RU2274658C2 - Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты - Google Patents
Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2274658C2 RU2274658C2 RU2004102936/13A RU2004102936A RU2274658C2 RU 2274658 C2 RU2274658 C2 RU 2274658C2 RU 2004102936/13 A RU2004102936/13 A RU 2004102936/13A RU 2004102936 A RU2004102936 A RU 2004102936A RU 2274658 C2 RU2274658 C2 RU 2274658C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ribonucleic acid
- hydrolyzate
- filtrate
- filtration
- oligonucleotides
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для промышленного получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты. Проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавляют этиловый спирт, отделяют осадок фильтрованием и к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л. Смесь олигонуклеотидов разделяют ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, затем олигонуклеотиды осаждают этиловым спиртом. Готовят раствор смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, проводят его фильтрацию и стерилизацию. Способ позволяет увеличить выход продукта в 1,2 раза (до 57-63%), унифицировать состав продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенности.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и состоит в совершенствовании технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты, находящего применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний: тапеторетинальных абиотрофий; нервно-мышечных заболеваний: болезни Шегрена и др.
Известен способ получения рибонуклеотидов [Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 - Jun. 154, 1982] путем гидролиза раствора дрожжевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) панкреатической рибонуклеазой. В этом способе раствор гидролизованной дрожжевой рибонуклеиновой кислоты центрифугируют, разделяют на фракции на колонке с сефадексом G 25 и лиофилизируют. Недостатком данного способа являются невысокий выход продукта и наличие большого количества высокомолекулярной РНК.
Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому эффекту является способ [Fux В.В., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture ofribonu-cleotides. USA Patent Number 5064758 Nov. 12, 1991], который выбран за прототип. Согласно этому способу проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой при температуре 62-65°C в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этанол, отделяют осадок фильтрованием, а фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 45-51%.
Задачей изобретения является увеличение выхода продукта. Поставленная задача решается тем, что гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой проводят при температуре 62-65°С в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этиловый спирт в количестве 15-30% по объему, отделяют осадок фильтрованием, к фильтрату добавляют миндальную кислоту до концентрации 0,10-0,12 мг/л. Миндальная кислота добавляется в качестве ингибитора рибонуклеаз. Способностью ингибировать рибонуклеазы обладает достаточно большой ряд веществ [McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436], но преимуществом миндальной кислоты является то, что она не ухудшает качество готового продукта, так как сама является лекарственным препаратом [Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988]. Применение миндальной кислоты имеет следствием унификацию целевого продукта, что обеспечивается ингибированием посторонней рибонуклеазной активности. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0°-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов, осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 57-63%.
Проведение способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1 (по прототипу)
70 г дрожжевой РНК растворяют в 430 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,1 2н. раствором гидроксида натрия. Добавляют 140 мг панкреатической рибонуклеазы и гидролизуют в течение 5 ч при температуре 65°С. Общий объем гидролизата 465 мл. Гидролизат охлаждают до температуры 25-35°С, добавляют 120 мл этанола, осадок отделяют на фильтре, а фильтрат подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану с диаметром пор 100 Å при давлении 0,4 МПа и температуре 30°С. Получают 360 мл пермеата. К ретанту добавляют дважды по 70 мл воды и дополнительно получают еще 140 мл пермеата. В объединенный пермеат объемом 500 мл добавляют 5 л этилового спирта (10-кратный объем). Суспензию охлаждают до 0-4°С, выдерживают при такой температуре в течение 4 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 0,36 л этилового спирта и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 36 г сухой смеси.
36 г сухой смеси олигопуклеотидов и 6 г хлористого натрия растворяют в 958 г дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор желтого цвета фильтруют через фильтр с величиной пор 2000 Å при давлении 98 кПа. Раствор рибонуклеотидов в стерильных условиях разливают в ампулы из нейтрального стекла по 3 мл и подвергают обработке в автоклаве при 119°С в течение 34 мин. Концентрация нуклеотидов в препарате 3,3%. Проведение всех указанных операций обеспечивает получение нетоксичного, стерильного, апирогенного препарата с выходом 51%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 | 3,15 |
А 260/280 | 1,60 |
Состав препарата, вес.%:
нуклеозиды | 1,5 |
мононуклеотиды | 25,6 |
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% | 72,9 |
Пример 2
Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,056 мг миндальной кислоты (концентрация 0,10 мг/л).
Выход продукта составляет 57%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 | 3,85 |
А 260/280 | 1,69 |
Состав препарата, вес.% :
мононуклеотиды | 24,1 |
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% | 75,9 |
Пример 3
Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,07 мг миндальной кислоты (концентрация 0,12 мг/л).
Выход препарата составляет 63%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 | 3,9 |
А 260/280 | 1,62 |
Состав препарата, вес.% :
мононуклеотиды | 15,6 |
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% | 84,4 |
Разработанный метод предназначен для промышленного применения. Преимущество предлагаемого способа получения панкреатического гидролизата РНК заключается в увеличении выхода продукта в 1,2 раза при сохранении его нетоксичности и апирогенности.
Литература:
1. Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of luecocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 -Jun. 154, 1982.
2. Fux B.B., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture of ribonucleotides. USA Patent Number 5064758 -Nov. 12, 1991.
3. McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436.
4. Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988.
Claims (1)
- Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты, включающий гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавление этилового спирта, отделение осадка фильтрованием, разделение смеси олигонуклеотидов ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, осаждение олигонуклеотидов этиловым спиртом, приготовление раствора сухой смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, фильтрацию и стерилизацию полученного раствора, отличающийся тем, что перед проведением ультрафильтрации к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) | 2004-02-03 | 2004-02-03 | Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) | 2004-02-03 | 2004-02-03 | Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2004102936A RU2004102936A (ru) | 2005-07-10 |
RU2274658C2 true RU2274658C2 (ru) | 2006-04-20 |
Family
ID=35837928
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) | 2004-02-03 | 2004-02-03 | Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2274658C2 (ru) |
-
2004
- 2004-02-03 RU RU2004102936/13A patent/RU2274658C2/ru not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2004102936A (ru) | 2005-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR20090071629A (ko) | 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법 | |
EP3413907B1 (de) | Blutbehandlung mit inaktivierung von freien nukleinsäuren | |
CN106727623B (zh) | 海藻低聚糖在制备抗禽白血病病毒制剂中的应用 | |
BRPI0814725B1 (pt) | Uso da composição antiviral | |
CN104066747A (zh) | 替考拉宁的纯化方法 | |
RU2274658C2 (ru) | Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты | |
SU933001A3 (ru) | Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью | |
CN110256516B (zh) | 一种聚肌胞的制备方法 | |
US5064758A (en) | Method of preparing a mixture of ribonucleotides | |
CN115770251A (zh) | 刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 | |
CN111253498B (zh) | 一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备 | |
US11246898B2 (en) | Antiviral arthrospira maxima extract | |
JP4991046B2 (ja) | アポトーシス誘導剤 | |
RU2392329C1 (ru) | Способ получения высокополимерной рнк из дрожжей | |
RU2392328C2 (ru) | Способ получения высокополимерной рнк из дрожжей | |
RU2278164C2 (ru) | Способ получения кальция фруктозодифосфата | |
JP4224313B2 (ja) | アミラーゼ阻害物質の調製方法 | |
CN113603808B (zh) | 改性褐藻胶及制备方法与其在制备促进胃肠蠕动药物中的应用 | |
JP2002293803A (ja) | 抗ウイルス剤 | |
CN109350625B (zh) | 一种刚毛藻粗多糖的抗病毒用途 | |
RU2302464C2 (ru) | Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты | |
KR20110056346A (ko) | 고순도의 의료용 히아루론산의 제조 방법 | |
KR0149793B1 (ko) | 고분자량 히알우론산의 정제방법 | |
RU2634408C1 (ru) | Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 | |
TWI440454B (zh) | 乾燥物及其製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080204 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20101027 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150204 |