RU2425879C1 - Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ - Google Patents
Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2425879C1 RU2425879C1 RU2010105590/10A RU2010105590A RU2425879C1 RU 2425879 C1 RU2425879 C1 RU 2425879C1 RU 2010105590/10 A RU2010105590/10 A RU 2010105590/10A RU 2010105590 A RU2010105590 A RU 2010105590A RU 2425879 C1 RU2425879 C1 RU 2425879C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nanoparticles
- immobilization
- enzyme
- immobilized
- suspension
- Prior art date
Links
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 6
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 5
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 5
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical compound [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229910000077 silane Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron(III) chloride Substances Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 3
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000006068 polycondensation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 2-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O LBLYYCQCTBFVLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N alpha-Methyl-n-butyl acrylate Natural products CCCCOC(=O)C(C)=C SOGAXMICEFXMKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- RBURNKQMEAEGBB-UHFFFAOYSA-K iron(3+);2-methylprop-2-enoate Chemical compound [Fe+3].CC(=C)C([O-])=O.CC(=C)C([O-])=O.CC(=C)C([O-])=O RBURNKQMEAEGBB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000002069 magnetite nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001490 poly(butyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004756 silanes Chemical class 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ. Способ заключается в модификации содержащих сложноэфирные группы наночастиц Fе3О4. Затем полученные частицы обрабатывают аминопропилтриэтоксисиланом. Далее суспензию наночастиц инкубируют с конденсирующим агентом и осуществляют иммобилизацию фермента. Способ позволяет получать иммобилизованные препараты с удельной активностью фермента более 70%. 3 табл.
Description
Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии, а именно к способу ковалентной иммобилизации биомолекул на поверхности наноматериалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы, и его применению при создании иммобилизованных ферментных препаратов. Изобретение может быть использовано в биотехнологии, в том числе в пищевой промышленности.
В данной области известно большое число технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации, заключающиеся в ковалентном связывании биомолекул с предварительно активированным носителем. Предварительная активация носителя предусматривает модификацию его поверхности путем обработки химическими соединениями, имеющими реакционноспособные функциональные группы (NH2, -NH-NH2, -ОН и др.), посредством которых реализуется химическое присоединение биомолекул. Однако в своей массе эти технические решения обладают рядом недостатков, а именно: использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость методик.
Известен способ иммобилизации (см. пат. РФ №94024389, МПК C12N 11/00, заявл. 29.06.1994, опубл. 10.06.1996) биообъектов на поверхности стекла (керамики), заключающийся в обработке поверхности носителя раствором алкоксибензоата металла. В качестве растворителя используют полярный апротонный растворитель, в частности тетрагидрофуран, диметоксиэтан. Концентрация раствора составляет 0,05-0,8 моль/л. Раствор алкоксибензоата металла наносят на поверхность центрифугированием или окунанием и сушат на воздухе при температуре 15-30°С. В качестве биообъекта используют глюкозооксидазу, которую в виде 3%-ного раствора наносят на модифицированную поверхность. Степень фиксации составляет 90%. Главными недостатками данного подхода являются низкая плотность функциональных групп на поверхности носителя, что приводит к невысокой эффективности ковалентного связывания, а также трудоемкость процедуры иммобилизации.
Известен также способ получения иммобилизованного протеолитического фермента (см. пат. РФ №1041567, МПК C12N 11/10, опубл. 15.09.1983), предусматривающий растворение содержащего альдегидные группы носителя в буферном растворе и последующее присоединение протеолитического фермента. В качестве носителя используют ксилоуронид, растворенный в 0,1 М трисоксиметиламинометановом буфере (рН 8,5), а присоединение фермента осуществляют при соотношении носитель-фермент 1:1. К основным недостаткам данного способа относятся следующие: дефицитный и дорогостоящий носитель - ксилоуронид, низкая стабильность целевого продукта, необходимость хранения препарата при низкой температуре (0-4°С).
Также известен подход к получению иммобилизованного фермента, заключающийся в следующем (см. пат. РФ №586182, МПК C07G 7/02, заявл. 30.08.1974, опубл. 30.12.1977). Фермент вводят в водную или спиртовую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, используя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например, полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизованный полиэтилентерефталат, в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т.д. При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде при значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-м-п-толуолсульфонат и т.д. Основной недостаток этого способа иммобилизации связан с низкой удельной активностью полученных препаратов.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является изобретение, описывающее ковалентную иммобилизацию биомолекул на поверхности полимерных материалов, содержащих этерифицированные карбоксильные группы (см. пат. РФ №2321574, МПК С07В 43/06, заявл. 06.04.2006, опубл. 10.04.2008). Данный способ основан на решении проведения модификации поверхности биочипа путем двухстадийной обработки, причем одна из стадий осуществляется в газовой фазе. Это позволяет снизить вероятность отслаивания модифицирующего слоя от поверхности носителя и увеличить количество иммобилизованных биообъектов. На первой стадии обработки поверхности чипа проводят аминолиз поверхностных сложноэфирных групп полимера, для чего подложку обрабатывают в газовой фазе аминосиланом (аминопропилтриэтоксисилан, аминопропилтриметоксисилан). На второй стадии формируют большое количество функциональных групп, необходимых для иммобилизации биомолекул, путем проведения совместной поликонденсации соответствующего силана с триалкоксисилановыми фрагментами.
На заключительном этапе формирования чипа выбирают способ нанесения и иммобилизации биомолекул на модифицированную поверхность подложки и проводят иммобилизацию.
Основным недостатком данного решения следует считать тот факт, что ковалентная иммобилизация описана только для органических полимерных носителей, таких как полиметилметакрилат, поливинилхлорид, поликарбонат, по-либутилметакрилат, сополимеры бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол и акрилонитрил.
Задачей технического решения является упрощение процедуры иммобилизации ферментных препаратов и улучшение их физико-химических характеристик.
Технический результат достигается за счет использования в качестве матрицы наночастиц Fe3O4, а также недорогих и доступных реактивов. Совокупность предложенных операций позволяет получать иммобилизованные ферментные препараты, отличающиеся от известных аналогов рядом признаков, прежде всего удельной активностью фермента, оптимальными значениями рН и температур.
Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц Fe3O4 для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение наночастиц магнетита, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием конденсирующего агента карбодиимида.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля нагревают при перемешивании в атмосфере азота до 220°С, после чего к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле, через несколько минут образовавшиеся наночастицы Fe3O4 со сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Полученные магнитные наночастицы защищены от агрегации в силу межчастичных взаимодействий и влияния среды, а также модифицированы и пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Следует отметить, что на второй стадии присутствие воды в системе должно быть ограничено, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 1 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы (5,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол:вода 1:1) в течение двух часов при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fe3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Далее 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии растворяют 500 мкг α-химотрипсина в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики химотрипсина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют химотрипсин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.
| Таблица 1 | |||||
| Физико-химические параметры иммобилизованного химотрипсина | |||||
| Способ иммобилизации | Содержание белка в иммобилизован-ном препарате, мкг/мг носителя | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активно-сть фермента, % от нативного | Оптимум, рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 | 14,5 | 30,5 | 76,3 | 7,5-9,0 | 40 |
| Контрольный опыт | 9,8 | 22,5 | 56,3 | 7,4-9,0 | 35 |
Пример 2
Получение наночастиц Fe3O4 с поверхностными сложноэфирными группами и их модификацию силаном осуществляют аналогично примеру 1. Затем готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 200 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). В качестве иммобилизуемого протеолитического фермента используют термолизин. Для его иммобилизации 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 200 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 200 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 200 мМ фосфатного буфера. Затем подготавливают раствор термолизина, растворив 1000 мг фермента в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буферного раствора, который инкубируют с 500 мкл суспензии наночастиц в 200 мМ фосфатном буфере при температуре 45°С в течение трех часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fe3O4 промывают 200 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 200 мМ фосфатного буфера (рН 7,0). Физико-химические характеристики термолизина, иммобилизованного на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.2. В качестве контроля используют термолизин, иммобилизованный на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.
| Таблица 2 | |||||
| Физико-химические параметры иммобилизованного термолизина | |||||
| Способ иммобилизации | Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя | Удельная активно-сть фермента, ед./мг белка | Удельная активно-сть фермента, % от нативного | Оптимум, рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 | 21,5 | 38,9 | 76,4 | 6,9-8,6 | 45 |
| Контрольный опыт | 13,2 | 24,0 | 47,2 | 7,6-8,2 | 30 |
Пример 3
Для получения наночастиц Fe3O4 со сложноэфирными группами на поверхности и их модификации силаном осуществляют последовательность операций, аналогичную примеру 1, после чего готовят суспензию наночастиц (5 мг/см3) в 100 мМ фосфатном буфере (рН 6,8). Иммобилизуемым объектом является протеолитический фермент эластаза. 200 мкл суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимида-м-п-толуолсульфоната в 100 мМ фосфатном буфере в течение двух часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 100 мМ фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 100 мМ фосфатного буфера. На следующем этапе иммобилизации растворяют 1000 мг эластазы в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии модифицированных наночастиц в 100 мМ фосфатном буфере при температуре 40°С в течение четырех часов. По окончании иммобилизации наночастицы промывают 100 мМ фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 100 мМ фосфатного буфера (рН 6,8). Физико-химические характеристики эластазы, иммобилизованной на наночастицах Fe3O4, представлены в табл.3. В качестве контроля используют эластазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fe3O4 адсорбционным способом.
| Таблица 3 | |||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной эластазы | |||||
| Способ иммобилизации | Содержание белка в иммобилизо-ванном препарате, мкг/мг носителя | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активно-сть фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fe3O4 | 11,3 | 5,8 | 70,7 | 6,5-7,2 | 35 |
| Контрольный опыт | 7,7 | 4,5 | 54,8 | 6,8-7,1 | 28 |
Таким образом, иммобилизация протеолитических ферментов на поверхности модифицированных наночастиц Fe3O4 позволяет получить гетерогенные ферментные препараты с высокой удельной активностью по сравнению с известными способами иммобилизации ферментов на органических полимерных носителях. Преимущества данного изобретения перед прототипом следующие:
- обеспечение возможности использования в качестве носителя для иммобилизации наночастиц, обладающих рядом преимуществ перед макрообъектами;
- повышение удельной активности иммобилизованных препаратов;
- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;
- упрощение технологии получения иммобилизованных препаратов.
Claims (1)
- Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ, состоящий в формировании большого количества активных функциональных групп с использованием алкоксисиланов на поверхности носителя со сложноэфирными фрагментами, отличающийся тем, что в качестве поверхностно-модифицированного носителя используются наночастицы Fe3O4.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010105590/10A RU2425879C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010105590/10A RU2425879C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2425879C1 true RU2425879C1 (ru) | 2011-08-10 |
Family
ID=44754549
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010105590/10A RU2425879C1 (ru) | 2010-02-16 | 2010-02-16 | Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2425879C1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2493857C1 (ru) * | 2012-10-03 | 2013-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания "ФАРМАСОФТ" (ООО "НПК "ФАРМАСОФТ") | Способ получения биологически активной наножидкости на основе наночастиц оксида железа (ii, iii) и производного 3-гидроксипиридина |
| CN106011206A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 天津大学 | 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 |
| RU2741010C1 (ru) * | 2020-06-04 | 2021-01-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный технический университет" | Гетерогенный катализатор жидкофазного окисления органических соединений и способ его получения |
| RU2832335C1 (ru) * | 2024-03-06 | 2024-12-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный технический университет" | Магнитоотделяемый катализатор окисления органических соединений и способ его получения |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4206286A (en) * | 1977-11-14 | 1980-06-03 | Technicon Instruments Corporation | Immobilization of proteins on inorganic supports |
| SU1518373A1 (ru) * | 1987-10-01 | 1989-10-30 | Вильнюсский государственный университет им.В.Капсукаса | Способ получени иммобилизованного трипсина |
| RU2321574C2 (ru) * | 2006-04-06 | 2008-04-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Способ получения днк-чипов |
-
2010
- 2010-02-16 RU RU2010105590/10A patent/RU2425879C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4206286A (en) * | 1977-11-14 | 1980-06-03 | Technicon Instruments Corporation | Immobilization of proteins on inorganic supports |
| SU1518373A1 (ru) * | 1987-10-01 | 1989-10-30 | Вильнюсский государственный университет им.В.Капсукаса | Способ получени иммобилизованного трипсина |
| RU2321574C2 (ru) * | 2006-04-06 | 2008-04-10 | Закрытое акционерное общество "Молекулярно-медицинские технологии" | Способ получения днк-чипов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WANG TZU-HSIEN ET AL. Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles. - Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2003, v. 8, pp.263-267. LIAO M-H. ET AL. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase on magnetic nanoparticles for improving its stability. - Biotechnology Letters, v. 23, №20, October 2001, pp.1723-1727. KOUASSI GILLES K. ET AL. Examination of Cholesterol oxidase attachment to magnetic nanoparticles. - Journal of Nanobiotechnology 2005, 3:1. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2493857C1 (ru) * | 2012-10-03 | 2013-09-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственная компания "ФАРМАСОФТ" (ООО "НПК "ФАРМАСОФТ") | Способ получения биологически активной наножидкости на основе наночастиц оксида железа (ii, iii) и производного 3-гидроксипиридина |
| CN106011206A (zh) * | 2016-05-19 | 2016-10-12 | 天津大学 | 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法 |
| RU2741010C1 (ru) * | 2020-06-04 | 2021-01-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный технический университет" | Гетерогенный катализатор жидкофазного окисления органических соединений и способ его получения |
| RU2832335C1 (ru) * | 2024-03-06 | 2024-12-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный технический университет" | Магнитоотделяемый катализатор окисления органических соединений и способ его получения |
| RU2832335C9 (ru) * | 2024-03-06 | 2025-04-25 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный технический университет" | Магнитоотделяемый катализатор окисления органических соединений и способ его получения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abdelhamid | Biointerface between ZIF-8 and biomolecules and their applications | |
| Sahin et al. | Covalent immobilization of trypsin on polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles activated with glutaraldehyde | |
| Li et al. | Functionalization strategies for protease immobilization on magnetic nanoparticles | |
| Vlakh et al. | Flow‐through immobilized enzyme reactors based on monoliths: I. Preparation of heterogeneous biocatalysts | |
| CN103882002B (zh) | 一种固定化蛋白酶试剂的制备及其应用 | |
| Cao et al. | PEI-crosslinked lipase on the surface of magnetic microspheres and its characteristics | |
| Sára et al. | Use of regularly structured bacterial cell envelope layers as matrix for the immobilization of macromolecules | |
| CN109266639B (zh) | 一种双重固定化酶及其制备方法和应用 | |
| Tamahkar et al. | Surface imprinted bacterial cellulose nanofibers for cytochrome c purification | |
| CN103723725B (zh) | 硅烷化活性炭的制备方法、固载化酶的制备方法 | |
| RU2425879C1 (ru) | Способ получения поверхностно-модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ | |
| US20240317895A1 (en) | Carrier for immobilizing protein and preparation method therefor | |
| CN114814215B (zh) | 基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条 | |
| Kang et al. | The properties of covalently immobilized trypsin on soap‐free P (MMA‐EA‐AA) latex particles | |
| CN111320760B (zh) | 一种多孔框架材料、包含该材料的酶制剂及制备方法和用途 | |
| CN103667241B (zh) | 一种毛发状亲水聚合物杂化磁性颗粒固定化蛋白酶及其制备方法 | |
| Pidenko et al. | Proteins: templates and matrices in molecular imprinting | |
| CN113061158A (zh) | 一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用 | |
| CN106148319B (zh) | 基于反应吸附法制备固定化酶的方法 | |
| CN103013976A (zh) | 一种固定化生物大分子的有机-无机复合水凝胶膜及接枝材料的制备方法 | |
| CN104480096B (zh) | 交联聚合固载β-葡萄糖苷酶的方法 | |
| Mustafa et al. | Cellulase immobilized on silica coated magnetic nanoparticles for improved stability and reusability | |
| Siar et al. | Tailoring the specificity of ficin versus large hemoglobin and small casein by co-immobilizing inert proteins on the immobilized enzyme layer and further modification with aldehyde dextran | |
| JPWO2003027674A1 (ja) | リガンド固定化用担体 | |
| Adikane et al. | Studies of penicillin G acylase immobilization using highly porous cellulose-based polymeric membrane |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20130530 |