RU2449794C2 - Применение 10-[(3r)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10н-фенотиазина для изготовления лекарства, селективно ингибирующего мускариновые рецепторы м1, м2 и м3 - Google Patents

Применение 10-[(3r)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10н-фенотиазина для изготовления лекарства, селективно ингибирующего мускариновые рецепторы м1, м2 и м3 Download PDF

Info

Publication number
RU2449794C2
RU2449794C2 RU2009128326/15A RU2009128326A RU2449794C2 RU 2449794 C2 RU2449794 C2 RU 2449794C2 RU 2009128326/15 A RU2009128326/15 A RU 2009128326/15A RU 2009128326 A RU2009128326 A RU 2009128326A RU 2449794 C2 RU2449794 C2 RU 2449794C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
azabicyclo
oct
phenothiazine
ylmethyl
urinary incontinence
Prior art date
Application number
RU2009128326/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2009128326A (ru
Inventor
Тьерри КЛЕР (FR)
Тьерри КЛЕР
Жаки ТИСН-ВЕРСАЛЬ (FR)
Жаки ТИСН-ВЕРСАЛЬ
Кристоф ПШИБИЛЬСКИ (FR)
Кристоф ПШИБИЛЬСКИ
Original Assignee
Пьер Фабр Медикамент
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Пьер Фабр Медикамент filed Critical Пьер Фабр Медикамент
Publication of RU2009128326A publication Critical patent/RU2009128326A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2449794C2 publication Critical patent/RU2449794C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/54—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame
    • A61K31/5415—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one sulfur as the ring hetero atoms, e.g. sulthiame ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. phenothiazine, chlorpromazine, piroxicam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

Предложено применение 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина (V0162), а также его фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарства, способного лечить или предупреждать недержание мочи и связанных с ним заболеваний, которые дают бактериальные или грибковые инфекции, развившиеся из-за пузырной гиперактивности, посредством селективного ингибирования M1-, M2- и М3-мускариновых рецепторов при местном и/или оральном применении. Показано: V0162 снижает внутрипузырное давление, оказывает антихолинергическое действие in vivo, эффективно проходит через слизистую оболочку, достигая уровней, необходимых для его антихолинергической активности, и при местной доставке не имеет токсического действия ни в гистологическом отношении, ни в отношении жизненно важных функций: дыхательного ритма, пульса, поведения. 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

Description

Изобретение относится к применению 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, а также его фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарства, позволяющего, в частности, предотвращать или лечить недержание мочи при местном и/или оральном введении. 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин в процессе синтеза, описанного в патенте, получают из рацемата: D,L-меквитазина. Первоначально меквитазин был лекарством, эффективным в лечении аллергических состояний, таких как сезонный или постоянный аллергический ринит, аллергические реакции на лекарства, кожные проявления аллергического или вирусного происхождения (зуд). Меквитазин является анти-Н1-антигистаминовым средством. Он включает асимметричный углерод, что ведет к двум различным пространственным конфигурациям: левовращающему и правовращающему (R-конфигурация). Исчерпывающий анализ свойств двух энантиомеров показал, что правовращающий энантиомер обладает очень высокой аффинностью к мускариновым рецепторам M1/M2/М3, проиллюстрированной ниже, в то время как другой энантиомер демонстрирует более низкую аффинность к мускариновым рецепторам. Ацетилхолин является основным нейромедиатором парасимпатической нервной системы. Физиологические действия ацетилхолина опосредованы мускариновыми или никотиновыми рецепторами. Каждый из этих рецепторов является гетерогенным: например, семейство мускариновых рецепторов включает в настоящее время 5 подтипов (М. подтип 1, М. подтип 2, М. подтип 3, М. подтип 4, М. подтип 5). Каждый рецептор кодируется отдельным геном и обладает отдельным физиологическим распределением и функцией. Тем не менее, несколько мускариновых рецепторов могут работать вместе для того, чтобы индуцировать общий физиологический эффект, как в случае регуляции недержания мочи.
М3-рецептор участвует в сокращении мышцы, контролирующей пузырный сфинктер (мышцы-детрузора мочевого пузыря: совокупности гладкой мускулатуры пузырной стенки/мочевого пузыря).
Существуют причины недержания мочи, которые можно ликвидировать, если они выявлены: например, инфекция мочевыводящих путей, литиаз (камни) и запоры. Кроме того, случается, что проблема в удержании может быть связана с лечением лекарствами. Недержание мочи у пожилых людей может соответствовать изменениям в среде обитания, при адаптации к окружающей среде. В период менопаузы у женщин уменьшение эстрогенной насыщенности часто участвует в возникновении феномена недержания мочи, заместительное гормональное лечение принадлежит к терапевтическому арсеналу у этой группы пациентов. Кроме этих обстоятельств причина недержания мочи может быть определена с помощью специфических тестов. При недержании мочи можно использовать лекарственные препараты, перевоспитание или в некоторых случаях хирургическое вмешательство. Чрезмерную реактивность мочевого пузыря можно лечить специфическими спазмолитическими лекарствами. Слабость сфинктеров можно устранять с помощью симпатомиметических лекарств или, у женщин, с помощью эстрогенных гормонов. Для расслабления чрезмерно сокращенных сфинктеров можно использовать симпатолитические лекарства.
Существует несколько типов недержания мочи, которые являются временными или постоянными в зависимости от этиологических факторов. Так, обычно различают следующие:
- недержание мочи при ургентном мочеиспускании (гиперрефлекторное сокращение детрузора), аномальные сокращения мочевого пузыря, которые возникают непроизвольно и вызывают неотложное желание помочиться;
- недержание мочи в результате стресса.
Они включают в себя пассивное недержание мочи в результате уменьшения уретральной резистентности. Утечка мочи происходит тогда, когда давление в брюшной полости увеличивается при кашле, чихании и т.д.);
- недержание мочи при нейрогенном мочевом пузыре, связанном с дисфункцией пузырного сфинктера;
- недержание мочи в связи с травмой;
- недержание мочи в связи с эктопическим анастомозом мочеиспускательного канала;
- энурез (у детей старше четырех лет).
Недержание мочи при ургентном мочеиспускании, недержание мочи при стрессе и недержание мочи при эктопическом анастомозе мочеиспускательного канала встречаются только у женщин, в то время как недержание мочи от переполнения встречается у мужчин.
Основное лечение "гиперактивного мочевого пузыря" основано на использовании антихолинергических или антимускариновых лекарств. Недавние мета-анализы свидетельствуют о том, что их клиническая польза по сравнению с плацебо является неоспоримой, даже если лечение сопровождается неблагоприятными эффектами, такими как тахикардия, запор или сухость во рту, что объясняет нежелание пациентов использовать такое лечение (Herbison P. et coll., BMJ, 2003). Это объясняется фактом отсутствия у антимускариновых агентов селективности к мочевому пузырю по сравнению с другими органами. Даже если М2-мускариновые рецепторы количественно наиболее экспрессированы в мочевом пузыре и нижних мочевыводящих путях, они пропорциональны малой фракции, и М3-мускариновые рецепторы имеют большее значение в плане функциональной регуляции сократительной деятельности детрузора. В функциональных исследованиях, основанных на моделях ex vivo с использованием фрагментов живого детрузора, было показано, что М3-подтип мускариновых рецепторов был идентифицирован как единственный рецепторный подтип, который участвует в сокращении мышцы у крыс (Longhurst P.A. et coll., Br. J. Pharmacol., 1995), у кроликов (Choppin A., et coll., Brit. J. Pharmacol., 1998) и у человека (Chess-Williams R., et coll., J. Auton. Pharmacol., 2002). Эти данные, важные в плане М3-рецепторной регуляции, были подтверждены на модели трансгенных мышей, дефицитных по М3-рецептору (Matsui M., et coll., PNAS, 2000). В механистическом плане в нормальном состоянии ацетилхолин фиксируется на М3-рецепторе, при этом высвобождаются вторичные посредники IP3 (инозитолтрифосфат) и DAG (диацилглицерод), вызывая сокращение гладких мышц. Ацетилхолин также вызывает сокращение путем ингибирования высвобождения аденозинмонофосфата и путем обратного расслабления, вызванного норадреналином через β-рецепторы.
Одним из главных неблагоприятных эффектов использования антихолинергетиков для ингибирования недержания мочи является феномен сухости во рту. Парадоксально, в зависимости от этого эффекта кандидатные препараты, потенциально применимые при недержании мочи, разделяются в фармакологии в соответствии с описанием ниже. В доклинических исследованиях на животных оксибутинин и дарифенацин, два ингибитора, используемые при недержании мочи, снижают слюноотделение и являются более селективными в отношении М3-рецептора, чем в отношении М2. Наоборот, толтеродин снижает слюноотделение меньше и более активно участвует в сокращении детрузора. Толтеродин является более специфичным в отношении М2-рецепторов, чем в отношении М3-рецепторов (Gillberg PG, et coll., Eur. J. Pharmacol., 1998). Тем не менее, даже если предположить, что селективность в отношении М2- и М3-рецепторов может сделать возможной дифференцировку эффектов ингибиторов, в клинике результаты являются менее четкими, и представляется, что одновременное действие на М2- и М3-рецепторы могло бы быть эффективной комбинацией в отношении синдромов недержания мочи. Таким образом, дарифенацин, который демонстрирует аффинность, в 7 раз более высокую к М3-мускариновым рецепторам, чем к М2-мускариновым рецепторам, не подтверждает селективность в отношении мочевого пузыря или слюнных желез. В заключение М3-рецепторы регулируют сократительную деятельность гладких мышц мочевого пузыря, а М2-рецепторы играют важную роль в инициировании этого сокращения (Krichevski В.П., et coll., J. Urol., 1999).
В соответствии с ранее приведенными причинами кажется, что кандидатные ингибиторы должны обладать смешанной связывающей активностью в отношении как M2-рецептора, так и М3-рецептора для того, чтобы иметь полное действие на индукцию сокращения и его регуляцию. Кроме того, M1-мускариновый рецептор, который был дискредитирован в данной области, похоже, также играет определенную роль в работе детрузора (Maruyama S., et coll., J. Urol., 2006).
Для уменьшения неблагоприятных эффектов, вызванных антимускариновыми агентами, были использованы различные устройства. У женщин это трансдермальные или in situ устройства в форме вагинальных колец с замедленным высвобождением (Sroder A., et coll., Urol., 2000). Для ограничения побочных эффектов, обусловленных системным распространением активного вещества, с успехом был протестирован трансдермальный оксибутинин в форме трансдермального устройства (Stakmann JS, et coll., Urol., 2006). При введении этим путем наблюдается ограничение эффектов и уменьшение сухости во рту или сухости глаз, проблем со зрением, запоров и мигреней, но с другой стороны, появляются кожные реакции на устройство. Тем не менее, феномен первичного печеночного пассажа нейтрализуется, что ограничивает вторичную активность, вызванную очень мощным печеночным метаболитом оксибутинина (N-дезоксибутинином) с плазменным уровнем после орального введения оксибутинина в 6-9 раз больше по сравнению с оксибутинином. Сопряжение этих двух механизмов вызывает эффект ингибирования недержания мочи, а также индукцию побочных эффектов.
Таким образом, ограничение плазменного уровня активных метаболитов антимускариновых лекарств может также влиять, кроме случаев введения специфическим путем, на специфический печеночный метаболизм, т.к. не производятся активные метаболиты, способные усугубить эффект первоначально введенного лекарства и повысить частоту и интенсивность побочных эффектов.
Кроме того, чем больше время полужизни продукта, тем ниже частота введения, что содействует соблюдению режима.
Суть данного изобретения основана на специфических и неожиданных свойствах 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина (правовращающего энантиомера меквитазина, закодированного здесь под названием V0162). Приведенные ниже примеры демонстрируют это:
- аффинность к человеческим M1-, М2-, М3-мускариновым рецепторам является очень мощной и в наномолярном диапазоне,
- правовращающий энантиомер (V0162) имеет большую аффинность к мускариновым рецепторам, чем рацемат и левовращающий энантиомер,
- мускариновая направленность является смешанной со следующим порядком аффинности: M1>M3>M2, это ингибирование в качественном и количественном отношении является оптимальным для подавления феномена недержания мочи,
- in vivo правовращающий энантиомер при внутривенном введении является антихолинергическим, в то время как левовращающий энантиомер не демонстрирует четкой активности. То же самое и при оральном введении,
- применение на слизистых in vivo V0162 в суспензии проявляется четким системным пассажем, ведущим к уровню циркуляции, совместимому с фармакологической активностью в отношении мускариновых рецепторных целей,
- in vivo на крысиной модели гиперсаливации V0162 вызывает значительное снижение секреции слюны после орального введения,
- in vivo на модели гиперактивного мочевого пузыря (ургентного недержания мочи), вызванного воздействием уксусной кислоты, V0162 снижает внутрипузырное давление, определяемое при цистоманометрии.
Сочетание всех этих свойств, рассмотренных в качестве примеров данного патента, неожиданным образом свидетельствует о том, что V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин) является активным соединением в недержании мочи и связанных с ним проблемах.
Пример 1: Аффинность V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина) к человеческим мускариновым рецепторам in vitro
Цель данного исследования состоит в том, чтобы определить константу аффинности для соединения к трем классам человеческих мускариновых рецепторов in vitro. Выбранная модель представляет собой СНО-клетки (овариальные клетки китайского хомячка), стабильно трансфицированные кДНК, которые кодируют каждый из этих трех человеческих мускариновых рецепторов. Вначале была определена аффинность клеток, экспрессирующих каждый тип рецепторов, для чего была проведена 100% фиксация лиганда к целевому мускариновому рецептору. Оптимальным лигандом для рекомбинантного рецептора M1 явился меченный тритием пирензепин в количестве 2 нМ (Dorje F., et coll, JPET, 1991), для рекомбинантного рецептора М2 меченный тритием метоктрамин в количестве 2 нМ, для рецептора М3 4-DAMP в количестве 0,2 нМ (Peralta E.G., et coll., EMBO, 1987). Специфичность связывания рецепторов, экспрессированных каждым типом клеток, определяли в параллели путем оценки незафиксированного атропина в 1 мкМ. Связывание в отношении к рецепторам определяли следующим образом: разница между общим связыванием и выявленным неспецифическим связыванием в присутствии избытка холодного лиганда. Результаты выражали в процентах от оптимального связывания, полученного на модельном лиганде (100%). IC50 (концентрации, необходимые для 50% ингибирования связывания оптимальных лигандов с их соответствующими целевыми рецепторами) и коэффициенты Хилла (nH) были определены путем нелинейного регрессионного анализа конкурентных кривых. Константы ингибирования (Ki) были рассчитаны на основе уравнения Cheng и Prusoff (Ki=IC50/(1+L/KD)), где L представляет собой концентрацию меченого лиганда, а KD представляет собой аффинность меченого лиганда к рецептору.
Таблица 1
V0162 рецепторное связывание in vitro
Человеческий рецептор Тестируемое соединение IC50 (нМ) Ki (нМ) nH
M1(h) 10-[(3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 5,9 5,1 1,1
10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 1,6 1,4 1,0
10-[(3R,3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 2,1 1,8 0,8
М2(h) 10-[(3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 94 66 1,0
10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 10 7 1,1
  10-[(3R,3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 20 14 0,9
М3(h) 10-[(3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10H-фенотиазин 17 12 1,0
10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин 5,5 3,9 1,1
10-[(3R,3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин 8 5,7 1,2
Эти результаты свидетельствуют о том, что V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин), представляет собой соединение, которое сильно связывается с мускариновыми рецепторами. Его соотношение специфичности М2/М3 находится между 1,5 и 2. Его аффинность к M1 также находится в наномолярном диапазоне.
Таким образом, in vitro данное соединение демонстрирует очень высокую аффинность к мускариновым рецепторам, участвующим в инициации, регулировании и поддержании сокращений детрузора. Что касается Ki, различия между энантиомерами и рацематом в отношении к этим трем рецепторам варьируют между коэффициентом 3 и коэффициентом 10.
Пример 2: Антихолинергическая активность ex vivo V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина)
Целью данных экспериментов являлось подтверждение антихолинергической активности V0162 на живых органах. Для этого экспланты из морских свинок сохраняли живыми. Морфология препаратов была однородной от партии к партии. Каждый эксплант помещали в камеру для сохранения жизнеспособности и погружали в физиологический раствор следующего состава (мМ): NaCl (118); KCl (4,7); MgSO4 (1,2); CaCl2 (2,5); KH2PO4 (1,2); NaHCO3 (25); глюкоза (11), при температуре 37°С и при pH 7,4. Перед проведением теста для блокировки неспецифических ответов на ацетилхолин в буфере для сохранения жизнеспособности диспергировали следующие агенты: пропанол (10-6 М) для блокировки β2-адренергических ответов; циметидин (10-5 М) для блокировки гистаминергических ответов 2 типа; метисергид (10-6 М) для блокировки серотонинергических ответов и индометацин (3×10-6 М) для предотвращения появления мышечного тонуса в связи с высвобождением простагландинов при их выработке. В момент сбора данных ткани были связаны с транспондерами для постоянной записи колебаний напряжения. Через 60 минут калибровки препаратов ткани подвергали действию V0162 различной концентрации. С целью определения ответа препарата на стимуляцию в отсутствие предполагаемого ингибитора были выполнены сокращения, индуцированные ацетилхолином как доза-ответы.
Таблица 2
V0162, антихолинергический эффект ex vivo
Тестируемое соединение Концентрация (нМ) Ответ на ацетилхолин
Кривые Макс. ответ(%) ЕС50 (×10-6 М)
V0162 0 Контроль 100 7,6±2
30 Тест 98±1 22,5±2,4*#
0 Контроль 100 5,4±0,8
100 Тест 98±1 76,0±3,6*#
0 Контроль 100 7,4±0,5
300 Тест 98±1 410±76,7*#
Результаты выражены в форме среднего ± стандартная ошибка среднего с n=6 в группе; *: р<0,05 intra и #: р<0,05 extra.
Антихолинергическая система оценки была проверена доза-эффектами, полученными с ацетилхолином в качестве физиологического посредника мышечного сокращения. Эти результаты, проанализированные с помощью t-теста Стьюдента для непарных значений, свидетельствуют о том, что V0162 выступает против сокращающей активности ацетилхолина. В этой модели ех vivo были подтверждены данные, полученные in vitro: V0162 ведет себя как конкурентный антагонист ацетилхолина. Его действие начинается при 30 нМ.
Пример 3: Ингибирующая активность V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина) в отношении гиперсаливации in vivo
Антихолинергическая активность была продемонстрирована in vitro на уровне клеточных рецепторов, а затем ех vivo на уровне целевой ткани, целью этих экспериментов было определить, имеет ли место ингибирование секреции слюны при оральном введении. Блокирование М3-рецепторов, участвующих в сокращениях детрузора и секреции слюны, часто приводит к феномену сухости во рту как побочному эффекту лечения недержания мочи оксибутинином или толтеродином. Исследования новых ингибиторных агентов недержания мочи в течение длительного времени были основаны на рецепторной селективности. Предполагалось, что специфичность агента в отношении М3-рецепторов, но не М2-рецепторов, позволит ограничить ингибирование в области рецепторной экспрессии, и таким образом избежать ингибирования физиологических мишеней, не участвующих в недержании мочи, таких как, например, сердечная система или слюнные железы. Однако, как мы уже видели ранее, селективность агентов в борьбе с недержанием мочи не зависит исключительно от тканевой селективности экспрессии подтипа мускариновых рецепторов. Более того, распределение этих рецепторов не совсем связано с разницей тканей (т.е. M2-рецепторы также имеются в детрузоре). В функциональном плане активация определенных рецепторов контролирует уровень активации других рецепторов этого же мускаринового семейства. Таким образом, элиминация соединений, способных воздействовать на секрецию слюны, с целью выбора соединений, активных исключительно в отношении детрузора (и, следовательно, недержании мочи) является бессмысленной. Таким образом, последние данные подталкивают к оценке агентов для борьбы с недержанием мочи в тестах на ингибирование секреции слюны. Основным моментом является способность соединения диффундировать в целевую ткань. Таким образом, соединения, способные ингибировать секрецию слюны на животных моделях ex vivo или даже in vivo, могут оказаться недостаточно эффективными при клинической сухости во рту у человека. Тем не менее, остается то, что активность ингибирования секреции слюны является инструментом выбора для антихолинергической активности.
Для оценки антихолинергической активности на одобренной модели пилокарпил-индуцированной гиперсаливации у крысы, группе некормленных животных на следующий день орально вводили продукты за 90 минут до интраперитонеальной инъекции пилокарпина (0,5 мг×кг-1). Тестируемые соединения вводили в дозах 2,5, 5 и 10 мг×кг-1. Предварительно V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2)окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин) суспендировали в носителе: карбоксиметилцеллюлозе 0,5%. В качестве положительного экспериментального контроля вводили атропин в дозе 1 мг×кг-1. Животным проводили анестезию, а затем отбирали слюнной секрет в течение 60 минут, каждые 10 минут. Затем образцы высушивали и взвешивали.
Таблица 3
Ингибирование секреции слюны у крыс после перорального введения, антихолинергический эффект in vivo
Обработка n Доза (мг×кг-1) Секреция (мг) Ингибирование (%)
Носитель 10 - 1045,8 -
V0162 10 2,5 735,6 29
V0162 10 5 338,9 67*
V0162 10 10 45,1 95*
Атропин 10 1 17,9 98*
Результаты выражены в форме среднего в группе с n=10; *: p<0,05.
Система оценки гиперсаливации была проверена действием атропина на модели. Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение, приведенное в качестве примера, значительно снижает секрецию слюны у животного при оральном введении. Полученные эффекты являются дозозависимыми. Потенция соединения V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина) аналогична той, которая была получена у атропина, используемого здесь в качестве стандартного способа. Таким образом, соединение V0162, а также его фармацевтически приемлемые соли, оказались полезными в изготовления лекарств, в частности формы, адаптированной для назального введения для лечения ринореи.
Впоследствии антихолинергическую активность двух энантиомеров сравнили при одной дозе после орального введения по такой же экспериментальной схеме, которая описана выше.
Таблица 4
Ингибирование секреции слюны у крыс после перорального введения рацематной смеси и смеси энантиомеров, антихолинергический эффект in vivo
Обработка n Доза (мг·кг-1) Ингибирование (%)
Носитель 7 - -
Левовращающий энантиомер (10-[(3S)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин 7 5 -4
Правовращающий энантиомер (V0162) (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин) 7 5 77*
2Рацематная смесь (10-[(3R,3S)-1- 6 5 73*
азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин)      
Результаты выражены в форме среднего в группе с n=10; *: p<0,05.
В заключение эти эксперименты подтверждают ранее полученные результаты in vitro и ex vivo и неожиданно демонстрируют, что V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин) имеет мощное антихолинергическое действие при пероральном приеме. Кроме того, он принадлежит к классу потенциальных ингибиторов недержания мочи, потому что, как оксибутирин, дарифенацин или толтеродин, он снижает секрецию слюны у животных после введения нетоксичных и хорошо переносимых фармакологических доз.
Кроме того, несмотря на ожидания, ингибирование холинергическим путем действует только после введения животным правовращающего энантиомера. Левовращающий энантиомер демонстрирует антихолинергическую активность in vitro, но эти результаты не являются такими же при пероральном введении.
Таким образом, эти результаты показывают, что только V0162 оказывает антихолинергическое действие in vivo.
Пример 4: Чрезслизистое прохождение суспензии V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина) in vivo у кролика.
Мы увидели, что соединение способно индуцировать антихолинергическую активность при оральном введении. Кроме того, было установлено, что селективность действия антихолинергетиков на мочевыводящую систему с целью ингибирования сокращений детрузора и, следовательно, недержания мочи, не основана на селективности к подтипам мускариновых рецепторов, поскольку они экспрессированы повсюду. Таким образом, одним из средств для достижения селективности является снижение системной циркуляции антимускариновых веществ и увеличение их концентрации в месте их действия: нижних мочевыводящих путях. Вагинальное применение этого соединения, возможно, может ограничить побочные эффекты при одновременном повышении эффективности. В фармакологическом плане мочевой пузырь может быть разделен на две части: тело и основание. Мускариновые рецепторы распределены преимущественно в теле, и сократительный ответ на холинергические стимуляции находится на этом же уровне. В то же время другой механизм, участвующий в поддержании удержания мочи, прямое действие на мышечную релаксацию, является контролирующим механизмом, расположенным в том же месте. Кроме того, последние работы показали возможность уменьшения сокращений мочевого пузыря с помощью местных инъекций антихолинергических агентов. Таким образом, антихолинергетики могут выступать не только в качестве антагонистов ацетилхолина в сокращении мышц детрузора, но также блокировать мускариновые рецепторы афферентных путей мочевого пузыря.
Таким образом, применение in situ соединения антагониста является подходом выбора для лечения недержания мочи, в частности в период менопаузы у женщин. Основным ограничением является способность антимускаринового агента пересекать вагинальную слизистую оболочку для того, чтобы влиять на мускариновую афферентацию в области мочевого пузыря (Yongtae K., et coll., J. Urol., 2005).
Для анализа склонности представляющего интерес соединения пересекать модельную слизистую V0162 наносили в виде спрея на слизистую оболочку носа кролика, а затем брали образцы крови для измерения потенциального циркулирующего объема V0162. Ежедневно в течение 28 дней 48 кроликов обрабатывали назально суспензией с титром 0,4% масса/объем. Три группы животных были обработаны следующим образом: физиологическим раствором, носителем, V0162. Каждая группа состояла поровну из самцов и самок. Назальное введение суспензии проводили дважды в день в течение 28 дней. Образцы плазмы брали в 1, 2, 7, 28, 35 дни. Образцы анализировали LC/MS/MS способом, проверенным анализом V0162.
Таблица 5
Циркулирующие уровни V0162 после повторных назальных введений
Дата и время взятия образца Уровень V0162 (нг×мл-1)
День 1/до введения Ниже ПКО
День 1/4 часа после введения 0,88
День 2/до введения 0,22
День 7/до введения 0,41
День 28/4 часа после введения 1,35
День 28/24 часа после введения 0,23
День 35/до введения Ниже ПКО
Результаты выражены в форме среднего в группе с n=10; ниже ПКО: ниже предела количественного определения.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что назальное введение суспензии V0162 индуцирует циркулирующий уровень около 4 нм, совместимый с фармакологическим действием. Действительно, мы уже видели, что IC50 для V0162 составляет 5 нМ для мускаринового рецептора М3 и 1 нМ для мускаринового рецептора M1.
Поэтому можно сделать вывод о том, что введение на слизистую V0162 сопровождается его эффективным прохождением, совместимым с уровнями циркуляции, необходимыми для его антихолинергической активности. Это введение не имеет вредного воздействия на слизистую оболочку носа. Полученные уровни циркуляции не имеют токсического воздействия на эту модель ни в гистологическом отношении, ни в отношении жизненно важных функций: дыхательного ритма, пульса, поведения.
Таким образом, для местной доставки антихолинергического агента можно вводить представляющее интерес соединение путем простой аппликации на слизистую.
Пример 5: Ингибирующая активность суспензии V0162 (10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина) в отношении недержания мочи in vivo
Целью данного исследования была оценка внутрипузырного давления и саливации у животных в целях проверки уроселективности антимускариновых веществ при их введении орально или вагинально. Для того чтобы оценить внутрипузырное давление, мочевые пузыри животных катетеризировали, с тем чтобы обеспечить возможность записи (цистоманометрия: постоянная регистрация пузырного давления). Продукты для тестирования вводили либо орально в дозе 5 мг×кг-1, либо путем местной аппликации суспензии V0162 в концентрации 0,4% в носителе на основе циклодекстрина и аргинина. Яремную вену также канюлировали для того, чтобы вводить мускариновый агонист: бетанехол (200 мкг/кг, внутривенно). При каждом введении бетанехола оценивали и количественно определяли изменение пузырного давления (ΔPV, мм рт.ст.) и количество слюны (мг). Положительный контроль состоял из группы животных, обработанных оксибутирином (Ditropan®; 10, 100 и 1000 мкг/кг, внутривенно).
Результаты (выраженные только в тексте) показывают, что по сравнению с оксибутирином V0162 при оральном или местном применении значительно сокращает рост внутрипузырного давления, вызванного рекомендованным агонистом: бетахенолом.
Предыдущие эксперименты показали, что соединение V0162 способно индуцировать антихолинергическую активность при оральном введении. Кроме того, соединение способно проходить через слизистую. Соединение V0162 обладает характеристиками мощного антихолинергетика: нМ in vitro и мг×кг-1 орально in vivo. Оно является активным при оральном применении и также может быть введено местно на слизистую оболочку в виде геля, изготовленного для целевой области, где представлены мускариновые рецепторы, непосредственно контролирующие или регулирующие удержание мочи.

Claims (8)

1. Применение 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, а также его фармацевтически приемлемых солей для изготовления лекарства для профилактики или лечения недержания мочи и связанных с ним заболеваний, которые дают бактериальные или грибковые инфекции, развившиеся из-за пузырной гиперактивности, посредством селективного ингибирования M1-, M2- и М3-мускариновых рецепторов.
2. Применение по п.1 где 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10-фенотиазина представляет собой смесь, выбранную среди смесей, содержащих по меньшей мере 95-100% 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, 96-100% 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, 97-100% 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, 98-100% 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина, 99-100% 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина и чистый 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазин.
3. Применение по п.1, характеризующееся тем, что недержание мочи выбрано среди следующих: недержание мочи при ургентном мочеиспускании (гиперрефлекторное сокращение детрузора), аномальные сокращения мочевого пузыря, которые возникают непроизвольно и вызывают неотложное желание помочиться; недержание мочи в результате стресса; недержание мочи нейрогенного мочевого пузыря, связанное с дисфункцией пузырного сфинктера; недержание мочи в связи с травмой; недержание мочи в связи с эктопическим анастомозом мочеиспускательного канала; энурез (у детей старше четырех лет).
4. Применение по п.1, характеризующееся тем, что лекарство представлено в форме, адаптированной для орального применения.
5. Применение по п.1, характеризующееся тем, что лекарство представлено оральной дозированной формой в дозе от 1 мкг×кг-1 до 10 мг×кг-1, предпочтительно от 0,01 мг×кг-1 до 1 мг×кг-1.
6. Применение по п.1, характеризующееся тем, что лекарство представлено местной интравагинальной дозированной формой в виде геля с активным веществом в концентрации от 0,01 до 10%.
7. Применение по п.1, характеризующееся тем, что лекарство представлено местной интравагинальной дозированной формой в суппозитории, содержащем от 10 и 500 мг эквивалента активного вещества.
8. Применение по п.1, характеризующееся тем, что лекарство для интравагинального введения представлено в виде вагинального кольца с системой замедленного высвобождения в дозе, позволяющей высвобождать в перимукозальный кровоток от 0,2 до 100 нг 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина на 1 мл плазмы, предпочтительно от 2 до 50 нг 10-[(3R)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10Н-фенотиазина на 1 мл плазмы.
RU2009128326/15A 2006-12-28 2007-12-26 Применение 10-[(3r)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10н-фенотиазина для изготовления лекарства, селективно ингибирующего мускариновые рецепторы м1, м2 и м3 RU2449794C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0656002A FR2910814B1 (fr) 2006-12-28 2006-12-28 Utilisation du 10-°(r3)-1-azabicyclo°2.2.2!oct-3-ylmethyl!-10h- phenothiazine pour la preparation d'un medicament exercant une inhibition selective des recepteurs muscariniques m1,2,3
FR0656002 2006-12-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2009128326A RU2009128326A (ru) 2011-02-10
RU2449794C2 true RU2449794C2 (ru) 2012-05-10

Family

ID=37951872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2009128326/15A RU2449794C2 (ru) 2006-12-28 2007-12-26 Применение 10-[(3r)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10н-фенотиазина для изготовления лекарства, селективно ингибирующего мускариновые рецепторы м1, м2 и м3

Country Status (22)

Country Link
US (1) US8143245B2 (ru)
EP (1) EP2124956A1 (ru)
JP (1) JP5564263B2 (ru)
KR (1) KR101465277B1 (ru)
CN (1) CN101573120B (ru)
AR (1) AR064714A1 (ru)
AU (1) AU2007341274B2 (ru)
BR (1) BRPI0720591A2 (ru)
CA (1) CA2674162A1 (ru)
FR (2) FR2910814B1 (ru)
HK (1) HK1133207A1 (ru)
IL (1) IL199557A (ru)
MA (1) MA31026B1 (ru)
MX (1) MX2009006950A (ru)
NO (1) NO20092654L (ru)
NZ (1) NZ577915A (ru)
RU (1) RU2449794C2 (ru)
TN (1) TN2009000257A1 (ru)
TW (1) TWI423806B (ru)
UA (1) UA98131C2 (ru)
WO (1) WO2008080924A1 (ru)
ZA (1) ZA200904304B (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015133989A (ja) * 2015-04-28 2015-07-27 重泉 達志 健康食品
KR101969263B1 (ko) 2018-07-16 2019-04-15 이상호 산소 챔버용 산소 공급 장치

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603132A (en) * 1984-03-16 1986-07-29 Laboratori Guidotti S.P.A. Phenothiazine compounds with anti-bronchospastic activity and pharmaceutical compositions containing them

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1251161B (it) * 1991-08-07 1995-05-04 Derivati ammonio quaternari di (-) e (+)-3-(10 h-fenotiazin-10-ilmetil)-l-azabiciclo (2.2.2.)ottano e composizioni farmaceutiche che li contengono
AU6686700A (en) 1999-08-23 2001-03-19 H. Lundbeck A/S Treatment of urinary incontinence
MXPA04006017A (es) * 2001-12-20 2005-06-08 Femmepharma Inc Suministro de farmacos por via vaginal.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603132A (en) * 1984-03-16 1986-07-29 Laboratori Guidotti S.P.A. Phenothiazine compounds with anti-bronchospastic activity and pharmaceutical compositions containing them

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
реферат [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных Esp@cenet). Kubo N et al. Antimuscarinic effects of antihistamines: quantitative evaluation by receptor-binding assay. Jpn J Pharmacol. 1987 Mar; 43 (3):277-82. [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 2884340). Stanton Т et al. Antagonism of the five cloned human muscarinic cholinergic recaptors expressed in CHO-K1 cells by antidepressants and antihistaminics. Biochem Pharmacol. 1993 Jun 9:45(11):2352-4. Реферат [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 8100134). *
ЭНЦИКЛОПЕДИЧЕСКИЙ СЛОВАРЬ МЕДИЦИНСКИХ ТЕРМИНОВ. - М.: Медицина, 2001, с.698. *
ЭНЦИКЛОПЕДИЯ ЛЕКАРСТВ. - М.: ООО «РЛС-2005», 2004, с.538, 728-729. Shi L. et al. [Effects of dexamethasone on the expression of muscarinic receptor mRNA in asthmatic guinea pig airway smooth muscle and eosinophil infiltration in bronchoalveolar lavage fluid]. Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao. 2005 Aug; 25(8):986-90. Реферат [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 16109556). Sweeney М et al. Role of capacitative Ca2+ entry in bronchial contraction and remodeling. J Appl Physiol. 2002 Apr; 92(4): 1594-602. [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных PubMed PMID: 11896026). БАЗА ДАННЫХ REGISTRY RN 147780-50-5 Entered STN: 27 May 1993 [он-лайн] [найдено 2011-07-06] (Найдено из базы данных STN). *

Also Published As

Publication number Publication date
HK1133207A1 (ru) 2010-03-19
RU2009128326A (ru) 2011-02-10
EP2124956A1 (fr) 2009-12-02
CN101573120A (zh) 2009-11-04
JP2010514730A (ja) 2010-05-06
US20100063276A1 (en) 2010-03-11
TWI423806B (zh) 2014-01-21
MX2009006950A (es) 2009-07-14
IL199557A (en) 2014-09-30
AR064714A1 (es) 2009-04-22
FR2910814B1 (fr) 2011-06-17
KR101465277B1 (ko) 2014-11-27
JP5564263B2 (ja) 2014-07-30
TN2009000257A1 (fr) 2010-10-18
AU2007341274B2 (en) 2012-09-20
MA31026B1 (fr) 2009-12-01
BRPI0720591A2 (pt) 2014-02-25
ZA200904304B (en) 2010-06-30
WO2008080924A1 (fr) 2008-07-10
FR2910814A1 (fr) 2008-07-04
NZ577915A (en) 2011-12-22
CA2674162A1 (fr) 2008-07-10
TW200833331A (en) 2008-08-16
CN101573120B (zh) 2011-11-23
UA98131C2 (ru) 2012-04-25
US8143245B2 (en) 2012-03-27
KR20090103887A (ko) 2009-10-01
FR2953721A1 (fr) 2011-06-17
NO20092654L (no) 2009-09-28
AU2007341274A1 (en) 2008-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
USRE41998E1 (en) Compositions and methods of treatment of sympathetically maintained pain
JP5312027B2 (ja) 病気の治療法
RU2484821C2 (ru) Новые способы
WO1992014453A1 (en) Compositions and methods of treatment of sympathetically maintained pain
JP2007536269A (ja) ゴニオトキシンを用いた創傷の治療方法
RU2290929C2 (ru) Фармацевтическая композиция для лечения интерстициального цистита
AU2017328999B2 (en) Combination of FXR agonists
US5939426A (en) Methods for treating urinary incontinence using descarboethoxyloratadine
KR20040030788A (ko) 요실금 치료를 위한 아릴(또는 헤테로아릴)아졸릴카르비놀 유도체
RU2449794C2 (ru) Применение 10-[(3r)-1-азабицикло[2.2.2]окт-3-илметил]-10н-фенотиазина для изготовления лекарства, селективно ингибирующего мускариновые рецепторы м1, м2 и м3
WO1997039750A1 (en) Treatment of mood/affective disorders by glutamatergic upmodulators
ES2322954T3 (es) Agonistas del adrenoceptor alfa 2b o 2b/2c para el tratamiento de la enfermedad de alzheimer y la enfermedad de parkinson.
AU2014365665B2 (en) Use of PAR-1 antagonists for preventing and/or treating pelvi-perineal functional pathological conditions
KR20100040294A (ko) 전립선 비대에 수반되는 하부 요로 증상의 개선용 의약 조성물
Finkbeiner et al. Uropharmacology: IX. Direct-acting smooth muscle stimulants and depressants
KR20220054593A (ko) 병용 치료를 위한 화합물
US20040248932A1 (en) Use of aryl- and heteroaryl-substituted tetrahydroisoquinolines in the treatment of chronic and neuropathic pain, migraine headaches, and urge, stress and mixed urinary incontinence
JP2010538974A (ja) ベンズアミド誘導体、その調製および医薬におけるその使用
KR20080058465A (ko) 복압요실금 및 혼합 요실금의 치료
Aronson New antihistamines
Wein et al. Pharmacologic management of urinary incontinence
MXPA99007802A (es) Uso de descarboetociloratadina para la preparacion de un farmaco para el tratamiento de la incontinencia urinaria, malestar causado por el movimiento y vertigo

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20151227