CN111320760B - 一种多孔框架材料、包含该材料的酶制剂及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明针对传统酶制剂可能存在的稳定性差、酶促反应效率低、适用性局限等问题，创造性地设计开发多孔框架材料(金属‑有机框架材料)作为具有广泛适用性的新型酶制剂载体，通过吸附、包埋、交联等手段高效负载生物催化剂(如蛋白、酶、多肽等)，从而制备高效耐用的酶制剂。用此技术制备的各类酶制剂均有很好的催化效果，具有高稳定性和耐用性。此技术大大提高了酶制剂的适用范围和使用效率。

Description

一种多孔框架材料、包含该材料的酶制剂及制备方法和用途
技术领域
本发明涉及材料化学和酶学，尤其是涉及多孔框架材料、该材料的制备方法，以及在生物制品储运与催化方面的应用。
背景技术
随着生物技术的不断发展，生物制品(尤其是酶制品)在工业催化等领域发挥了日益重要作用。但是一些蛋白类生物制品容易受外界因素的影响而失去活性，例如酶对温度，pH及抑制剂十分敏感，需要严密的储运条件来保证其活性。这样做耗时耗力，同时也限制了这些生物制品的应用范围和途径。此外，自然界中超过一半的酶需要金属离子或一些小分子化合物作为辅因子来发挥催化效果。这些酶在制备纯化过程中常常丢失金属离子，从而影响酶活。因此亟需高效的保护手段在不破坏生物制品结构的前提下，降低外界环境变化对其影响，同时有效的将金属离子激活剂与酶结合在一起。从而极大提高生物制品的使用效率和范围，并且降低储运成本。
作为新一代多孔材料，金属-有机框架材料(MOFs)凭借高比表面积、高孔道率，孔道大小容易调控等性能，在气体吸附与分离、感应器、催化等等方面的应用发展迅速。多金属-有机框架材料具有很好的结晶性、确定的空间结构和孔道环境，可以清楚地研究和分析材料与其所吸附/负载、释放的客体分子间的相互作用和相关机理，这些非凡性能使得多孔框架材料在生物化工(尤其是固定化酶)领域的应用价值引起广泛关注。目前金属-有机框架材料在生物领域的应用多集中于生物传感器与固定化酶。经多孔框架材料固定、包裹的酶类的稳定性得到了提升，但是其催化活性往往会受到影响。
常见酶制剂基本都是蛋白质类生物分子，由于蛋白分子结构高度灵活且存在二、三级结构，所以在机械力、pH值改变、温度变化等条件下，蛋白质容易发生降解和聚集而失活。另一方面，一半以上的酶制剂在催化过程中都需要金属离子作为辅因子。这些酶在制备纯化过程中金属离子常常会受到损失而影响酶活。经多孔框架材料负载后，可有效隔离外界环境，并对蛋白质结构域进行固定。另外，多孔框架材料在自组装过程中可以将金属离子及小分子激活剂有效的结合在酶分子表面，从而起到促进酶活的作用。
本发明经过系统深入地研究酶分子与多孔框架材料的相互作用机制和制备方法等，可以简便快捷的将酶制剂进行可控性高效释放而发挥其作用。本发明首次研究和发展了多孔框架材料在制备促酶制剂中的创新性应用，并全面检测和评估了各项性能，实现了良好的催化效果。
本发明旨在提供一种新型技术，解决酶制剂的常温储运以及催化方面的应用，此技术简便高效、成本较低，可显著提高酶制品的稳定性同时显著提高酶活。通过提高生物分子的稳定性，可有效降低其保存难度和成本,有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明针对制备易于储运、便携、便于使用的生物制品(包括蛋白质、酶等生物制品)，创造性地利用MOFs与生物分子形成生物分子-多孔框架材料复合物，从而保护生物制品耐受较为恶劣的环境(如抑制剂、化学试剂、溶剂、温度等的变化)，提高其稳定性。同时，该技术体系可根据需要，使用含特定金属离子或配体的多孔框架材料负载特定的生物分子，并在其催化体系下释放包裹的生物分子，达到最优的催化效果。本发明解决了酶制品储运和使用中的关键难题，对酶制品具有良好的稳定效果，降低其储运成本，同时可方便取用。此外，此技术大大提高生物制剂的机械加工性能和稳定性，为进一步加工生物制剂提供新的解决方案。
一方面，本发明提供一种基于多孔框架材料的酶制剂，其特征在于，包括含有酶激活剂的多孔框架材料和生物分子，其中生物分子负载在多孔框架材料上。
优选的，该多孔框架材料可以在温和条件下降解。
优选的，所述生物分子为金属蛋白酶或非金属蛋白酶。进一步优选的，所述金属蛋白酶为碳酸酐酶，淀粉酶，辣根过氧化物酶或细胞色素c；所述非金属蛋白酶为脂肪酶，胰蛋白酶，溶菌酶或葡萄糖氧化酶。
优选的，所述酶激活剂为Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+，Fe2+，Co2+，Ni2+,Ca2+中的任意一种或几种的结合。
优选的，所述多孔框架材料为NKMOF-101、ZIF-8、ZIF-90、ZPF-1、ZPF-2。
另一方面，本发明提供了一种酶制剂的制备方法，其特征在于，生物分子通过包埋法、吸附法或酶模板法负载到多孔框架材料中。
另一方面，本发明提供了一种酶制剂的用途，其用作酶的稳定剂或酶的促活剂。
另一方面，本发明提供一种多孔框架材料，其特征在于，该材料为NKMOF-101。
同时，本发明提供一种金属有机框架材料，其特征在于，该金属有机框架材料是由方酸钠和不同的金属盐合成的。
优选的，该材料结构为P-M，其中P为NKMOF-101，M为Zn、Cu、Mn、Mg、Fe、Co、Ni、Ca中的一种或几种。
金属-有机框架材料是由金属离子(或金属簇)以及具有特定官能团和形状的有机配体来合成，因此可以根据需要来设计合成金属离子合适的、高比表面积和高孔道率的MOFs材料。如：NKMOF-101、ZIF-8、ZIF-90等。
金属-有机框架材料的结构具有明确性、灵活性和可调控性的特点，经过优化我们对部分多孔框架材料的合成过程进行了优化，如缩短反应时间，拓展反应温度及溶剂体系的范围，并简化了操作流程。提供的策略具有操作简单、条件温和、稳定性好、有较好的生物制品回收率，所需原料易得等特点。
本发明中，生物分子与多孔框架材料形成生物分子-多孔框架材料复合物。可由本应用进行保护的生物分子，包括但不限于蛋白质、酶、多肽等。
用于生物制品保存中的多孔框架材料，其特征在于，多孔框架材料的反应体系可与生物分子形成复合物，而不会影响其结构。
优选地，根据需要，多孔框架材料可在特定环境(如特定pH值、特定溶液、特定温度等)中温和的释放生物分子。其特征在于，某些多孔框架材料可在生物分子催化体系中进行分解，并且不需要通过超滤、分子筛、蛋白凝胶电泳等常见理化手段对生物分子进行分离。
优选地，本应用所选用的多孔框架材料可以与生物制品形成复合物而提高生物制品的稳定性，提高其对于各种环境变化的耐受性，如机械力、抑制剂、化学试剂等的作用，以及溶剂、温度、pH、湿度等的变化。
优选地，本应用所选用的多孔框架材料由对酶活具有促进作用的金属离子或小分子有机配体组成，在降解释放过程中可以有效的提高酶活。
优选地，本发明将多孔框架材料与一些生物制品(如：酶、多肽、蛋白等)形成复合物进行生物制品的保存。该复合物由生物分子与多孔框架材料构成，该复合物可在特定环境(酶催化体系)中可以释放。大大提高了生物产品的稳定性和对不佳环境的耐受性以及良好的可加工性，可成为生物制品的新型剂型，有利于降低生物制品的储运成本，利于生物制剂的广泛应用。
优选地，多孔框架材料与生物分子形成复合物的方式，包括但不局限于框架材料前体与生物分子“一锅法”反应，形成生物分子-多孔框架材料复合物。
优选地，我们筛选了多种具有良好的生物相容性和较低的生物毒性的金属-有机框架材料。
附图说明：
图1:脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物的粉末X射线衍射图。
图2:脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物的傅立叶变换红外光谱。
图3:脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物的扫描电镜图。
图4:脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中脂肪酶的释放情况。
图5：脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中释放的脂肪酶与游离的脂肪酶的酶活的比较图。
图6：经高温，有机溶剂以及蛋白酶处理后脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中释放的脂肪酶与经处理后游离脂肪酶的催化活性比较图。
图7：脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中释放的脂肪酶与游离的脂肪酶的圆二色谱图。
具体实施方式：
除非本发明上下文中另有其他说明，否则本发明中所用技术术语及缩写均具有本领域技术人员所知的常规含义；除非另有说明，否则下述实施例中所用原料化合物均为商购获得。
按照本发明所提到的，多孔框架材料的合成、各种性能的表征测试及其对活性物质的活性测试的方法，其具体实施方式如下。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
申请人声明，本发明通过下述实施例来说明本发明的基于多孔框架材料的生物制品储运的制剂及其制备和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1
NKMOF-101-Mn的制备。
称取0.015g方酸钠溶于0.5mL水中，0.014g氯化锰溶于0.35mL水和0.15mL无水乙醇的混合液中。将两者轻轻混匀，室温静置10min。反应结束后，将反应混合物离心，弃上清液，得到白色固体，用无水乙醇多次洗涤。放入干燥器内，室温干燥24小时。
NKMOF-102-Mn的制备。NKMOF-101合成过程中除了可以用氯化锰外，还可以用等物质的量的硝酸锌，硝酸钴或者硝酸镍形成具有同种结构的MOF。
实施例2：
脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物的制备：
将含有250μL溶解有2mg lipase的水溶液，与250μL的60mg/mL方酸钠水溶液混合，混匀，再向蛋白-方酸钠水溶液中加入500μL 28mg/mL氯化锰的15％乙醇的水溶液。将该体系室温放置10分钟。反应结束后，将反应混合物以6000rmp离心，弃上清液，得到白色固体，经-80℃预冻，之后冻干8h。图1:粉末衍射数据表明合成的脂肪酶@NKMOF-101-Mn与NKMOF-101-Mn及其结构模拟结果一致，说明脂肪酶@NKMOF-101-Mn制备成功。图2：傅立叶红外变化广谱中1660cm-1处的峰是蛋白中C＝O基团的特征峰,纯材料中无此特征峰，复合物中该峰的存在证明蛋白成功负载进了材料中。图3：扫描电子显微镜结果表明脂肪酶@NKMOF-101-Mn晶体为正方体结构。
实施例3：
从脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中包裹的脂肪酶的释放情况：将回收冻干后的脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物1mg，加入1mL的50mM HEPES(pH 6.5)缓冲液中充分混合，10分钟后，使用掌心离心机短暂离心5秒，使用超滤管，以10000g超滤10-20分钟(具体时间需考虑该蛋白生物制品的浓度、分子量与所使用的超滤管滤膜的孔径)。超滤结束后，使用超纯水超滤膜回收蛋白。使用bradford法检测释放后的脂肪酶的浓度，获得释放量数据。计算后与原本加入的蛋白总量进行比较。最终释放率不低于95％。释放率＝回收的生物制品量/体系中初始加入的生物制品量x100％。释放率实验结果见图4，由图4可见，本应用开发的酶制剂在应用时能够很好的释放以发挥催化功能。
实施例4：
比较脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中释放的脂肪酶与游离的脂肪酶的酶活实验：通过bradford法对脂肪酶@NKMOF-101-Mn中负载的脂肪酶进行定量。将含有5μg脂肪酶的脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物和5μg游离的脂肪酶分别加入反应液(300μL 10mM对硝基苯乙酸酯溶液、2.7mL HEPES缓冲液)进行反应，检测405nm处的吸收值。分别计算反应初速率，进行比较。结果见图5。脂肪酶@NKMOF-101-Mn中的脂肪酶催化活性游离脂肪酶催化活性的135％。表明释放过程中材料对酶活有明显促进作用。
实施例5：
NKMOF-101对蛋白的保护性检测。通过以下三种方式处理脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物和游离脂肪酶。然后检测并对比他们的催化活性。(1)将样品置于2ml反应管中，在80℃下孵育1h来进行热处理。(2)将样品和丙酮溶液混匀后在室温下反应1h检测有机溶剂的影响。(3)将样品在含有胰蛋白酶的溶液中处理1h检测蛋白酶的影响。结果见图6。脂肪酶@NKMOF-101-Mn经处理后催化活性仍能保持在90％以上。游离脂肪酶在处理后活性下降至原来的20％-50％。说明材料在储运过程中对酶有很好的保护作用。
实施例6：
使用圆二色谱仪对脂肪酶@NKMOF-101-Mn复合物中释放出的蛋白和游离的蛋白溶液进行测试。使用pH 6.5的50mM HEPES缓冲液收集释放后的脂肪酶，加样300μL。检测200nm至250nm范围内释放后及游离的蛋白样品的圆二色光谱。结果见图7。复合物中释放后的脂肪酶与游离脂肪酶广谱完全一致，都在209nm和220nm处有峰。说明材料的负载没有破坏蛋白的二级结构，负载过程不会影响蛋白活性。

Claims (4)

1.一种基于多孔框架材料的酶制剂，其特征在于，包括含有酶激活剂的多孔框架材料和生物分子，其中生物分子负载在多孔框架材料上，且该多孔框架材料可以在温和条件下降解，所述生物分子为金属蛋白酶或非金属蛋白酶，所述多孔框架材料为NKMOF-101，所述金属蛋白酶为碳酸酐酶，淀粉酶，辣根过氧化物酶或细胞色素c，所述非金属蛋白酶为脂肪酶，胰蛋白酶或溶菌酶。
2.根据权利要求1所述的酶制剂，其特征在于，所述酶激活剂为Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+，Fe2 +，Co2+，Ni2+,Ca2+中的任意一种或几种的结合。
3.根据权利要求1-2任一项所述的酶制剂的制备方法，其特征在于，生物分子通过包埋法、吸附法或酶模板法负载到多孔框架材料中。
4.根据权利要求1-2任一项所述的酶制剂的用途，其特征在于，所述酶制剂用作酶的促活剂。
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