RU2371199C1 - Способ получения иммуноглобулинового препарата - Google Patents

Способ получения иммуноглобулинового препарата Download PDF

Info

Publication number
RU2371199C1
RU2371199C1 RU2008122066/15A RU2008122066A RU2371199C1 RU 2371199 C1 RU2371199 C1 RU 2371199C1 RU 2008122066/15 A RU2008122066/15 A RU 2008122066/15A RU 2008122066 A RU2008122066 A RU 2008122066A RU 2371199 C1 RU2371199 C1 RU 2371199C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
medicine
immunoglobulin
impurities
solution
concentration
Prior art date
Application number
RU2008122066/15A
Other languages
English (en)
Inventor
Александра Вадимовна Мелихова (RU)
Александра Вадимовна Мелихова
Валерий Юрьевич Давыдкин (RU)
Валерий Юрьевич Давыдкин
Владимир Андрианович Алёшкин (RU)
Владимир Андрианович Алёшкин
Игорь Юрьевич Давыдкин (RU)
Игорь Юрьевич Давыдкин
Original Assignee
Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) filed Critical Федеральное государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.Н. Габричевского Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" (ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора)
Priority to RU2008122066/15A priority Critical patent/RU2371199C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2371199C1 publication Critical patent/RU2371199C1/ru

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения иммуноглобулинового препарата. Сущность изобретения включает стадию экстракции осадка Б (III фракции по Кону) физиологическим раствором, удаления балластных примесей сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С и выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. Преимущество изобретения заключается в исключении из технологического цикла токсичного реагента, повышении выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей. 1 табл.

Description

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, выделяемых экстракцией из осадка Б (III фракции по Кону) солями металлов.
Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения, включающий экстракцию спиртового осадка Б ((III фракции Кона) хлороформом в концентрации 10% в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия с последующим осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (RU, патент 2084229 C1, А61К 35/14, 20.07.1997).
Основным недостатком этого изобретения является то, что длительная обработка хлороформом приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, их полимеризации и снижению титра антител в продукте.
Наиболее близким по своей сути к заявляемому является способ получения иммуноглобулинового препарата, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией (RU, патент 2189833 С2, А61К 39/395, 35/16, 27.09.2002).
Основным недостатком прототипа является использование хлороформа для связывания липидов, что малоэффективно, и больших концентраций сульфата меди для осаждения липопротеидов, что приводит к снижению выхода выделяемых из осадка Б иммуноглобулинов.
В основу заявляемого изобретения положена задача исключения из технологического цикла токсичного реагента, повышения выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.
Задача решена тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.
В результате проведенных исследований нами впервые показано, что высокой степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей (балластных белков, липопротеидов, липидов) можно добиться, создав такие условия проведения реакции, когда с реагентом будут взаимодействовать только примеси, находящиеся в растворе. Это реализуется при сочетании следующих факторов: реагент - сульфат меди в концентрации 0,003-0,03%, рН проведения реакции 4,9-5,1 и температура смеси 0-5°С. При таком сочетании факторов сульфат меди реагирует только с примесными белками и липопротеидами, а рН и температура раствора способствуют выделению липидов. Кроме того, рН раствора создает условия попадания примесных белков в изоэлектрическую точку, что приводит к их коагуляции, которая усиливается взаимодействием этих белков с ионами меди.
Таким образом, указанное сочетание факторов обеспечивает высокую степень очистки иммуноглобулинового раствора от примесей, что позволило отказаться от использования токсичного реагента - хлороформа.
Применение сульфата меди в концентрации менее 0,003%, так же как изменение рН и температуры реакции, ведет к ухудшению степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей, а превышение концентрации более 0,03% приводит к снижению выхода иммуноглобулинов из осадка Б.
В результате проведенных исследований впервые показана возможность выделения 50-99% иммуноглобулинов из раствора осадка Б посредством осаждения примесных белков и липидов сульфатом меди без использования токсичного реагента - хлороформа.
Согласно изобретению исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей обеспечивается тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.
Заявляемый способ получения иммуноглобулинового препарата является новым и в литературе не описан.
Техническим результатом заявляемого изобретения является исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.
Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны результатами экспериментальных исследований. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Содержание балластных примесей определяли на биохимическом анализаторе Cobas Integra 400+ по методикам разработчика, а содержание общих липидов - с помощью «Bio-la-test» Lachema. Гравитационное осаждение примесей осуществляли в центрифугах MLW T24D. Ультафильтрацию - на установке с полыми волокнами или фильтрационной установке Millipore.
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей при использовании заявляемого способа.
Пример 1
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,03 мг/мл (0,003%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,1. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Пример 2
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,3 мг/мл (0,03%). При этом рН суспензии снижался до 4,8-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Пример 3
Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,115 мг/мл (0,0115%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.
Таблица
Характеристики Значения характеристик для
прототипа заявляемого способа при концентрации сульфата меди, %
осадок Б препарат осадок Б 0,003 0,0115 0,03
Общий белок, мг/мл 35,4 56,0 23,6 60,0 67,0 56,0
Общие Ig, мг/мл 16,9 54,9 11,9 58,5 65,0 54,0
Содержание IgG, IgA, IgM, % 39;35;26 60;23;17 59,28,13 59,25,16 64;24;12 62;24;14
Примесные белки, мг/мл 18,5 1,1 11,7 1,5 2,0 1,0
Доля примесей, % 52,0 1,8 49,6 1,9 1,7 3,0
Альбумин, мг/мл 17,5 1,0 10,8 1,4 1,8 1,0
Трансферрин, мг/мл 0,1 0,1 0,13 0,1 0,1 0,1
Церулоплазмин, мг/м 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1
Холестерол, мг/мл 1,68 0,7 1,5 0,5 0,5 0,2
Триглицериды, мг/мл 1,3 0,3 1,6 0,3 0,3 0,1
Общие липиды, мг/мл 2,07 1,04 2,90 1,04 0,90 0,5
Выход иммуноглобулинов, % - 15 - 97 64 54
Предлагаемый способ позволяет исключить из технологического цикла токсичный реагент, повысить выход выделяемых иммуноглобулинов и степень очистки препарата от примесей при одинаковой производительности с прототипом.

Claims (1)

  1. Способ получения иммуноглобулинового препарата, включающий стадии экстракции осадка Б (III фракции по Кону), удаления балластных примесей, выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.
RU2008122066/15A 2008-06-03 2008-06-03 Способ получения иммуноглобулинового препарата RU2371199C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008122066/15A RU2371199C1 (ru) 2008-06-03 2008-06-03 Способ получения иммуноглобулинового препарата

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008122066/15A RU2371199C1 (ru) 2008-06-03 2008-06-03 Способ получения иммуноглобулинового препарата

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2371199C1 true RU2371199C1 (ru) 2009-10-27

Family

ID=41353009

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008122066/15A RU2371199C1 (ru) 2008-06-03 2008-06-03 Способ получения иммуноглобулинового препарата

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2371199C1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2616266C1 (ru) * 2015-12-18 2017-04-13 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Руководство по вакцинному и сывороточному делу./ Под ред. акад. П.Н. Бургасова. - М.: Медицина, с.324-335. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2616266C1 (ru) * 2015-12-18 2017-04-13 Федеральное бюджетное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK152334B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af et intravenoest indgiveligt, pyrogenfrit, lagringsstabilt serumproteinpraeparat
WO1993008264A1 (en) Colostrum fraction, preparation and use thereof as cell culture media supplement
RU2371199C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата
HUE029232T2 (en) A method for preparing injectable formulations of protein derived from blood, and materials obtained using said method
RU2371200C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата
CN101816789B (zh) 抗蝰蛇蛇毒冻干血清及制备方法
US3429867A (en) Serum substantially free from gamma globulin and method of preparing same
CN1129609C (zh) 一种絮凝澄清-超滤浓缩工艺生产复合免疫活性蛋白的方法
WO2020058936A1 (pt) Processo para purificar um anticorpo a partir da gema de ovo, seus produtos e usos
EP4361252A1 (en) Commercial purification method for high-purity bacterial extracellular vesicles
KR20220164446A (ko) 염 분별 침전을 이용한 세포외 소포체 분리 방법
KR20150077954A (ko) 계란 난황으로부터 면역글로불린 y와 포스비틴을 연속적으로 분리추출하는 방법
RU2189833C2 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата
RU2128508C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинов
CN103561758B (zh) 通过沉降灭活/去除凝血因子的方法
CN1151174C (zh) 抗人淋巴细胞球蛋白制备方法
RU2586255C1 (ru) Способ получения продукта, содержащего иммуноглобулины g,a,m
JPH06116297A (ja) 卵黄水溶性蛋白質の分離方法
RU2084229C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных заболеваний
JP2003159094A (ja) 卵黄抗体の無菌的製造法
CN117804867A (zh) 利用血液制品中间产品组分制备特种蛋白质控品的方法及特种蛋白质控品
EP3854814A1 (en) Purification of immunoglobulin y and uses thereof
RU2616266C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата для наружного применения
JPS6143330B2 (ru)
RU2060034C1 (ru) Способ получения иммуноглобулинового препарата