RU2274658C2 - Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты - Google Patents

Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты Download PDF

Info

Publication number
RU2274658C2
RU2274658C2 RU2004102936/13A RU2004102936A RU2274658C2 RU 2274658 C2 RU2274658 C2 RU 2274658C2 RU 2004102936/13 A RU2004102936/13 A RU 2004102936/13A RU 2004102936 A RU2004102936 A RU 2004102936A RU 2274658 C2 RU2274658 C2 RU 2274658C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ribonucleic acid
hydrolyzate
filtrate
filtration
oligonucleotides
Prior art date
Application number
RU2004102936/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2004102936A (ru
Inventor
Марина Михайловна Баурина (RU)
Марина Михайловна Баурина
Алла Альбертовна Красноштанова (RU)
Алла Альбертовна Красноштанова
Игорь Алексеевич Крылов (RU)
Игорь Алексеевич Крылов
Марина Евгеньевна Шабанова (RU)
Марина Евгеньевна Шабанова
Original Assignee
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева filed Critical Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева
Priority to RU2004102936/13A priority Critical patent/RU2274658C2/ru
Publication of RU2004102936A publication Critical patent/RU2004102936A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2274658C2 publication Critical patent/RU2274658C2/ru

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для промышленного получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты. Проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавляют этиловый спирт, отделяют осадок фильтрованием и к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л. Смесь олигонуклеотидов разделяют ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, затем олигонуклеотиды осаждают этиловым спиртом. Готовят раствор смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, проводят его фильтрацию и стерилизацию. Способ позволяет увеличить выход продукта в 1,2 раза (до 57-63%), унифицировать состав продукта при сохранении его нетоксичности и апирогенности.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и состоит в совершенствовании технологии получения панкреатического гидролизата дрожжевой рибонуклеиновой кислоты, находящего применение в медицине для лечения широкого круга заболеваний: тапеторетинальных абиотрофий; нервно-мышечных заболеваний: болезни Шегрена и др.
Известен способ получения рибонуклеотидов [Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of leucocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 - Jun. 154, 1982] путем гидролиза раствора дрожжевой рибонуклеиновой кислоты (РНК) панкреатической рибонуклеазой. В этом способе раствор гидролизованной дрожжевой рибонуклеиновой кислоты центрифугируют, разделяют на фракции на колонке с сефадексом G 25 и лиофилизируют. Недостатком данного способа являются невысокий выход продукта и наличие большого количества высокомолекулярной РНК.
Наиболее близким по технологической сущности и достигаемому эффекту является способ [Fux В.В., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture ofribonu-cleotides. USA Patent Number 5064758 Nov. 12, 1991], который выбран за прототип. Согласно этому способу проводят гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой при температуре 62-65°C в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этанол, отделяют осадок фильтрованием, а фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов. Осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 45-51%.
Задачей изобретения является увеличение выхода продукта. Поставленная задача решается тем, что гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой проводят при температуре 62-65°С в течение 5 ч при рН 4,5-5,5. К гидролизату добавляют этиловый спирт в количестве 15-30% по объему, отделяют осадок фильтрованием, к фильтрату добавляют миндальную кислоту до концентрации 0,10-0,12 мг/л. Миндальная кислота добавляется в качестве ингибитора рибонуклеаз. Способностью ингибировать рибонуклеазы обладает достаточно большой ряд веществ [McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436], но преимуществом миндальной кислоты является то, что она не ухудшает качество готового продукта, так как сама является лекарственным препаратом [Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988]. Применение миндальной кислоты имеет следствием унификацию целевого продукта, что обеспечивается ингибированием посторонней рибонуклеазной активности. Фильтрат подвергают ультрафильтрации через мембрану с диаметром пор 50-150 Å при давлении 0,15-0,4 МПа и температуре 20°-30°С. Ретант дважды промывают водой в режиме диафильтрации. Из пермеата осаждают панкреатический гидролизат 8-10-кратным объемом этилового спирта. Суспензию охлаждают до 0°-4°С и выдерживают при такой температуре в течение 4 часов, осадок отделяют фильтрованием, промывают этиловым спиртом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Сухую смесь олигонуклеотидов растворяют в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 3,3-3,7%, фильтруют через фильтр с диаметром пор 2000-2200 Å при давлении 78-98 кПа, раствор стерилизуют при температуре 119-122°С в течение 34 мин и ампулируют по 3 мл. Выход продукта составляет 57-63%.
Проведение способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1 (по прототипу)
70 г дрожжевой РНК растворяют в 430 мл дистиллированной воды и доводят рН до 5,1 2н. раствором гидроксида натрия. Добавляют 140 мг панкреатической рибонуклеазы и гидролизуют в течение 5 ч при температуре 65°С. Общий объем гидролизата 465 мл. Гидролизат охлаждают до температуры 25-35°С, добавляют 120 мл этанола, осадок отделяют на фильтре, а фильтрат подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану с диаметром пор 100 Å при давлении 0,4 МПа и температуре 30°С. Получают 360 мл пермеата. К ретанту добавляют дважды по 70 мл воды и дополнительно получают еще 140 мл пермеата. В объединенный пермеат объемом 500 мл добавляют 5 л этилового спирта (10-кратный объем). Суспензию охлаждают до 0-4°С, выдерживают при такой температуре в течение 4 ч. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 0,36 л этилового спирта и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают 36 г сухой смеси.
36 г сухой смеси олигопуклеотидов и 6 г хлористого натрия растворяют в 958 г дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Полученный раствор желтого цвета фильтруют через фильтр с величиной пор 2000 Å при давлении 98 кПа. Раствор рибонуклеотидов в стерильных условиях разливают в ампулы из нейтрального стекла по 3 мл и подвергают обработке в автоклаве при 119°С в течение 34 мин. Концентрация нуклеотидов в препарате 3,3%. Проведение всех указанных операций обеспечивает получение нетоксичного, стерильного, апирогенного препарата с выходом 51%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 3,15
А 260/280 1,60
Состав препарата, вес.%:
нуклеозиды 1,5
мононуклеотиды 25,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% 72,9
Пример 2
Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,056 мг миндальной кислоты (концентрация 0,10 мг/л).
Выход продукта составляет 57%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 3,85
А 260/280 1,69
Состав препарата, вес.% :
мононуклеотиды 24,1
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% 75,9
Пример 3
Получение препарата проводят как в примере 1, только перед проведением ультраконцентрирования к гидролизату добавляют 0,07 мг миндальной кислоты (концентрация 0,12 мг/л).
Выход препарата составляет 63%.
Удельное поглощение Eсм=240 при λ=260 нм и рН 2.
Отношение поглощений (А) при рН 7 и длине волн 230, 260 и 280 нм:
А 260/230 3,9
А 260/280 1,62
Состав препарата, вес.% :
мононуклеотиды 15,6
ди- и другие олигонуклеотиды, составляющие общее количество до 100% 84,4
Разработанный метод предназначен для промышленного применения. Преимущество предлагаемого способа получения панкреатического гидролизата РНК заключается в увеличении выхода продукта в 1,2 раза при сохранении его нетоксичности и апирогенности.
Литература:
1. Beljanski M. Poliribonucleotides capable of promoting the genesis of luecocytes and blood platelets. USA Patent Number 4335239 -Jun. 154, 1982.
2. Fux B.B., Shabanova M.E., Fedorov S.N., Mixtais U.Y., Ermolaev E.D., Gailuma M.A. Method of preparing a mixture of ribonucleotides. USA Patent Number 5064758 -Nov. 12, 1991.
3. McDonald M.R. Ribonucleases. Methods in enzymology. 1955, v.2, p.427-436.
4. Dorland's illustrated medical dictionary, 30th edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co, 1988.

Claims (1)

  1. Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты, включающий гидролиз дрожжевой рибонуклеиновой кислоты панкреатической рибонуклеазой, добавление этилового спирта, отделение осадка фильтрованием, разделение смеси олигонуклеотидов ультрафильтрацией через мембрану с величиной пор 50-150 Å, осаждение олигонуклеотидов этиловым спиртом, приготовление раствора сухой смеси олигонуклеотидов в 0,55-0,65%-ном растворе хлорида натрия, фильтрацию и стерилизацию полученного раствора, отличающийся тем, что перед проведением ультрафильтрации к фильтрату добавляют миндальную кислоту до ее конечной концентрации в фильтрате 0,10-0,12 мг/л.
RU2004102936/13A 2004-02-03 2004-02-03 Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты RU2274658C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) 2004-02-03 2004-02-03 Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) 2004-02-03 2004-02-03 Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2004102936A RU2004102936A (ru) 2005-07-10
RU2274658C2 true RU2274658C2 (ru) 2006-04-20

Family

ID=35837928

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2004102936/13A RU2274658C2 (ru) 2004-02-03 2004-02-03 Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2274658C2 (ru)

Also Published As

Publication number Publication date
RU2004102936A (ru) 2005-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20090071629A (ko) 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법
EP3413907B1 (de) Blutbehandlung mit inaktivierung von freien nukleinsäuren
CN106727623B (zh) 海藻低聚糖在制备抗禽白血病病毒制剂中的应用
BRPI0814725B1 (pt) Uso da composição antiviral
CN104066747A (zh) 替考拉宁的纯化方法
RU2274658C2 (ru) Способ получения панкреатического гидролизата рибонуклеиновой кислоты
SU933001A3 (ru) Способ получени синтетической двунитчатой РНК, обладающей интерферониндуцирующей активностью
CN110256516B (zh) 一种聚肌胞的制备方法
US5064758A (en) Method of preparing a mixture of ribonucleotides
CN115770251A (zh) 刺糖中性多糖在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用
CN111253498B (zh) 一种褐藻多糖衍生物纳米胶束的制备
US11246898B2 (en) Antiviral arthrospira maxima extract
JP4991046B2 (ja) アポトーシス誘導剤
RU2392329C1 (ru) Способ получения высокополимерной рнк из дрожжей
RU2392328C2 (ru) Способ получения высокополимерной рнк из дрожжей
RU2278164C2 (ru) Способ получения кальция фруктозодифосфата
JP4224313B2 (ja) アミラーゼ阻害物質の調製方法
CN113603808B (zh) 改性褐藻胶及制备方法与其在制备促进胃肠蠕动药物中的应用
JP2002293803A (ja) 抗ウイルス剤
CN109350625B (zh) 一种刚毛藻粗多糖的抗病毒用途
RU2302464C2 (ru) Способ получения двуспиральной рибонуклеиновой кислоты
KR20110056346A (ko) 고순도의 의료용 히아루론산의 제조 방법
KR0149793B1 (ko) 고분자량 히알우론산의 정제방법
RU2634408C1 (ru) Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3
TWI440454B (zh) 乾燥物及其製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20080204

NF4A Reinstatement of patent

Effective date: 20101027

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150204