на 0,057 и составил через полгода 0,57. Отмеченные различия в значениях признака между четвертым и первым визитами в клинической группе были статистически достоверны (Р=0,001). В контроле индекс за полгода уменьшился на 0,02 единицы - с 0,458±0,182 до 0,438±0,187. Однако эти изменения не явились статистически значимыми.
Разница между приростом среднего значения ЛПИ между группами составила +0,077 (медиана +0,065), отмеченные различия были статистически достоверны.
- Линейная скорость кровотока (по данным ультразвуковой допплерографии задней болыиеберцовой артерии), У пациентов клинической группы данный показатель имел тенденцию к росту в течение всего периода исследования: значение среднего возросло на 8,24 см/с, медианы - на 5,0 см/с - с уровня 14,95±10,19 см/с до 23,19±12,71 см/с через полгода.
У пациентов контрольной группы значения показателя увеличилось на 1,30 см/с (от 17,60±6,60 см/с. В начале исследования, до 18,90±6,77 см/с - через полгода), значение медианы осталось без изменения, на уровне 20,0 см/с. В ходе всего исследования различия в значениях показателя между группами были статистически достоверны (Р=0,005).
Прирост показателя в клинической группе был больше, чем в контрольной по значению среднего (+6,94 см/с) и медианы (+5,00 см/с), эти различия были статистически достоверны (Р=0,005).
Таким образом, по критерию эффективности «дистанция безболевой ходьбы» у пациентов клинической группы обнаружен статистически значимый рост показателя от 135,3 м на момент первого визита до 248,7 м через полгода (прирост 110,5%), который статистически значимо отличался от выявленной тенденции у пациентов контрольной группы (Р=0,001).
По другим критериям эффективности:
- ЛПИ - прирост составляет 11,11% (Р=0,001);
- ТКНК - прирост составляет 11,38% (Р=0,001);
- ЛСК - прирост составляет 55,12% (Р=0,001).
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Claims (3)
1. Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli TOP10 плазмидой pCMV-VEGF165, характеризующейся SEQ ID NO:1, культивирование штамма в подходящих для накопления биомассы условиях с последующим выделением плазмиды pCMV-VEGF165 в сверхскрученной форме и последующую лиофилизацию плазмиды pCMV-VEGF165, которую проводят при обязательном присутствии в лиофилизируемом растворе вспомогательных веществ, а именно криопротектанта, стабилизатора рН, антиоксиданта и иных веществ, позволяющих получить изотонический раствор для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0 и обеспечивающих сохранение сверхскрученной формы плазмиды pCMV-VEGF165 при последующем хранении.
2. Фармацевтическая композиция для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, полученная способом по п.1 и содержащая очищенную плазмиду pCMV-VEGF165, характеризующуюся последовательностью SEQ ID NO:1, обеспечивающую экспрессию гена VEGF165 в клетках человека, и фармацевтически допустимые вспомогательные вещества в виде, по меньшей мере, одного криопротектанта, обладающего свойствами наполнителя, и стабилизатора рН, в эффективных количествах, обеспечивающих получение изотонического раствора для инъекций с концентрацией очищенной плазмиды от 0,1 до 10 мг/мл и рН от 7,0 до 9,0.
3. Способ лечения ишемии тканей и/или органов человека, заключающийся во введении внутримышечно человеку фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.2, в эффективном количестве, обеспечивающем лечебный эффект.
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012137126/10A RU2542385C2 (ru) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека |
| PCT/RU2013/000669 WO2014035289A1 (en) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | A pharmaceutical composition for stimulation of angiogenesis |
| CN201380045032.7A CN105308173B (zh) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | 用于刺激血管生成的药物组合物 |
| CA2881799A CA2881799C (en) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | A pharmaceutical composition comprising a plasmid dna encoding a vegf for stimulation of angiogenesis |
| SI201330595A SI2890777T1 (sl) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Farmacevtski sestavek, ki obsega pCMV-VEGF165, za stimulacijo angiogeneze |
| EP13832746.5A EP2890777B1 (en) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | A pharmaceutical composition comprising pcmv-vegf165 for stimulation of angiogenesis |
| US14/423,532 US9616103B2 (en) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Pharmaceutical composition for stimulation of angiogenesis |
| ES13832746.5T ES2621675T3 (es) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Una composición farmacéutica que comprende PCMV-VEGF165 para la estimulación de angiogénesis |
| HUE13832746A HUE032520T2 (en) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | A pharmaceutical composition containing PCMV-VEGF165 to stimulate angiogenesis |
| BR112015002522-6A BR112015002522B1 (pt) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Composição farmacêutica para estimulação da angiogênese |
| MX2015002658A MX360980B (es) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Una composición farmacéutica para la estimulación de la angiogénesis. |
| PL13832746T PL2890777T3 (pl) | 2012-08-31 | 2013-08-02 | Kompozycja farmaceutyczna zawierająca pcmv-vegf165 do stymulacji angiogenezy |
| ZA2015/00909A ZA201500909B (en) | 2012-08-31 | 2015-02-09 | A pharmaceutical composition for stimulation of angiogenesis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012137126/10A RU2542385C2 (ru) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012137126A RU2012137126A (ru) | 2014-03-10 |
| RU2542385C2 true RU2542385C2 (ru) | 2015-02-20 |
Family
ID=50183970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012137126/10A RU2542385C2 (ru) | 2012-08-31 | 2012-08-31 | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9616103B2 (ru) |
| EP (1) | EP2890777B1 (ru) |
| CN (1) | CN105308173B (ru) |
| BR (1) | BR112015002522B1 (ru) |
| CA (1) | CA2881799C (ru) |
| ES (1) | ES2621675T3 (ru) |
| HU (1) | HUE032520T2 (ru) |
| MX (1) | MX360980B (ru) |
| PL (1) | PL2890777T3 (ru) |
| RU (1) | RU2542385C2 (ru) |
| SI (1) | SI2890777T1 (ru) |
| WO (1) | WO2014035289A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201500909B (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694826C1 (ru) * | 2018-06-05 | 2019-07-17 | Юрий Валентинович Червяков | Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза при окклюзии артерий голени |
| RU2842291C1 (ru) * | 2024-09-03 | 2025-06-24 | Акционерное общество "НекстГен" | Лечение отморожения конечностей пациента |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2558294C1 (ru) * | 2014-09-16 | 2015-07-27 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Кодон-оптимизированная рекомбинантная плазмида, способ стимуляции регенерации периферического нерва, способ лечения поврежденного нерва человека |
| RU2612497C2 (ru) | 2015-05-26 | 2017-03-09 | Общество с ограниченной ответственностью "НекстГен" | Оптимизированная нуклеотидная последовательность и фармацевтическая композиция на ее основе с пролонгированной экспрессией трансгена vegf |
| CN112804938B (zh) * | 2018-08-08 | 2024-08-13 | 布赖特斯佩克股份有限公司 | 用于低挥发性采样的方法和设备 |
| CN110760542B (zh) * | 2019-11-18 | 2022-07-26 | 天津大学 | 一种共表达znf580和vegf165双基因的质粒及应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6627436B2 (en) * | 1997-10-31 | 2003-09-30 | Stratagene | Vector for gene expression in prokaryotic and eukaryotic systems |
| WO2006029908A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-23 | Centelion | Stable liquid formulations of plasmid dna |
| RU2297848C2 (ru) * | 2005-05-11 | 2007-04-27 | Александр Веньяминович Иткес | Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed) |
| RU2376373C2 (ru) * | 2003-06-30 | 2009-12-20 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, способный связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (vegf), слитый полипептид, реплицируемый экспрессионный вектор, способ получения слитого полипептида, ловушка vegf, фармацевтическая композиция, способ лечения и набор для лечения vegf-опосредованного заболевания или состояния |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6613563B1 (en) * | 1997-03-14 | 2003-09-02 | Selective Gentics, Inc. | Viral vectors with modified tropism |
| EP1061955B1 (en) * | 1998-03-13 | 2005-05-04 | Wyeth | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof |
| AU5646300A (en) | 1999-02-10 | 2000-08-29 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods of stimulating angiogenesis |
| US7288521B2 (en) | 2000-04-06 | 2007-10-30 | Franco Wayne P | Growth factor therapy mobilization of stem cells into the peripheral blood |
| CN1351055A (zh) | 2000-10-26 | 2002-05-29 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人的血管内皮生长因子165受体(vegf－165r)10.67和编码这种多肽的多核苷酸 |
| US7981863B2 (en) * | 2001-09-19 | 2011-07-19 | Neuronova Ab | Treatment of Parkinson's disease with PDGF |
| CN100431611C (zh) | 2002-07-04 | 2008-11-12 | 朱静亚 | 多肽－脂质体与人血管内皮生长因子基因重组质粒复合物及用途 |
| AU2003302590B2 (en) | 2002-12-02 | 2008-11-06 | Anges Mg, Inc. | Compositions for treating or preventing angiogenesis-dependent symptoms |
| ES2338400B1 (es) | 2008-05-06 | 2011-09-14 | David Benet Ferrus | Conjunto de moleculas antiangiogenicas y su uso. |
| US8367350B2 (en) * | 2009-04-29 | 2013-02-05 | Morehouse School Of Medicine | Compositions and methods for diagnosis, prognosis and management of malaria |
-
2012
- 2012-08-31 RU RU2012137126/10A patent/RU2542385C2/ru active
-
2013
- 2013-08-02 CN CN201380045032.7A patent/CN105308173B/zh active Active
- 2013-08-02 BR BR112015002522-6A patent/BR112015002522B1/pt active IP Right Grant
- 2013-08-02 WO PCT/RU2013/000669 patent/WO2014035289A1/en not_active Ceased
- 2013-08-02 ES ES13832746.5T patent/ES2621675T3/es active Active
- 2013-08-02 PL PL13832746T patent/PL2890777T3/pl unknown
- 2013-08-02 CA CA2881799A patent/CA2881799C/en active Active
- 2013-08-02 HU HUE13832746A patent/HUE032520T2/en unknown
- 2013-08-02 SI SI201330595A patent/SI2890777T1/sl unknown
- 2013-08-02 US US14/423,532 patent/US9616103B2/en active Active
- 2013-08-02 MX MX2015002658A patent/MX360980B/es active IP Right Grant
- 2013-08-02 EP EP13832746.5A patent/EP2890777B1/en active Active
-
2015
- 2015-02-09 ZA ZA2015/00909A patent/ZA201500909B/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6627436B2 (en) * | 1997-10-31 | 2003-09-30 | Stratagene | Vector for gene expression in prokaryotic and eukaryotic systems |
| RU2376373C2 (ru) * | 2003-06-30 | 2009-12-20 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, способный связывать фактор роста эндотелиальных клеток сосудов (vegf), слитый полипептид, реплицируемый экспрессионный вектор, способ получения слитого полипептида, ловушка vegf, фармацевтическая композиция, способ лечения и набор для лечения vegf-опосредованного заболевания или состояния |
| WO2006029908A1 (en) * | 2004-09-17 | 2006-03-23 | Centelion | Stable liquid formulations of plasmid dna |
| RU2297848C2 (ru) * | 2005-05-11 | 2007-04-27 | Александр Веньяминович Иткес | Генно-инженерная конструкция vegf-ибмед (vegf-ibmed) |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Регистрационное удостоверение лекарственного препарата для медицинского применения, ЛП-000671 от 28.09.2011. ШВАЛЬБ П.Г. и др., Эффективность и безопасность применения. препарата "Неоваскулген" в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей (IIb-III фаза клинических испытаний), КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ, КТТИ, 2011, т.VI, N 3, с.76-83. * |
| ШЕНДЕР В.О. и др., Моделирование стратегии ферментации рекомбинантного штамма продуцента E. coli для продукции терапевтической плазмидной ДНК pCMV-VEGF165, Сборник тезисов I Научно-практической конференции "Технология и анализ косметических средств и фармацевтических препаратов" РХТУ имени Д.И.Менделеева 24 мая 2011 г * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694826C1 (ru) * | 2018-06-05 | 2019-07-17 | Юрий Валентинович Червяков | Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей атеросклеротического генеза при окклюзии артерий голени |
| RU2842291C1 (ru) * | 2024-09-03 | 2025-06-24 | Акционерное общество "НекстГен" | Лечение отморожения конечностей пациента |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2881799A1 (en) | 2014-03-06 |
| ZA201500909B (en) | 2016-10-26 |
| BR112015002522B1 (pt) | 2022-04-05 |
| CA2881799C (en) | 2019-10-29 |
| US20150335711A1 (en) | 2015-11-26 |
| MX2015002658A (es) | 2015-09-25 |
| EP2890777B1 (en) | 2017-01-11 |
| CN105308173A (zh) | 2016-02-03 |
| BR112015002522A2 (pt) | 2017-11-07 |
| US9616103B2 (en) | 2017-04-11 |
| SI2890777T1 (sl) | 2017-06-30 |
| EP2890777A4 (en) | 2015-12-16 |
| CN105308173B (zh) | 2020-03-17 |
| EP2890777A1 (en) | 2015-07-08 |
| WO2014035289A9 (en) | 2014-05-08 |
| HUE032520T2 (en) | 2017-10-30 |
| RU2012137126A (ru) | 2014-03-10 |
| WO2014035289A1 (en) | 2014-03-06 |
| PL2890777T3 (pl) | 2017-07-31 |
| ES2621675T3 (es) | 2017-07-04 |
| MX360980B (es) | 2018-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10086016B2 (en) | Pharmaceutical composition for the treatment of heart diseases | |
| RU2542385C2 (ru) | Способ получения фармацевтической композиции для индукции развития кровеносных сосудов в тканях, фармацевтическая композиция, полученная этим способом, и способ лечения ишемии тканей и/или органов человека | |
| AU765177B2 (en) | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof | |
| WO2018109220A2 (en) | Novel recombinant prefusion rsv f proteins and uses thereof | |
| EA010056B1 (ru) | Конструкции нуклеиновых кислот | |
| JP6808650B2 (ja) | 短縮型ロタウイルスｖｐ４タンパク質およびその適用 | |
| US7276359B1 (en) | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof | |
| WO2001037804A2 (en) | Preservation and formulation of bioactive materials | |
| JP5916769B2 (ja) | 組み換え型ポリペプチド系新規抗菌薬の製造方法 | |
| EP1555033A2 (en) | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof | |
| EA008247B1 (ru) | Конструкции нуклеиновых кислот для экспрессии генов | |
| JP7321142B2 (ja) | 医薬組成物、包装体及びその製造方法 | |
| CN119656310B (zh) | 敲低或抑制ant1的试剂在制备预防和/或治疗异位骨化的药物中的应用 | |
| RU2259214C1 (ru) | Способ получения вакцины оспенной инактивированной сухой "оспавир" | |
| CN114507677B (zh) | Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品 | |
| CN101818171B (zh) | 人ski基因真核表达载体、制备方法及其应用 | |
| RU2628706C2 (ru) | Способ стимуляции ангиогенеза в ишеминизированных тканях и комбинированное лекарственное средство для осуществления способа | |
| JPH01304882A (ja) | ヒトＣｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの安定保存法 | |
| KR20230051186A (ko) | 동결건조된 살아있는 보르데텔라 백신 | |
| HK40083861B (en) | Pharmaceutical composition of recombinant adeno-associated virus vector and application thereof | |
| Mikshis et al. | Effect of Antigens Obtained from the Recombinant Strain Bacillus anthracis 55ΔTPA-1Spo–on Organs and Tissues of Immunized Animals | |
| MXPA00008761A (en) | Polynucleotide composition, method of preparation, and use thereof | |
| Shiqiang et al. | Direct gene transfer into rabbit peripheral nerve in vivo | |
| BR112018002107B1 (pt) | Uso de um imunomodulador para potencializar resposta imune em espécies suínas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180907 Effective date: 20180907 |
|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180928 Effective date: 20180928 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QZ41 | Official registration of changes to a registered agreement (patent) |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180928 Effective date: 20201221 |